KR20210104074A - 시클로이소말토테트라오스, 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 및 그 제조방법과 용도 - Google Patents

시클로이소말토테트라오스, 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 및 그 제조방법과 용도 Download PDF

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아키히로 후지타
아키라 카와시마
히로키 후지사와
테츠야 모리
토모유키 니시모토
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가부시기가이샤하야시바라
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Abstract

D-글루코오스를 구성당으로 하는 신규의 환형 당질, 해당 환형 당질을 생성하는 신규 효소, 그들 제조방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 하며, 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 시클로이소말토테트라오스, 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 해당 효소를 코딩하는 DNA, 및 이들 제조방법 및 용도를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

시클로이소말토테트라오스, 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 및 그 제조방법과 용도
본 발명은 D-글루코오스를 구성당으로 하는 신규의 환형 당질, 그 환형 당질을 생성하는 신규 효소, 그리고 그들의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
당질(糖質)분야에서는, 전분 또는 전분 부분 분해물 등의 D-글루코오스를 구성당으로 하는 α-1,4 글루칸을 원료로 하여 효소반응에 의해 제조되는 여러가지 환형 당질이 알려져 있다. 비특허문헌 1에는, 전분에 마세란스 아밀라아제(macerans amylase)를 작용시킴으로써 얻어지는, 6 내지 8분자의 D-글루코오스가 α-1,4 글루코시드 결합을 통해 환형 구조를 형성한 당질인 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린이 개시되어 있다. 현재는 전분으로부터 이들 시클로덱스트린이 공업적 규모로 생산되며, 비환원성이고, 무맛이며, 포접능(包接能)을 갖는 등의 각각의 특성을 살린 용도로 이용되고 있다. 또한, 특허문헌 1에는, 전분 또는 그 부분 분해물에 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 작용시킴으로써 얻어지는, 4분자의 글루코오스가 α-1,3 글루코시드 결합 및 α-1,6 글루코시드 결합으로 교대로 결합된 환형 구조, 즉, 시클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 갖는 환형 사당(四糖)이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2에는, 전분 또는 그 부분 분해물에 환형 말토실말토오스 생성효소를 작용시킴으로써 얻어지는, 4분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코시드 결합 및 α-1,6 글루코시드 결합으로 교대로 결합된 환형 구조, 즉, 시클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→4)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 갖는 환형 사당(일명, 환형 말토실말토오스)이 개시되어 있다. 또한, 나아가, 특허문헌 3에는, 말토펜타오스 분자의 환원 말단 글루코오스 1위치와 비환원 말단 글루코오스 6위치 수산기가 α-1,6 글루코시드 결합되어 환형 구조를 형성한 환형 오당(五糖)(이소시클로말토펜타오스), 및, 말토헥사오스 분자의 환원 말단 글루코오스 1위치와 비환원 말단 글루코오스 6위치 수산기가 α-1,6 글루코시드 결합되어 환형 구조를 형성한 환형 육당(六糖)(이소시클로말토헥사오스)이 개시되어 있다. 이들 환형 당질은 환형 구조를 갖기 때문에 포접능을 가지며, 휘발성 유기물을 안정화하는 작용을 나타내는 동시에, 비환원성의 당질이기 때문에, 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않으며, 갈변, 열화(劣化)를 걱정하지 않고도 이용, 가공될 수 있으므로, 각각의 특성을 살려 여러 분야에 이용되거나 이용이 기대되고 있다.
한편, D-글루코오스를 구성당으로 하는 또 다른 α-글루칸으로서, D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 사슬 모양으로 늘어선 α-1,6 글루칸을 기본 구조로 하는 덱스트란이 알려져 있으며, 덱스트란을 원료로 한 효소반응에 의해 얻어지는 환형 당질로서 시클로이소말토올리고당('환형 이소말토올리고당','시클로 덱스트란'이라고도 불리고 있음)이 보고되고 있다. 특허문헌 4, 비특허문헌 2에는, 덱스트란에 바실러스(Bacillus)속 미생물 유래의 효소를 작용시켜 얻어지는, 7 내지 9분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형 구조를 형성한 당질인 시클로이소말토헵타오스(CI-7), 시클로이소말토옥타오스(CI-8) 또는 시클로이소말토노나오스(CI-9)가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 5, 비특허문헌 3에는, 글루코오스 중합도가 10 내지 16으로 더 큰 CI-10~CI-16이 개시되어 있고, 특허문헌 6에는, 글루코오스 중합도가 또한 13 내지 33으로 더 큰 CI-13~CI-33이 개시되어 있다. 그러나, 글루코오스 중합도가 7 미만인 시클로이소말토올리고당은 전혀 알려져 있지 않다.
상기한 당질 이외에도 D-글루코오스를 구성당으로 하는 환형 당질이 제공되면, 더욱 다양한 용도로의 이용이 기대된다.
국제공개팜플렛 WO2001/90338A1호 국제공개팜플렛 WO2005/21564A1호 국제공개팜플렛 WO2006/35725A1호 일본공개특허공보 평6-197783호 일본공개특허공보 2004-166624호 일본공개특허공보 2005-192510호
저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(Journal of American Chemical Society), 미국, 1949년, 제71권, 353 내지 358 페이지 바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리(Biosci. Biotech. Biochem.) 제57권, 1225-1227 페이지(1993년) 바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리(Biosci. Biotech. Biochem.) 제72권, 3277-3280 페이지(2008년)
본 발명의 과제는 D-글루코오스를 구성당으로 하는 신규의 환형 당질, 그 환형 당질을 생성하는 신규 효소, 그리고 그 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 직쇄상으로 연결된 글루코오스 폴리머인 α-1,6 글루칸을 기본 구조로 하는 덱스트란 또는 그 부분 분해물로부터 신규의 환형 당질을 생성하는 완전히 새로운 효소에 기대를 담아, 이러한 효소를 생산하는 미생물을 널리 검색해왔다.
그 결과, 새로이 토양에서 분리한 아그레이아(Agreia)속에 속하는 미생물 D1110주나 마이크로박테리움속에 속하는 미생물 D2006주가 신규의 효소를 생산하고, 이 신규 효소의 작용에 의해 α-1,6 글루칸, 또는 α-1,6 글루칸을 기본 구조로 하는 덱스트란 또는 그 부분 분해물로부터, 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합(이하, 본 명세서에서는 단순히 'α-1,6 결합'이라고 하는 경우가 있다.)을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 신규 당질, 시클로이소말토테트라오스가 대량 생성되는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 해당 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 신규 효소의 생산능을 갖는 미생물을 배양하고, 배양물로부터 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 정제하여, 그 모든 성질을 분명히 밝히는 동시에, 그 제조방법을 확립하고, 또한, 해당 효소를 코딩하는 DNA와 이를 포함하여 이루어진 재조합 DNA 및 형질전환체를 확립하며, 나아가, 본 효소를 이용한 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 제조방법 및 용도를 확립하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 신규 당질인 시클로이소말토테트라오스, 해당 당질을 생성하는 신규의 시클로이소말토테트라오스 생성효소, 해당 효소를 코딩하는 DNA와 이를 포함하여 이루어진 재조합 DNA 및 형질전환체, 그들 제조방법, 그리고 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 포함하여 이루어진, 음식물, 기호물, 사료, 먹이류, 화장품, 의약품, 공업용품 등의 조성물을 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 아직 알려지지 않은 신규 환형 당질인 시클로이소말토테트라오스, 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 공급할 수 있게 되어, 음식물, 화장품, 의약품을 비롯한 다양한 분야에서의 이용이 가능해진다.
도 1은 덱스트란 기질에 미생물 D1110주 유래 조(粗)효소액을 작용시켜 얻은 효소반응물의 TLC 크로마토그램이다.
도 2는 미지(未知) 당질 I 정제 표품(標品)의 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 미지 당질 I 정제 표품의 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 4는 미지 당질 I 정제 표품의 1H-1H COSY 스펙트럼이다.
도 5는 미지 당질 I 정제 표품의 13C-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 미지 당질 I 정제 표품의 HSQC 스펙트럼이다.
도 7은 미지 당질 I 정제 표품의 HMBC 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 시클로이소말토테트라오스의 구조를 나타낸 도면이다.
도 9는 시클로이소말토테트라오스 결정의 현미경 사진이다(배율 400배).
도 10은 시클로이소말토테트라오스 오함수(五含水) 결정의 분말 X선 회절도이다.
도 11은 아그레이아 스피시즈(Agreia sp.) D1110 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 12는 아그레이아 스피시즈 D1110 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 pH를 나타낸 도면이다.
도 13은 아그레이아 스피시즈 D1110 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 온도 안정성을 나타낸 도면이다.
도 14는 아그레이아 스피시즈 D1110 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 15는 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰(Microbacterium trichothecenolyticum) D2006 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 16은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 pH를 나타낸 도면이다.
도 17은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 온도 안정성을 나타낸 도면.
도 18은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 19는 아그레이아 스피시즈 D1110 및 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자, ORF9038 및 ORF5328이 각각 코딩하는 아미노산 서열의 상동성을 나타낸 도면이다.
도 20은 재조합 DNA, pRSET A-ORF9038을 나타낸 도면이다. 도면 중, 검정색 굵은 선으로 표시한 부분은 아그레이아 스피시즈 D1110 유래의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 DNA이다.
도 21은 재조합 DNA, pRSET A-ORF9038을 보유하는 재조합 대장균 E9038을 배양하여 조제한 세포추출물 상청액을 기질 덱스트란에 작용시켜 얻은 반응액의 HPLC 크로마토그램이다.
도 22는 시클로이소말토테트라오스를 수용체로 하고, α-시클로덱스트린을 당공여체로 한 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스페라제의 당전이반응에 의해 얻은 반응물을 글루코아밀라아제 처리, 알칼리 처리하여 얻은 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체 함유 당질의 HPLC 크로마토그램이다.
도 23은 시클로이소말토테트라오스의 2종의 글루코실 유도체의 구조를 나타낸 도면이다.
본 발명은 신규의 환형 당질인 시클로이소말토테트라오스에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시클로이소말토테트라오스란, 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조, 즉, 시클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 갖는 환형 글루코 사당(四糖)을 의미한다(도 8 참조).
본 발명의 시클로이소말토테트라오스는, 본 발명자들이, 토양에서 얻은 미생물의 배양액을 조(粗)효소제로 하여 기질 덱스트란에 작용시켜, 얻어진 반응액 중에 그 생성을 처음 발견한 종래 미지의 신규 당질이며, 상기 구조를 가지고 있는 한, 그 급원(給源), 제조방법에 상관없이 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스는 다른 실시예로서, 결정 형태에 있는 것을 포함한다. 본 발명의 시클로이소말토테트라오스의 결정은 통상적으로 오함수 결정의 형태에 있다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스의 오함수 결정은, 그 분말 X선 회절도에서 회절각(2θ) 9.0°, 9.8°, 11.8°, 13.1° 및 19.1°에 특징적인 회절 피크를 가지고 있다.
본 발명은 그 다른 실시예로서, 시클로이소말토테트라오스 및/또는 시클로이소말토테트라오스의 결정과 함께 다른 당질을 포함하여 이루어진 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 포함한다. 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 형태는 시럽, 분말, 결정 함유 분말 또는 고형물 중 어느 것이어도 좋다.
본 발명은 그 다른 실시예로서, 시클로이소말토테트라오스에 1분자 또는 2분자의 D-글루코오스가 결합된 구조를 갖는 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체를 포함한다. 이 글루코실 유도체에서의 D-글루코오스의 시클로이소말토테트라오스에 대한 결합 양식은 특별히 한정되지 않으며, α-1,2, α-1,3, 또는 α-1,4 결합 중 어느 것이어도 좋다. 1분자의 D-글루코오스가 시클로이소말토테트라오스를 구성하는 4개의 글루코오스 잔기 중 1잔기에 α-1,3 결합을 통해 결합된 글루코실 유도체는, 후술하는 효소에 의한 시클로이소말토테트라오스 생성 반응의 반응액 중에 미량으로 존재한다. 또한, 후술하는 실시예에 예시한 대로, 시클로이소말토테트라오스를 수용체로 하여, 적절한 당공여체의 존재하에서 적절한 당전이효소를 작용시키는 당전이반응, 나아가서는 당전이생성물의 효소 분해를 수행함으로써 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체를 생성시켜 얻을 수도 있다. 당전이효소로는 예를 들어, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, α-아밀라아제, 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스페라제(CGTase) 등을 사용할 수 있다. 당전이생성물의 효소 분해에는 예를 들어, 글루코아밀라아제, β-아밀라아제 등을 사용할 수 있다. 또한, 당공여체와 당전이효소를 선택함으로써, D-글루코오스 이외의 당을 시클로이소말토테트라오스로 전이시킨 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체, 예를 들어 프락토실 유도체, 갈락토실 유도체 등을 생성시켜 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 시클로이소말토테트라오스 생성효소란, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 그 부분 분해물에 작용하여, 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 반응을 촉매하는 효소 전반을 의미한다. 상기의 반응을 촉매하는 효소는 그 급원, 형태, 조(粗)효소 또는 정제 효소의 구별없이, 또한, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 그 부분 분해물에 작용하여, 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 반응의 메커니즘에 관계없이, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소에 포함된다. 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 그 일례에서, 덱스트란에 작용시킨 경우, 이소말토테트라오스 단위로 α-1,6 결합을 절단하고, 이 이소말토테트라오스의 환원 말단 글루코오스의 1위치를 동일 분자의 비환원 말단 글루코오스의 6위치 수산기에 α-1,6 전이하는 분자내 전이반응으로 고리화함으로써 시클로이소말토테트라오스를 생성하고 있는 것으로 추정된다. 또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 그 바람직한 일례에서, 일단 생성된 시클로이소말토테트라오스에 더 작용하여 가수분해함으로써 환형 구조를 개환하고, 이소말토테트라오스를 생성하는 활성도 가지고 있다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 효소 활성은 다음과 같이 하여 측정할 수 있다. 기질로서의 덱스트란 또는 덱스트란의 부분 분해물을 농도가 1.11w/v%가 되도록 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질용액으로 하고, 그 기질용액 0.9mL에 20mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 조제한 효소액 0.1mL를 첨가하여 40℃에서 반응을 시작하며, 반응 0.5분과 반응 30.5분의 시점에서 반응액을 0.4mL 샘플링하여 각각 100℃의 뜨거운 물로 중탕하여 10분간 가열함으로써 효소를 불활성화시켜 반응을 정지시킨 후, 각각의 액 중의 시클로이소말토테트라오스의 양을, 후술하는 실험 1에 기재된 HPLC로 정량한다. 30.5분 시점에서의 시클로이소말토테트라오스의 양으로부터 0.5분 시점의 시클로이소말토테트라오스의 양을 감산함으로써 반응 30분 동안 생성된 시클로이소말토테트라오스의 양을 산출한다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 활성 1단위(U)는 상기의 조건하에서 1분 동안에 1μ몰의 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 구체적인 예로는, 예를 들어, 하기의 이화학적 성질을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 들 수 있다.
(1) 분자량
SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에서, 86,000 ± 10,000 달톤;
(2) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서, 35 내지 40℃;
(3) 최적 pH
40℃, 30분간 반응의 조건하에서, pH 5.5 내지 6.0;
(4) 온도 안정성
pH 6.0, 각 온도 30분간 유지의 조건하에서, 40℃까지 안정;
(5) pH 안정성
4℃, 16시간 유지의 조건하에서, pH 5.0 내지 10.0에서 안정;
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 다른 구체적인 예로는, 예를 들어, 하기의 이화학적 성질을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 들 수 있다.
(1) 분자량
SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에서, 86,000 ± 10,000 달톤;
(2) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서, 40℃;
(3) 최적 pH
40℃에서 30분간 반응의 조건하에서, pH 5.5 부근;
(4) 온도 안정성
pH 6.0, 각 온도 30분간 유지의 조건하에서, 35℃까지 안정;
(5) pH 안정성
4℃, 18시간 유지의 조건하에서, pH 5.0 내지 7.0에서 안정;
또한, 상기 이화학적 성질을 갖는 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 그 N말단 서열로서, 서열목록에서 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 있는 경우가 있다.
그러나, 상기 이화학적 성질 또는 N말단 아미노산 서열을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 어디까지나 일례이어서, 상기와 다른 이화학적 성질 또는 N말단 아미노산 서열을 갖는 효소도, 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 한 본 발명에 따른 시클로이소말토테트라오스 생성효소에 포함되는 것은 물론이다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 통상적으로, 소정의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 그 일례로서는, 예를 들어, 서열목록에서 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 그와 상동적인 아미노산 서열을 들 수 있다. 서열목록에서 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 상동인 아미노산 서열을 갖는 변이체 효소로서는, 덱스트란 또는 그 부분 분해물에 작용하여 시클로이소말토테트라오스를 생성한다는 효소 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있으며, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 대해, 통상적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 그 급원에 의해 제한되지 않지만, 바람직한 급원으로서, 미생물을 들 수 있으며, 특히 본 발명자들이 토양에서 분리한 미생물 D1110주 혹은 그 변이주, 또는, 마찬가지로 토양에서 분리한 미생물 D2006주 또는 그 변이주가 바람직하게 사용된다. 여기서 말하는 변이주로는서는, 예를 들어, 인위적으로 변이를 도입함으로써, 친주(親株)보다도 배양 성상이 개선된 변이주, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산능이 친주보다 향상된 효소 고생산 변이주, 보다 활성이 높은 시클로말토테트라오스 생성효소를 생산하는 변이주 등을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산능을 가지는 미생물 D1110주 및 D2006주는, 본 발명자들이 토양에서 새롭게 분리한 미생물인데, 후술하는 실험 4에 기재된 바와 같이, 16S rRNA(16S rDNA)의 염기서열에 기초하여, 공지된 균의 염기서열과의 상동성을 검토하여, 균종의 동정을 수행한 결과, 미생물 D1110주는 아그레이아 스피시즈(Agreia sp.)로 동정되며, 또한, 미생물 D2006주는 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰(Microbacterium trichothecenolyticum)으로 동정되었다. 이들 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 미생물 D1110주 및 D2006주를 각각 신규 미생물 아그레이아 스피시즈 D1110, 및 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006으로 명명하고, 일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-6에 소재하는 독립행정법인 제품평가기술기반기구(NITE) 특허미생물기탁센터(NPMD)에 기탁하여, 2018년 12월 28일자로 각각 NITE BP-02815 및 NITE BP-02816의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산능을 갖는 미생물에는, 상기 균은 물론, 그 변이주, 그리고 본 명세서에서 사용한, 기질 덱스트란에 배양액을 조효소액으로서 작용시켜 시클로이소말토테트라오스의 생성을 조사하는 스크리닝 방법에 의해, 자연계로부터 분리, 선발되는 다른 속, 종에 속하는 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산능을 갖는 미생물, 및 그들 변이주 등도 포함된다.
본 발명은 상술한 본 발명에 따른 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 전반, 및 해당 염기서열에 상보적인 염기서열 전반을 갖는 DNA에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 DNA는, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인 한, 그것이 천연 유래의 것이어도 좋고, 인위적으로 합성된 것이어도 좋다. 천연의 급원으로서는, 예를 들어 아그레이아 스피시즈 D1110을 포함하는 아그레이아속의 미생물, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006을 포함한 마이크로박테리움속 미생물 등을 들 수 있으며, 이들 균체로부터 본 발명의 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 얻을 수 있다. 즉, 이러한 미생물을 영양 배지에 접종하여, 호기적 조건하에서 약 5 내지 10일간 배양한 후, 배양물로부터 균체를 채취하고, 리소자임이나 β-글루카나아제 등의 세포벽 용해효소나 초음파로 처리함으로써 해당 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 균체 밖으로 용출시킨다. 이 때, 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 병용하거나, SDS 등의 계면활성제를 공존시키거나 동결융해할 수도 있다. 이렇게 얻어지는 처리물에, 예를 들면, 페놀 추출, 알코올 침전, 원심 분리, 리보뉴클레아제 처리 등의 통상적인 방법을 적용하면 목적의 게놈 DNA를 얻을 수 있다. 본 발명의 DNA를 인위적으로 합성하기 위해서는, 예를 들어, 서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에 병기된 아미노산 서열에 기초하여 화학합성하면 된다. 또한, 해당 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 주형으로 하여, 적당한 프라이머가 되는 화학합성 DNA를 사용하여 PCR 합성하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 DNA의 일례로서는, 서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열, 또는 그들과 상동적인 염기서열, 그리고 그들 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA를 들 수 있다. 서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에 상동인 염기서열을 갖는 DNA로서는, 코딩하는 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 것을 들 수 있으며, 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에 대해, 통상적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 또한 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성(서열 동일성)을 갖는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 이들 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 DNA에 있어서, 유전자 코드의 축중(縮重)에 기초하여, 각각이 코딩하는 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 아미노산 서열을 바꾸지 않고도 염기의 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 것, 그들과 상보적인 것도 본 발명의 DNA에 포함된다.
본 발명의 DNA를, 자율복제가능한 적절한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA로 하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 재조합 DNA는 일반적으로 DNA와 자율복제가능한 벡터로 이루어지며, DNA를 입수할 수 있다면, 통상적인 방법의 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 조제할 수 있다. 이러한 벡터의 예로서는 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 사용할 수 있으며, 도입되는 세포 또는 도입방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 숙주세포 내에서 발현가능한 벡터를 적절히 선택하면 된다. 숙주세포의 종류에 따라, 확실하게 상기 유전자를 발현시키기 위해 적절히 프로모터 서열을 선택하고, 이와 상기 유전자를 각종 플라스미드 등에 삽입한 것을 발현벡터로서 사용하면 된다. 이러한 발현벡터로서는, 예를 들면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 레토로바이러스 벡터, 염색체 벡터, 에피솜 벡터 및 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오 파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 엘리먼트 및 바이러스(예를 들면, 바큐로 바이러스, 파포바 바이러스, 왁시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 조류 폭스 바이러스, 가성 광견병 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌치 바이러스 및 레토로 바이러스)) 및 그들 조합에서 유래하는 벡터(예를 들면, 코스미드 및 파지미드)를 이용 가능하다.
세균에서의 사용에 바람직한 벡터로서는, 예를 들어 pRSET A, pQE-70, pQE-60, pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH6a, pNH18A 및 pNH46A; 그리고 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5 등을 들 수 있다. 또한, 진핵생물에서의 사용에 바람직한 벡터로서는, pWLNE0, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 그리고 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL 등을 들 수 있다.
본 발명의 DNA를 이러한 벡터에 삽입하기 위해서는, 이 분야에서 통상 일반적인 방법이 채택사용된다. 구체적으로는, 우선, 목적으로 하는 DNA를 포함하는 유전자 DNA와 자율복제가능한 벡터를 제한효소 및/또는 초음파에 의해 절단하고, 이어, 생성된 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는 적절히 숙주에 도입하여 형질전환체로 하고, 이를 배양함으로써 무한히 복제할 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는 대장균, 고초균, 방선균, 효모를 비롯한 적절한 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 형질전환체를 얻기 위해서는, 콜로니 하이브리다이제이션법을 적용하거나, 영양 배지에서 배양하여 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 생산하는 것을 선택하면 된다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산능을 갖는 형질전환체도 포함한 미생물의 배양에 사용하는 배지는, 미생물을 생육할 수 있으며, 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 생산할 수 있는 영양 배지이면 되고, 합성 배지 및 천연 배지 중 어느 것이라도 좋다. 탄소원으로는, 미생물을 생육에 이용할 수 있는 것이면 되며, 예를 들어, 덱스트란이나 그 부분 분해물, 식물 유래의 전분이나 피토글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀루란, 또한, 이들 부분 분해물이나 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질, 또한, 구연산, 호박산 등의 유기산도 사용할 수 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 질소원으로는 예를 들어 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물, 및 예를 들어 우레아, 옥수수 침지액(corn steep liquor), 카제인, 펩톤, 효모 엑기스, 육즙 등의 유기 질소 함유물을 적절히 사용할 수 있다. 또한, 무기 성분으로는 예를 들어 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등의 염류를 적절히 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 아미노산, 비타민 등을 적절히 사용할 수 있다.
배양은 통상적으로 온도 15 내지 37℃에서 pH 5.5 내지 10의 범위, 바람직하게는 온도 20 내지 34℃에서 pH 5.5 내지 8.5의 범위로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 이루어진다. 배양 시간은 해당 미생물이 증식할 수 있는 시간이면 되며, 바람직하게는 10시간 내지 150시간이다. 또한, 배양 조건에서의 배양액의 용존 산소 농도에는 특별히 제한은 없지만, 통상적으로는 0.5 내지 20ppm이 바람직하다. 그 때문에, 통기량을 조절하거나, 교반하거나 하는 등의 수단을 적절히 채택사용한다. 또한, 배양방식은 회분 배양 또는 연속 배양 중 어느 것이어도 좋다.
이렇게 하여 미생물을 배양한 후, 본 발명의 효소를 포함하는 배양물을 회수한다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 주로 배양물의 제균액에서 확인되며, 제균액을 조효소액으로서 채취할 수도, 배양물 전체를 조효소액으로서 사용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하기 위해서는, 공지된 고액(固液) 분리법이 채택사용된다. 예를 들어, 배양물 그 자체를 원심분리하는 방법, 혹은, 프리코트 필터 등을 이용하여 여과분리하는 방법, 평막, 중공사막 등의 막 여과에 의해 분리하는 방법 등이 적절하게 채택사용된다. 제균액을 그대로 조효소액으로서 사용할 수 있지만, 일반적으로는 농축하여 사용된다. 농축법으로는 황산암모늄 염석법, 아세톤 및 알코올 침전법, 평막, 중공사막 등을 이용한 막 농축법 등을 채택사용할 수 있다.
또한, 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성을 갖는 제균액 및 그 농축액을 이용하여, 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 공지된 방법으로 고정화할 수도 있다. 예를 들면, 이온 교환체로의 결합법, 수지 및 막 등과의 공유 결합법·흡착법, 고분자 물질을 이용한 포괄법 등을 적절히 채택사용할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 조효소액을 그대로 또는 농축하여 사용할 수 있지만, 필요에 따라, 공지된 방법에 의해 추가로 분리·정제하여 사용할 수도 있다. 예를 들어, 배양액의 처리물을 황산암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품을 투석 후, "DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S" 겔(토소 주식회사제)을 사용한 음이온 교환 컬럼크로마토그래피, 이어, "페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl) 650M" 겔(토소 주식회사제)을 사용한 소수성 크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 전기영동적으로 단일 수준으로까지 정제된 정제효소 형태로 얻을 수 있다.
시클로이소말토테트라오스 생성효소가 재조합형 효소인 경우에는, 숙주의 종류에 따라서는 균체 내에 효소가 축적되는 일이 있다. 이러한 경우에는, 균체 또는 배양물을 그대로 사용하는 것도 가능하지만, 통상적으로는 사용에 앞서, 필요에 따라, 삼투압 충격이나 계면활성제에 의해 균체로부터 추출한 후, 또는, 초음파나 세포벽 용해효소에 의해 균체를 파쇄한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 재조합형 효소를 균체 또는 균체파쇄물로부터 분리하여 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
상기의 방법으로 얻어지는 천연형 또는 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 사용하면, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스, 및 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 제조할 수 있다.
시클로이소말토테트라오스, 및 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 제조할 때에, 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 작용시키는 기질 원료로서는, 덱스트란이나, 덱스트란을 산이나 덱스트라나아제 등의 효소에 의해 부분적으로 가수분해하여 얻어지는 덱스트란의 부분 분해물 등의 α-1,6 글루칸을 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 실험 14에 기재된 대로, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 이소말토테트라오스에 작용하여 시클로이소말토테트라오스를 생성하기 때문에, 적어도 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸을 기질로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 국제공개번호 WO2008/136331호 팜플렛에 개시된 분기 α-글루칸은, 그 분자의 부분 구조로서 D-글루코오스가 α-1,6 결합으로 연결된 α-1,6 글루칸 구조를 가지고 있기 때문에, 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 작용시키는 기질 원료로서 사용할 수 있다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 기질 원료에 작용시킬 때에, 그 기질 농도는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 기질 농도가 10질량% 이상의 비교적 고농도의 수용액을 사용할 경우에는, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소에 의한 생성 반응은 진행되기 어려워지기 때문에, 기질 농도 5질량% 이하가 바람직하며, 이 조건 하에서, 시클로이소말토테트라오스를 유리하게 생성할 수 있다. 반응 온도는 반응이 진행되는 온도, 즉 55℃ 부근까지에서 수행하면 된다. 바람직하게는 30 내지 45℃ 부근의 온도를 사용한다. 반응 pH는 통상적으로 4.0 내지 8.0의 범위, 바람직하게는 pH 4.5 내지 7.5의 범위로 조정하는 것이 좋다. 효소의 사용량과 반응 시간은 밀접하게 관계되어 있어, 목적으로 하는 효소반응의 진행에 따라 효소의 사용량과 반응 시간을 적절히 조정하면 된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질로부터 시클로이소말토테트라오스를 생성한다. 따라서, 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용하여, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소와 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 조합하여 사용하면, 전분 또는 전분 부분 분해물을 기질 원료로 하여 시클로이소말토테트라오스를 제조할 수 있다. 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용하여, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸 또는 덱스트란을 생성하는 효소로서는, 예를 들어 덱스트린 덱스트라나아제를 사용할 수 있으며, 또한 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소로서는, 예를 들면, 국제공개번호 WO2008/136331호 팜플렛에 개시된 α-글루코실 전이효소를 사용할 수 있다.
상기한 효소의 조합에 의해 전분 또는 전분 부분 분해물로부터 시클로이소말토테트라오스를 제조할 때에는, 먼저, 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용하여, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소를 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용시켜 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 일단 생성시킨 후, 이 생성물에 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 작용시켜 시클로이소말토테트라오스를 생성시키는 축차 반응을 수행하여도 좋고, 또한, 전분 또는 전분 부분 분해물에, 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용하여, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소와 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 동시에 작용시키는 동시 반응을 수행할 수도 있다.
상기의 반응에 의해 얻어진 반응액은, 그대로 시클로이소말토테트라오스 함유 당액으로서 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 시클로이소말토테트라오스 함유 당액에, 덱스트라나아제, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 등을 작용시켜, 혼입되는 이소말토올리고당을 가수분해한 시클로이소말토테트라오스 함유 당액으로서 사용할 수도 있다. 또한, 수소첨가하여 반응액 중에 잔존하는 환원성 당질을 당 알코올로 변환하여 환원력을 소멸시키는 등의 추가적인 가공처리를 실시하는 것도 임의이다. 일반적으로는, 시클로이소말토테트라오스 함유 당액은 추가로 정제하여 사용된다. 정제방법으로서는, 당의 정제에 사용되는 통상적인 방법을 적절히 채택사용하면 되며, 예를 들면, 활성탄에 의한 탈색, H형, OH형 이온 교환 수지에 의한 탈염, 이온 교환 컬럼크로마토그래피, 활성탄 컬럼크로마토그래피, 실리카겔 컬럼크로마토그래피 등의 컬럼크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등 유기용매에 의한 분별, 적당한 분리성능을 갖는 막에 의한 분리, 그리고, 시클로이소말토테트라오스를 이용하지 않고 혼입 당질을 자화, 분해하는 미생물, 예를 들어 효모 등에 의한 발효 처리나, 알칼리 처리 등에 의해 잔존하고 있는 환원성 당질을 분해 제거하는 등의 1종 또는 2종 이상의 정제방법을 적절하게 채택사용할 수 있다.
특히, 대량생산방법으로서는 이온 교환 컬럼크로마토그래피의 채택이 바람직하며, 예를 들면, 일본공개특허공보 소58-23799호, 일본공개특허공보 소58-72598호 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 컬럼크로마토그래피에 의해 혼입 당류를 제거하고, 목적물의 함량을 향상시킨 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이 때, 고정상 방식, 이동상 방식, 유사이동상 방식 중의 어느 방식을 채택사용하는 것도 임의이다.
이렇게 하여 얻어진 시클로이소말토테트라오스를 포함하는 수용액, 또는 그 함량을 향상시킨 당질 수용액은, 통상적으로 시클로이소말토테트라오스를 고형물당 10질량% 이상, 바람직하게는 40질량% 이상 함유하는 당질 수용액으로, 통상적으로 이를 농축하여 시럽형 제품으로 한다. 이 시럽형 제품은, 또한 건조하여 비정질 고형물 제품 또는 비정질 분말 제품으로 하는 것도 임의이다.
또한, 상기 시클로이소말토테트라오스를 함유하는 당질 수용액을 통상적인 방법에 의해 정제함으로써, 시클로이소말토테트라오스 고함유 당질이나 고순도의 시클로이소말토테트라오스 표품으로 할 수 있으며, 또한, 시클로이소말토테트라오스 고함유 당질이나 고순도의 시클로이소말토테트라오스 표품을 원료로 하여 결정화를 수행함으로써 시클로이소말토테트라오스의 결정, 및 결정 함유 분말을 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스는 소장 점막 α-글루코시다아제에 의해 겨우 분해될 뿐이기 때문에, 경구 섭취하여도 대부분 소화흡수되지 않는 난소화성 당질이어서, 무독, 무해한 당질로 생각된다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질은, 감미료, 미감개량제, 품질개량제, 안정제, 변색방지제, 부형제, 분말화기재 등으로서, 다른 성분과 조합하여, 음식물, 기호물, 사료, 먹이류, 화장품, 의약품, 공업용품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용가능하다.
본 발명의 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질은, 그대로 단맛 부가를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예를 들어, 가루엿, 포도당, 이성화당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스, 꿀, 메이플 슈가, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 나한과 감미물, 글리틸리틴, 타우마틴(Thaumatin), 수크랄로오스, L-아스파라틸 페닐알라닌 메틸에스테르, 사카린, 글리신, 알라닌 등과 같은 다른 감미료와, 또한, 덱스트린, 전분, 젖당 등의 증량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 분말형 제품은, 그대로, 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여, 과립, 구형, 짧은 막대형, 판상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형하여 사용하는 것도 임의이다.
또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 단맛은 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 감칠맛, 쓴맛 등의 다른 맛을 갖는 각종 물질과 잘 조화하고, 또한, 본 발명의 시클로이소말토테트라오스는 후술하는 실험에 나타낸 바와 같이, 내산성, 내열성도 크기 때문에, 일반적인 음식물의 단맛 부가, 미감 개량, 또한 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
예를 들면, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미(거르지 않은 술이나 간장), 히시오(장), 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 분말초밥용 식초, 중화요리용 스프, 튀김용 장국, 면용 장국, 소스, 케첩, 불고기 소스, 카레 루(roux), 스튜용 소스, 스프용 소스, 다시용 소스, 복합 조미료, 미림, 새 미림, 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료에 대한 감미료로서, 또한 미감 개량제, 품질 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 예를 들면, 전병, 아라레(말린 찐쌀을 볶은 일본과자), 밥풀과자, 규히(찐 찹쌀가루와 물엿·설탕을 반죽하여 부드럽게 만든 일본과자), 떡류, 만쥬, 우이로(쌀가루에 설탕 등을 넣고 찐 일본과자), 팥고물류, 양갱, 묽은 양갱, 킹교쿠(끓여서 녹인 한천에 설탕이나 물엿 등의 단맛을 더해 굳힌 일본과자), 젤리, 카스텔라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스킷, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터크림, 카스타드 크림, 슈크림, 와플, 스폰지 케이크, 도넛, 초콜릿, 추잉 검, 카라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스크림, 셔벗 등의 얼음 과자, 과일의 시럽 절임, 빙수 위에 뿌리는 시럽 등의 시럽류, 플라워페이스트, 피너츠페이스트, 프루츠페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마말레이드, 시럽 절임, 당과(dragees) 등의 과일, 야채의 가공 식품류, 후쿠진즈케(채소 절임의 일종), 벳타라즈케(무우의 누룩 절임), 센마이즈케(채소 절임의 일종), 염교 절임 등의 절임류, 단무지 소스, 배추 절임용 소스 등의 채소 절임용 소스류, 햄, 소세지 등의 축산 제품류, 어육 햄, 어육 소세지, 어묵, 생선살 꼬치구이, 튀김 등의 어육 제품, 성게, 오징어 젓갈, 식초에 절인 다시마, 오징어포, 복어를 미림에 조미하여 말린 것, 대구, 도미, 새우 등을 잘게 찢어 설탕/간장 등으로 조리한 것 등의 각종 진미류, 김, 산채, 마른 오징어, 작은 생선, 조개 등에 의해 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 롤(roll) 다시마 등의 반찬 식품, 유제품, 어육, 축육(畜肉), 과일, 야채의 병조림, 캔 식품류, 합성주, 증양주, 청주, 과실주, 발포주, 맥주 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸딩 믹스, 핫케익 믹스, 인스턴트 쥬스, 인스턴트 커피, 인스턴트 단팥죽, 인스턴트 스프 등의 인스턴트 식품, 그리고 이유식, 치료식, 드링크제, 펩타이드 식품, 냉동식품 등의 각종 음식물에 대한 단맛 부가, 미감 개량, 품질 개량 등에 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 먹이류 등으로 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 기타, 담배, 크림 치약, 립스틱, 립크림, 내복액, 정제, 트로키, 간유 드롭, 구강청결제, 구강향제, 양치질제 등의 고형, 페이스트형, 액상 등 임의의 형태에 있는 기호물, 화장품, 의약품, 의약부외품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서, 또는 미감개량제, 교미제로서, 나아가 품질개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
품질개량제, 안정제로서는, 유효성분, 활성 등 잃기쉬운 각종 생리활성물질 또는 이를 포함하는 건강식품, 기능성식품, 의약품 등에 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들어, 인터페론-α, -β, -γ, 종양괴사인자(tumor necrosis factor)-α, -β, 대식세포 유주 억제인자((macrophage migration inhibitory factor), 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터루킨 II 등의 림포카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프로락틴, 에리트로포에틴, 알세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 소아마비 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로블린 등의 생물제제 함유액, 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등의 항생물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르빈산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액, EPA, DHA, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파아제, 에스테라아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 인삼 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트, 로얄 젤리 등의 각종 생리활성물질을 포함하는 건강식품, 기능성 식품, 의약품 등에 대해서도 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 품질개량제 또는 안정제로 사용함으로써, 그 유효성분, 활성을 잃지 않고, 안정적인 고품질의 액상, 페이스트형 또는 고형의 건강식품, 기능성 식품이나 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상에서 설명한 바와 같은 각종 조성물에, 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을 함유시키는 방법으로는, 그 제품이 완성될 때까지의 공정에 함유시키면 되며, 예를 들면, 혼화, 혼합반죽, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 정석(晶析), 고화 등 공지된 방법이 적절하게 선택된다. 그 양은 통상 0.1질량% 이상, 바람직하게는 1질량% 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하, 실험에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다.
<실험 1 : 덱스트란으로부터의 생성물>
<실험 1-1 : 조(粗)효소액의 조제>
시판되는 덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파머코스모스사제) 15g/L, 효모 엑기스(상품명 "분말 효모 엑기스 SH", 일본제약주식회사 제조) 1.0g/L, 폴리펩톤(상품명 "하이폴리펩톤", 일본제약주식회사 제조) 5.0g/L, 인산이칼륨 1.0g/L, 인산일나트륨 이수화물 0.6g/L, 황산마그네슘 칠수화물 0.5g/L, 황산제일철 칠수화물 0.01g/L, 황산망간 오수화물 0.01g/L, 탄산칼슘 3.0g/L, 및 물로 이루어진 액체 배지(pH 6.8)를 500mL 용량의 삼각 플라스크 20개에 100mL씩 넣고, 오토클레이브로 121℃, 20분간 멸균하여, 냉각하였다. 이어서, 토양에서 분리한 미생물 D1110주를 접종하여, 27℃, 240rpm으로 4일간 회전진탕배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리(12,000rpm, 10분간)하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 얻어진 배양 상청액 약 0.9L에 황산암모늄을 80% 포화가 되도록 첨가, 용해하여 염석하고, 염석물을 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)에 용해시켜, 4℃에서 24시간 투석한 후, 4℃, 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 얻은 상청액을 조효소액으로서 회수하였다.
<실험 1-2 : 조효소액의 덱스트란에 대한 작용>
덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파머코스모스사제)을 1%(w/v), 방부제인 히노키티올을 0.006%(w/v) 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 1L에, 실험 1-1에서 얻은 조효소액을 첨가하여, 40℃에서 20시간 반응시켰다. 반응액을 100℃에서 10분간 열처리함으로써 효소를 불활성화시키며, 증발기를 사용하여 농축하고, 탈이온수 100mL에 용해시켰다. 여기에 에탄올 200mL를 첨가함으로써 반응액 중에 잔존하는 고분자(덱스트란, 단백질 등)를 침전시키고, 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 얻어진 상청액은 분획 분자량 10,000의 막 여과를 실시함으로써, 잔존하는 고분자를 더욱 제거하여, 효소반응물로 하였다.
얻어진 효소반응물 중의 당질을 조사하기 위해, 이소말토올리고당 마커(주식회사 하야시바라 조제품), 이소말토트리오스 표준품(주식회사 하야시바라 조제품), 이소말토테트라오스 표준품(주식회사 하야시바라 조제품)과 함께, 전개 용매로서 2-프로판올 : 1-부탄올 : 물 혼합액(용량비 12 : 3 : 4)을, 또한, 박층 플레이트로서 Merck사의 "Kieselgel 60"(알루미늄 플레이트 10×20cm)을 사용하며, 2회 전개하는 박층 크로마토그래피(이하 'TLC' 라고 약칭함)에 제공하여, 당질을 분리하였다. 얻어진 TLC 플레이트 상에 분리된 당질을 황산-메탄올법으로 발색시켜 검출하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 동시에 전개한 이소말토올리고당 마커(레인 1), 이소말토트리오스 표준품(레인 2), 및 이소말토테트라오스 표준품(레인 3)과의 대비에서, 효소반응물을 분리한 레인 4에서는, 글루코오스 중합도 3의 이소말토트리오스(도 1 중의 부호 'IG3')보다도 이동도가 작고, 글루코오스 중합도 4의 이소말토테트라오스(도 1 중의 부호 'IG4')보다도 이동도가 큰 미지(未知)의 당질의 스폿(도 1 중의 부호 'I')이 검출되었다. 이 미지의 당질을 '미지 당질 I'이라고 명명하였다.
<실험 1-3 : 미지 당질 I의 조제>
효소반응물을 소량 사용한 예비 시험에서, 미지 당질 I이 α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제에 의해 분해되지 않고, 알칼리 처리로 분해되지 않는 것이 확인되었기 때문에, 계속해서, 미지 당질 I에 혼입되는 덱스트란 분해물을 D-글루코오스까지 가수분해하는 실험을 실시하였다. 즉, 실험 1-2에서 얻은 미지 당질 I을 함유하는 효소반응물을 염산으로 pH 5.0으로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 "트랜스 글루코시다아제 L '아마노'", 아마노엔자임 주식회사 제조)를 고형물 1g당 100 단위, 글루코아밀라아제(나가세켐텍스 주식회사 판매)를 고형물 1g당 1,000 단위 첨가하여 50℃, 4일 동안 반응시켰다. 반응 후, 약 100℃에서 10분간 열처리하여 반응을 정지시켰다. 얻어진 반응액 중의 당질을 분석용의 고속 액체 크로마토그래피(이하, 분석 HPLC로 약칭한다.)로 분석한 결과, 용출시간 58.7분의 D-글루코오스, 용출시간 49.4분의 미지 당질 I이 검출되었다. 반응액의 당 조성은 D-글루코오스가 30.0질량%, 미지 당질 I이 65.5질량%, 기타 이소말토올리고당을 포함하는 덱스트란 부분 분해물이 4.5질량%이었다. 또한, 분석 HPLC는 컬럼에 "MCIgel CK04SS"(미쓰비시케미컬 주식회사 제조) 2개를 직렬로 연결하고, 용리액에 물을 이용하여, 컬럼 온도 80℃, 유속 0.4mL/min의 조건에서 수행하였으며, 검출은 시차굴절계 RID-10A(주식회사 시마즈제작소 제조)를 이용하여 수행하였다.
이어, α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제 처리에 의해 얻어진 상기 반응액에 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 12으로 조정하고, 98℃에서 1시간 유지함으로써 환원당(D-글루코오스와 소량의 덱스트란 부분 분해물)을 분해하였다. 불용물을 여과하여 제거한 후, 미쓰비시케미컬 주식회사제 양이온 교환 수지 "다이아이온 SK-1B"를 첨가하여 중화함으로써 pH 8 부근으로 한 후, 활성탄 처리에 의해 탈색하였다. 얻어진 당액을 추가로 "다이아이온 SK-1B"와 미쓰비시케미컬 주식회사제 음이온 교환 수지 "다이아이온 WA30" 및 오르가노제 음이온 교환 수지 "IRA411"을 이용하여 탈염하고, 정밀여과한 후, 증발기로 농축하고, 진공 건조하여 고형물로서 약 60mg의 미지 당질 I의 정제 표품을 얻었다. 얻어진 미지 당질 I 표품의 당 조성을 분석 HPLC로 조사한 결과, 도 2의 HPLC 크로마토그램에 나타낸 바와 같이, 미지 당질 I의 순도는 99.1질량%이며, 극히 고순도의 표품인 것으로 밝혀졌다.
<실험 2 : 미지 당질 I의 구조 분석>
실험 1에서 얻은 미지 당질 I의 정제 표품에 대해, LC/MS 분석, 각종 NMR 분석을 실시하여, 미지 당질 I의 구조 분석을 실시하였다.
<실험 2-1 : LC/MS 분석>
실험 1에서 얻은 미지 당질 I의 정제 표품에 대해, LC/MS 분석 장치(상품명 'Prominence')(주식회사 시마즈제작소제)를 이용하여, 액체 크로마토그래피에 관해서는 상기 실험 1-3에서 실시한 HPLC와 동일한 조건으로 분석한 결과, 미지 당질 I의 피크가 유지 시간 49.5분에 용출되는 동시에, 질량수(m/z) 671의 나트륨 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어, 미지 당질 I의 분자량은 648인 것으로 밝혀졌다. 이 분자량은, 미지 당질 I이, 4분자의 D-글루코오스가 환형으로 연결된 구조를 갖는 환형 글루코 사당(四糖)임을 시사하는 것이었다.
<실험 2-2 : 1H-NMR 및 1H-1H COSY 분석>
미지 당질 I의 화학 구조를 결정할 목적으로, 실험 1에서 얻은 미지 당질 I의 정제 표품을 중수(D2O)에 용해시켜, NMR 장치("Avance II spectrometer", Bruker사제)를 이용한 핵자기공명(NMR) 분석에 제공하고, 1H-NMR 및 1H-1H COSY 분석을 실시하였다. 미지 당질 I의 1H-NMR 스펙트럼을 도 3에, 1H-1H COSY 스펙트럼을 도 4에 각각 나타내었다.
도 3에서 볼 수 있듯이, 미지 당질 I의 1H-NMR 스펙트럼에는 7개의 주요한 피크가 확인되었다(또한, NMR 분석의 용매로서 중수를 사용하고 있기 때문에, 본 스펙트럼에서는 OH기의 프로톤은 검출되지 않는다). 피크의 적분비로부터, 미지 당질 I의 분자 내에는 환경이 다른 7개의 프로톤이 존재함을 알 수 있었다. 5.13ppm으로 확인된 더블렛의 피크를 D-글루코오스의 아노메릭 카본에 결합하는 1위치의 프로톤으로 귀속하였다. 도 4에 나타낸 1H-1H COSY 스펙트럼에 기초하여, 1위치 프로톤으로부터 순차적으로 상관관계가 확인된 피크를 귀속하였다. 확인된 7개의 프로톤 피크를 귀속한 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00001
표 1에 나타낸 각 프로톤 피크의 커플링 상수 및 케미컬 시프트의 값으로부터, 미지 당질 I는 글루코피라노실 구조를 가지는 것으로 밝혀졌으며, 아노메릭 카본에 결합하는 1위치의 프로톤 피크가 5.13ppm으로 확인된 것으로 볼 때, 미지 당질 I에서의 D-글루코오스의 결합 양식은 α-아노머임을 알 수 있었다.
<실험 2-3 : 13C-NMR, HSQC 및 HMBC 분석>
실험 2-2에서 사용한 NMR 장치를 이용하여, 계속해서 13C-NMR, HSQC(Heteronuclear Single-Quantum Correlation Spectroscopy, 이종핵-양자 상관 분광법) 및 HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectroscopy, 이종핵 다양자 상관 분광법) 분석을 실시하였다. 미지 당질 I의 13C-NMR 스펙트럼, HSQC 스펙트럼 및 HMBC 스펙트럼을 각각 도 5, 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 5에서 볼 수 있듯이, 미지 당질 I의 13C-NMR 스펙트럼에는 카본의 피크가 6종만 확인되었다. 실험 2-1의 LC/MS 분석에서 분자량으로부터, 미지 당질 I는 4분자의 D-글루코오스가 환형으로 연결된 구조를 갖는 환형 글루코 사당임이 시사되어 있으며, 카본의 피크가 6종밖에 확인되지 않은 점으로부터, 미지 당질 I는 단일 결합 양식으로 결합한 환형 글루코 사당임이 시사되어 있다. 13C-NMR 스펙트럼에서의 95.522ppm으로 확인되는 카본을 아노메릭 카본으로 귀속하였다.
표 1에 나타낸 1H-NMR 스펙트럼의 피크의 귀속 결과에 기초하여, 도 6에 나타낸 HSQC 스펙트럼에서 각 프로톤과 상관 관계를 보인 카본을 귀속한 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00002
또한, 도 7에 나타낸 HMBC 스펙트럼에서, 1위치의 프로톤과 상관 관계를 보이는 카본을 관찰한 결과, 1위치의 프로톤과 2,3,5,6위치의 카본에 상관 관계가 확인되었으며, 4위치의 카본에는 상관 관계가 확인되지 않았다. 2,3,5위치의 카본 이외에 6위치의 카본과의 사이에도 상관 관계를 보였기 때문에, 미지 당질 I에서, 1위치의 카본과 6위치의 카본과의 사이에 글루코시드 결합이 존재하는 것, 즉 미지 당질 I에서 D-글루코오스는 1,6 글루코시드 결합을 통해 결합하고 있는 것으로 밝혀졌다.
이상의 결과로부터, 미지 당질 I는, 도 8에 나타낸 바와 같이, 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 환형 글루코 사당, 즉 시클로이소말토테트라오스인 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 구조를 갖는 당질은 종래 전혀 알려져 있지 않아, 시클로이소말토테트라오스는 신규의 환형 당질이다.
<실험 3 : 시클로이소말토테트라오스의 결정>
실험 1의 방법을 스케일 업하여 재(再)조제한 시클로이소말토테트라오스 정제 표품(25.9g, 순도 96.1질량%)을 사용하여, 해당 당질의 결정 획득을 시도하였다.
<실험 3-1 : 결정의 조제>
상기 시클로이소말토테트라오스 정제 표품을 탈이온수에 현탁한 후, 가열 용해하고, 당 농도(Brix값)를 53.2%로 조정한 시클로이소말토테트라오스 수용액을 정치하여 실온까지 냉각한 결과, 결정이 석출되었다. 결정의 현미경 사진을 도 9에 나타내었다. 석출된 결정을 여과로 회수하고, 25℃에서 감압 건조함으로써 시클로이소말토테트라오스의 결정 표품 8.6g을 얻었다. 본 결정의 시클로이소말토테트라오스 순도를 상기한 분석 HPLC로 측정한 결과, 99.5질량%로 고순도이었다.
<실험 3-2 : 결정 시클로이소말토테트라오스의 분석>
실험 3-1에서 얻은 시클로이소말토테트라오스의 결정 표품에 대해, 통상적인 방법에 의해, 수분 함량을 측정하는 동시에 열분석, 분말 X선 회절을 실시하였다.
<수분 함량>
실험 3-1에서 얻은 시클로이소말토테트라오스의 결정 표품에 대해, 수분 함량을 칼 피셔 수분측정장치(상품명 'AVQ-2200A', 히라누마산업주식회사제)로 측정한 결과, 13.9질량%의 값이 얻어졌다. 결정 시클로이소말토테트라오스가 오함수 결정 또는 육함수 결정이라고 가정한 경우의 수분 함량의 이론값은 12.2질량% 또는 14.3질량%이기 때문에, 본 결정 시클로이소말토테트라오스는 오함수 결정 또는 육함수 결정 중 어느 하나로 생각되었다.
<열분석(DSC, TG/DTA)>
실험 3-1에서 얻은 시클로이소말토테트라오스 결정 표품 약 5mg을 알루미늄 용기에 정밀하게 측정하여, 질소분위기 하에, 5℃/분의 승온 속도로 30℃~300℃까지 승온시키고, 시차 열량 중량 동시측정장치(상품명 'TG/DTA 6200', 주식회사 히타치하이테크사이언스제)에 의해 열 분석을 실시한 결과, 116.5℃까지 12.12질량%의 중량 감소가 확인되었다. 이 중량 감소는 결정수의 이탈에 의한 것으로 생각되며, 수분 함량에 대한 상기의 지식과 함께, 본 결정 시클로이소말토테트라오스는 오함수 결정으로 생각되었다.
<분말 X선 회절도>
시클로이소말토테트라오스 오함수 결정의 분말 X선 회절 분석은 실리콘제 무반사판에 시료를 올려놓고, 분말 X선 회절장치 "X'Pert Pro MPD"(CuKα선 사용)(스펙트리스주식회사제)를 사용하여 실시하였다. 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정의 분말 X선 회절도를 도 10에 나타내었다. 회절각(2θ) 9.0°, 9.8°, 11.8°, 13.1° 및 19.1°(도 10에서의 부호 '↓')에 특징적인 회절 피크가 확인되었다.
<실험 4 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산균의 동정>
토양 스크리닝에 있어서, 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산균으로서, 신규 미생물 D1110주와, 균의 콜로니 형태가 D1110주와는 다른 신규 미생물 D2006주의 2주를 분리하였다. 각 미생물의 현미경 관찰을 실시한 결과, 미생물 D1110주와 D2006주는 모두 간균(桿菌)임을 알 수 있었다. 본 실험에서는, 16S rRNA(16S rDNA)의 염기서열을 결정하고, 이 염기서열에 기초하여 미생물 D1110주 및 D2006주의 균종 동정을 실시하였다.
<실험 4-1 : 미생물 D1110주 및 D2006주로부터의 16S rDNA의 조제>
시판의 덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파머코스모스사제) 1.5g/L, 인산이칼륨 1.0g/L, 황산마그네슘 칠수화물 1.0g/L, 염화나트륨 1.0g/L, 황산암모늄 2.0g/L, 황산제일철 칠수화물 0.01g/L, 황산망간 칠수화물 0.01g/L, 황산아연 칠수화물 0.001g/L, 젤란검 20.0g/L 및 물로 이루어진 배지(pH 6.8)를, 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균한 후, 페트리 접시에 분주하고 냉각하여 젤란검 평판 배지를 조제하였다. 이어, 토양에서 분리한 미생물 D1110주 및 D2006주를 각각 이 평판 배지에 접종하고, 각각 27℃에서 3일간 정치배양하여 단일 콜로니화하였다.
상기에서 단일 콜로니화한 미생물 D1110주 및 D2006주를 각각 조균(extracting bacteria)하여, 시판의 DNA 간이 추출 시약(상품명 "MightyPrep reagent for DNA", 타카라바이오주식회사 판매) 50μL에 현탁하고, 95℃에서 10분간 처리한 후, 15,000rpm, 2분간 원심분리함으로써 게놈 DNA를 포함하는 상청액을 회수하였다. 회수한 미생물 D1110주의 게놈 DNA 및 미생물 D2006주의 게놈 DNA 각각에 대해, 서열목록에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머 '8F', 및 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머 '1512R'를 이용한 PCR을 실시하여, PCR 증폭 산물에 대하여 아가로스 전기영동을 실시한 결과, 각각으로부터 약 1.5kbp의 PCR 증폭 산물이 확인되었기 때문에, 에탄올 침전에 의해 각각을 회수하여 16S rDNA로 하였다.
<실험 4-2 : 16S rDNA 염기서열의 결정>
실험 4-1에서 얻은 미생물 D1110주 및 D2006주의 16S rDNA의 염기서열을 각각 통상적인 방법에 의해 결정한 결과, 각각 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열(1,447bp) 및 서열목록에서 서열번호 4로 표시되는 염기서열(1,485bp)을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
<실험 4-3 : 상동성 검색에 의한 미생물 D1110주 및 D2006주의 동정>
실험 4-2에서 결정한 16S rDNA의 염기서열에 기초하여, 데이터베이스 RDP(The Ribosomal Database Project) 및 EzTaxon에 대해, 유전자 분석 소프트웨어(GENETYX Ver.13)를 이용하여 상동성 검색을 실시하였다.
실험 4-2에서 얻은 미생물 D1110주의 16S rDNA에 대해 실시한 상동성 검색의 결과로서, 검색된 상동성이 높은 상위 20엔트리 중, 엔트리 상위 5위까지의 미생물의 속·종·주와 그들의 16S rDNA 염기서열과의 상동성을 표 3에 나타내었다. 또한, 미생물 D2006주의 16S rDNA에 대해 동일하게 수행한 것의 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
표 3에서 볼 수 있듯이, D1110주의 16S rDNA의 염기서열은 아그레이아 프라텐시스(Agreia pratensis) VKM Ac-2510(T)주와의 사이에서 가장 높은 상동성 98.34%를 나타내었다. 일반적으로, 16S rDNA 염기서열에서의 세균 분류는 99% 이상의 상동성이 있으면 동종일 가능성이 높은 것으로 알려져 있다. 검색한 것 중에 99% 이상의 상동성을 나타내는 것은 없으며, 균종의 동정에까지는 이르지 못했지만, D1110주는 아그레이아속에 속하는 것으로 나타났다. 이 결과에 기초하여, D1110주를 아그레이아 스피시즈(Agreia sp.)로 동정하고, 아그레이아 스피시즈 D1110이라고 명명하였다.
또한, 표 4에서 볼 수 있듯이, D2006주의 16S rDNA의 염기서열은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰(Microbacterium trichothecenolyticum) DSM8608주와의 사이에서 가장 높은 상동성 99.17%를 나타냈다. 이 결과에 기초하여, D2006주의 속·종을 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰으로 동정하고, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006이라고 명명하였다.
아그레이아 스피시즈 D1110 및 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006은 모두, 일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-6에 소재하는 독립행정법인 제품평가기술기반기구(NITE) 특허미생물기탁센터(NPMD)에 기탁하여, 2018년 12월 28일자로 각각 NITE BP-02815 및 NITE BP-02816의 수탁번호를 부여받았다.
<실험 5 : 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 조제>
실험 1-1에서 사용한 것과 동일한 액체 배지를 시험관에 3mL씩 넣은 후, 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)를 접종하고, 27℃, 240rpm으로 96시간 진탕배양한 것을 종배양(seed culture)으로 하였다.
종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 100mL 넣은 용량 500mL의 삼각 플라스크 20개를 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1mL씩 접종하고, 온도 27℃에서 66시간 회전진탕배양하였다. 배양 후, 원심분리(12,000rpm, 15분간)하여 균체를 제거하고, 배양 상청액 약 1.8L를 얻었다. 배양 상청액에 대해 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성을 측정한 결과, 배양 상청액 중에는 그 산소 활성을 0.112U/mL 포함함을 알 수 있었다.
<실험 6 : 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 정제>
실험 5에서 얻은 배양 상청액 약 1.8L(총활성 202U)에, 80% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하고, 4℃에서 24시간 방치함으로써 염석하였다. 생성된 염석 침전물을 원심분리(12,000rpm, 30분)로 회수하고, 이를 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)에 용해시킨 후, 동일 완충액에 대해 투석하며, 투석효소액으로서 153mL를 얻었다. 투석효소액 중의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 33.2U이었다. 이 효소액을 토소 주식회사제 "DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S" 겔을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 24.1mL)에 제공하였다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 "DEAE-토요펄 650S" 겔에 흡착하고, 식염 농도 0M에서 0.5M까지의 선형 그라디언트로 용출시킨 결과, 식염 농도 약 0.25M 부근으로 용출되었다. 이 활성 분획을 회수하고, 최종 농도가 1M가 되도록 황산암모늄을 첨가한 후, 원심분리하여 불용물을 제거하고, 토소 주식회사제 "페닐-토요펄(Phenyl-Toyopearl) 650M" 겔을 이용한 소수성 크로마토그래피(겔 용량 11mL)에 제공하였다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은, 1M 황산암모늄을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 "페닐-토요펄 650M" 겔에 흡착하여, 황산암모늄 농도 1M에서 0M까지의 선형 그라디언트로 용출시킨 결과, 황산암모늄 농도 약 0.3M 부근으로 용출되었다. 이 정제의 각 단계에서의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 전체 활성, 전체 단백질, 비(比)활성 및 수율을 표 5에 나타내었다.
Figure pct00005
"페닐-토요펄 650M" 겔을 이용한 소수성 크로마토그래피로 정제한 시클로이소말토테트라오스 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)(8 내지 16w/v% 농도 구배)에 제공하여, 순도를 검정한 결과, 단일한 단백질 밴드를 나타내어, 순도 높은 표품인 것으로 밝혀졌다.
<실험 7 : 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 성질>
<실험 7-1 : 분자량>
실험 6의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(6 내지 16w/v% 농도 구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(상품명 "프레시젼 Plus 단백질 미착색 스탠다드", 일본 Bio-Rad 랩 주식회사 판매)와 비교하여 분자량을 측정한 결과, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 분자량은 86,000±10,000 달톤인 것으로 밝혀졌다.
<실험 7-2 : 효소반응의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 6의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 이러한 결과를 도 11(최적 온도), 도 12(최적 pH)에 나타내었다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응의 조건 하에서 35 내지 40℃이며, 최적 pH는 40℃에서 30분간 반응의 조건하에서 pH 5.5 내지 6.0인 것으로 밝혀졌다.
<실험 7-3 : 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 6의 방법으로 얻은 정제 시클로이소말토테트라오스 생성효소 표품을 이용하여, 본 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소 용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0) 각 온도로 30분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 본 효소를 각 pH의 100mM 완충액 중에서 4℃, 16시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이러한 결과를 도 13(온도 안정성), 도 14(pH 안정성)에 나타내었다. 도 13에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 온도 안정성은 40℃까지 안정적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 14에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 pH 안정성은 pH 5.0 내지 10.0의 범위에서 안정적인 것으로 밝혀졌다.
<실험 7-4 : N말단 아미노산 서열>
실험 6의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 이용하여, D1110 유래 효소의 N말단 아미노산 서열을 단백질 시퀀서(protein sequencer) PPSQ-31A형(주식회사 시마즈제작소제)을 이용하여 분석한 결과, 서열목록에서 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열, 즉 알라닌-트레오닌-발린-글리신-아스파르트산-알라닌-트립토판-트레오닌-아스파르트산-리신-알라닌-아르기닌-티로신-아스파르트산-프롤린을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
<실험 8 : 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 조제>
실험 1-1에서 사용한 것과 동일한 액체 배지를 시험관에 3mL씩 넣은 후, 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균하여, 냉각하고, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816)를 접종하여, 27℃, 240rpm으로 96시간 진탕배양한 것을 종배양으로 하였다.
종배양과 동일한 조성의 액체 배지를 100mL 넣은 용량 500mL의 삼각 플라스크 15개를 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1mL씩 접종하여 온도 27℃에서 66시간 회전진탕배양하였다. 배양 후, 원심분리(12,000rpm, 15분간)하여 균체를 제거하고, 배양 상청액 약 1.4L를 얻었다. 배양 상청액에 대해 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성을 측정한 결과, 배양 상청액 중에는 그 효소 활성을 0.069U/mL 포함함을 알 수 있었다.
<실험 9 : 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 정제>
실험 8에서 얻은 배양 상청액 약 1.4L(총활성 96.6U)에 80% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하여, 4℃, 16시간 방치함으로써 염석하였다. 생성된 염석 침전물을 원심분리(12,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이를 1mM의 염화칼슘을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)에 용해시킨 후, 동일 완충액에 대해 투석하여, 투석효소액으로 110mL를 얻었다. 투석효소액 중의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 140.7U이었다. 이 효소액을 토소 주식회사제 "DEAE-토요펄(Toyopearl) 650S" 겔을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 20mL)에 제공하였다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 1mM의 염화칼슘을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 "DEAE-토요펄 650S" 겔에 흡착하며, 식염 농도 0M에서 0.5M까지의 선형 그라디언트로 용출시킨 결과, 식염 농도 약 0.2M 부근으로 용출되었다. 이 활성 분획을 회수하고, 1mM의 염화칼슘을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH7.5)에 대해 투석한 후, GE 헬스케어 재팬 주식회사제 "모노 Q(Mono Q) 5/50GL" 겔을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1.0mL)에 제공하였다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소 활성은 1mM의 염화칼슘을 포함하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5)으로 평형화한 "모노 Q 5/50GL" 겔에 흡착하여, 식염 농도 0M에서 0.5M까지의 선형 그라디언트로 용출시킨 결과, 식염 농도 약 0.3M 부근으로 용출되었다. 이 정제의 각 단계에서의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 전체 활성, 전체 단백질, 비활성 및 수율을 표 6에 나타내었다.
Figure pct00006
"모노 Q 5/50GL" 겔을 이용한 소수성 크로마토그래피로 정제한 시클로이소말토테트라오스 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)(8 내지 16w/v% 농도 구배)에 제공하여, 순도를 검정한 결과, 단일한 단백질 밴드를 보여 순도 높은 표품인 것으로 밝혀졌다.
<실험 10 : 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 성질>
<실험 10-1 : 분자량>
실험 9의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(6 내지 16w/v% 농도 구배)에 제공하고, 동시에 영동한 분자량 마커(상품명 "프리시젼 Plus 단백질 미착색 스탠다드", 일본 Bio-Rad 랩 주식회사 판매)와 비교하여 분자량을 측정한 결과, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 분자량은 86,000±10,000 달톤인 것으로 밝혀졌다.
<실험 10-2 : 효소반응의 최적 온도 및 최적 pH>
실험 9의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 이용하여, 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정방법에 준하여 조사하였다. 이들 결과를 도 15(최적 온도), 도 16(최적 pH)에 나타내었다. 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응의 조건 하에서 40℃이며, 최적 pH는 40℃, 30분간 반응의 조건 하에서 pH 5.5 부근인 것으로 밝혀졌다.
<실험 10-3 : 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성>
실험 9의 방법으로 얻은 정제 시클로이소말토테트라오스 생성효소 표품을 이용하여, 본 효소의 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소 용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0) 각 온도로 30분간 유지하고, 수냉한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 본 효소를 각 pH의 100mM 완충액 중에서 4℃, 18시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이들 결과를 도 17(온도 안정성), 도 18(pH 안정성)에 나타내었다. 도 17에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 온도 안정성은 35℃까지 안정적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 18에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 pH 안정성은 pH 5.0 내지 7.0의 범위에서 안정적인 것으로 밝혀졌다.
<실험 10-4 : N말단 아미노산 서열>
실험 9의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 사용하여, D2006 유래 효소의 N말단 아미노산 서열을, 단백질 시퀀서 PPSQ-31A형(주식회사 시마즈제작소제)을 이용해 분석한 결과, 서열목록에서 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열, 즉 알라닌-아스파르트산-류신-글리신-아스파르트산-알라닌-트립토판-트레오닌-아스파르트산을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
<실험 11 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 이를 포함하는 재조합 DNA와 형질전환체의 조제>
시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 DNA를, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 및 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816)로부터 각각 클로닝하여, 자율복제가능한 재조합 DNA의 제작, 효소를 코딩하는 DNA의 염기서열의 결정, 및 형질전환체의 조제를 실시하였다.
<실험 11-1 : 게놈 DNA의 조제>
평판 한천배지에서 계대배양한 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 또는 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816)을 각각 한 백금 이로 긁어내어, 실험 1에서 사용한 액체 배지 3mL를 넣은 시험관에 식균하고, 27℃, 240rpm으로 5일간 각각 진탕배양하였다. 배양 종료 후, 배양액을 원심분리하여 회수한 각각의 균체로부터, 시판의 전체 DNA 정제 키트(상품명 "DNeasy Blood & Tissue Kit", QIAGEN사 판매)를 사용하여 통상적인 방법에 의해 게놈 DNA를 조제하였다.
<실험 11-2 : 차세대 시퀀서를 이용한 전체 게놈 염기서열의 결정>
실험 11-1에서 얻은 각각의 미생물 유래의 게놈 DNA를, 각각 시판의 키트(상품명 "Nextera XT DNA Library Preparation Kit", 일루미나사 판매)를 이용하여 효소적으로 단편화하고, 단편화한 DNA의 말단 평활화 처리와 DNA 말단으로의 어댑터 서열의 부가를 실시함으로써 DNA 단편을 라이브러리화하며, 또한 PCR로 증폭한 후, 시판의 DNA 정제 키트(상품명, "AMPure XP", 벡크만 콜터사 판매)를 이용하여 정제하였다. 이어, 라이브러리화한 DNA 단편의 염기서열을 차세대 시퀀서(장치명 "MiSeq", 일루미나사제)를 사용하여 결정하고, 결정된 각 DNA 단편의 염기서열(콘티그(contig) 서열)을 컴퓨터 상에서 통합함으로써, 전체 게놈 DNA의 염기서열을 각각 얻었다.
이어서, 유전자 영역 예측 소프트웨어("Glimmer")를 사용하여 전체 게놈 DNA의 염기서열을 분석하여, 단백질을 코딩하고 있다고 추정되는 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame, ORF: 추정 유전자 영역)을 예측한 결과, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)의 전체 게놈 DNA에는, ORF가 9,139개 있는 것으로 밝혀졌으며, 마찬가지로 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816)의 전체 게놈 DNA에는 ORF가 11,068개 있는 것으로 밝혀졌다.
<실험 11-3 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 ORF의 동정>
실험 11-2의 전체 게놈 분석에서 확인된 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 게놈 DNA의 9,139개의 ORF를 대상으로 하여, 실험 3-2에서 결정한 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 N말단 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열)과 일치하는 아미노산 서열을 코딩하는 ORF를 검색한 결과, 그 N말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 아미노산 서열이 ORF 9038로 코딩되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로부터, ORF9038의 염기서열, 즉 서열목록에서 서열번호 9로 표시되는 염기서열이 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 구조 유전자 DNA이며, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 서열목록에서 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 병기된 아미노산 서열로부터, 분비 신호 서열로 추정되는 N말단 부분의 31 아미노산 잔기가 제거된 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것으로 밝혀졌다.
또한, 실험 11-2의 전체 게놈 분석에서 확인된 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 게놈 DNA의 11,068개의 ORF를 대상으로 하여, 실험 10-4에서 결정한 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 N말단 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열)과 일치하는 아미노산 서열을 코딩하는 ORF를 검색한 결과, 그 N말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 아미노산 서열이 ORF5328에 코딩되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이 결과로부터, ORF5328의 염기서열, 즉 서열목록에서 서열번호 10으로 표시되는 염기서열이 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 구조 유전자 DNA이며, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 서열목록에서 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에 병기된 아미노산 서열로부터, 분비 신호 서열로 추정되는 N말단 부분의 32 아미노산 잔기가 제거된 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다.
참고로, 서열목록에서 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 분자량은 86,350으로 산출되고, 또한, 서열목록에서 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 동일 효소의 분자량은 86,658로 산출되어, 상기 실험 3-1 및 실험 10-1에서 SDS-PAGE에 의해 각각 구한 분자량 86,000±10,000과 잘 일치하였다. 서열목록에서 서열번호 9로 표시되는 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 효소 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과, 서열목록에서 서열번호 10으로 표시되는 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 효소 유전자가 코딩하는 아미노산 서열과의 상동성(서열 동일성)을 시판의 유전정보처리 소프트웨어("GENETYX Ver.13", 주식회사 제네틱스 판매)를 사용하여 조사한 결과, 71%이었다(도 19 참조).
<실험 12 : 발현용 재조합 DNA, pRSET A-ORF9038의 제작과 그 형질전환체 E9038에 의한 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산>
아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)의 게놈 DNA로부터 ORF9038의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자를 통상적인 방법에 따라 PCR로 증폭하고, 발현용 벡터 "pRSET A"(써모피셔 사이언티픽(주)제)에 삽입하여, 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 대장균에서의 발현을 검토하였다.
<실험 12-1 : 발현용 재조합 DNA, pRSET A-ORF9038의 제작 및 형질전환체 E9038의 조제>
아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자를 발현용 벡터 "pRSET A"에 삽입했을 때에, 서열목록에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열을 갖는 센스 프라이머와, 서열목록에서 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 갖는 안티센스 프라이머의 조합으로, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)의 전체 게놈 DNA에 대해 PCR을 실시하여, 증폭 DNA 단편을 얻었다. 이 PCR 증폭 DNA는 벡터 pRSET A에 In-fusion법으로 삽입하기 위해, 5'말단 및 3'말단에 pRSET A와 상동적인 15염기의 서열을 가지고, 또한, 개시 코돈 ATG의 직후에 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 성숙 효소의 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 배치하고, 그 직후에 종결 코돈 TAA·TAG가 위치하도록 설계되어 있다. 또한, T7 프로모터, 리보솜 결합부위(RBS) 및 개시 코돈 ATG는 pRSET A상의 것을 이용하기로 하였다.
상기에서 증폭한 DNA를 벡터 pRSET A에 In-fusion법으로 삽입하여 얻어진 재조합 DNA를 "pSET A-ORF9038"이라고 명명하였다. pRSET A-ORF9038을 도 20에 나타내었다. pSET A-ORF9038을 이용하여 대장균 HST-08(타카라바이오 주식회사 판매)을 형질전환하여, 얻어진 형질전환체로부터 pRSET A-ORF9038을 분리, 조제하여, 발현용 숙주 대장균 BL21(DE3)(Merck주식회사 판매)을 형질전환하여 형질전환체 "E9038"을 조제하였다.
<실험 12-2 : 형질전환체 E9038에 의한 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산>
Terrific Broth(써모피셔사이언티픽사제) 47g/L, 글리세롤 4g/L, 및 물로 이루어진 액체 TB배지(pH 6.8)를 유리 시험관에 5mL씩 넣고, 오토 클레이브로 121℃, 20분간 멸균하여, 냉각한 후, 암피실린을 최종농도 100μg/mL가 되도록 무균적으로 첨가하여 액체 배지를 조제하였다. 이 액체 배지에 실험 12-1에서 얻은 형질전환체 E9038을 접종하여, 37℃에서 8시간 진탕배양한 시점에서 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도가 100μM가 되도록 첨가하여 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자의 발현을 유도하고, 다시 16시간 배양하였다. 얻어진 배양물로부터 원심분리에 의해 균체를 회수하였다. 얻어진 균체를 통상적인 방법에 따라, 리소자임 처리, 동결해동처리 후, 초음파 파쇄하여 세포추출물을 조제하였다. 초음파 파쇄는 균체를 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.5)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음물 중에서 냉각하면서 초음파 균질기(모델 UH-600, 주식회사 에스엠티제)에서 세포파쇄함으로써 실시하였다. 얻어진 세포파쇄추출물을 원심분리하여 세포추출물 상청액을 얻었다.
이렇게 하여 조제한 세포추출물 상청액을 재조합 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 조효소액으로 하고, 해당 조효소액 0.3mL를 덱스트란(상품명 "덱스트란 T70" 파마코스모스사제)을 2.0%(w/v) 함유하는 200mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 0.3mL와 혼합하여, 40℃에서 하룻밤 유지함으로써 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 얻어진 반응액을 실험 1에서 사용한 분석 HPLC에 제공하였다. 반응액의 HPLC 크로마토그램을 도 21에 나타내었다. 또한, 대조군으로서, 발현 벡터 pRSET A를 유지하는 대장균 BL21(DE3)을 상술한 형질전환체의 경우와 동일 조건에서 배양하여, 배양물로부터 세포추출물 상청액을 조제하고, 마찬가지로 시클로이소말토테트라오스 생성능을 조사하였다.
도 21에서 볼 수 있듯이, 반응액의 HPLC 크로마토그램에는 유지시간 17분 부근에 기질로 한 덱스트란의 피크(도 21에서 부호 'Dex')의 용출이 확인되었으며, 유지시간 49.4분 부근에 시클로이소말토테트라오스의 피크(도 21에서 부호 'CI-4')가 확인되었다. 이 결과로부터, 숙주 대장균의 세포 내에서 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자가 발현하고, 시클로이소말토테트라오스 생성효소가 생산하고 있는 것이 정성적으로 확인되었다. 한편, 구체적인 크로마토그램은 생략하지만, 숙주인 대조군 대장균의 균체 추출 상청액에서는 시클로이소말토테트라오스의 생성은 확인되지 않아, 해당 효소 활성은 전혀 검출할 수 없었다.
또한, 상세한 내용은 생략하지만, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 효소에 대해서도, 상기 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 효소의 경우와 마찬가지로, 재조합 DNA, 형질전환체를 조제하고, 숙주 대장균의 세포 내에서 재조합 효소를 발현시킨 결과, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산이 확인되었다.
<실험 13 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 이소말토펜타오스에 대한 작용>
시클로이소말토테트라오스 생성효소의 기질특이성을 조사하는 일환으로서, 이소말토펜타오스에 대한 작용을 조사하였다. 이소말토펜타오스(주식회사 하야시바라 조제품, 순도 98.1질량%)를 1%(w/v), 방부제로서 히노키티올을 0.006%(w/v) 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 0.5mL에 실험 6의 방법으로 얻은 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 정제 표품을 이소말토펜타오스 1g당 2.0 단위 첨가하고, 40℃에서 24시간 동안 반응시켜, 반응액을 100℃에서 10분간 열처리함으로써 효소를 불활성화시켰다. 반응액 중의 생성물을 조사하기 위해, 전개용매로서 아세토니트릴 : 물 : 에틸아세테이트 : 1-프로판올 혼합액(용량비 85 : 70 : 20 : 50)을 사용하고, 또한 박층판으로서 Merck사의 "Kieselgel 60"(알루미늄 플레이트, 10×20cm)을 사용하며, 2회 전개하는 TLC를 실시하여, 당질을 분리하였다. 황산-메탄올법으로 발색시킴으로써 분리한 당질을 검출하여, 이소말토펜타오스로부터의 효소반응 생성물을 확인하였다.
그 결과, 시클로이소말토테트라오스 생성효소는 이소말토펜타오스에 작용하여, 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 동시에 이소말토테트라오스를 생성하고, 또한 아주 소량 이소말토트리오스, 이소말토오스, 글루코오스 및 고분자 글루칸을 생성하는 것로 밝혀졌다. 이 결과로부터, 본 효소는 적어도 글루코오스 중합도가 5 이상인 α-1,6 글루칸에 작용하는 것으로 생각되었다.
<실험 14 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 기질특이성>
각종 당질을 사용하여, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 기질특이성을 조사하였다. D-글루코오스, 말토오스, 이소말토오스, 파노오스, 이소말토트리오스, 이소말토테트라오스, 이소말토펜타오스, 이소말토헥사오스, 이소말토헵타오스, 덱스트란 T10(평균분자량 10,000, 파마코스모스사제), 덱스트란 T70(평균분자량 70,000, 파마코스모스사제) 또는 덱스트란 T2000(평균분자량 2,000,000, 파마코스모스사제)을 포함하는 수용액을 조제하였다. 이들 기질용액에, 최종 농도 50mM의 아세트산 완충액(pH 6.0)과 최종 농도 1mM의 염화칼슘을 첨가한 후, 실험 6의 방법으로 얻은 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소 정제 표품을 기질고형물 1g당 각각 20단위씩 첨가하여, 기질 농도를 1%(w/v)가 되도록 조정하고, 40℃, pH 6.0에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 전후의 반응액 중의 당질을 조사하기 위해, 전개용매로서 2-프로판올, 1-부탄올, 물 혼합액(용량비 12 : 3 : 4)을, 또한, 박층판으로서 Merck사의 "Kieselgel 60F254"(알루미늄 플레이트 10×20cm)를 사용하며, 2회 전개하는 실리카겔 박층 크로마토그래피(이하, TLC라 약칭한다)를 실시하여, 당질을 분리하였다. 황산-메탄올법으로 발색시켜, 분리된 당질을 검출하고, 각각의 당질로부터의 시클로이소말토테트라오스의 생성 정도와 기타 생성물을 조사하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
Figure pct00007
표 7에서 볼 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 생성효소는, 시험한 당질 중, D-글루코오스, 말토오스, 이소말토오스, 파노오스, 이소말토트리오스 등의 단당, 이당, 삼당에 대해서는 작용하지 않았다. 한편, 이 효소는 이소말토테트라오스, 이소말토펜타오스, 이소말토헥사오스, 이소말토헵타오스, 및 덱스트란에 작용하여, 시클로이소말토테트라오스를 생성한 것으로 볼 때, 글루코오스 중합도가 4 이상인 α-1,6 글루칸에 작용하여 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 효소는 생성된 시클로이소말토테트라오스를 가수분해함으로써 이소말토테트라오스를 생성하였다. 또한, 이 효소는 글루코오스 중합도가 4 이상인 α-1,6 글루칸에 작용하여 글루코오스 중합도 2 이상의 일련의 이소말토올리고당을 생성하는 불균등화 반응을 촉매하는 것으로도 밝혀졌다. 뿐만 아니라, 이 효소는 수용체인 이소말토오스의 공존 하에서 시클로이소말토테트라오스에 작용시킨 결과, 이소말토헥사오스를 생성한 것으로 볼 때, 시클로이소말토테트라오스를 개환하는 동시에 이소말토테트라오스를 이소말토오스에 결합시키는 커플링 반응도 촉매하는 것으로도 밝혀졌다. 또한, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소에 대해서도 마찬가지로 기질특이성을 조사한 결과, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래 효소와 마찬가지로 글루코오스 중합도가 4 이상인 α-1,6 글루칸에 작용하여 시클로이소말토테트라오스를 생성하였다. 또한, 이 효소는 시클로이소말토테트라오스의 가수분해반응, α-1,6 글루칸의 불균등화 반응, 커플링 반응을 촉매하는 점에서도 D1110 유래 효소와 마찬가지이며, 전체적으로, 그 기질특이성은 D1110 유래 효소와 동등하였다.
<실험 15 : 시클로이소말토테트라오스의 소장(小腸) 점막 효소에 의한 소화시험>
실험 3-1에서 얻은 순도 99.5질량%의 시클로이소말토테트라오스 결정 표품을 50mM 말레인산 완충액(pH 6.0)에 농도 1질량%가 되도록 용해하여, 기질용액으로 하였다. 이 기질용액에 래트 소장(小腸) 아세톤 파우더(시그마알드리치사 판매)로부터 조제한 소장 점막 효소(α-글루코시다아제)를 말토오스 분해 활성으로 하여, 시클로이소말토테트라오스 1g당 50단위 첨가하고, 37℃에서 24시간 유지한 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 반응 전과 반응 후의 용액 중의 시클로이소말토테트라오스를 HPLC법으로 각각 정량하여, 효소반응 후의 시클로이소말토테트라오스의 잔존율(%), 즉 (반응 후의 질량/반응 전의 질량)×100을 측정한 결과, 효소반응 24시간 후에 잔존율이 91.6%이었다. 시클로이소말토테트라오스는 소장 점막 효소에서 조금밖에 분해되지 않는 난소화성 당질이었다.
<실험 16 : 시클로이소말토테트라오스의 열안정성>
실험 3-1에서 얻은 순도 99.5질량%의 시클로이소말토테트라오스 결정 표품을 탈이온수에 용해시켜, 농도 7w/v%의 시클로이소말토테트라오스 수용액을 조제하였다. 그 수용액 8ml를 스크류 캡이 달린 유리제 원심관에 채취하여, 밀봉한 후, 120℃에서 30 내지 90분간 가열하였다. 가열 전과 각 가열시간 후의 수용액에 대해 착색도 측정과 HPLC법에 의한 시클로이소말토테트라오스의 순도 측정을 실시하였다. 착색도는 1cm 셀의 480nm에서의 흡광도로 하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.
Figure pct00008
표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스 수용액은 120℃의 고온 가열에서도 착색되지 않고, 분해에 의한 순도 저하도 확인되지 않아, 시클로이소말토테트라오스는 열에 대하여 안정적인 당질인 것으로 밝혀졌다.
<실험 17 : 시클로이소말토테트라오스의 pH 안정성>
실험 3-1에서 얻은 시클로이소말토테트라오스 결정 표품을 각종 완충액에 용해시켜, 시클로이소말토테트라오스 농도 4w/v%, pH를 3 내지 9로 조정한 7종류의 시클로이소말토테트라오스 수용액을 조제하였다. 각각의 수용액 8ml를 스크류 캡이 달린 유리제 원심관에 채취하여, 밀봉한 후, 100℃에서 24시간 가열하였다. 방냉 후, 실험 16과 마찬가지로 그 수용액의 착색도 측정과, HPLC법에 의한 시클로이소말토테트라오스의 순도 측정을 실시하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.
Figure pct00009
표 9에서 알 수 있듯이, 시클로이소말토테트라오스는 100℃, 24시간 가열에서, pH 4 내지 9의 범위에서 실질적으로 분해되지 않아, 약산성 내지 약알칼리성의 넓은 범위에서 안정적임을 알 수 있었다. 그러나, pH 3에서는 약간 분해되어, 순도 저하가 확인되었다.
이하, 실시예에 의하여 더욱 상세히 본 발명을 설명한다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
시판하는 덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파마코스모스사제) 15g/L, 효모 엑기스(상품명 "분말 효모 엑기스 SH", 일본제약주식회사 판매) 1.0g/L, 폴리펩톤(상품명 "하이폴리펩톤", 일본제약주식회사 판매) 5.0g/L, 인산이칼륨 1.0g/L, 인산일나트륨 이수화물 0.6g/L, 황산마그네슘 칠수화물 0.5g/L, 황산제일철 칠수화물 0.01g/L, 황산망간 오수화물 0.01g/L, 탄산칼슘 3.0g/L, 및 물로 이루어진 액체 배지(pH 6.8)를 500ml 용량의 삼각 플라스크 50개에 100mL씩 넣고, 오토클레이브로 121℃, 20분 동안 멸균하여, 냉각하였다. 이어, 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815)을 접종하고, 27℃, 240rpm으로 4일간 회전진탕배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리(12,000rpm, 10분간)하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 또한, 그 배양 상청액 약 4.8L를 UF막 농축하여, 0.70U/mL의 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 포함하는 농축효소액 1,100mL를 조효소액으로서 회수하였다.
실시예 2
효모 엑기스(상품명 "분말 효모 엑기스 SH", 일본제약주식회사 판매)를 다른 효모 엑기스(상품명 "효모 엑기스 미스트 과립 S", 아사히 푸드 앤 헬스케어 주식회사 판매)로 바꾸고, 또한, 폴리펩톤(상품명 "하이폴리펩톤", 일본제약주식회사 판매)을 (상품명 "하이뉴트 S", 후지세이유주식회사 판매)로 바꾼 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조성의 액체 배지(pH 6.8)를 조제하여, 500ml 용량의 삼각 플라스크 50개에 100mL씩 넣고, 오토 클레이브로 121℃, 20분 동안 멸균하여, 냉각하였다. 이어, 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816)을 접종하여, 27℃, 240rpm으로 4일간 회전진탕배양하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리(12,000rpm, 10분)하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 또한, 그 배양 상청액 약 4.7L를 UF막 농축하여, 0.41U/mL의 본 발명의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 포함하는 농축효소액 920mL를 조효소액으로서 회수하였다.
실시예 3
덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파마코스모스사제)을 2%(w/v), 방부제인 히노키티올을 0.006%(w/v) 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 10L에 실시예 1의 방법으로 얻은 아그레이아 스피시즈 D1110(NITE BP-02815) 유래의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 포함하는 조효소액을 덱스트란 1g당 5단위 첨가하여, 40℃에서 24시간 동안 반응시킨 결과, 반응물은 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 11.2질량%, 이소말토테트라오스를 1.8질량% 함유하고 있었다. 반응액을 95℃에서 30분간 열처리함으로써 효소를 불활성화시켜 냉각한 후, 분획 분자량 10,000의 UF막으로 막 여과를 실시하여 고분자를 더 제거하고, 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 62질량%, 이소말토테트라오스를 12.8질량% 함유하는 당액을 얻었다. 얻어진 여액을 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온 교환수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농축하여, 농도 60질량%의 시럽을 얻었다. 얻어진 시럽을 당액으로 하여, 강산성 양이온 교환수지(Amberlite CR-1310, Na형, 오르가노주식회사 제조)를 이용한 컬럼 분획을 실시하였다. 수지를 내경 5.4cm의 재킷이 달린 스테인리스제 컬럼 4개에 충전하고, 직렬로 연결하여 수지층 전체길이를 20m로 하였다. 컬럼내 온도를 60℃로 유지하면서, 당액을 수지에 대해 5v/v% 첨가하고, 여기에 60℃의 온수를 SV 0.13으로 흘려 분획하며, 용출액의 당 조성을 HPLC법으로 모니터링하고, 시클로이소말토테트라오스를 포함하는 분획을 채취하여 농축함으로써 시클로이소말토테트라오스 용액(시클로이소말토테트라오스 순도 98.6질량%)을 얻었다. 이어, 실험 3-1에 기재된 방법에 준하여 시클로이소말토테트라오스를 결정화하고, 순도 99.8질량%의 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정을 얻었다. 본 제품은 환원력을 갖지 않으며, 품질개량제, 안정제, 부형제, 분말화기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용가능하다.
실시예 4
덱스트란(상품명 "덱스트란 T70", 파마코스모스사제)을 2.5%(w/v), 방부제인 히노키티올을 0.006%(w/v) 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0) 20L에 실시예 2의 방법으로 얻은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 포함하는 조효소액을 덱스트란 1g당 5단위 첨가하여, 35℃에서 48시간 반응시킨 결과, 반응물은 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 9.7질량%, 이소말토테트라오스를 2.0질량% 함유하고 있었다. 반응액을 95℃에서 30분간 열처리함으로써 효소를 불활성화시켜, 냉각한 후, 분획 분자량 10,000의 UF막 여과를 실시하여 고분자를 더 제거하고, 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 62질량%, 이소말토테트라오스를 12.8질량% 함유하는 당액을 얻었다. 얻어진 당액을 다시 농축, 분말화하여 시클로이소말토테트라오스 함유 분말을 얻었다. 본 제품은 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 64질량%, 이소말토테트라오스를 13질량%, 글루코오스 중합도 7 이상의 기타 당질을 25질량% 함유하고 있었다. 본 제품은 품질개량제, 안정제, 부형제, 분말화기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용가능하다.
실시예 5
시판의 옥수수 전분을, 1mM 염화칼슘을 포함하는 20mM 아세트산 완충액(pH 5.5)에 농도가 30질량%가 되도록 현탁한 후, 가열 용해하고, 이를 50℃까지 냉각한 원료 용액에, 국제공개번호 WO2008/136331호 팜플렛에 개시된 α-글루코실 전이효소, 이소아밀라아제(전분 탈분지효소), 및 α-아밀라아제(상품명 "크라이스타제 E5CC", 아마노엔자임주식회사 판매)를 각각 기질고형물당 10단위, 1,000단위 및 10단위 첨가하고, 온도 50℃에서 72시간 반응시킨 후, 100℃에서 15분간 가열함으로써 효소를 불활성화시켜, α-1,6 글루칸을 부분구조로서 갖는 분기 α-글루칸 혼합물을 함유하는 반응액을 조제하였다.
상기에서 얻은 분기 α-글루칸 혼합물 함유 반응액의 일부를, 1mM 염화칼슘을 포함하는 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 농도가 1.0질량%가 되도록 희석하여, 실험 8의 방법으로 얻은 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(NITE BP-02816) 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 기질고형물 1g당 2.2단위 첨가하여 40℃에서 48시간 반응시킨 결과, 반응물은 고형물당 시클로이소말토테트라오스를 8.1질량%, 이소말토테트라오스를 5.7질량%, 이소말토트리오스를 4.2질량%, 이소말토오스를 5.0질량% 함유하고 있었다. 이 때문에, 전분으로부터 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소와 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 조합하여 사용함으로써, 전분 기질로부터 시클로이소말토테트라오스를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6
<시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체>
무수물 환산으로 0.5g의 실시예 3의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정과, 2.5g의 시판하는 α-시클로덱스트린(상품명 "CAVAMAX W6 food", 시클로켐사 판매)을 각각 당전이반응의 수용체 및 당공여체로서 사용하고, 1mM의 염화칼슘을 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.5) 50mL에 용해시켜, 얻어진 용액을 기질용액으로 하였다. 이 기질용액에 당전이효소로서 지오바실러스 스테로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) 유래 CGTase을 당공여체 1g당 2단위 첨가하여, 50℃에서 24시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열함으로써 효소반응을 정지시켰다. 이어서, 얻어진 반응액에 시판의 글루코아밀라아제(상품명 "글루코침 #2000", 나가세켐텍스 주식회사 판매)를 당공여체 1g당 10단위 첨가하고, 다시 50℃에서 24시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열함으로써 효소반응을 정지시켰다. 얻어진 글루코아밀라아제 처리액에 수산화나트륨을 첨가하여 pH 13.0으로 조정한 후, 105℃에서 1시간 오토클레이브하는 알칼리 처리를 실시하여 글루코아밀라아제 처리액 중의 환원당을 분해하였다. 또한, 알칼리 처리액을 통상적인 방법에 의해 탈염, 농축, 여과하며, 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체 함유 당액을 얻었다.
상기에서 얻은 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체 함유 당액을 하기 조건에 의한 HPLC 분석에 제공하여, 얻어진 크로마토그램을 도 22에 나타내었다.
(HPLC 조건)
컬럼 : YMC-Pack ODS-AQ303(4.6mm×250mm)
(주식회사 와이엠씨제)
용리액 : 물/메탄올(95 : 5, v/v)
컬럼 온도 : 40℃ 유속 : 0.7mL/분
검출 : 시차굴절계
도 22에서 볼 수 있는 바와 같이, 유지시간 6.47분에 시클로이소말토테트라오스의 피크가 유지시간 9.12분 및 11.36분에 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체로 생각되는 2개의 당질 피크가 확인되었으며, 또한, 유지시간 19.1분에 당공여체로 한 α-시클로덱스트린의 피크가 유지시간 47.7분에 α-시클로덱스트린으로부터 생성된 것으로 생각되는 β-시클로덱스트린의 피크가 확인되었다. 유지시간 9.12분 및 11.36분에 용출된 당질을 각각 글루코실 유도체 A 및 B로 하였다. 글루코실 유도체 함유 당액에서의 글루코실 유도체 A의 함량은 31.6질량%이며, 글루코실 유도체 B의 함량은 15.8질량%이었다.
글루코실 유도체 함유 당액을 ODS 컬럼(상품명 "D-ODS-5", 주식회사 와이엠씨제)을 이용한 분취 HPLC에 제공하여, 글루코실 유도체 A 및 B를 각각 분취함으로써, 순도 99.2질량%의 글루코실 유도체 A를 229mg 얻었으며, 순도 98.0질량%의 글루코실 유도체 B를 117mg 얻었다. 글루코실 유도체 A 및 B를 실험 2에서 사용한 LC/MS 분석 및 NMR 분석에 제공한 결과, 글루코실 유도체 A는 분자량 810을 가지며, 1분자의 D-글루코오스가 시클로이소말토테트라오스를 구성하는 4개의 글루코오스 잔기 중 1잔기에 α-1,4 결합을 통해 결합된 구조를 갖는 오당(五糖)이며, 시클로이소말토테트라오스의 모노글루코실 유도체인 것으로 밝혀졌다. 또한, 글루코실 유도체 B는 분자량 972를 가지고, 2분자의 D-글루코오스가 시클로이소말토테트라오스를 구성하는 4개의 글루코오스 잔기 중 대각선에 위치하는 2개의 글루코오스 잔기에 각각 α-1,4 결합을 통해 결합된 구조를 갖는 육당(六糖)이며, 시클로이소말토테트라오스의 디글루코실 유도체인 것으로 밝혀졌다. 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체 A 및 B의 구조를 도 23에 나타내었다.
실시예 7
<하드 캔디>
농도 55%의 자당 용액 100질량부에 실시예 3의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정 30질량부를 가열혼합하고, 이어, 감압 하에서 수분 2% 미만이 될 때까지 가열농축하며, 여기에 구연산 0.6질량부 및 적량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하고, 통상적인 방법에 따라 성형하여 제품을 얻었다. 본 제품은 씹는 맛, 미감, 풍미 모두 양호하고, 시클로이소말토테트라오스를 함유하기 때문에 자당의 정출(晶出)도 일으키지 않으며, 흡습성이 적고, 드리핑(dripping)도 일으키지 않는 안정적인 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 8
<초코쿠키>
밀가루(박력분) 140질량부, 버터 90질량부, 초콜릿 115질량부, 과립당 360질량부, 홀에그(whole egg) 200질량부, 아몬드 200질량부, 실시예 4의 방법으로 조제한 시클로이소말토테트라오스 함유 분말 30질량부를 사용하여, 통상적인 방법에 의해 초코쿠키를 제조하였다. 본 제품을 실온에서 2주간 저장한 후, 시식한 결과, 흡습이나 건조도 없고, 또한, 시클로이소말토테트라오스가 유지(油脂)의 산화나 분해를 억제하여, 제조 직후의 풍미가 잘 유지되어 있었다.
실시예 9
<유산균 음료>
탈지분유 175질량부, 실시예 4의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 함유 분말 30질량부 및 락토수크로오스 고함유 분말(주식회사 하야시바라 판매, 등록상표 "유과 올리고") 70질량부를 물 1500질량부에 용해시키고, 65℃에서 30분간 살균하여, 40℃로 냉각한 후, 여기에 통상적인 방법에 따라, 유산균 스타터를 30질량부 식균하고, 37℃에서 8시간 배양하여 유산균 음료를 얻었다. 본 제품은 풍미가 양호하고 올리고당, 시클로이소말토테트라오스를 함유하며, 비피더스균을 안정적으로 유지할 뿐만 아니라, 비피더스균 증식촉진작용, 정장 작용을 갖는 유산균 음료로서 적합하다.
실시예 10
<바디 비누>
라우린산 칼륨 15질량부, 미리스틴산 칼륨 5.0질량부, 실시예 4의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 함유 분말 4.0질량부, 프로필렌글리콜 2.0질량부, 폴리에틸렌 분말 0.5질량부, 히드록시프로필 키토산 용액 0.5질량부, 글리신 0.25질량부, 글루타민 0.25질량부, 감광 색소 201호 0.1질량부, 적량의 페놀, pH 조절제, 라벤더수를 적량 첨가한 후, 정제수를 첨가하여 총량을 100질량부로 하고, 통상적인 방법에 의해 유화하여 바디 비누를 조제하였다. 본 제품은 거품이 잘 일어나고 사용감이 뛰어난 바디 비누이다. 또한, 본 제품은 체취 발생의 예방, 가려움증의 예방이나, 혹은 피부 노화의 치료용, 예방용 등에 유리하게 이용가능하다. 또한, 본 제품은 시클로이소말토테트라오스를 함유하기 때문에 보습성이 뛰어날 뿐만 아니라, 피부에 대한 자극성이 낮기 때문에, 과민증을 걱정하지 않고도 이용할 수 있다.
실시예 11
<화장용 크림>
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌글리콜 2질량부, 자기유화형 모노스테아린산 글리세린 5질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정 2질량부, α-글루코실루틴(주식회사 하야시바라 판매, 상품명 "αG 루틴") 1질량부, 유동파라핀 1질량부, 트리옥탄산 글리세린 10질량부 및 방부제 적량을 통상적인 방법에 따라 가열용해시키며, 여기에 L-젖산 2질량부, 1,3-부틸렌글리콜 5질량부 및 정제수 66질량부를 첨가하고, 균질기에 걸어 유화하며, 또한 향료 적량을 첨가하여 교반혼합함으로써, 화장용 크림을 제조하였다. 본 제품은 시클로이소말토테트라오스가 α-글루코실루틴의 항산화능을 안정화하여, 고품질의 자외선 차단제, 피부미용제, 화이트닝제 등으로서 유리하게 이용가능하다.
실시예 12
<크림 치약>
제2인산칼슘 45질량부, 라우릴황산나트륨 1.5질량부, 글리세린 25질량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5질량부, 실시예 3의 방법으로 얻은 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정 10질량부, 사카린 0.02질량부를 물 18질량부와 혼합하여 크림 치약을 얻었다. 본 제품은 계면활성제의 세정력을 저하시키지 않고, 불쾌감을 개량하여 사용 후 느낌도 양호하다.
본 발명에 따르면, 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 신규 당질인 시클로이소말토테트라오스 또는 시클로이소말토테트라오스 함유 당질을, 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 이용하여 제조하여, 제공하는 것이 가능하게 된다. 완전히 신규의 시클로이소말토테트라오스의 제공을 가능하게 하는 본 발명은 음식물, 화장품, 의약품 등 여러 이용분야에 기여하게 되어, 그 산업적 의의는 매우 크다.
도 1에 있어서,
레인 1 : 이소말토올리고당 마커
레인 2 : 이소말토트리오스 표준품
레인 3 : 이소말토테트라오스 표준품
레인 4 : 덱스트란 기질에 미생물 D1110주 유래 조(粗)효소를 작용시켜 얻은 효소반응물
G : 글루코오스
IG2 : 이소말토오스
IG3 : 이소말토트리오스
IG4 : 이소말토테트라오스
I : 미지(未知) 당질
도 4, 도 6 및 도 7에 있어서,
점선은 신호 귀속의 편의를 위해 출원인이 추가한 보조선이다.
1H : D-글루코오스의 1위치 카본에 결합한 프로톤
2H : D-글루코오스의 2위치 카본에 결합한 프로톤
3H : D-글루코오스의 3위치 카본에 결합한 프로톤
4H : D-글루코오스의 4위치 카본에 결합한 프로톤
5H : D-글루코오스의 5위치 카본에 결합한 프로톤
6Ha 및 6Hb : D-글루코오스의 6위치 카본에 결합한 프로톤
도 6 및 도 7에 있어서,
1C : D-글루코오스의 1위치 카본
2C : D-글루코오스의 2위치 카본
3C : D-글루코오스의 3위치 카본
4C : D-글루코오스의 4위치 카본
5C : D-글루코오스의 5위치 카본
6C : D-글루코오스의 6위치 카본
도 10에 있어서,
↓ : 시클로이소말토테트라오스 오함수 결정의 분말 X선 회절도에서의 특징적인 회절 피크
도 19에 있어서,
ORF9038 : 아그레이아 스피시즈 D1110 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자가 코딩하는 아미노산 서열
ORF5328 : 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006 유래 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자가 코딩하는 아미노산 서열
도 20에 있어서,
f1 ori : f1 파지 복제기점
Ampicillin : 암피실린 내성 유전자
pUC ori : pUC 복제기점
PT7 : T7 프로모터
RBS : 리보솜 결합 부위
ATG : 개시 코돈
흑색 화살표 : 시클로이소말토테트라오스 생성효소 유전자
도 21에 있어서,
Dex : 덱스트란
CI-4 : 시클로이소말토테트라오스
도 22에 있어서,
CI-4 : 시클로이소말토테트라오스
A : 시클로이소말토테트라오스 유도체 A
B : 시클로이소말토테트라오스 유도체 B
α-CD : α-시클로덱스트린
β-CD : β-시클로덱스트린
도 23에 있어서,
(A) 유도체 A : 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체;
(B) 유도체 B : 시클로이소말토테트라오스의 디글루코실 유도체;
특허미생물기탁센터 NITEBP-02815 20181108 특허미생물기탁센터 NITEBP-02816 20181108
SEQUENCE LISTING <110> Hayashibara Co., Ltd. <120> Cycloisomaltotetraose, cycloisomaltotetraose-forming enzyme, their preparation and uses <130> 10130502 <160> 12 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 AGAGTTTGAT CATGGCTCAG 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 TACGGTTACC TTGTTACGAC TT 22 <210> 3 <211> 1447 <212> DNA <213> Unknown <400> 3 GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAAC GATGAAGCTC CAGCTTGCTG 60 GGGTGGATTA GTGGCGAACG GGTGAGTAAC ACGTGAGTAA CCTGCCCTTG ACTCTGGGAT 120 AAGCGTTGGA AACGACGTCT AATACCGGAT ATGACGACCG ATGGCATCAT CTGGTTGTGG 180 AAAGAATTTT GGTCAAGGAT GGACTCGCGG CCTATCAGGT AGTTGGTGAG GTAATGGCTC 240 ACCAAGCCTA CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGTGACCG GCCACACTGG GACTGAGACA 300 CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC GAAAGCCTGA 360 TGCAGCAACG CCGCGTGAGG GATGACGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT TAGTAGGGAA 420 GAAGCGAAAG TGACGGTACC TGCAGAAAAA GCACCGGCTA ACTACGTGCC AGCAGCCGCG 480 GTAATACGTA GGGTGCAAGC GTTGTCCGGA ATTATTGGGC GTAAAGAGCT CGTAGGCGGT 540 TTGTCGCGTC TGCTGTGAAA ACTGGAGGCT CAACCTCCAG CCTGCAGTGG GTACGGGCAG 600 ACTAGAGTGC GGTAGGGGAG ATTGGAATTC CTGGTGTAGC GGTGGAATGC GCAGATATCA 660 GGAGGAACAC CGATGGCGAA GGCAGATCTC TGGGCCGTAA CTGACGCTGA GGAGCGAAAG 720 CATGGGGAGC GAACAGGATT AGATACCCTG GTAGTCCATG CCGTAAACGT TGGGAACTAG 780 ATGTAGGGGC CATTCCACGG TTTCTGTGTC GCAGCTAACG CATTAAGTTC CCCGCCTGGG 840 GAGTACGGCC GCAAGGCTAA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGCGGAG 900 CATGCGGATT AATTCGATGC AACGCGAAGA ACCTTACCAA GGCTTGACAT ATACGAGAAC 960 GGGCTAGAAA TAGTCAACTC TTTGGACACT CGTAAACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG 1020 CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTCGT TCTATGTTGC 1080 CAGCACGTTA TGGTGGGAAC TCATAGGAGA CTGCCGGGGT CAACTCGGAG GAAGGTGGGG 1140 ATGACGTCAA ATCATCATGC CCCTTATGTC TTGGGCTTCA CGCATGCTAC AATGGCCGGT 1200 ACAAAGGGCT GCGATACCGT AAGGTGGAGC GAATCCCAAA AAGCCGGTCT CAGTTCGGAT 1260 TGAGGTCTGC AACTCGACCT CATGAAGTCG GAGTCGCTAG TAATCGCAGA TCAGCAACGC 1320 TGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT CAAGTCATGA AAGTCGGTAA 1380 CACCCAACGC CAGTGGCCTA ACCCGTAAGG GAGGGAGCTG TCTAAGGTGG GATCGGTGAT 1440 TAGGACT 1447 <210> 4 <211> 1485 <212> DNA <213> Unknown <400> 4 GAGTTTGATC ATGGCTCAGG ATGAACGCTG GCGGCGTGCT TAACACATGC AAGTCGAACG 60 GTGAAGCCAA GCTTGCTTGG TGGATCAGTG GCGAACGGGT GAGTAACACG TGAGCAACCT 120 GCCCTGGACT CTGGGATAAG CGCTGGAAAC GGCGTCTAAT ACTGGATATG AGCTCTCATC 180 GCATGGTGGG GGTTGGAAAG ATTTTTTGGT CTGGGATGGG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 240 TGGTGAGGTA ATGGCTCACC AAGGCGTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 300 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC 360 AATGGGCGGA AGCCTGATGC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 420 CCTCTTTTAG CAAGGAAGAA GCTTTTGTGA CGGTACTTGC AGAAAAAGCG CCGGCTAACT 480 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG CGCAAGCGTT ATCCGGAATT ATTGGGCGTA 540 AAGAGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCTGC TGTGAAATCC CGAGGCTCAA CCTCGGGCCT 600 GCAGTGGGTA CGGGCAGACT AGAGTGCGGT AGGGGAGATT GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 660 GGAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGA TGGCGAAGGC AGATCTCTGG GCCGTAACTG 720 ACGCTGAGGA GCGAAAGGGT GGGGAGCAAA CAGGCTTAGA TACCCTGGTA GTCCACCCCG 780 TAAACGTTGG GAACTAGTTG TGGGGTCCTT TCCACGGATT CCGTGACGCA GCTAACGCAT 840 TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGAC 900 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC 960 TTGACATACA CGAGAACATC CCAGAAATGG GGGACTCTTT GGACACTCGT GAACAGGTGG 1020 TGCATGGTTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA 1080 CCCTCGTTCT ATGTTGCCAG CACGTAATGG TGGGAACTCA TGGGATACTG CCGGGGTCAA 1140 CTCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGTCTTG GGCTTCACGC 1200 ATGCTACAAT GGCCGGTACA AAGGGCTGCA ATACCGTGAG GTGGAGCGAA TCCCAAAAAG 1260 CCGGTCCCAG TTCGGATTGA GGTCTGCAAC TCGACCTCAT GAAGTCGGAG TCGCTAGTAA 1320 TCGCAGATCA GCAACGCTGC GGTGAATACG TTCCCGGGTC TTGTACACAC CGCCCGTCAA 1380 GTCATGAAAG TCGGTAACAC CTGAAGCCGG TGGCCCAACC CTTGTGGAGG GAGCCGTCGA 1440 AGGTGGGATC GGTAATTAGG ACTAAGTCGT AACAAGGTAA CCGTA 1485 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Agreia sp. <400> 5 Ala Thr Val Gly Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Microbacterium trichothecenolyticum <400> 6 Ala Asp Leu Gly Asp Ala Trp Thr Asp 1 5 <210> 7 <211> 810 <212> PRT <213> Agreia sp. <400> 6 Ala Thr Val Gly Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Pro Gly 1 5 10 15 Gln Gln Val Thr Val Thr Ala Glu Val Asp Gly Ser Gly Pro Val Glu 20 25 30 Phe Ser Leu Val His Leu Gly Glu Thr Val Arg Thr Gly Thr Val Gln 35 40 45 Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Thr Trp Thr Val Thr Pro Pro Thr Thr 50 55 60 Asp Phe Thr Gly Tyr Leu Val His Ala Asp Ala Gly Gly Ser Thr Ala 65 70 75 80 Gln Thr Ala Val Asp Val Ser Ser Thr Trp Thr Arg Phe Pro Arg Met 85 90 95 Gly Tyr Leu Asp Glu Tyr Pro Ala Asp Ser Thr Gln Ala Asp Arg Asp 100 105 110 Ala Ile Val Thr Asp Leu Ala Asn Lys Tyr His Leu Asn Ala Leu Gln 115 120 125 Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Glu Ala Pro Ile Glu Arg Asp Gly 130 135 140 Asn Gly Asp Leu Val Gly Thr Trp Thr Ala Trp Asn Gly Asp Val Ile 145 150 155 160 Ala Pro Ala Thr Val Ser Gly Leu Val Asp Ala Gly His Ala Val Asn 165 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Ala Leu Glu Gly Phe 180 185 190 Gln Ala His Gly Val Asp Ala Asp Trp Arg Leu Lys Tyr Arg Ser Ser 195 200 205 Gly Asp Asp Trp Lys Phe Gln Met Leu Pro Asn Glu Pro Asp Thr Thr 210 215 220 Leu Trp Ile Met Asn Pro Glu Asn Pro Asp Trp Val Ser His Ile Thr 225 230 235 240 Glu Gln Tyr Ala Asp Gln Ile Asp Ala Leu Gly Phe Asp Gly Thr His 245 250 255 Ile Asp Gln Leu Gly Asn Trp Gly Glu Ala Val Asp Gly Gly Met Asp 260 265 270 Asp Val Ala Gly Asp Pro Val Asp Ile Pro Gln Gly Phe Ala Asn Leu 275 280 285 Val Ala Ala Thr Lys Asp Ala Thr Gly Lys Thr Thr Gly Phe Asn Ala 290 295 300 Val Asp Gly Phe Gly Ser Asp Trp Leu Ala Gly Ser Glu Ser Asp Tyr 305 310 315 320 Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Glu Asn His Glu Thr Tyr Ala Gln Val Gln 325 330 335 Asp Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Ala Ala Ser Gly Gly Lys Gly Ala Val 340 345 350 Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Ser Asn Thr Gly Asp Gln Tyr Glu 355 360 365 Ala Glu Ala Gly Val Leu Ala Gly Gly Val Gln Val Asp Ser Asp His 370 375 380 Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Ile Asp Ser Tyr 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His Ala Asp Ala Gly Gly Ser Thr Ala Gln 100 105 110 acc gcc gtc gat gtg tcg agc acc tgg acc cga ttc ccg cga atg ggc 384 Thr Ala Val Asp Val Ser Ser Thr Trp Thr Arg Phe Pro Arg Met Gly 115 120 125 tac ctg gac gag tat ccg gcc gac agc acg cag gcg gat cgc gac gca 432 Tyr Leu Asp Glu Tyr Pro Ala Asp Ser Thr Gln Ala Asp Arg Asp Ala 130 135 140 atc gtg acg gac ctc gcc aac aag tac cac ttg aac gcg ctg cag ttc 480 Ile Val Thr Asp Leu Ala Asn Lys Tyr His Leu Asn Ala Leu Gln Phe 145 150 155 160 tac gac tgg atg tgg cgg cac gaa gct ccc atc gag cgc gac ggc aac 528 Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Glu Ala Pro Ile Glu Arg Asp Gly Asn 165 170 175 ggc gat ctg gtc ggc acc tgg acg gcg tgg aac ggc gat gtg atc gca 576 Gly Asp Leu Val Gly Thr Trp Thr Ala Trp Asn Gly Asp Val Ile Ala 180 185 190 cct gcc acg gtg tcc gga ctc gtt gac gcc ggt cac gcc gtc aac gtg 624 Pro Ala Thr Val Ser Gly Leu Val Asp Ala Gly His Ala Val Asn Val 195 200 205 gcg gca ttg ccg tat tcc atg agc tac gcg gcg ctc gaa gga ttc gaa 672 Ala Ala Leu Pro Tyr Ser Met Ser Tyr Ala Ala Leu Glu Gly Phe Glu 210 215 220 gcc cac ggc gtc gac gcg gat tgg cgg ctg aag tac cgc agt gat tcc 720 Ala His Gly Val Asp Ala Asp Trp Arg Leu Lys Tyr Arg Ser Asp Ser 225 230 235 240 tcc gac tgg aag ttc cag atg ctg cct ggc cgg ccc gac acc aat ctc 768 Ser Asp Trp Lys Phe Gln Met Leu Pro Gly Arg Pro Asp Thr Asn Leu 245 250 255 tgg atc atg aat ccg agc aat ccg gac tgg cga gac cat att tcg gcc 816 Trp Ile Met Asn Pro Ser Asn Pro Asp Trp Arg Asp His Ile Ser Ala 260 265 270 gag tat cag gat cag atc gac acg ttc ggg ttc gac ggc acc cac ctc 864 Glu Tyr Gln Asp Gln Ile Asp Thr Phe Gly Phe Asp Gly Thr His Leu 275 280 285 gat cag ctc ggc aac tgg ggc agc ggg gca tcc gac ggt ggg atg aac 912 Asp Gln Leu Gly Asn Trp Gly Ser Gly Ala Ser Asp Gly Gly Met Asn 290 295 300 gac gtg gcg ggg aat cct gtc gat att ccg gtc ggg ttc cgc gac ctg 960 Asp Val Ala Gly Asn Pro Val Asp Ile Pro Val Gly Phe Arg Asp Leu 305 310 315 320 gtc gcc gaa acc aag gcc gcc acg ggg aag ccc gtc ggc ttc aac gcg 1008 Val Ala Glu Thr Lys Ala Ala Thr Gly Lys Pro Val Gly Phe Asn Ala 325 330 335 gtc gac ggt ttc gcc ggc tcc acc ctg gcg agc tcg agc agt gac tac 1056 Val Asp Gly Phe Ala Gly Ser Thr Leu Ala Ser Ser Ser Ser Asp Tyr 340 345 350 ctc tac acg gaa ctg tgg gag aac cac gaa acc tac tcg gag gtg cag 1104 Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Glu Asn His Glu Thr Tyr Ser Glu Val Gln 355 360 365 agc tac ctg gcc ggc cag cgg gcg gaa tcg gga ggc aag gcg gca gta 1152 Ser Tyr Leu Ala Gly Gln Arg Ala Glu Ser Gly Gly Lys Ala Ala Val 370 375 380 acg gcc gcg tac ctg aac tac cgg agc aac acg ggt gat cgg tac gag 1200 Thr Ala Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Ser Asn Thr Gly Asp Arg Tyr Glu 385 390 395 400 gcg gaa gac gga acc ctc atc ggg gtc cag gtc aac tcc aac cac ccc 1248 Ala Glu Asp Gly Thr Leu Ile Gly Val Gln Val Asn Ser Asn His Pro 405 410 415 ggg tat acg ggt acc ggt ttc gtc gat cag ttc gga gac gtc ggc gac 1296 Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gln Phe Gly Asp Val Gly Asp 420 425 430 agt gtc acg ctg agc gtc acg gtg ccg gag tca cgg cgc tac ggc atc 1344 Ser Val Thr Leu Ser Val Thr Val Pro Glu Ser Arg Arg Tyr Gly Ile 435 440 445 gtc ccc gcc tgg gcc aac gac acg gcg aca acg gcc acc cgc acc gtg 1392 Val Pro Ala Trp Ala Asn Asp Thr Ala Thr Thr Ala Thr Arg Thr Val 450 455 460 cga gtg gac gga gtg ccg gcc gga aag ctg aag atg acg ccg acg ggc 1440 Arg Val Asp Gly Val Pro Ala Gly Lys Leu Lys Met Thr Pro Thr Gly 465 470 475 480 agc tgg gac tcc tgg aac acg gaa gcc ggc ttc ggc act tat ctg tcg 1488 Ser Trp Asp Ser Trp Asn Thr Glu Ala Gly Phe Gly Thr Tyr Leu Ser 485 490 495 gcg ggg agc cac acg atc gag gtg tcc ctg gac gcc gga gat acc ggt 1536 Ala Gly Ser His Thr Ile Glu Val Ser Leu Asp Ala Gly Asp Thr Gly 500 505 510 ttc gcg aac ctc gac agc atc acg ctc ggc acg ttc aac acg cca tcc 1584 Phe Ala Asn Leu Asp Ser Ile Thr Leu Gly Thr Phe Asn Thr Pro Ser 515 520 525 gtt cag ttg gcg aat gct gcg ctc gcg gcg agt ggg gcc agc cat atc 1632 Val Gln Leu Ala Asn Ala Ala Leu Ala Ala Ser Gly Ala Ser His Ile 530 535 540 gag atg ggc cag ggt gat caa atg ctc gtc gcg ccg tac ttc ctg gat 1680 Glu Met Gly Gln Gly Asp Gln Met Leu Val Ala Pro Tyr Phe Leu Asp 545 550 555 560 gat tcc aag cag atg agc acc gaa ctg cag gcg tgg atg gag tcg tac 1728 Asp Ser Lys Gln Met Ser Thr Glu Leu Gln Ala Trp Met Glu Ser Tyr 565 570 575 tac gac gtc atc acg ggc tac gag aac ctg ctg tac ggc ccg act ctc 1776 Tyr Asp Val Ile Thr Gly Tyr Glu Asn Leu Leu Tyr Gly Pro Thr Leu 580 585 590 cgg caa ctg ccc aac gct gtt tcg atc gcg ggg cac acc acg agc acg 1824 Arg Gln Leu Pro Asn Ala Val Ser Ile Ala Gly His Thr Thr Ser Thr 595 600 605 gac ggc acc ggc gac acc atc tgg gcg acg ccc atg cgc aac gac ggc 1872 Asp Gly Thr Gly Asp Thr Ile Trp Ala Thr Pro Met Arg Asn Asp Gly 610 615 620 atg gac gtg ctg cac ctg atc aac ctg gag ggc aac gac ggt cgc tgg 1920 Met Asp Val Leu His Leu Ile Asn Leu Glu Gly Asn Asp Gly Arg Trp 625 630 635 640 cga gaa ccg gcg gca cag gct ccg acg ttg tcg aat ctg ccg gtg aag 1968 Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Thr Leu Ser Asn Leu Pro Val Lys 645 650 655 tac tac ctg gcc gac cgg ccg gtc ccc gcc gac gtc agg atc gcg agt 2016 Tyr Tyr Leu Ala Asp Arg Pro Val Pro Ala Asp Val Arg Ile Ala Ser 660 665 670 ccg gac aac ggc ggc cga tcg agc acg ctg gca ttc aca tcc gga agc 2064 Pro Asp Asn Gly Gly Arg Ser Ser Thr Leu Ala Phe Thr Ser Gly Ser 675 680 685 gac gcg ggc ggg aac tac atc tcc ttc acg gtg ccg gag ctg aag aac 2112 Asp Ala Gly Gly Asn Tyr Ile Ser Phe Thr Val Pro Glu Leu Lys Asn 690 695 700 tgg agc ttc gtc tac ctc gga gac tcc acg agg gga aac ggc aac gtc 2160 Trp Ser Phe Val Tyr Leu Gly Asp Ser Thr Arg Gly Asn Gly Asn Val 705 710 715 720 gtc acc cag gcg agc acg tgc ctc gac gtt gcg ggc ggc aac agc gcc 2208 Val Thr Gln Ala Ser Thr Cys Leu Asp Val Ala Gly Gly Asn Ser Ala 725 730 735 gac gga acg gcc gtt cag gtc tgg aac tgt gcg agc gtt ccg gcc atg 2256 Asp Gly Thr Ala Val Gln Val Trp Asn Cys Ala Ser Val Pro Ala Met 740 745 750 cag tgg acg ttc cag aac aac acg ctg tcg gcg ctc ggc aaa tgc ctg 2304 Gln Trp Thr Phe Gln Asn Asn Thr Leu Ser Ala Leu Gly Lys Cys Leu 755 760 765 gat ctc gtc gcg ggc gga acc gcg gac ggc aca ctc gct cac ctc tgg 2352 Asp Leu Val Ala Gly Gly Thr Ala Asp Gly Thr Leu Ala His Leu Trp 770 775 780 acg tgc tcc gac gtg ccc agt cag acc tgg gag cgt acc ggc cag ggg 2400 Thr Cys Ser Asp Val Pro Ser Gln Thr Trp Glu Arg Thr Gly Gln Gly 785 790 795 800 cag tac ctc aat ccg gcc agc ggc aag tgc ctc gac ctg gtg ggt ggg 2448 Gln Tyr Leu Asn Pro Ala Ser Gly Lys Cys Leu Asp Leu Val Gly Gly 805 810 815 tcg acc gcc aac gga acc aga gct cac ctg tgg agt tgc cac gcg ggt 2496 Ser Thr Ala Asn Gly Thr Arg Ala His Leu Trp Ser Cys His Ala Gly 820 825 830 gcg agc cag aag tgg acg ctg ccc cag 2523 Ala Ser Gln Lys Trp Thr Leu Pro Gln 835 840 <210> 10 <211> 2529 <212> DNA <213> Microbacterium trichothecenolyticum <400> 10 atg cgt tct tcc ccc ttc aga cgc cga ctc acg gcg gtc aca atc gcg 48 Met Arg Ser Ser Pro Phe Arg Arg Arg Leu Thr Ala Val Thr Ile Ala 1 5 10 15 gga ctc gcc gtc gca gga atc atc gtt ccc gcg gct ccc gcc gca gcc 96 Gly Leu Ala Val Ala Gly Ile Ile Val Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala 20 25 30 gcc gac ctc ggc gac gcg tgg acc gac aag gca cgc tac gca ccc ggc 144 Ala Asp Leu Gly Asp Ala Trp Thr Asp Lys Ala Arg Tyr Ala Pro Gly 35 40 45 gag cag gtc acc gtc acc gcc gaa gta tcc ggc acc ggg tcc gtc cag 192 Glu Gln Val Thr Val Thr Ala Glu Val Ser Gly Thr Gly Ser Val Gln 50 55 60 ttc tcc ctg gtg cac ctg gga gac gtg gtg gac acc gga aca gtc acc 240 Phe Ser Leu Val His Leu Gly Asp Val Val Asp Thr Gly Thr Val Thr 65 70 75 80 gcc acc ggc tcg ggg cag gtc aac tgg acg gtg acg ccg ccc gcg aac 288 Ala Thr Gly Ser Gly Gln Val Asn Trp Thr Val Thr Pro Pro Ala Asn 85 90 95 gac ttc acc ggt tac atg gtg cac gtc gat gcc ggg tcc agc acg acg 336 Asp Phe Thr Gly Tyr Met Val His Val Asp Ala Gly Ser Ser Thr Thr 100 105 110 cag acc gct gtc gac gtg tcc agc aac tgg acg cga ttc cct cgc acc 384 Gln Thr Ala Val Asp Val Ser Ser Asn Trp Thr Arg Phe Pro Arg Thr 115 120 125 ggg ttc ctc gac acc tac ccg atc gac ctg gac agc act gaa cag gcc 432 Gly Phe Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Asp Leu Asp Ser Thr Glu Gln Ala 130 135 140 gcc acg gta gac gaa ctg tcc cgc aat tac cac ctg aac tcg cta cag 480 Ala Thr Val Asp Glu Leu Ser Arg Asn Tyr His Leu Asn Ser Leu Gln 145 150 155 160 ttc tac gac tgg atg tgg cgg cac gag aag cct gtg cag cga gag tcg 528 Phe Tyr Asp Trp Met Trp Arg His Glu Lys Pro Val Gln Arg Glu Ser 165 170 175 aac ggg gac ctc gtc gac acc tgg acg gca tgg aac ggc gac gtc atc 576 Asn Gly Asp Leu Val Asp Thr Trp Thr Ala Trp Asn Gly Asp Val Ile 180 185 190 gct ccg gac acc gtg gcc gga ctc atc gac gcc acc cat gac gtg aac 624 Ala Pro Asp Thr Val Ala Gly Leu Ile Asp Ala Thr His Asp Val Asn 195 200 205 gcg gcc gcg ctg ccg tac tcc atg agc tac gca gcg ctg gag ggc ttc 672 Ala Ala Ala Leu Pro Tyr Ser Met Ser Tyr Ala Ala Leu Glu Gly Phe 210 215 220 cag gcg cac ggg gtc gac gcc gac tgg cgg ctc aag tac cgc agc agc 720 Gln Ala His Gly Val Asp Ala Asp Trp Arg Leu Lys Tyr Arg Ser Ser 225 230 235 240 ggg gat gac tgg aaa ttc cag atg ctt ccc aac gag ccc gac acc acc 768 Gly Asp Asp Trp Lys Phe Gln Met Leu Pro Asn Glu Pro Asp Thr Thr 245 250 255 ctg tgg atc atg aac ccc gag aac ccc gac tgg gtc tcc cac atc acc 816 Leu Trp Ile Met Asn Pro Glu Asn Pro Asp Trp Val Ser His Ile Thr 260 265 270 gaa cag tac gcc gac cag atc gac gcg ctc ggg ttc gac ggc acc cac 864 Glu Gln Tyr Ala Asp Gln Ile Asp Ala Leu Gly Phe Asp Gly Thr His 275 280 285 atc gac caa ctc ggg aac tgg ggc gag gca gtg gac ggc ggc atg gac 912 Ile Asp Gln Leu Gly Asn Trp Gly Glu Ala Val Asp Gly Gly Met Asp 290 295 300 gac gtc gcc ggt gac ccc gtc gac atc ccc cag ggc ttc gcg aac ctc 960 Asp Val Ala Gly Asp Pro Val Asp Ile Pro Gln Gly Phe Ala Asn Leu 305 310 315 320 gtc gcg gcg acc aag gac gcc acc ggc aaa acc acc ggg ttc aac gcc 1008 Val Ala Ala Thr Lys Asp Ala Thr Gly Lys Thr Thr Gly Phe Asn Ala 325 330 335 gtc gac gga ttc ggc agc gac tgg ctg gcc ggg tcc gag agc gac tac 1056 Val Asp Gly Phe Gly Ser Asp Trp Leu Ala Gly Ser Glu Ser Asp Tyr 340 345 350 ctc tac acc gag ctg tgg gaa aac cac gaa acc tac gcg cag gtg cag 1104 Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Glu Asn His Glu Thr Tyr Ala Gln Val Gln 355 360 365 gac tac ctc gcc cag cag cgc gca gca tcc ggc ggc aag ggc gcc gtg 1152 Asp Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Ala Ala Ser Gly Gly Lys Gly Ala Val 370 375 380 ctc gcg gcc tac ctg aac tac cgc agc aac acc ggc gac cag tac gaa 1200 Leu Ala Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Ser Asn Thr Gly Asp Gln Tyr Glu 385 390 395 400 gcc gaa gcc gga gtg ctc gcc ggc ggc gtc caa gtg gac tcc gac cac 1248 Ala Glu Ala Gly Val Leu Ala Gly Gly Val Gln Val Asp Ser Asp His 405 410 415 acc ggg tat acc ggt acc ggg ttc atc gac tcc tac ggg gcc agc ggg 1296 Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Ile Asp Ser Tyr Gly Ala Ser Gly 420 425 430 gat gcc gtc acc gtg acg gta gcc gtg ccc gag agc cgc cgc tac gga 1344 Asp Ala Val Thr Val Thr Val Ala Val Pro Glu Ser Arg Arg Tyr Gly 435 440 445 atc gtc ccc cgg tgg acg aat gga acc ggt gcg acg gcg acc cga acc 1392 Ile Val Pro Arg Trp Thr Asn Gly Thr Gly Ala Thr Ala Thr Arg Thr 450 455 460 gtc acc gtg gac ggc acc aac gtg ggg cgc atc aag ctg cct tcc acg 1440 Val Thr Val Asp Gly Thr Asn Val Gly Arg Ile Lys Leu Pro Ser Thr 465 470 475 480 gcc gac tgg gac acc tgg aac atc gaa ggt ggc acg gcc gcg tac ctg 1488 Ala Asp Trp Asp Thr Trp Asn Ile Glu Gly Gly Thr Ala Ala Tyr Leu 485 490 495 acg gcc gga acc cac acc atc acc ctc gcc gtg ggc tcc ggg gac acc 1536 Thr Ala Gly Thr His Thr Ile Thr Leu Ala Val Gly Ser Gly Asp Thr 500 505 510 ggc tac gtc aac ctc gac agc gtc acg ctg ggc act ttc gac aca ccc 1584 Gly Tyr Val Asn Leu Asp Ser Val Thr Leu Gly Thr Phe Asp Thr Pro 515 520 525 tca gta cag ctc gcc aac gcc gcg ttc gcg gcg aac ggg gca tcg cac 1632 Ser Val Gln Leu Ala Asn Ala Ala Phe Ala Ala Asn Gly Ala Ser His 530 535 540 atc gag atg ggc cag ggc gac cag atg ctc gtc gcg ccc tac ttc ctc 1680 Ile Glu Met Gly Gln Gly Asp Gln Met Leu Val Ala Pro Tyr Phe Leu 545 550 555 560 gac gaa acc aag cag atg aac cac gaa ctg caa ggg tgg ttg gag aag 1728 Asp Glu Thr Lys Gln Met Asn His Glu Leu Gln Gly Trp Leu Glu Lys 565 570 575 tac tac gac gtc atc acc ggc tac gag aac ctc ttc tac ggc ccc acc 1776 Tyr Tyr Asp Val Ile Thr Gly Tyr Glu Asn Leu Phe Tyr Gly Pro Thr 580 585 590 ctc cgt cag cta tcg aac gcc gtg acc atc agc ggt caa ccg aca agc 1824 Leu Arg Gln Leu Ser Asn Ala Val Thr Ile Ser Gly Gln Pro Thr Ser 595 600 605 acg gac ggc gct gcg aac acg gtc tgg acc aat gtg atg cgc aac gac 1872 Thr Asp Gly Ala Ala Asn Thr Val Trp Thr Asn Val Met Arg Asn Asp 610 615 620 ggc atc gac gtc atc cat ctc atc aac ttg aag ggc aac aac ggc agc 1920 Gly Ile Asp Val Ile His Leu Ile Asn Leu Lys Gly Asn Asn Gly Ser 625 630 635 640 tgg cgc gac ccg gcc gcg aca cca tcc acc ctc acc aac ctg ccc gtc 1968 Trp Arg Asp Pro Ala Ala Thr Pro Ser Thr Leu Thr Asn Leu Pro Val 645 650 655 aag tac tac ctc ggc gat agc cca gtg cct gca tcc gtg cac gtt gcg 2016 Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Ser Pro Val Pro Ala Ser Val His Val Ala 660 665 670 agc ccc gac cga gac ggc ggc cgt tcc acc gca ctg ccc ttc acc acg 2064 Ser Pro Asp Arg Asp Gly Gly Arg Ser Thr Ala Leu Pro Phe Thr Thr 675 680 685 gga tcg gac gcg aac ggc acg tac ctg agc ttc acc gtg ccc gag ctg 2112 Gly Ser Asp Ala Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Phe Thr Val Pro Glu Leu 690 695 700 aag agc tgg gac ttc gtc tac ctg ggc gat tcc acc gcc ggc aac ggc 2160 Lys Ser Trp Asp Phe Val Tyr Leu Gly Asp Ser Thr Ala Gly Asn Gly 705 710 715 720 aac gtc gtc acc aag gcg agc aag tgc ctc gac gtc gcc ggc gga agt 2208 Asn Val Val Thr Lys Ala Ser Lys Cys Leu Asp Val Ala Gly Gly Ser 725 730 735 gcg gcg aac gga acc gct gtc cag atc tgg gac tgc gcc agc gtg ccc 2256 Ala Ala Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Trp Asp Cys Ala Ser Val Pro 740 745 750 gcc cag gac tgg gac tac gcg ggc gag aag ctc tcc gcg ctg ggc aag 2304 Ala Gln Asp Trp Asp Tyr Ala Gly Glu Lys Leu Ser Ala Leu Gly Lys 755 760 765 tgc ctc gac ctg tat cag ggt ggc acc gcg aac ggg acc ctc gcg cac 2352 Cys Leu Asp Leu Tyr Gln Gly Gly Thr Ala Asn Gly Thr Leu Ala His 770 775 780 ctg tgg gac tgc gcc aac gtg ccc agc cag cag tgg gta cgg acc gcc 2400 Leu Trp Asp Cys Ala Asn Val Pro Ser Gln Gln Trp Val Arg Thr Ala 785 790 795 800 cag tcg cag tac tac aac ccc gcc agc ggc cgg tgc ctc gat acc gtc 2448 Gln Ser Gln Tyr Tyr Asn Pro Ala Ser Gly Arg Cys Leu Asp Thr Val 805 810 815 gga ggt ggt gcg gcg aac ggc acg cgc atc cac ctt tgg gat tgc cac 2496 Gly Gly Gly Ala Ala Asn Gly Thr Arg Ile His Leu Trp Asp Cys His 820 825 830 gcc gga ccc agc cag aaa tgg acg ctg ccg ggc 2529 Ala Gly Pro Ser Gln Lys Trp Thr Leu Pro Gly 835 840 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 GGAGATATAC ATATGGCAAC CGTCGGCGAC GCGTGG 36 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 GCTAGCCATA CCATGCTATT ACTGGGGCAG CGTCCACTTC TG 42

Claims (28)

  1. 4분자의 D-글루코오스가 α-1,6 글루코시드 결합을 통해 환형으로 연결된 구조를 갖는 시클로이소말토테트라오스.
  2. 제1항의 시클로이소말토테트라오스의 결정.
  3. 제2항에 있어서,
    오함수 결정의 형태에 있는 시클로이소말토테트라오스의 결정.
  4. 분말 X선 회절도에서 회절각(2θ) 9.0°, 9.8°, 11.8°, 13.1° 및 19.1°에 특징적인 회절 피크를 갖는 제3항의 오함수 결정의 형태에 있는 시클로이소말토테트라오스의 결정.
  5. 제1항의 시클로이소말토테트라오스 및/또는 제2항의 시클로이소말토테트라오스의 결정과 함께 다른 당질을 포함하여 이루어진 시클로이소말토테트라오스 함유 당질.
  6. 제5항에 있어서,
    형태가 시럽, 분말, 결정 함유 분말 또는 고형물 중 어느 하나인 시클로이소말토테트라오스 함유 당질.
  7. 시클로이소말토테트라오스에 1분자 또는 2분자의 D-글루코오스가 결합된 구조를 갖는 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체.
  8. 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 덱스트란의 부분 분해물에 작용하여, 제1항의 시클로이소말토테트라오스를 생성하는 작용을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  9. 제8항에 있어서,
    하기의 이화학적 성질을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소 :
    (1) 분자량
    SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에서, 86,000±10,000 달톤;
    (2) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응의 조건 하에서, 35 내지 40℃;
    (3) 최적 pH
    40℃, 30분간 반응의 조건 하에서, pH 5.5 내지 6.0;
    (4) 온도 안정성
    pH 6.0, 30분간 유지의 조건 하에서, 40℃까지 안정;
    (5) pH 안정성
    4℃, 16시간 유지의 조건 하에서, pH 5.0 내지 10.0에서 안정.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    서열목록에서 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 아미노산 서열을 N말단 아미노산 서열로서 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열목록에서 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열목록에서 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 그 효소 활성을 유지하는 범위에서 1개 또는 2개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  12. 제11항에 있어서,
    서열목록에서 서열번호 7 또는 8로 표시되는 아미노산 서열에 대해, 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물 유래의 효소인 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  14. 제13항에 있어서,
    미생물이 아그레이아(Agreia)속에 속하는 미생물이거나, 또는 마이크로박테리움(Microbacterium)속에 속하는 미생물인 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  15. 제14항에 있어서,
    아그레이아(Agreia)속에 속하는 미생물이 아그레이아 스피시즈(Agreia sp.) D1110(독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터, 수탁번호 NITE BP-02815) 또는 그 변이주이며, 마이크로박테리움(Microbacterium)속에 속하는 미생물이 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰(Microbacter trichothecenolyticum) D2006(독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터, 수탁번호 NITE BP-02816) 또는 그 변이주인 시클로이소말토테트라오스 생성효소.
  16. 아그레이아 스피시즈 D1110(독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터, 수탁번호 NITE BP-02815) 또는 그 변이주, 또는 마이크로박테리움 트리코테세놀리티쿰 D2006(독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터, 수탁번호 NITE BP-02816) 또는 그 변이주인 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소 생산능을 갖는 미생물.
  17. 제11항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 코딩하는 DNA.
  18. 제17항에 있어서,
    서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열, 또는 서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에 있어서, 코딩하는 효소의 활성을 유지하는 범위에서 1개 또는 2개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열, 또는 그들과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA.
  19. 제18항에 있어서,
    유전자 코드의 축중(縮重)에 기초하여, 코딩할 아미노산 서열을 바꾸지 않고, 서열목록에서 서열번호 9 또는 10으로 표시되는 염기서열에서의 염기 중 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    아그레이아(Agreia)속에 속하는 미생물 또는 마이크로박테리움(Microbacterium)속에 속하는 미생물에서 유래하는 DNA.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 DNA와, 자율복제가능한 벡터를 포함하여 이루어진 복제가능한 재조합 DNA.
  22. 제21항의 재조합 DNA를 적절한 숙주에 도입하여 이루어진 형질전환체.
  23. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 생산능을 갖는 미생물을 영양 배지에서 배양하는 공정과, 얻어지는 배양물로부터 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 채취하는 공정을 포함하여 이루어진, 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 제조방법.
  24. 제22항의 형질전환체를 배양하는 공정과, 배양물로부터 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 채취하는 공정를 포함하여 이루어진, 재조합형 시클로이소말토테트라오스 생성효소의 제조방법.
  25. 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란, 또는 덱스트란의 부분 분해물을 함유하는 용액에, 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 작용시키는 공정을 포함하여 이루어진, 제1항 또는 제2항의 시클로이소말토테트라오스 또는 그 결정, 또는, 제5항 또는 제6항의 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 제조방법.
  26. 전분 또는 전분 부분 분해물에 작용하여, 글루코오스 중합도 4 이상의 α-1,6 글루칸, 덱스트란 또는 α-1,6 글루칸을 부분 구조로서 갖는 당질을 생성하는 효소와, 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항의 시클로이소말토테트라오스 생성효소를 조합하여 전분 또는 전분 부분 분해물을 함유하는 용액에 작용시키는 공정을 포함하여 이루어진, 전분 또는 전분 부분 분해물로부터의 제1항 또는 제2항의 시클로이소말토테트라오스 또는 그 결정, 또는, 제5항 또는 제6항의 시클로이소말토테트라오스 함유 당질의 제조방법.
  27. 제1항 또는 제2항의 시클로이소말토테트라오스 또는 그 결정, 제5항 또는 제6항의 시클로이소말토테트라오스 함유 당질, 또는 제7항의 시클로이소말토테트라오스의 글루코실 유도체와 함께 다른 성분을 포함하여 이루어진 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    음식물, 기호물, 사료, 먹이류, 화장품, 의약품 또는 공업용품인 조성물.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06197783A (ja) 1992-12-28 1994-07-19 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho 新規な環状イソマルトオリゴ糖及びその製造法
WO2001090338A1 (en) 2000-05-22 2001-11-29 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo α-ISOMALTOSYLTRANSFERASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF
JP2004166624A (ja) 2002-11-21 2004-06-17 National Food Research Institute 高分子サイクロデキストラン、その製造方法及びそれに用いる微生物
WO2005021564A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
JP2005192510A (ja) 2004-01-09 2005-07-21 National Food Research Institute サイクロデキストラン高生産微生物とこれを用いたサイクロデキストランの製造法
WO2006035725A1 (ja) 2004-09-27 2006-04-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5823799A (ja) 1981-08-03 1983-02-12 株式会社林原生物化学研究所 高純度マルト−スの製造方法
JPS5872598A (ja) 1981-10-26 1983-04-30 Hayashibara Biochem Lab Inc 高純度イソマルト−スの製造方法
JP3429569B2 (ja) * 1994-08-30 2003-07-22 財団法人野田産業科学研究所 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法
WO2008136331A1 (ja) 2007-04-26 2008-11-13 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo 分岐α－グルカン及びこれを生成するα－グルコシル転移酵素とそれらの製造方法並びに用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06197783A (ja) 1992-12-28 1994-07-19 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho 新規な環状イソマルトオリゴ糖及びその製造法
WO2001090338A1 (en) 2000-05-22 2001-11-29 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo α-ISOMALTOSYLTRANSFERASE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF
JP2004166624A (ja) 2002-11-21 2004-06-17 National Food Research Institute 高分子サイクロデキストラン、その製造方法及びそれに用いる微生物
WO2005021564A1 (ja) 2003-08-28 2005-03-10 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途
JP2005192510A (ja) 2004-01-09 2005-07-21 National Food Research Institute サイクロデキストラン高生産微生物とこれを用いたサイクロデキストランの製造法
WO2006035725A1 (ja) 2004-09-27 2006-04-06 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo イソサイクロマルトオリゴ糖及びイソサイクロマルトオリゴ糖生成酵素とそれらの製造方法並びに用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리(Biosci. Biotech. Biochem.) 제57권, 1225-1227 페이지(1993년)
바이오사이언스 바이오테크놀로지 바이오케미스트리(Biosci. Biotech. Biochem.) 제72권, 3277-3280 페이지(2008년)
저널 오브 아메리칸 케미컬 소사이어티(Journal of American Chemical Society), 미국, 1949년, 제71권, 353 내지 358 페이지

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