KR100932810B1 - 이소말토오스 및 이소말티톨의 제조방법과 그것들의 용도 - Google Patents

이소말토오스 및 이소말티톨의 제조방법과 그것들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소말토오스 및 이소말티톨의 신규의 제조방법과 그것들의 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, 특정한 미생물 유래의 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서 이소말토오스를 제조하는 방법, 이 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말토오스를 이용해서 이소말티톨을 제조하는 방법, 이들 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말토오스 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질, 및 그것들의 용도를 확립함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다.

Description

이소말토오스 및 이소말티톨의 제조방법과 그것들의 용도 {PROCESSES FOR PRODUCING ISOMALTOSE AND ISOMALTITOL AND USE THEREOF}
본 발명은, 이소말토오스 및 이소말티톨의 신규의 제조방법과 그것들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가지는 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터 이소말토오스 및/또는 이소말티톨을 고수율로 얻기 위한 제조방법과 그것들의 용도에 관한 것이다.
이소말토오스는, 천연계에 있어서는 발효식품 등에 미량 존재하는 것에 불과한 희소 당질이고, 공업적으로는 산촉매를 이용하는 덱스트란의 부분 가수분해 반응, 덱스트라나아제나 이소말토덱스트라나아제 등을 이용하는 효소반응, 글루코오스로부터의 글루코아밀라아제 또는 산촉매를 이용하는 역합성 반응, 말토오스 또는 말토덱스트린으로부터의 α-글루코시다아제를 이용하는 글루코오스 당전이 반응 등에 의한 제조방법이 알려져 있다.
그러나, 종래법에 의해 얻게 되는 반응액 중의 이소말토오스 함유량은, 고형물당 약 10 내지 약 25％（w/w)(이하, 본 명세서에 있어서는, 별달리 명시하지 않는 한,「％（w/w)」을 간단히 「％」로 약기한다.) 정도에 지나지 않아 이소말토오스의 공업적 제조방법으로서는 순도가 낮으므로, 도저히 만족할만한 것이 아니었다.
이 문제점을 개선하는 방법으로서, 예를 들면, 일본국 특개소58-72598호 공보에 개시된 칼럼 크로마토그래피가 있다. 이 방법에 의하면, 고형물당, 이소말토오스 함유량이 약 10 내지 약 25％의 원료 당액으로부터 고순도 이소말토오스를 얻을 수 있다. 그러나 이 이소말토오스의 제조방법에 있어서도, 얻게 되는 이소말토오스의 순도와 수율은 원료 당액 중의 이소말토오스 함유량에 의존하지 않을 수 없다는 문제점이 있었다.
이와 같은 상황하에, 이소말토오스를 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있는 신규의 제조방법의 확립이 크게 기대되고 있었다.
또한, 이소말티톨은 비환원성으로서 저감미(低甘味)의 보습성을 가진 당 알코올이며, 종래, 소르비톨, 말티톨, 글루코실-1,6-만니톨 등과의 혼합 당질로 하여 각종 식품, 화장품, 의약품 등에 폭넓게 사용되고 있는 유용한 당 알코올이다.
이소말티톨은, 이론적으로는 환원성 올리고당인 이소말토오스 또는 파라티노오스의 환원기를 수소첨가(환원 반응)해서 알코올기화함으로써 생성할 수 있다. 특히, 이소말티톨은 이소말토오스로부터 고수율로 얻을 수 있지만, 원료로서 이용하는 이소말토오스의 공업적 공급에는 난점이 있었다. 이소말토오스는 산촉매를 이용하는 덱스트란의 부분 가수분해 반응, 덱스트라나아제나 이소말토덱스트라나아제 등을 이용하는 효소반응, 글루코오스로부터의 글루코아밀라아제 또는 산촉매를 이용하는 역합성 반응, 말토오스 또는 말토덱스트린으로부터의 α-글루코시다아제를 이용하는 글루코오스 당전이 반응 등에 의해 얻게 되는 것이 알려져 있다. 그러나 종래법에 의해 얻게 되는 반응액 중의 이소말토오스 함유량은, 고형물당 약 10 내지 약 25％（w/w)(이하, 본 명세서에 있어서는, 별달리 명시하지 않는 한, 「％（w/w)」을 간단히 「％」로 약기한다.) 정도에 지나지 않아, 이것을 수소첨가해서 얻게 되는 이소말티톨의 순도는 낮으므로 이소말티톨의 공업적 제조방법으로서는 만족할 수 있는 것이 아니었다.
이 문제점을 개선하는 방법으로서, 예를 들면, 일본국 특개소58-72598호 공보에는, 칼럼 크로마토그래피에 의하면, 고형물당의 이소말토오스 함유량이 약 10 내지 약 25％인 비교적 저함유량의 원료 당액으로부터 고순도 이소말토오스를 얻을 수 있고, 이것을 수소첨가함으로써 이소말티톨을 제조할 수 있다. 그러나 이 이소말티톨의 제조방법에 있어서도, 얻게 되는 이소말토오스의 수율 및 제조 코스트는 원료 당액 중의 이소말토오스 함유량에 의존하므로, 저수율, 높은 제조 코스트로 얻을 수 밖에 없다는 결점이 있었다.
한편, 파라티노오스로부터 이소말티톨을 제조할 경우, 원료로서의 이소말토오스의 공급에 관하여, 파라티노오스는 수크로오스로부터 α-글루코실트란스페라아제를 사용해서 글루코오스 당전이 반응 등에 의해 얻게 되는 것이 알려져 있다. 그러나 얻게 되는 반응액 중에는 이성체로서의 트레할로오스나 가수 분해물로서의 글루코오스, 프룩토오스 등이 부생하고, 파라티노오스 함량은 고형물당 약 85％에 머무른다. 더욱이, 파라티노오스로부터 이소말티톨을 제조할 경우, 이소말티톨과 함께 글루코실-1,6-만니톨이 생성하고, 양자의 생성 중량비는 통상, 1:1이며, 결과적으로, 이소말티톨의 순도, 수율이 낮아진다라는 결점이 있었다.
이와 같은 상황하에, 이소말티톨을 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있는 신규의 제조방법의 확립이 크게 기대되고 있었다.
본 발명은, 이와 같은 종래기술을 감안하여, 이소말토오스 및 이소말티톨을 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있는 이들의 제조방법과 용도를 확립하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은, 이소말토오스 및 이소말티톨을 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있는 이들의 제조방법, 이소말토오스 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질, 및 이들의 용도를 확립하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하는 것을 목적으로 하여 예의 연구하는 중에 『European Journa1 of Biochemistry』, 제226권, 641 내지 648 페이지(1994년)에서, 주로 4개의 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합에 의해 교대로 결합한 구조를 가진 알테르난(alternan)에 가수분해 효소 알테르나나아제(alternanase)를 작용시켜서 얻게 되는, 분자 내에 이소말토오스 구조를 가진 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 4당류(이하, 『환상 4당』이라고 약기할 경우도 있음.)가 보고되었다.
한편, 본 발명자들은, 먼저 일본국 특허출원2000-229557호 명세서(국제공개 번호 제WOO1/90338호)에 개시한 바와 같이, 파노오스 등의 전분 유래의 당질로부터 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이 효소를 사용하는 환상 4당의 제조방법을 확립함과 아울러, 일본국 특허출원2000-234937호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/10361호)에 있어서는, α-이소말토실 전이효소와 말토올리고당 등으로부터 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 원료에 작용시켜서 환상 4당을 효율적으로 제조하는 방법을 확립하였다. 더욱이, 본 발명자들은, 일본국 특허출원2001-130922호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/088374호)에 개시한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와, 이소말토오스를 유리하는 작용을 가진 이소말토오스 유리 효소를 전분원료에 작용시켜서 이소말토오스를 고수율로 제조하는 방법을 확립하였다.
그 후, 본 발명자들은, 상기 이소말토오스의 제조방법에 사용할 수 있는 α-이소말토실글루코 당질 및 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 새롭게 발견하고, 이들 효소를 이용함으로써 이소말토오스를 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있는 것을 발견하였다.
더욱이, 본 발명자들은 이소말토오스로부터 이소말티톨을 제조하는 방법에 대해서도 연구하였다. 즉, 본 발명자들은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 효소반응 메커니즘에 대해서 연구한 결과, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가지는 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와, 이소말토오스를 유리하는 작용을 가지는 이소말토오스 유리 효소를 작용시키면, 이소말토오스의 생성 수율이 비약적으로 향상하고, 얻게 되는 이소말토오스를 수소첨가함으로써 이소말티톨을 고수율로 얻게 되는 것, 게다가, 공업적으로 용이하게 실시할 수 있는 것을 발견하였다.
더욱이, 본 발명자들은, 이와 같은 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말티톨의 용도도 확립해서 본 발명을 완성하였다. 구체적으로는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가지는 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, PCT/JPOl/06412호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/10361호)에 개시된 바실루스 글로비스포루스(Bacillus g1obisporus) N75(FERM BP-7591)(이하, 간단히 「N75주」라 할 경우도 있음.) 및/또는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) A19(FERM BP-7590)(이하, 간단히 「A19주」라고 할 경우도 있음.) 유래의 α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 및 PCT/JPO1/06412호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/10361호)에 개시된 아르드로박터 라모서스(Arthrobacter ramosus) S1(FERM BP-7592)(이하, 간단히 「S1주」라 할 경우도 있음.) 유래의 1종 또는 2종 이상의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가지는 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 이소말토오스의 제조방법, 이소말토오스 함유 혼합 당질, 및 그 용도를 확립함으로써 본 발명의 과제를 해결하였다. 더욱이, 상기 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591)는, 본 출원인이 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁되어 있다. 또한, 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590)는, 본 출원인이 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁되어 있다. 더욱이, 아르드로박터 라모서스 S1(FERM BP-7592)은, 본 출원인이 2001년 5월 16일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁되어 있다.
또한, 본 발명자들은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가지는 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질 및/또는 환상 4당을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시켜, 이것을 그대로 또는 이소말토오스를 채취한 후에 수소첨가해서 이소말티톨을 생성시키며, 이 생성한 이소말티톨을 채취하는 이소말티톨의 제조방법, 이소말티톨 함유 혼합 당질, 및 그 용도를 확립함으로써 본 발명의 과제를 해결하였다.
도 1은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 당질을 고속 액체 크로마토그래피 처리했을 때의 용출 패턴을 나타내는 도면.
도 2는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼( 1 H-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 3은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소 반응에 의해 얻어진 환상 4당의 핵자기 공명 스펙트럼(13C-NMR 스펙트럼)을 나타내는 도면.
도 4는 환상 4당의 구조가, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것을 나타내는 도면.
도 5는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 6은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 7은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 8은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 9는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 10은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 11은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 12는 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 13은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 14는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 15는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 16은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 17은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 18은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 19는 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 20은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 21은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 22는 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 23은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 24는 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 25는 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 26은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 27은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 28은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 29는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 30은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 31은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 32는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 33은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 34는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 35는 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 36은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 37은 재조합 DNA의 『pAGA4』의 제한효소 지도를 나타내는 도면. 도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 폴리펩티드를 코드하는 DNA.
도 38은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면.
도 39는 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 효소활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면.
도 40은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 온도 안정성을 나타내는 도면.
도 41은 아르드로박터 라모서스 S1 유래의 α-이소말토실 전이효소의 pH 안정성을 나타내는 도면.
도 42는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실 말토트리오스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 43은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실 말토테트라오스의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 44는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실 말토트리오스의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 45는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 반응에 의해 얻어진 α-이소말토실 말토테트라오스의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 46은 생성물 A의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 47은 생성물 A의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 48은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 결정 이소말티톨의 분말 X선 회절도를 나타내는 도면.
도 49는 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 결정 이소말티톨의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
도 50은 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 결정 이소말티톨의 13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명에서 사용하는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소라 함은, 전분질로부터 α-이소말토실글루코오스(별명, 파노오스), α-이소말토실말토오스, α-이소말토실말토트리오스, α-이소말토실테트라오스 등의 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 효소를 의미하고, 구체적으로는, PCT/JPOl/06412호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/10361호)에 개시된 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C9(FERM BP-7143)(이하, 간단히 「C9주」라 할 경우도 있음.), 바실루스 글로비스포루스(Bacillus globisporus) C11(FERM BP-7144)(이하, 간단히 「C11주」라고 할 경우도 있음.), 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 및 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 더욱이는, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/055708호)에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 가진 폴리펩티드 등을 예시할 수 있다. 이들 효소 중에서, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 및 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 본 발명에 있어서는 가장 적절하게 이용할 수 있다. 한편, 상기 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)는, 본 출원인이 2000년 4월 25일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소(현재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소) 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁되어 있다. 또한, 상기 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144)은, 본 출원인이 2000년 4월 25일자로 일본 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1, 중앙 제6소재의 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소(현재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소) 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하여 수탁되어 있다.
본 발명에 의한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소(본원 발명에 있어서는 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 가진 효소 또는 폴리펩티드를 「α-이소말토실글루코 당질 생성효소」라고 총칭한다.)는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하고, 덱스트란 생성능을 가지지 않으며, EDTA에 의해 활성이 저해되는 효소인데, 상세하게는, 아래의 이화학적 성질을 가진 효소이다. 그리고 상기 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로서는, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 예시할 수 있다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이 함으로써 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코시드 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성한다.
(2) 분자량
SDS -겔 전기 영동법에 의해, 약 74,000 내지 160,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해, pI 약 3.8 내지 7.8의 범위내에서 등전점을 가진다.
(4) 최적 온도
pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40 내지 50℃의 범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 6.0, 60분간 반응에서, 1mM Ca2+ 존재하, 약 45 내지 55℃의 범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 8.4, 60분간 반응에서, 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는
pH 8.4, 60분간 반응에서 1mM Ca2+ 존재하, 65℃에서 최적 온도를 가진다.
(5) 최적 pH
35℃, 60 분간 반응에서, pH 약 6.0 내지 8.4의 범위내에서 최적 pH를 가진다.
pH 8.4, 60분간 반응에서, 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는,
pH 8.4, 60분간 반응에서 1mM Ca2+ 존재하, 65℃에서 최적 온도를 가진다.
(6) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mM Ca2+ 존재하, 약 50℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 약 55℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다. 또는, pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mM Ca2+ 존재하, 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
(7) pH 안정성
4℃, 24시간 유지하는 조건에서, pH 약 4.5 내지 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
(8) N 말단 아미노산 서열
티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신, 히스티딘-발린-세린-알라닌-로이신-글리신-아스파라긴-로이신―로이신, 또는 알라닌-프롤린-로이신-글리신-발린-글루타민-아르기닌-알라닌-글루타민-페닐알라닌-글루타민-세린-글리신을 가질 경우가 있다.
그리고 본 발명에서 사용하는 α-이소말토실 전이효소라 함은, 파노오스나 이소말토실말토오스와 같은 α-이소말토실글루코 당질로부터 환상 4당을 생성하는 효소를 의미하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143), 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144), 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 및 아르드로박터 라모서스 S1(FERM BP-7592) 유래의 α-이소말토실 전이효소, 더욱이는, PCT/JPOl/10044호 명세서(국제공개 번호 제WO02/40659호)에 개시된 유전자 재조합형 α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 폴리펩티드 등(본원 발명에 있어서는, α-이소말토실 전이효소 활성을 가진 효소 또는 폴리펩티드를 「α-이소말토실 전이효소」로 총칭한다.)을 예시할 수 있다. 이들 효소 중에서, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 및 아르드로박터 라모서스 S1(FERM BP-7592) 유래의 α-이소말토실 전이효소는 본 발명에 있어서는 가장 적절하게 이용할 수 있다. 이들 본 발명에 관계되는 α-이소말토실 전이효소의 이화학적 성질을 나타내면 아래와 같다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질로부터, α-이소말토실 전이를 포함하는 반응에 의해 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성한다.
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에 의해, 약 82,000 달톤 내지 약 136,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해, pI 약 3.7 내지 약 8.3의 범위내에서 등전점을 가진다.
(4) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응의 조건하에서, 약 45℃ 내지 약 50℃의 범위내에서 최적 온도를 가진다.
(5) 최적 pH
35℃, 30분간 반응의 조건하에서, pH 약 5.5 내지 약 6.5의 범위내에서 최적 pH를 가진다.
(6) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 약 45℃ 이하에서 안정 온도영역을 가진 다.
(7) pH 안정성
4℃, 24시간 유지하는 조건에서, pH 약 3.6 내지 약 lO.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
(8) N 말단 아미노산 서열
이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린, 또는, 아스파라긴산-트레오닌-로이신-세린-글리신-발린-페닐알라닌-히스티딘-글리신-프롤린을 가질 경우가 있다.
더욱이, 본 발명에서 사용하는 이소말토오스 유리 효소는, α-이소말토실글루코 당질이나 환상 4당으로부터 이소말토오스를 유리하는 작용을 가진 효소를 의미하고, 예를 들면, 『JournaI of Biochemistry), 제75권, 105 내지 112 페이지(1974년)에 보고되어 있는 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis) T6(NRRL B-4425), 동경대학 응용 미생물 연구소에서 분양 제공되는, 아르드로박터 글로비포르미스(Arthrobacter globiformis)(IAM 12103), 및 『카보하이드레이트 리서치(Carbohydrate Research)』, 제89권, 289 내지 299 페이지(1981년)에 보고되어 있는, 악티노마듀라(Actinomadura) R1O(NRRL B-11411) 등의 미생물 유래의 이소말토덱스트라나아제(EC3.2.1.94)를 예시할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질이라 함은, 예를 들면, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 의미한다. 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분 등의 원료전분으로서는, 옥수수 전분, 쌀 전분, 밀 전분 등의 지상 전분, 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분 등의 지하 전분 및 그것들의 부분 가수 분해물(전분 부분 분해물) 등을 예시할 수 있다. 이 전분 부분 분해물은, 통상, 상기한 지상 내지 지하 전분을 물에 현탁하고, 통상, 농도 10％ 이상, 보다 바람직하게는 15％ 내지 65％, 더욱이 바람직하게는 20％ 내지 50％의 전분유(澱粉乳)로 하고, 이것을 가열해서 액화하거나, 또는 상기한 지상 내지 지하 전분을 산제(酸劑) 혹은 효소제에 의해 액화해서 얻을 수 있다. 액화의 정도는 비교적 낮게 설정하는 것이 좋고, 통상, DE 15 미만, 바람직하게는 DE lO 미만, 보다 바람직하게는 DE 9 내지 0.1의 범위로 한다. 산제로써 액화할 경우에는, 예를 들면, 염산, 인산, 옥살산 등의 산제에 의해 액화한 후, 통상, 탄산 칼슘, 산화 칼슘, 탄산 나트륨 등의 1종 또는 2종 이상의 알칼리제를 사용해서 소망의 pH로 중화하는 방법을 채용한다. 효소제로 액화할 경우에는, α-아밀라아제, 특히, 내열성의 액화형 α-아밀라아제가 본 발명에서는 적절하게 이용할 수 있다. 이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질 및/또는 환상 4당을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시켜, 이 생성한 이소말토오스를 채취함으로써 이소말토오스를 고수율로 얻을 수 있다. 또한, α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시킬 때에, α-이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제(이하, 『CGTase』로 약기함.), α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 전분 지절(枝切) 효소(이소아밀라아제, 풀룰라나아제 등)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시키거나, 또는 α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시킨 후에, α-이소말토실 전이효소, CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 작용시킴으로써 이소말토오스를 보다 고수율로 제조할 수 있다. 특히, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실 전이효소의 존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서 얻게 되는 환상 4당에 이소말토오스 유리 효소를 작용시킬 경우, 환상 4당으로부터의 이소말토오스 생성 수율을 최대 100％까지 향상시키는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 복수의 효소를 사용할 경우의 순서는, 이소말토오스의 생성 수율, 반응 시간, 반응 조건 등을 감안하면서 설정하면 좋고, 복수의 효소를 동시에 작용시키는 것도, 또한, 이들 효소의 필요량을 수회로 나누고, 다른 타이밍에서 작용시키는 것도 가능하다. 본 발명에서 사용하는 효소를 작용시킬 때의 pH는 각 효소가 그들의 효소활성을 발휘할 수 있는 pH이면 좋은데, 통상, pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 9의 범위로부터 선택된다. 또한, 효소를 작용시킬 때의 온도는, 통상, 10 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 70℃의 범위로부터 선택된다. 효소량은, 각 효소의 반응 조건, 반응 시간을 고려해서 적당히 증감하면 좋은데, 통상, 기질 고형물 그램당, α-이소말토실 전이효소 및 α-이소말토실글루코 당질 생성 효소는 각각 0.01 내지 100 단위의 범위로부터, 이소말토오스 유리 효소 및 전분 지절 효소는 각각 1 내지 10,000 단위의 범위로부터, 그리고 CGTase, α-글루코시다아제, 글루코아밀라아제 및 이소아밀라아제는 0.05 내지 7,000 단위의 범위로부터 적당히 선택해서 사용한다. 또한, 이용하는 효소반응 시간은 효소량에 의존하지만, 이소말토스의 생성 수율을 감안하면서 적당히 선택하면 좋은데, 통상, 1 내지 200시간, 바람직하게는 5 내지 150시간, 10 내지 100시간에서 전체 효소반응을 완결하도록 설정한다. 그리고 각각의 효소반응시의 pH 및 온도는, 본 발명에 있어서의 효소반응이 완료할 때까지의 공정에서 적당히 변경하는 것도 가능하다.
이렇게 하여 얻게 되는 효소 반응액 중의 이소말토오스 함유량은, 고형물당, 통상, 30％ 이상, 바람직하게는 40％ 이상, 보다 바람직하게는 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 최대 99％ 이상이나 된다. 특히, 이들 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, α-이소말토실글루코 당질 생성효소, α-이소말토실 전이효소 및 이소말토오스 유리 효소를 동시 또는 이 순서로 첨가할 때에는, 고형물당의 이소말토오스 함유율이 50％ 이상인 효소 반응액을 용이하게 얻을 수 있다. 이 효소 반응액은, 통상, 여과, 원심분리 등의 통상적인 방법에 의해 효소 반응액 중의 불용물을 제거하고, 이어서, 활성탄에 의해 탈색하고, H형, OH형 이온교환 수지 등으로 탈염하여 정제하고, 농축해서 시럽상물로 하거나, 다시, 이것을 건조해서 고상물 또는 분말상물로 한다. 필요하면, 더욱이, 예를 들면, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기용매를 이용하는 분별, 막분리법 등의 1종 또는 2종 이상을 적당히 조합해서 정제하여 이소말토오스 고함유물로 하는 것도 가능하다. 특히, 이소말토오스 고함유물의 공업적 대량 제조방법으로서는 이온교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피가 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면, 일본국 특개소58-23799호 공보 및 일본국 특개소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는, 술폰기를 결합한 스티렌-디비닐벤젠 가교 공중합체 수지의 Na+형 등의 알칼리 금속형, 및 Ca2+형, Mg2+형 등의 알칼리 토류 금속형의 1종 또는 2종 이상의 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 이온교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의할 때에는, 이소말토오스 고함유물을 공업적으로 고수율로 대량으로, 용이하고도 저렴하게 제조할 수 있다. 상기 강산성 캐타이온 교환 수지의 시판품으로서는, 예를 들면, Dow 케미칼사제의 상품명 『Dowex 50WX2』, 『Dowex 50WX4』 및 『Dowex 50WX8』, 롬·앤드·하스사제의 상품명 『AmberliteCG-120』, 東京有機化學 공업사제의 상품명 『XT-1022E』, 三菱化成 공업사제의 상품명 『Diaion SK1B』, 『Diaion SKlO2』 및 『Diaion SKlO4』등을 예시할 수 있다. 상기 이온교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 있어서는 고정상(固定床) 방식, 이동상 방식, 의사 이동상 방식 중에서 어느 방식을 채용하는 것도 가능하다. 이와 같은 방법에 의하면, 이소말토오스의 고형물당의 순도를, 통상, 60％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 99％ 이상의 최고 순도까지 고수율로 향상시키는 것이 가능하다. 그리고 최고 순도의 이소말토오스 이외의 이소말토오스로서의 이소말토오스 고함유물은, 통상, 이소말토오스와 함께, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 기타의 전분 부분 가수 분해물, α-이소말토실글루코 당질, 환상 4당, 및 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-글루코오스(이하, 『개환(開環) 4당』으로 약칭할 경우도 있음.)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을, 고형물당 합계, 통상, 1 내지 60％ 함유하고 있다. 또한, 이소말토오스를 수소첨가해서 이소말티톨을 공업적으로 제조할 경우에는, 필요에 따라서, 상기 H형, OH형 이온교환 수지 등에 의한 탈염, 정제를 생략할 수 있다.
이렇게 하여 얻게 되는 이소말토오스 또는 이소말토오스 함유물을 환원 촉매하에서 수소첨가 함으로써 이소말티톨 또는 이소말티톨 함유물을 고수율로 얻을 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 농도 40 내지 60％의 이소말토오스 수용액에 라네이 니켈 촉매를 첨가하여 이것을 내압성 용기 속에 넣고, 이 용기 속으로 수소를 충전하여 가압하고, 온도 100 내지 120℃에서 수소가 소비되지 않게 될 때까지 교반해서 수소첨가한다. 이 때, 이소말토오스는 이소말티톨로 환원됨과 아울러 이소말토오스 함유물중에 함유되는 환원성 당질, 예를 들면, 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 기타의 환원성 전분 부분 가수 분해물, 환원성 α-이소말토실글루코 당질, 및 개환 4당도 동시에 환원되어 당 알코올이 된다. 더욱이 환상 4당은 비환원성 당질이며, 수소첨가해도 변화는 받지 않는다. 얻어진 이소말티톨 용액을 라네이 니켈 촉매와 분리하고, 통상적인 방법에 따라서 활성탄에 의해 탈색하고, H형, OH형 이온교환 수지 등으로 탈염하고, 정제하여 농축해서 시럽상물로 하거나, 다시, 이것을 건조해서 분말상물로 한다. 필요하면, 더욱이, 예를 들면, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 결정화, 알코올 및 아세톤 등 유기용매를 이용하는 분별, 막분리법 등의 1종 또는 2종 이상의 방법을 적당히 조합해서 정제하여 이소말티톨 함유 혼합 당질로 하는 것도 가능하다. 이소말티톨의 결정화 방법은, 통상, 온도 40 내지 95℃의 이소말티톨 과포화 용액을 조정관(助晶罐)에 취하고, 여기에 종정을, 통상, 0.1 내지 20％의 비율로 첨가하고, 천천히 교반하면서 서냉하여 결정석출을 촉진해서 매스키트로 한다. 이어서, 분밀(分蜜) 방법, 블록 분쇄 방법, 유동 조립(造粒) 방법, 분무건조 방법 등의 공지의 방법에 의해 이 매스키트로부터 분말상 결정 이소말티톨(통상, 무수결정 이소말티톨)을 얻을 수 있다. 예를 들면, 분밀 방법은, 통상, 매스키트를 바스켓형 원심분리기에 의해 결정 이소말티톨과 꿀을 분리하는 방법이고, 필요에 따라서, 이 결정에 소량의 냉수를 스프레이하여 세정하는 것도 용이해서, 보다 고순도의 비흡습성 결정 이소말티톨을 제조하는데 바람직하다. 기타의 세가지 방법은, 꿀을 분리하지 않으므로, 얻게 되는 꿀함유 결정 중의 이소말티톨 순도의 향상은 나타나지 않지만, 생성 수득량이 많은 특징을 가지고 있다. 따라서, 이러한 제품의 경우에는, 결정 이소말티톨 이외에, 통상, 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨, 말토테트라이톨, 기타의 전분 부분 가수 분해물에서 유래하는 당 알코올, α-이소말토실글루코 당질에서 유래하는 당 알코올, 환상 4당, 및 α-글루코실-(1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-소르비톨(이하, 『환원 개환 4당』으로 약칭할 경우도 있다.)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질이 함유되어 있다. 분무건조의 경우에는, 통상, 농도 70 내지 85％, 결정 석출율 25 내지 60 정도의 매스키트를 고압 펌프에서 노즐로부터 분무하여 결정 분말이 용융하지 않는 온도, 예를 들면, 60 내지 100℃의 온풍에서 건조하고, 이어서, 30 내지 60℃의 온풍으로 약 1 내지 20시간 숙성하면, 비흡습성 내지 난(難)흡습성의 함밀(含蜜) 결정을 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 블록 분쇄 방법은, 통상, 농도 85 내지 95％, 결정 석출율 10 내지 60％ 정도의 매스키트를 0.5 내지 5일간 정치(靜置)해서 전체를 블록상으로 결정석출 고화시키고, 이것을 파쇄 또는 절삭 등의 방법에 의해 분쇄하고, 건조하면, 비흡습성 내지 난흡습성의 함밀 결정을 용이하게 제조할 수 있다.
이와 같은 결정석출 방법에 의하면, 이소말티톨의 고형물당의 순도가, 통상, 40％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 99％ 이상의 이소말티톨을 고수율로 얻을 수 있다. 또한, 이소말티톨과 함께, 통상, 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨, 말토테트라이톨, 기타의 전분 부분 가수 분해물에서 유래하는 당 알코올, α-이소말토실글루코 당질에서 유래하는 당 알코올, 환상 4당, 및 환원 개환 4당으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을, 고형물당 합계, 통상, 70％ 이하, 바람직하게는 60％ 이하, 바람직하게는 1 내지 50％ 함유하는 이소말티톨 함유 혼합 당질을 용이하게 얻을 수 있다.
이상 설명한 이소말티톨 함유 혼합 당질 중에서, 이소말티톨과 함께 환상 4당, 환원 개환 4당, 소르비톨, 말티톨, 말토트리이톨, 말토테트라이톨, 기타의 전분 부분 가수 분해물에서 유래하는 당 알코올, α-이소말토실글루코 당질에서 유래하는 당 알코올로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 함유하는 이소말티톨 함유 혼합 당질은 신규의 조성물이다. 본 발명의 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말티톨 및 이소말티톨 함유 혼합 당질의 형태로서는, 액상, 페이스트상, 시럽상, 입상, 분말상, 고체상 또는 분말상 등의 여러가지 형태를 예시할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 얻게 되는 이소말토오스, 이소말티톨, 이소말토오스 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질, 및 결정 이소말티톨(이하, 간단히 「본 발명의 당질」이라고 총칭할 경우도 있다.)은 양질이고 상품의 단 맛을 가짐과 아울러, 이렇게 하여 얻게 되는 본 발명의 당질은 양질이고 상품의 단 맛을 가짐과 아울러, 충치의 원인의 하나인 충치균에 의한 산(酸) 생성이 일어나기 어려운 성질을 가지고 있어, 충치를 일으키기 어려운 감미료로서 적절하게 이용된다. 또한, 본 발명의 당질은, 이소말토오스 및 이소말티톨의 순도에 의해 다소 변동하나, 실질적으로 비흡습성 내지 난흡습성이고, 양호한 유동성을 가지며, 점착, 고착의 우려도 없으며, 비환원성이기 때문에, 그 자체, 보존 안정성이 우수할 뿐만 아니라, 아미노산, 단백질 등의 아미노 화합물 존재하에서도 메일라아드 반응을 일으키는 일이 없고, 공존하는 성분을 손상시키거나, 자체 착색하거나 하는 일이 거의 없다. 특히, 이소말티톨 함유 혼합 당질 또는 결정 이소말티톨 함유 제품의 경우에는, 풀룰란, 히드록시에틸스타치, 폴리비닐피롤리돈 등의 공지의 1종 또는 2종 이상의 결합제와 병용하여 정제의 당의제로서도 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 당질은, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 호화 전분의 노화 방지성 등의 유용한 성질도 겸비하고 있다. 따라서, 본 발명의 당질은, 감미료, 정미 개량제, 풍미 개량제, 풍미 유지제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서, 건강식품이나 건강보조 식품을 포함한 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 당질은, 각종 물품의 단 맛 부여를 위한 조미료로서도 이용할 수 있다. 필요에 따라서, 예를 들면, 가루엿, 포도당, 프룩토오스, 락토수크로오스, α, α-트레할로오스, α, β-트레할로오스(별명, 네오트레할로오스), β, β-트레할로오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화 당, 벌꿀, 메이플 슈거, 이소말토 올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸 에스테르, 스쿠랄로오스, 아세술팜 K, 사카린, 글리신, 알라닌 등과 같은 기타의 감미료의 1종 또는 2종 이상과 병용하는 것도, 더욱이 필요하면, 덱스트린, 전분, 락토오스 등의 증량제의 1종 또는 2종 이상을 병용하는 것도 마음대로이다.
또한, 본 발명의 당질, 특히, 이소말티톨의 결정 분말상 제품은 그대로로, 또는 필요에 따라서, 적당한 증량제, 부형제, 결합제, 감미료 등의 1종 또는 2종 이상과 병용하여 과립, 원형, 단봉상, 판상, 입방체상, 정제상, 필름상 또는 시트상 등의 각종 형상으로 성형해서 이용하는 것도 마음대로이다.
더욱이, 본 발명의 당질의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로움, 쓴 맛 등의 기타의 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 자체가 내산성, 내열성도 크므로 각종 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량에, 또한 품질 개량을 목적으로 하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 삼배초, 분말 초밥 초, 츄카 노 모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 케첩, 불고기의 소오스, 커리 루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물 믹스, 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린, 신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등, 각종 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 센배이, 아라레, 오코시, 떡류, 만두, 우이로오, 팥소류, 양갱, 물양갱, 멘쿄쿠, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸린, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 요크셔 푸딩, 초콜렛, 츄잉 검, 캬라멜, 캔디 등의 양과자, 아이스 크림, 샤베트 등의 빙과, 과실의 시럽 절임, 얼음꿀 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류, 잼, 마마레이드, 시럽 절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진츠케, 베타라츠케, 센마이츠케, 라쿄오츠케 등의 절인 야채류, 단무지 믹스, 배추절임 믹스 등의 절인 야채의 믹스류, 햄, 소세지 등의 축육제품류, 어육 햄, 피시 소시지, 어묵, 오뎅, 튀김 등의 어육제품, 성게, 물오징어의 젓, 초 다시마, 말린 오징어, 복어 미린 말림 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 츠쿠다니류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 요구르트, 치즈 등의 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 청주, 소주, 츄하이, 합성 술, 리큐어, 칵테일, 양주 등의 주류, 커피, 홍차, 코코아, 주스, 스포츠 음료, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸린 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석식품, 또한, 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품, 건강식품 등의 각종 음식물에 유리하게 이용할 수 있다. 더욱이, 가축, 집에서 기르는 새, 기타 꿀벌, 누에, 어류, 갑각류(새우, 게 등) 등의 사육 동물용의 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복 액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등의 각종 고형물용 감미제로서, 또는 그것들의 정미 개량제, 교미제(矯味劑), 품질 개량제, 안정제, 보습제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 당질은, 실질적으로 비환원성이기 때문에 메일라아드 반응을 일으키지 않는 비(非)메일라아드성의 당 알코올로, 아미노 화합물 등의 유효성분 등을 손상시키는 일이 적어, 품질 개량제 및/또는 안정제로 하여, 유효성분, 활성성분 또는 생리활성 물질을 함유하는 건강식품, 의약품 등에 배합함으로써, 안정하고 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품이나 의약품을 얻을 수 있다. 상기 유효성분이나 생리활성 물질로서는, 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, TNF-α, TNF-β, 매크로파아지 유주(遊走)저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트랜스퍼 팩터, 인터류킨 등의 림포카인, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 백신, 두묘, 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로블린 등의 생물 제제, 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생 물질, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, α-글리코실아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤, 루틴, α-글리코실루틴, 나린진, α-글리코실나린진, 헤스페리딘, α-글리코실헤스페리딘 등의 비타민류, 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등의 효소, 약용 인삼 엑기스, 조릿대 엑기스, 매실 엑기스, 소나무 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류, 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균, 로얄 젤리 등을 예시할 수 있다.
이상 설명한 각종 조성물에 본 발명의 당질을 함유시키는 방법은, 이들 조성물이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예를 들면, 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등의 공지의 방법이 적당히 선택된다. 그 양은, 통상, 상기 조성물 중량당 0.1％ 이상, 바람직하게는 1％ 이상, 보다 바람직하게는 2 내지 99.9％ 배합한다.
이하, 본 발명의 이소말토오스 및 이소말티톨의 제조방법에 대해서 실험에 의해 설명한다.
실험 1 < 배양물로부터의 비환원성 환상 당질의 조제>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #1』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 5w/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히 미스트』, 아사히 맥주 주식회사 제조) 1.5w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지 100ml을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 넣고, 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 후, 원심분리해서 균체를 제거하여 배양 상청(上淸)을 얻었다. 다시, 그 배양 상청을 120℃에서 15분간 오토클레이브하고, 방냉한 후, 불용물을 원심분리해서 제거하여 상청을 회수하였다.
얻어진 상청중의 당질을 조사하기 위해서, 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액(용량비 6:4:1), 박층 플레이트로서 메르크사제 『키젤 겔 60』(알루미늄 플레이트, 20×20cm)을 사용하여 2회 전개하는 실리카겔 박층 크로마토그래피(이하, 간단히「TLC」라 함.)를 하여 상청중의 당질을 분리하였다. 검출법으로서, 분리한 전체 당질을 황산-메탄올법으로 발색하고, 또한, 환원당질을 디페닐아민-아닐린법으로 발색해서 조사한 결과, Rf값이 약 0.31인 위치에서 황산-메탄올법에서 양성, 디페닐아민-아닐린법에서 음성의 비환원성 당질이 검출되었다.
앞서 얻은 상청 약 90ml을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 주식회사 제조)를 고형물 1 그램당 1,500 단위와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매)를 고형물 1 그램당 75 단위 첨가해서 24시간 처리하고, 이어서 수산화 나트륨으로 pH를 12로 조정하여 2시간 펄펄 끓여 잔존하는 환원당을 분해하였다. 불용물을 여과해서 제거한 후, 일본국의 三菱화학제 이온교환 수지 『Diaion PK218』과 『Diaion WA30』을 사용해서 탈색, 탈염하고, 더욱이, 일본국의 三菱화학제 캐타이온 교환 수지 『Diaion SK-1B』와 오르가노제 음이온 교환 수지 『IRA411』로써 다시 탈염하고, 활성탄으로 탈색하여 정밀여과한 후, 에바포레이터에서 농축하고 동결 진공건조해서 고형물로서 약 0.6g의 당질 분말을 얻었다.
얻어진 당질의 조성을 고속 액체 크로마토그래피법(이하, 간단히「HPLC」라고 약칭한다.)으로 조사한 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이, 용출시간 약 10.84분에서 단일 피크만이 검출되어, 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도인 것이 밝혀졌다. 또한, HPLC는, 『Shodex KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사 제조)을 사용하여 칼럼 온도 60℃, 물의 유속 0.5ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용해서 하였다. 또한, 환원력을 소모기·넬슨법으로 측정한 결과, 그 환원력은 검출한계 이하이며, 이 표품(標品)은 실질적으로 비환원성 당질이라고 판단되었다.
실험 2 <비환원성 당질의 구조해석>
실험 1의 방법으로 얻어진 비환원성 당질에 대해서, 고속 원자 충격법에 의한 질량분석(통칭 「FAB-MS」)을 한 결과, 질량수 649의 프로톤 부가 분자 이온이 현저하게 검출되어, 이 당질의 질량수가 648인 것이 밝혀졌다. 또한, 통상적인 방법에 따라 황산을 사용하여 가수분해 하고, 가스 크로마토그래피법으로 구성당을 조사한 결과, D-글루코오스만이 검출되어, 이 당질의 구성당은 D-글루코오스이고, 또한 질량수를 고려하면 이 당질은 D-글루코오스 4분자로 된 환상 당질인 것을 알았다. 더욱이 이 당질을 사용해서 핵자기 공명법(통칭, 「NMR」)을 실시한 결과, 도 2에 나타내는 1H-NMR 스펙트럼과, 도 3에 나타내는 13C-NMR 스펙트럼을 얻을 수 있고, 이들 스펙트럼을 기지 당질의 것과 같거나 다른 점을 비교한 결과, 『European Journal of Biochemistry)』, 641 내지 648 페이지(1994년)에 기재되어 있는 비환원성 환상 당질 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 스펙트럼과 일치하고, 이 당질의 구조가 도 4에 나타내는 환상 4당, 즉, 사이클로{→6)-α- D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}인 것이 밝혀졌다.
실험 3 <바실루스 글로비스포루스 C9로부터의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 생산>
전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #4』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조) 4.Ow/v％, 효모 추출물(상품명 『아사히 미스트』,(아사히 맥주 주식회사 제조) 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％, 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)을 접종하여, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종(種)배양액으로 하였다.
용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액중의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은 약 0.45 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.5 단위/ml이며, 환상 4당 생성 활성은 약 0.95 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)하여 회수한 상청 약 18L의 효소활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 약 0.45 단위/ml의 활성(총활성 약 8,110 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.5 단위/ml의 활성(총활성 약 26,900 단위)이며, 환상 4당 생성 활성은 약 0.95 단위/ml(총활성 약 17,100 단위)이었다.
그리고 효소활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성의 측정은, 말토트리오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가해서 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액에서 주로 생성하는 이소말토실말토오스와 말토오스 중에서 이 말토오스량을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다. 본 명세서를 통해서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 효소활성은 이상과 같이 해서 측정되는 활성(단위)을 의미한다.
또한, α-이소말토실 전이효소의 효소활성의 측정은, 파노오스를 농도 2w/v％가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜서 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가해서 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액에서 주로 생성하는 환상 4당과 글루코오스 중에서 이 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실 전이효소의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다. 본 명세서를 통해서 α-이소말토실 전이효소의 효소활성은, 이상과 같이 해서 측정되는 활성(단위)을 의미한다.
또한, 환상 4당 생성 활성의 측정은, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사 제조)을 농도 2w/v％가 되도록 50mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가해서 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 후, 다시, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약 제조) 70 단위/ml와 글루코아밀라아제(일본국의 나가세 생화학공업 주식회사 판매) 27 단위/ml를 함유하는 50mM 아세트산 완충액(pH 5.0) 1ml을 가해서 50℃에서 60분간 처리하고, 그 액을 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활시킨 후, 환상 4당량을 실험 1에 기재한 HPLC법으로 정량함으로써 실시하였다. 환상 4당 생성 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 환상 4당을 생성하는 효소량으로 정의하였다. 본 명세서를 통해서 환상 4당 생성 활성은, 이상과 같이 해서 측정되는 활성(단위)을 의미한다.
실험 4 <바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 조제>
실험 4-1 <바실루스 글로비스포루스 C9 유래 효소의 정제>
실험 3에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 8,110 단위와, α-이소말토실 전이효소 활성을 24,700 단위와, 환상 4당 생성 활성을 약 15,600 단위 가지고 있었다. 이 조효소액을 일본국의 三菱화학 주식회사제 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피(겔 용량 1,000ml)에 사용하였다. 이 때, α-이소말토실글루코 당질 생성효소, α-이소말토실 전이효소 및 환상 4당의 모두가 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분으로 용출하였다.
이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불순물을 제거하고, 아머샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소활성 성분은 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여, 말토테트라오스 OmM로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 OM 부근에서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은, 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실 전이효소 활성 획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성 획분을 따로 수집하여 회수하였다. 또한, 환상 4당 생성 활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 쪽의 획분에서도 나타나지 않고, 또한, 얻어진 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 α-이소말토실 전이효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성 활성을 나타내는 것으로부터, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 두가지 효소활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로 따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 4-2 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 정제>
실험 4-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는 Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성, 수율을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
공 정 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질 생성효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 8,110 0.12 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 7,450 0.56 91.9
이온교환 칼럼 용출액 5,850 1.03 72.1
어피니티 칼럼 용출액 4,040 8.72 49.8
소수 칼럼 용출액 3,070 10.6 37.8
어피니티 칼럼 용출액 1,870 13.6 23.1
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 4-3 <α-이소말토실 전이효소의 정제>
실험 4-1에 기재한 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 2에 나타낸다.
[표 2]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 26,900 0.41 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 24,700 1.85 91.8
이온교환 칼럼 용출액 19,400 3.41 72.1
어피니티 칼럼 용출액 13,400 18.6 49.8
소수 칼럼 용출액 10,000 21.3 37.2
어피니티 칼럼 용출액 6,460 26.9 24.0
실험 5 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 5-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 성질>
실험 4-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 140,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다. 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+ 비존재하와 1 mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 5(온도의 영향), 도 6(pH의 영향)에 나타내었다.
효소의 최적 온도는, pH 6.0, 60분간 반응에서 약 40℃(Ca2+ 비존재), 약 45℃(Ca2+ 1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0 내지 6.5이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다.
또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 7(온도 안정성), 도 8(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 35℃까지(Ca2+ 비존재), 약 40℃까지(Ca2+ 1 mM 존재)이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다. 이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 92 Ba2+ 65
Mg2+ 100 Sr2+ 80
Ca2+ 115 Pb2+ 103
Co2+ 100 Fe2+ 98
Cu2+ 15 Fe3+ 97
Ni2+ 98 Mn2+ 111
Al3+ 99 EDTA 20

표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn 2+에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을 프로테인 시퀀서 모델 473A(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.
실험 5-2 <α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 4-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000 ± 20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.5 ±0.5이었다.
이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 9(온도의 영향), 도 10(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는, pH 6.0, 30분간 반응에서 약 45℃, 최적 pH는, 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다. 이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다.
각각의 결과를 도 11(온도 안정성), 도 12(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 pH 약 4.0 내지 9.0이었다.
이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 1
Zn2+ 88 Ba2+ 102
Mg2+ 98 Sr2+ 101
Ca2+ 101 Pb2+ 89
Co2+ 103 Fe2+ 96
Cu2+ 57 Fe3+ 105
Ni2+ 102 Mn2+ 106
Al3+ 103 EDTA 104

표 4의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)을 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 2에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-아스파라긴-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.
실험 6 <바실루스 글로비스포루스 C11로부터의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 생산>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 C11(FERM BP-7144)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액중의 이 효소의 활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.8 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 약 0.51 단위/ml의 활성(총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.7 단위/ml의 활성(총 활성 약 30,400 단위)이며, 환상 4당 생성활성은 약 1.1 단위/ml(총 활성 약 19,400 단위)이었다.
실험 7 <바실루스 글로비스포루스 C11 유래 효소의 조제>
실험 7-1 <바실루스 글로비스포루스 C11 유래 효소의 정제>
실험 6에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 416ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 8,440 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 28,000 단위, 환상 4당 생성활성을 약 17,700 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을, 실험 4-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성, α-이소말토실 전이효소 활성, 환상 4당 생성 모두가 『Sepabeads FP-DA13』 겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 효소액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다.
효소 활성은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여, 말토테트라오스 OmM으로부터 100mM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 분리해서 용출하여, α-이소말토실 전이효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3M 부근에서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 따로따로 수집하여 회수하였다.
실험 4에 기재한 C9주의 경우와 마찬가지로, 환상 4당 생성활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 획분에도 나타나지 않는 것을 알 수 있고, 또한, 얻어진 α-이소말토실 전이효소 획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성활성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 두가지 효소 활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 7-2 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 정제>
실험 7-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.
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[표 5]
공 정 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질 생성효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 9,180 0.14 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 8,440 0.60 91.9
이온교환 칼럼 용출액 6,620 1.08 72.1
어피니티 칼럼 용출액 4,130 8.83 45.0
소수 칼럼 용출액 3,310 11.0 36.1
어피니티 칼럼 용출액 2,000 13.4 21.8
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 7-3 <α-이소말토실 전이효소의 정제>
실험 7-1에 기재한 어피니티 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopearl 65OM』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 6에 나타낸다.
[표 6]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 30,400 0.45 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 28,000 1.98 92.1
이온교환 칼럼 용출액 21,800 3.56 71.7
어피니티 칼럼 용출액 13,700 21.9 45.1
소수 칼럼 용출액 10,300 23.4 33.9
어피니티 칼럼 용출액 5,510 29.6 18.1
실험 8 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 8-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 성질>
실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 137,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.2 ±0.5이었다.
또한, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 또한, 온도의 영향에 대해서는 Ca2+ 비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 13(온도의 영향), 도 14(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃(Ca2+ 비존재), 약 50℃(Ca2+ 1 mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 15(온도 안정성), 도 16(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지(Ca2+ 비존재), 약 45℃까지(Ca2+ 1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다. 이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[표 7]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 4
Zn2+ 91 Ba2+ 65
Mg2+ 98 Sr2+ 83
Ca2+ 109 Pb2+ 101
Co2+ 96 Fe2+ 100
Cu2+ 23 Fe3+ 102
Ni2+ 93 Mn2+ 142
Al3+ 100 EDTA 24

표 7의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되고, Ba2+, Sr2+에 의해서 저해되었다. Ca2+, Mn 2+에 의해서 활성화되는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열 N 말단 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다. 이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-1의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 N 말단 서열과 비교하면 동일한 것이 판명되고, α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 공통의 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열 티로신-발린-세린-세린-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-이소로이신의 N 말단 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다. 상세한 아미노산 서열 분석 방법에 대해서는, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 제WOO2/055708호)에 상세히 개시되어 있는 바로부터 알 수 있는데, 실험 7-2에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 제W002/055708호)에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열 번호 21에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제36 내지 제1284번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험 8-2 <α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 7-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 102,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 5.6 ±0.5이었다.
또한, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 17(온도의 영향), 도 18(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 5.5 내지 6.0이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하여 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 19(온도 안정성), 도 20(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 40℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
더욱이, 이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 2
Zn2+ 83 Ba2+ 90
Mg2+ 91 Sr2+ 93
Ca2+ 91 Pb2+ 74
Co2+ 89 Fe2+ 104
Cu2+ 56 Fe3+ 88
Ni2+ 89 Mn2+ 93
Al3+ 89 EDTA 98

표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)을 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 3에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.
이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-2의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 서열과 비교하고, α-이소말토실 전이효소가 공통되는 N 말단 아미노산 서열은 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 아미노산 서열인 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린의 N 말단 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다. 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국의 특허출원2000-350142호 명세서(국제공개 제WOO2/40659호)에 상세히 개시되어 있는 바로부터 알 수 있고, 실험 7-3에서 얻은 α-이소말토실 전이효소는 일본국의 특허출원2000-350142호 명세서(국제공개 제W002/40659호)에 개시되어 있는 바와 같이 서열표에 있어서의 서열 번호 22에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제30 내지 1093번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험 9 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열>
실험 9-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 내부 부분 아미노산 서열>
실험 7-2의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 트립신(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)을 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 마이크로본다팩 C18 칼럼(지름 2.1 mm × 길이 150mm, Waters사제)을 이용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1% 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세토니트릴 용액의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 양호하게 분리한 3 펩티드 [P64(유지시간 약 64분), P88(유지시간 약 88분), P99(유지시간 약 99분)]를 분취(分取)하고, 각각을 진공건조한 후, 200 ㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하여, 각각 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 5 내지 7에 나온 아미노산 서열을 얻을 수 있었다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 9에 나타낸다.
[표 9]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
P64 아스파라긴산-알라닌-세린-알라닌-아스파라긴-발린-트레오닌-트레오닌
P88 트립토판-세린-로이신-글리신-페닐알라닌-메티오닌-아스파라긴-페닐알라닌
P99 아스파라긴-티로신-트레오닌-아스파라긴산-알라닌-트립토판-메티오닌-페닐알라닌

실험 9-2 <α-이소말토실 전이효소의 내부 부분 아미노산 서열>
실험 7-3의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실 전이효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 리질엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 마이크로본다팩 C18 칼럼(지름 2.1 mm × 길이 150 mm, Waters사제)을 이용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세토니트릴 용액의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 양호하게 분리한 3 펩티드 [P22(유지시간 약 22분), P63(유지시간 약 63분), P71(유지시간 약 71분)]를 분취하고, 각각을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하여 각각 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 8 내지 10에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 10에 나타낸다.
삭제
[표 10]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
P22 글리신-아스파라긴-글루탐산-메티오닌-아르기닌-아스파라긴-글루타민-티로신
P63 이소로이신-트레오닌-트레오닌-트립토판-프롤린-이소로이신-글루탐산-세린
P71 트립토판-알라닌-페닐알라닌-글리신-로이신-트립토판-메티오닌-세린

실험 10 <바실루스 글로비스포루스 N75로부터의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 생산>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열 멸균하여 냉각하고, 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0로 유지하면서, 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액중의 이 효소 활성은 약 0.34 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.1 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.69 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 약 0.33 단위/ml의 활성(총 활성 약 5,940 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.1 단위/ml의 활성(총 활성 약 19,800 단위)이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.67 단위/ml(총 활성 약 12,100 단위)이었다.
실험 11 <바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 효소의 조제>
실험 11-1 <바실루스 글로비스포루스 N75 유래 효소의 정제>
실험 10에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 60％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.3)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 450ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 4,710 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 15,700 단위, 환상 4당 생성활성을 약 9,590 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을, 실험 4-1에 기재한 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 이용하는 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은, Sephabeads gel에 흡착하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 Sephabeads gel에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 계속해서, NaCl 농도 OM으로부터 1M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.25M 부근에서 용출하였다. 따라서, α-이소말토실 전이효소 활성획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 따로따로 수집하여 회수하였다. 실험 4에 기재한 C9주의 경우 및 실험 7에 기재한 C11주의 경우와 마찬가지로, 환상 4당 생성활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 획분에도 나타나지 않고, 또한, 얻어진 α-이소말토실 전이효소 획분과 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성활성을 나타내는 것으로부터, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 두가지 효소 활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 11-2 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 정제>
실험 11-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 회사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소 활성은, Sephacryl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트, 더욱 계속하여, 말토테트라오스 OmM로부터 100mM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은, 말토테트라오스의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 30mM 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 크로마토그래피(겔량 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, Butyl-Toyopearl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 상기 Sephacryl 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성, 수율을 표 11에 나타낸다.
[표 11]
공 정 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질 생성효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 5,940 0.10 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 4,710 0.19 79.3
이온교환 칼럼 용출액 3,200 2.12 53.9
어피니티 칼럼 용출액 2,210 7.55 37.2
소수 칼럼 용출액 1,720 10.1 29.0
어피니티 칼럼 용출액 1,320 12.5 22.2
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 11-3 <α-이소말토실 전이효소의 정제>
실험 11-1에 기재한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사제 『Sephacryl HR S-200)』 겔을 사용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소는 Sephacryl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 또한, 효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Butyl-Toyopearl 650M)』 겔을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는 Butyl-Toyopearl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 이 회수액을 1OmM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『Super Q Toyopearl 650C』 겔을 이용하는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는 Super Q Toyopearl에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하며, 얻어진 용출획분을 회수하여 최종 정제 효소 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 12에 나타낸다.
[표 12]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 19,000 0.33 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 15,700 0.64 82.6
이온교환 칼럼 용출액 12,400 3.56 65.3
어피니티 칼럼 용출액 8,320 11.7 43.8
소수 칼럼 용출액 4,830 15.2 25.4
이온교환 칼럼 용출액 3,850 22.6 20.3
정제한 α-이소말토실 전이효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 12 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 12-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 성질>
실험 11-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 136,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 7.3±0.5이었다.
또한, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그리고 온도의 영향에 대해서는, Ca2+ 비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 21(온도의 영향), 도 22(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는, pH 6.0, 60분간 반응에서 약 50℃（Ca2+ 비존재), 약 55℃（Ca2+ 1mM 존재), 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 23(온도 안정성), 도 24(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지(Ca2+ 비존재), 약 50℃까지(Ca2+ 1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
[표 13]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 1
Zn2+ 82 Ba2+ 84
Mg2+ 96 Sr2+ 85
Ca2+ 108 Pb2+ 86
Co2+ 93 Fe2+ 82
Cu2+ 7 Fe3+ 93
Ni2+ 93 Mn2+ 120
Al3+ 98 EDTA 35

표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되었다. Ca2+, Mn2+에 의해 활성화되는 것도 밝혀졌다. 또한, 이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)을 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 11에 나온 아미노산 서열 N 말단 히스티딘-발린-세린-알라닌-로이신-글리신-아스파라긴-로이신-로이신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다. 이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-1의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 및 실험 8-1의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 N 말단 서열과 비교하면, 제1번째 및 제4번째, 제9번째의 아미노산이 다르기는 하지만 유사성이 높은 것이 밝혀졌다. 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 제W002/055708호)에 상세히 개시되어 있는 바로부터 알 수 있고, 실험 11-2에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 제W002/055708호)에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열 번호 23에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제36번 내지 제1286번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험 12-2 <α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 11-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 112,000±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 7.8±0.5이었다.
더욱이, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 25(온도의 영향), 도 26(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 27(온도 안정성), 도 28(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 10.0이었다. 이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 0.5
Zn2+ 75 Ba2+ 102
Mg2+ 95 Sr2+ 91
Ca2+ 100 Pb2+ 69
Co2+ 92 Fe2+ 97
Cu2+ 15 Fe3+ 90
Ni2+ 91 Mn2+ 101
Al3+ 94 EDTA 92

표 14의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서 저해되었다. 또한, Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 알았다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)을 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 3에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린-티로신-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.
이 N 말단 아미노산 서열 결과를 실험 5-2의 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 및 실험 8-2의 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 서열과 비교하고, α-이소말토실 전이효소의 공통되는 N 말단 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 아미노산 서열의 이소로이신-아스파라긴산-글리신-발린-티로신-히스티딘-알라닌-프롤린의 N 말단 아미노산 서열인 것이 밝혀졌다. 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는, PCT/JPOl/04276호 명세서에 상세(국제공개 제W001/90338호)하게 개시되어 있는 바로부터 알 수 있고, 실험 11-3에서 얻은 α-이소말토실 전이효소는, PCT/JPOl/04276호 명세서(국제공개 제 W001/90338호)에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열 번호 24에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제30번 내지 제1093번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험 13 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 아미노산 서열>
실험 13-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 내부 부분 아미노산 서열>
실험 11-2의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 20 ㎍의 리질엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 『마이크로본다스페아 C18 칼럼』(지름 3.9mm × 길이 150mm, Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-36％ 아세토니트릴 용액의 120분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는, 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 양호하게 분리한 3 펩티드 [PN59(유지시간 약 59분), PN67(유지시간 약 67분), PN87(유지시간 약 87분)]를 분취하고, 각각 진공건조한 후, 200 ㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하고, 각각 8 잔기까지 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 12 내지 14에 나온 아미노산 서열을 얻을 수 있었다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 15에 나타낸다.
[표 15]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
PN59 아스파라긴산-페닐알라닌-세린-아스파라긴-아스파라긴-프롤린-트레오닌-발린
PN67 티로신-트레오닌-발린-아스파라긴-알라닌-프롤린-알라닌-알라닌
PN87 티로신-글루탐산-알라닌-글루탐산-세린-알라닌-글루탐산-로이신

실험 13-2 <α-이소말토실 전이효소의 내부 부분 아미노산 서열>
실험 11-3의 방법으로 얻어진 정제 α-이소말토실 전이효소 표품의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1 ml)에 20 ㎍의 리질엔도펩티다아제(일본국의 和光純藥 주식회사 판매)를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 『마이크로본다스페아 C18 칼럼』(지름 3.9mm × 길이 150mm, Waters사제)을 사용하고, 유속 0.9ml/분, 실온에서 0.1％ 트리플루오로아세트산-4％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-42.4％ 아세토니트릴 용액의 90분간의 리니어 그래디언트의 조건에서 하였다. 칼럼으로부터 용출한 펩티드는, 파장 210nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 양호하게 분리한 3 펩티드 [PN21(유지시간 약 21분), PN38(유지시간 약 38분), PN69(유지시간 약 69분)]를 분취하고, 각각 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해하였다. 이들 펩티드 시료를 프로테인 시퀀서에 사용하고, 각각 8 잔기까지(단, PN21은 6 잔기까지) 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 15 내지 17에 나온 아미노산 서열을 얻을 수 있었다. 얻어진 내부 부분 아미노산 서열을 표 16에 나타낸다.
[표 16]
펩티드명 내부 부분 아미노산 서열
PN21 아스파라긴-트립토판-트립토판-메티오닌-세린-리진
PN38 트레오닌-아스파라긴산-글리신-글리신-글루탐산-메티오닌-발린-트립토판
PN69 아스파라긴-이소로이신-티로신-로이신-프롤린-글루타민-글리신-아스파라긴산

실험 14 <아르드로박터 글로비포르미스 A19로부터의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 생산>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590)를 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 9.0로 유지하면서, 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액중의 이 효소 활성은 약 1.1 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.7 단위/ml이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.35 단위/ml이고, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 약 1.06 단위/ml의 활성(총 활성 약 19,100 단위)이고, α-이소말토실 전이효소는 약 1.6 단위/ml의 활성(총 활성 약 28,800 단위)이며, 환상 4당 생성활성은 약 0.27 단위/ml(총 활성 약 4,860 단위)이었다. 또한, 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 활성측정은, 기질을 위한 완충액으로서 100mM 글리신―NaOH 완충액(pH 8.4)을 사용한 이외는 실험 3에 기재한 방법과 마찬가지로 하였다.
실험 15 <아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래 효소의 조제>
실험 15-1 <아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래 효소의 정제>
실험 14에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 60％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 850ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성을 8,210 단위, α-이소말토실 전이효소 활성을 약 15,700 단위, 환상 4당 생성활성을 약 2,090 단위를 가진 것이 밝혀졌다. 이 조효소액을, 일본국의 Tosoh 주식회사제 『DEAE-Toyopearl 650S』 겔을 사용하는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 효소 활성은 DEAE-Toyopearl 겔에 흡착하고, NaCl 농도 OM로부터 0.5M의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소는 분리해서 용출하고, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은 NaCl의 리니어 그래디언트로 그 농도가 약 0.2M 부근에서 용출하고, α-이소말토실 전이효소 활성은 NaCl의 리니어 그래디언트로 그 농도가 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성획분과 α-이소말토실 전이효소 활성획분을 따로따로 수집하여 회수하였다. 그리고 환상 4당 생성활성은 이 칼럼 크로마토그래피의 어느 획분에도 나타나지 않는 것과, 또한, 얻어진 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 α-이소말토실 전이효소 획분을 혼합한 효소액은 환상 4당 생성활성을 나타내는 것으로부터, 전분 부분 분해물로부터 환상 4당을 생성하는 활성은 α-이소말토실 전이효소와 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 두가지 효소 활성의 공동 작용에 의해 발휘되는 것이 밝혀졌다.
이하, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 따로따로 정제하는 방법에 대해서 설명한다.
실험 15-2 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 정제>
실험 15-1에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 효소 활성은, Sephacryl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성은, 황산 암모늄의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.2M 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하여 최종정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량, 비활성, 수율을 표 17에 나타낸다.
[표 17]
공 정 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질 생성효소 비활성 (단위/mg 단백질) 수 율 (%)
배양 상청 19,100 0.11 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 8,210 0.48 43.0
이온교환 칼럼 용출액 6,890 4.18 36.1
어피니티 칼럼 용출액 5,220 35.1 27.3
정제한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 15-3 <α-이소말토실 전이효소의 정제>
실험 15-1에 기재한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 획분과 분리한 α-이소말토실 전이효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지 주식회사제 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다.
이 효소는 Sephacryl 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 OM 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하고, 정제 효소 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소 활성량, 비활성, 수율을 표 18에 나타낸다.
[표 18]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg단백질) 수 율 (%)
배양 상청 28,800 0.18 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 15,700 0.97 54.5
이온교환 칼럼 용출액 7,130 4.01 24.8
어피니티 칼럼 용출액 1,440 12.1 5.0
정제한 α-이소말토실 전이효소 표품을 7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기 영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 16 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 16-1 <α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 성질>
실험 15-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 94,000 ±20,000 달톤이었다.
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정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 4.3±O.5이었다.
또한, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 또한, 온도의 영향에 대해서는, Ca2+ 비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다. 이들 결과를 도 29(온도의 영향), 도 30(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 8.4, 60분간 반응에서 약 6O℃（Ca2+ 비존재), 약 65℃（Ca2+ 1mM 존재), 최적 pH는 35℃, 60분간 반응에서 약 8.4이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 글리신―NaOH 완충액, pH 8.0)을 Ca2+ 비존재하 또는 1mM 존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 8.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 31(온도 안정성), 도 32(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 55℃까지(Ca2+ 비존재), 약 60℃까지(Ca2+ 1mM 존재)이고, pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
더욱이, 이 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 표 19에 나타낸다.
[표 19]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 0
Zn2+ 56 Ba2+ 99
Mg2+ 97 Sr2+ 102
Ca2+ 106 Pb2+ 43
Co2+ 93 Fe2+ 36
Cu2+ 0 Fe3+ 35
Ni2+ 46 Mn2+ 98
Al3+ 37 EDTA 2

표 19의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+, Cu2+, EDTA에 의해서 현저하게 저해되는 것이 밝혀졌다. 이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 나온 아미노산 서열 N 말단 알라닌-프롤린-로이신-글리신-발린-글루타민-아르기닌-알라닌-글루타민-페닐알라닌-글루타민-세린-글리신의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다. 상세한 아미노산 서열의 분석 방법에 대해서는, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 번호 제W002/055708호)에 상세히 개시되어 있는 바로부터 알 수 있고, 실험 15-2에서 얻은 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 번호 제W002/055708호)에 개시되어 있는 폴리펩티드와 마찬가지로 서열표에 있어서의 서열 번호 25에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제37번 내지 965번째의 아미노산 서열을 가진다.
실험 16-2 <α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 15-3의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 113,000 ±20,000 달톤이었다.
정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％ 앰폴라인(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 4.2 ±0.5이었다.
더욱이, 이 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 33(온도의 영향), 도 34(pH의 영향)에 나타내었다. 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.5이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고 pH 안정성은, 이 효소를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 35(온도 안정성), 도 36(pH 안정성)에 나타내었다. 이 효소의 온도 안정성은 약 45℃까지이고, pH 안정성은 약 4.5 내지 9.0이었다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 19에 나온 아미노산 서열의 아스파라긴-트레오닌-로이신-아스파라긴산-글리신-발린 -트립토판-히스티딘-아스파라긴-프롤린-티로신-글리신-알라닌-아스파라긴산-글루탐산-로이신-티로신-알라닌-트레오닌-글루타민의 N 말단 아미노산 서열을 가지고 있는 것을 알았다.
실험 16-3 <α-이소말토실 전이효소의 전체 아미노산 서열>
일본국 특원2001-5441호 명세서(국제공개 번호 제WOO2/055708호)에 기재한 방법으로 아르드로박터 글로비포르미스 A19주로부터 염색체 DNA를 추출·정제한 후, 제한 효소 NotI로써 분해하여 단편화하였다. 별도로, 플러스미드 벡터 『BluescriptII SK(+)』(스트라타진·클로닝·시스템 주식회사제)를 제한 효소 NotI을 작용시켜서 완전히 절단한 후, 그 절단된 플러스미드 벡터와 먼저 얻은 DNA단편을 『DNA 라이게이션 키트』(일본국의 寶酒造 주식회사제)를 이용해서 연결하고, 얻어진 재조합 DNA를 이용하여 컴피턴트 셀 『Epicurian Coli XL2-Blue』(스트라타진·클로닝·시스템 주식회사제)를 형질전환해서 유전자 라이브러리를 제작하였다.
별도로, 실험 16-2의 방법으로 밝혀진, 서열표에 있어서의 서열 번호 19에 나온 아미노산 서열에 있어서의 제1번째로부터 제18번째까지의 아미노산 서열에 근거해 5'-AAYACNCTNGAYGGNGTNTGGCAYAAYCCNTAYGGNGCNGAYGARCTNTGGAC-3'로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 통상적인 방법에 따라 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드키나아제를 사용해서 동위체 표지하여 프로브로 하고, 앞서 얻어진 유전자 라이브러리를 이용하여, 일본국 특허출원2001-5441호 명세서(국제공개 번호 제W002/055708호)에 기재한 방법에 준해서 콜로니 하이브리다이제이션법을 실시하여, 프로브와 현저한 회합을 나타내는 1 종류의 형질 전환체를 선택하고, 이 형질 전환체를 『AGA4』로 명명하였다. 통상적인 방법에 의해, 이 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 채취하고, 이 재조합 DNA의 염기서열을, 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는 아르드로박터 글로비포르미스 A19주에서 유래하는, 체인 길이(鎖長) 6153 염기쌍의, 서열표에 있어서의 서열 번호 26에 나온 염기서열의 DNA를 함유하고 있었다. 도 37에 나온 바와 같이, 이 재조합 DNA에 있어서, 이 DNA는 제한 효소 NotI에 의한 인식 부위의 하류에 연결되어 있었다.
한편, 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 26에 병기한 바와 같고, 이 아미노산 서열과, 실험예 16-2의 방법으로 확인된 α-이소말토실 전이효소의 N 말단 아미노산 서열과 비교한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 19에 나온 아미노산 서열은, 서열 번호 26에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제50번 내지 제69번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다. 더욱이, 서열표의 서열 번호 26에 있어서의 제4644번 내지 제4646번째의 염기서열은 번역 종지 코돈(5'-TGA-3')을 코드하고 있으므로, α-이소말토실 전이효소의 C 말단은 그 직전의 아르기닌(서열표의 서열 번호 26에 있어서의 제1121번째의 아미노산)인 것이 밝혀졌다. 이들 결과는, 실험 15-3에서 얻은 α-이소말토실 전이효소는 서열표의 서열 번호 26에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제50번 내지 제1121번째의 아미노산 서열을 가지고, 서열표의 서열 번호 26에 나온 염기서열에 있어서의 제1428번 내지 제4643번째의 염기서열을 가진 DNA에 의해 코드되어 있는 것을 나타내고 있다.
그리고 서열표의 서열 번호 26에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제1번 내지 제49번째의 아미노산 서열은 이 폴리펩티드의 분비 시그널 서열로 추정되었다. 이들 사실로부터, 이 폴리펩티드의 분비전의 전구체 펩티드는, 서열표의 서열 번호 26에 병기된 아미노산 서열로 되어 있고, 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 26에 나온 염기서열에 코드 되어 있는 것이 밝혀졌다. 이와 같이 하여, 그 염기서열을 확인한 재조합 DNA를 『pAGA4』로 명명하였다.
실험 17 <아르드로박터 라모서스 S1로부터의 α-이소말토실 전이효소의 생산>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.Ow/v％, 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8w/v％, 인산 2칼륨 0.1w/v％, 인산 1나트륨·12수염 0.06w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 라모서스 S1(FERM BP-7592)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전진탕 배양한 것을 종배양액으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열 멸균, 냉각해서 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 27℃, pH 6.0 내지 8.0로 유지하면서, 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후의 배양액중의 이 효소 활성은 약 0.45 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 이 효소 활성은 0.44 단위/ml(총 효소 활성 약 7,920 단위)이었다.
실험 18 <아르드로박터 라모서스 S1로부터의 α-이소말토실 전이효소의 정제>
실험 17에서 얻어진 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여 이 효소 활성을 6,000 단위 함유하는 조효소액 약 380ml을 얻었다. 이 조효소액을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거한 후, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 칼럼 크로마토그래피(겔량 500ml)에 사용하였다. 이 효소는 Sephacryl HR S-200겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트 및, 이것에 계속하여 말토테트라오스 Ow/v％로부터 5w/v％의 리니어 그래디언트로 용출시킨 결과, 말토테트라오스 농도 약 2w/v％ 부근에서 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 더욱이, 이 효소 획분을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하여, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피(겔량 380ml)에 사용하였다. 이 효소는, Butyl-Toyopearl 650M 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 겔에 흡착한 효소가 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 회수하여 정제 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이효소의 활성량, 비활성, 수율을 표 20에 나타낸다.
[표 20]
공 정 α-이소말토실 전이효소 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 비활성 (단위/mg단백질) 수 율 (%)
배양 상청 7,920 0.47 100
황산 암모늄 염석 후의 투석액 6,000 3.36 75.8
어피니티 칼럼 용출액 5,270 29.9 66.5
소수 칼럼 용출액 4,430 31.1 55.9
7.5w/v％ 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 SDS-PAGE에 의해, 본 실험에서 정제한 α-이소말토실 전이효소 표품의 순도를 검정한 결과, 이 효소 표품의 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 표품이었다.
실험 19 <α-이소말토실 전이효소의 성질>
실험 18의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(겔 농도 7.5w/v％)에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커(일본 바이오·랏도·라보라토리즈 주식회사제)와 비교해서 이 효소의 분자량을 측정한 결과, 분자량 약 116,000±20,000 달톤이었다.
또한, 이 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 2w/v％『앰폴라인 』(아마샴 파아마시아 바이오테크놀로지사 제조) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 사용하고, 영동 후, 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점(pI)은 약 4.2±0.5이었다.
더욱이, 이 효소의 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정의 방법에 준해서 조사하였다. 그 결과를 도 38(온도의 영향), 도 39(pH의 영향)에 나타내었다. 이 효소의 최적 온도는 pH 6.0, 30분간 반응에서 약 50℃, 최적 pH는 35℃, 30분간 반응에서 약 6.0이었다.
이 효소의 온도 안정성은, 효소용액(20mM 아세트산 완충액, pH 6.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, 이 효소를 pH가 다른 50mM 완충액중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과를 도 40(온도 안정성), 도 41(pH 안정성)에 나타내었다.
이들 도면에 나온 바와 같이, 이 효소의 상기한 조건하에서의 안정 온도영역은 약 45℃ 이하이고, 또한 이 효소의 상기한 조건하에서의 안정 pH영역은 약 3.6 내지 약 9.0이었다.
그리고 이 효소의 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 농도 1mM의 각종 금속염 존재하에서 활성측정의 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다.
[표 21]
금속 이온 상대 활성(%) 금속 이온 상대 활성(%)
무첨가 100 Hg2+ 0.1
Zn2+ 78 Ba2+ 97
Mg2+ 99 Sr2+ 101
Ca2+ 103 Pb2+ 85
Co2+ 91 Fe2+ 105
Cu2+ 2 Fe3+ 75
Ni2+ 87 Mn2+ 98
Al3+ 93 EDTA 91

표 21의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소 활성은, Hg2+에 의해서 현저하게 저해되고, Cu2+에 의해서도 저해되었다. 그리고 Ca2+에 의해서 활성화되지 않는 것도, EDTA에 의해서 저해되지 않는 것도 밝혀졌다.
이 효소의 N 말단 아미노산 서열을, 『프로테인 시퀀서 모델 473A』(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석하였다. 이 효소의 N 말단 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 20에 나온, 아스파라긴산-트레오닌-로이신-세린-글리신-발린-페닐알라닌-히스티딘-글리신-프롤린으로 나타내어지는 서열인 것이 밝혀졌다.
실험 20 <각종 당질에의 작용>
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 기질이 될 수 있는가 아닌가의 시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, α, α-트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 세라기노오스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드를 함유하는 용액을 조제하였다.
이들의 용액에, 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품, 또는 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품, 또는 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 기질 고형물 1 그램 당 2 단위 가하고, 기질 농도를 2w/v％가 되도록 조정하여 이것을 30℃, pH 6.0(아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 효소의 경우, pH 8.4)에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 전후의 반응액을 실험 1 기재의 TLC법으로 분석하고, 각각의 당질에 대한 효소작용의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표 22에 나타낸다.
[표 22]
기 질 효 소 작 용
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
말토오스 + + + +
말토트리오스 ++ ++ ++ ++
말토테트라오스 +++ +++ +++ +++
말토펜타오스 +++ +++ +++ +++
말토헥사오스 +++ +++ +++ +++
말토헵타오스 +++ +++ +++ +++
이소말토오스 - - - -
이소말토트리오스 - - - -
파노오스 - - - -
이소파노오스 ++ ++ ++ ++
트레할로오스 - - - -
코지비오스 + + + +
니게로오스 + + + +
네오트레할로오스 + + + +
셀로비오스 - - - -
겐티비오스 - - - -
말티톨 - - - -
말토트리이톨 + + + +
락토오스 - - - -
수크로오스 - - - -
에를로오스 + + + +
세라기노오스 - - - -
말토실글루코시드 ++ ++ ++ ++
이소말토실글루코시드 - - - -

주) 효소반응 전후에서,
「-」은 변화가 없었던 것을 나타내고,
「+」은 기질의 스폿이 약간 감소하고, 기타의 생성물이 나타난 것을 나타내며,
「++」은 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 기타의 생성물이 나타난 것을 나타내고,
「+++」은 기질의 스폿이 대부분 소실하고, 기타의 생성물이 나타난 것을 나타낸다.
표 22의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 시험한 여러 종류의 당질 중에서, 글루코오스 중합도 3 이상이고, 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 판명되었다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는, 말토오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로오스, 말토트리이톨 및 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 밝혀졌다.
실험 21 <말토올리고당으로부터의 생성물>
실험 21-1 <생성물의 조제>
농도 1％의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 또는 말토펜타오스의 각각의 수용액에 실험 7-2의 방법으로 얻은 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를, 각각 고형물 1 그램당 2 단위(말토오스 및 말토트리오스), 0.2 단위(말토테트라오스), 0.1 단위(말토펜타오스) 첨가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시키고, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는, 『YMC Pack ODS-AQ303』 칼럼(주식회사 와이·에무·시 제조)을 사용하여 칼럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min물의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사 제조)를 사용해서 하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다.
[표 23]
반응에서 생성한 당질의 종류 기 질
말토오스 말토트리오스 말토테트라오스 말토펜타오스
글루코오스 8.5 0.1 0.0 0.0
말토오스 78.0 17.9 0.3 0.0
말토트리오스 0.8 45.3 22.7 1.9
말토테트라오스 0.0 1.8 35.1 19.2
말토펜타오스 0.0 0.0 3.5 34.4
말토헥사오스 0.0 0.0 0.0 4.6
이소말토오스 0.5 0.0 0.0 0.0
글루코실말토오스 8.2 1.2 0.0 0.0
글루코실말토트리오스 2.4 31.5 6.8 0.0
X 0.0 2.1 30.0 11.4
Y 0.0 0.0 1.4 26.8
Z 0.0 0.0 0.0 1.7
기타 0.6 0.1 0.2 0.0

표 중에서,
글루코실말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-0-α-글루코실말토오스, 파노오스)이고,
글루코실말토트리오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 63-0-α-글루코실말토트리오스)이며,
X는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실말토트리오스(별명, 64-0-α-글루코실말토테트라오스)이고,
Y는 실험 11-2에 기재한 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 65-0-α-글루코실말토펜타오스)이며,
Z는 미확인의 당질이다.
표 23의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이 효소의 작용의 결과, 기질 말토오스로부터는 주로 글루코오스와 α-이소말토실 글루코오스(별명, 62-0-α-글루코실 말토오스, 파노오스)가 생성하고, 기질 말토트리오스로부터는, 주로 말토오스와 α-이소말토실 글루코오스(별명, 63-0-α-글루코실 말토트리오스)가 생성하고, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실 글루코오스(별명, 62-0-α-글루코실 말토오스, 파노오스), 생성물 X가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질 말토테트라오스로부터는 주로 말토트리오스와 생성물 X가 생성하고, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실 글루코오스(별명, 63-0-α-글루코실 말토트리오스), 생성물 Y가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질 말토펜타오스로부터는 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 생성물 X, 생성물 Z가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 X, 및 기질 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 단리·정제를 하였다. 분취용(分取用) HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-15 12A』(주식회사 와이·에무·시제)를 사용해서 정제하고, 상기의 말토테트라오스로부터의 반응물, 말토펜타오스로부터의 반응물 각각으로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 X 표품을 고형물당 수율 약 8.3％로서, 그리고 순도 99.9％ 이상의 생성물 Y를 고형물당 수율 약 11.5％로서 단리하였다.
실험 21-2 <생성물의 구조해석>
실험 21-1의 방법으로 얻은 생성물 X 및 생성물 Y를 이용하고, 통상적인 방법을 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석의 결과는 표 24에 정리하였다. NMR 분석의 결과에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼을 도 42(생성물 X), 도 43(생성물 Y)에, 13C-NMR 스펙트럼을 도 44(생성물 X), 도 45(생성물 Y)에, 생성물 X, Y의 귀속을 표 25에 정리하였다.
[표 24]
분석 메틸화물의 종류 조 성 비
생성물 X 생성물 Y
2,3,4-트리메틸화물 1.00 1.00
2,3,6-트리메틸화물 3.05 3.98
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.82 0.85

[표 25]
글루코오스 번호 탄소 번호 NMR 화학 시프트값 (ppm)
생성물 X 생성물 Y
a 1a 100.8 100.8
2a 74.2 74.2
3a 75.8 75.7
4a 72.2 72.2
5a 74.5 74.5
6a 63.2 63.1
b 1b 102.6 102.6
2b 74.2 74.2
3b 75.8 75.7
4b 72.1 72.1
5b 74.0 74.0
6b 68.6 68.6
c 1c 102.3 102.3
2c 74.2 74.2
3c 76.0 76.0
4c 79.6 79.5
5c 73.9 73.9
6c 63.2 63.1
d 1d 102.2 102.3
2d 74.0(α), 74.4(β) 74.2
3d 76.0 76.0
4d 79.8 79.5
5d 73.9 73.9
6d 63.2 63.1
e 1e 94.6(α), 98.5(β) 102.1
2e 74.2(α), 76.7(β) 74.0(α), 74.4(β)
3e 75.9(α), 78.9(β) 76.0
4e 79.6(α), 79.4(β) 79.8
5e 72.6(α), 77.2(β) 73.9
6e 63.4(α), 63.4(β) 63.1
f 1f 94.6(α), 98.5(β)
2f 74.2(α), 76.7(β)
3f 76.0(α), 78.9(β)
4f 79.6(α), 79.5(β)
5f 72.6(α), 77.2(β)
6f 63.3(α), 63.3(β)

이들 결과로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성효소에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 X는, 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코오스기가 α 결합한 5당이고, 구조식 1로 나타내어지는 α-이소말토실 말토트리오스(별명, 64-0-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 1:
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
그리고 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는, 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코실기가 α 결합한 6당이고, 구조식 2로 나타내어지는 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 65-0-α-글루코실 말토펜타오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 2:
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp -(1→4)-D-Glcp
이상으로부터, α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.
(1) 이 효소는, 기질로서, α-1, 4 결합으로 된 글루코오스 중합도가 2 이상인 말토올리고당에 작용하고, 그 비환원 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원 말단의 글루코실 잔기의 6 위치에 전이하는 작용을 가진 분자간의 6-글루코실 전이를 촉매하고, 비환원 말단에 6-0-α-글루코실기를 가진 글루코오스 중합도가 1증가한 α-이소말토실글루코 당질(별명, 6-0-α-글루코실 말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.
(2) 이 효소는, 4-글루코실 전이도 약간 촉매하고, 말토올리고당으로부터 글루코오스 중합도가 1 증가한 말토올리고당과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.
실험 22 <환원력 생성시험>
α-이소말토실글루코 당질 생성효소가 환원력 생성 능력을 가지는가 아닌가를 조사하기 위해서 아래의 시험을 하였다.
농도 1％의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을, 기질 고형물 1 그램당 0.25 단위 가하고, 35℃, pH 6.0(아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 효소의 경우, pH 8.4)에서 작용시켜, 그 반응액의 일부를 경시적으로 채취하고, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하여 반응액의 환원력을 측정하였다. 즉, 그 효소반응 전후의 용액의 환원당의 양을 소모기·넬슨법으로 측정하고, 또한, 동시에 그 효소반응 전후의 용액의 전체당의 양을 안트론 황산법으로 측정하여, 환원력 생성율(％)은 아래의 계산식을 이용해서 산출하였다.
계산식:
환원력 생성율(％）＝{[반응 후의 환원당의 양/반응 후의 전체당의 양]- [반응 전의 환원당의 양/반응 전의 전체당의 양]} × 100
그 결과를 표 26에 나타낸다.
[표 26]
반응 시간 (시간) 환원력 율 (%)
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
0 0.0 0.0 0.0 0.0
1 0.0 0.1 0.1 0.0
2 0.1 0.0 0.0 0.1
4 0.1 0.1 0.0 0.0
8 0.0 0.0 0.1 0.1

표 26의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 말토테트라오스를 기질로서 작용시키면, 반응물의 환원력을 실질적으로 증가하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 가수분해 작용을 나타내지 않거나 혹은 검출할 수 없을 정도의 근소한 것임이 밝혀졌다.
실험 23 <덱스트란 생성 시험>
α-이소말토실글루코 당질 생성효소가 덱스트란 생성 작용을 가지는가 아닌가를 조사하기 위해서, 『Bioscience Biotechnology and Biochemistry』, 169 내지 173(1992년)에 기재한 방법에 준해서 시험을 하였다.
농도 1％의 말토테트라오스 수용액에 실험 4-2의 방법으로 얻은 C9주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을, 기질 고형물 1 그램당 0.25 단위 첨가하고, 35℃, pH 6.0(아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 효소 표품의 경우, pH 8.4)에서 4시간 및 8시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 50㎕을 원심관에 넣고, 거기에 3배량의 에탄올을 가해 충분히 교반한 후, 4℃에서 30분간 정치하였다. 이어서, 원심분리(15,000rpm, 5분간)하고, 그 상청을 제거한 후, 1ml의 75w/w％ 에탄올을 가하고 교반하여 세정하였다. 다시, 원심분리해서 상청을 제거하고, 진공건조한 후, 1ml의 탈이온수를 가하고 충분히 교반하였다. 그 액중의 전체당의 양(글루코오스 환산)을 페놀 황산법으로 측정하여 시험의 전체당의 양으로 하였다. 반응의 블랭크로서, 100℃에서 10분간 열처리하여 실활시킨 바실루스 글로비스포루스 C9 유래 또는 바실루스 글로비스포루스 C11 유래, 바실루스 글로비스포루스 N75 유래, 및 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 사용하여 마찬가지로 하여 블랭크의 전체당의 양으로 하였다. 덱스트란 생성량은 아래의 계산식으로 계산하였다.
계산식:
덱스트란 생성량(mg/ml)= [(시험의 전체당의 양)-(블랭크의 전체당의 양)]×20
그 결과를 표 27에 나타낸다.
[표 27]
반응 시간 (시간) 생성 덱스트란 (mg/ml)
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
4 0.0 0.0 0.0 0.0
8 0.0 0.0 0.0 0.0
표 27의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 말토테트라오스에 작용시켜도 덱스트란을 생성하지 않는 것, 즉, 이 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 덱스트란 생성작용을 실질적으로 가지지 않거나, 그 생성량은 검출한계 이하인 것이 밝혀졌다.
실험 24 <전이 수용체 특이성>
각종 당질을 사용하여 이 효소의 전이 수용체가 될 수 있는 것인가 아닌가의 시험을 하였다. D-글루코오스, D-크실로오스, L-크실로오스, D-갈락토오스, D-프룩토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스, D-프시코오스, L-소르보오스, L-람노오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, N-아세틸글루코사민, 소르비톨, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 글리세롤, 말티톨, 락토오스, 수크로오스, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린, L-아스코르브산의 용액을 조제하였다.
이들 수용체 용액(농도 1.6％)에, 당(糖) 공여체로서 전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』(농도 4％)을 가하고, 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품 또는 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소, 또는 실험 15-2의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 당 공여체 고형물 1 그램당 1 단위 가하고, 이것을 30℃, pH 6.0(아르드로박터 글로비포르미스 A19 효소의 경우, pH 8.4)에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 후의 반응액을, 수용체가 단당 또는 2당인 경우는 가스 크로마토그래피법(이하, 간단히 「GLC법」이라 함)에 의하고, 수용체가 3당 이상인 경우는 HPLC법으로 분석하고, 각각의 당질이 이 효소의 전이 수용체가 되는지를 확인하였다.
그리고 GLC에 있어서, GLC 장치는 『GC-16A』(일본국의 일본국의 주식회사 島津제작소제), 칼럼은 지·엘·사이언스 주식회사제 『2％ 실리콘 OV-17/크로모조르브 W』를 충전한 스테인레스제 칼럼(3mmΦ×2m), 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40ml/분으로 하여 160℃로부터 320℃까지 7.5℃／분의 속도로 승온하고, 검출은 수소염 이온 검출기로 분석하였다. HPLC에서는, HPLC 장치는 일본국의 Tosoh 주식회사제 『CCPD』, 칼럼은 『ODS-AQ-303』(주식회사 와이 에무 시사제), 용리액은 물을 유속 0.5ml/분으로 하여, 검출은 시차(示差) 굴절계로 분석하였다. 그 결과를 표 28에 나타낸다.
[표 28]
당 질 전 이 생 성 물
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소
D-글루코오스 + + + +
D-크실로오스 ++ ++ ++ +
L-크실로오스 ++ ++ ++ +
D-갈락토오스 + + + ±
D-프룩토오스 + + + +
D-만노오스 - - - ±
D-아라비노오스 ± ± ± ±
D-푸코오스 + + + ±
D-프시코오스 + + + +
L-소르보오스 + + + +
L-람노오스 - - - -
메틸―α-글루코시드 ++ ++ ++ ++
메틸―β-글루코시드 ++ ++ ++ ++
N-아세틸글루코사민 + + + -
소르비톨 - - - -
트레할로오스 ++ ++ ++ ++
이소말토오스 ++ ++ ++ +
이소말토트리오스 ++ ++ ++ ±
셀로비오스 ++ ++ ++ ++
겐티비오스 ++ ++ ++ +
글리세롤 + + + +
말티톨 ++ ++ ++ ++
락토오스 ++ ++ ++ ++
수크로오스 ++ ++ ++ ++
α-사이클로덱스트린 - - - -
β-사이클로덱스트린 - - - -
γ-사이클로덱스트린 - - - -
L-아스코르브산 + + + +

표 중에서,
「-」은 수용체에의 당전이물이 검출되지 않은 것을 나타내고,
「±」은 수용체에의 당전이물이 검출되었지만, 그 생성량이 1％ 미만이었음을 나타내고,
「+」는 수용체에의 당전이물이 1 이상 10％ 미만이었음을 나타내고,
「++」은 수용체에의 당전이물이 10％ 이상이었음을 나타낸다.
표 28의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 전이 수용체로서 여러가지의 당질을 이용할 수 있고, 바실루스 글로비스포루스 C9, C11, N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소는, 특히, D-/L-크실로오스, 메틸―α-글루코시드, 메틸-β-글루코시드, α,α-트레할로오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서, D-글루코오스, D-프룩토오스, D-푸코오스, D-프시코오스, L-소르보오스, N-아세틸글루코사민, 글리세롤 및 L-아스코르브산에 전이하며, 더욱이는, D-아라비노오스에도 전이하는 것이 밝혀졌다. 아르드로박터 글로비포르미스 A19 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소는, 특히, 메틸―α-글루코시드, 메틸―β-글루코시드, α,α-트레할로오스, 셀로비오스, 말티톨, 락토오스 및 수크로오스에 잘 전이하고, 이어서, D-글루코오스, D-/L-크실로오스, D-프룩토오스, D-프시코오스, L-소르보오스, 이소말토오스, 겐티비오스, 글리세롤 및 L-아스코르브산에 전이하며, 더욱이는, D-갈락토오스, D-만노오스, D-아라비노오스, D-푸코오스 및 이소말토트리오스에도 전이하는 것이 밝혀졌다.
이상에서 설명한 α-이소말토실글루코 당질 생성효소의 성질에 대해서, 먼저 보고되어 있는 6-글루코실 전이작용을 가진 효소, 『Bioscience Biotechno1ogy and Biochemistry』, 제56권, 169 내지 173페이지(1992년)에 기재한 덱스트린·덱스트라나아제 및 『일본 농예화학회지』, 제37권, 668 내지 672 페이지(1963년)에 기재한 트란스글루코시다아제와 비교하였다. 그 결과를 표 29에 정리하였다.
[표 29]
성질 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 덱스트린·덱스트라나아제 트란스글루코시다아제
C9 효소 C11 효소 N75 효소 A19 효소 (대조) (대조)
가수분해 능력 가수분해 않음 가수분해 않음 가수분해 않음 가수분해 않음 가수분해 않음 주로 가수분해함
최적 pH 6.0∼6.5 6.0 6.0 8.4 4.0∼4.2 3.5
EDTA에 의한 저해 저해됨 저해됨 저해됨 저해됨 저해되지 않음 저해되지 않음
표 29로부터 명확한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소는 기지의 덱스트린·덱스트라나아제나 트란스글루코시다아제와는 전혀 다른 신규의 이화학적 성질을 가진 것이 밝혀졌다.
실험 25 <환상 4당의 생성>
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 α-이소말토실 전이효소의 작용에 의한 환상 4당 생성시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 아밀로오스, 가용성 전분, 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제) 또는 글리코겐(굴 유래, 일본국의 和光純藥 주식회사 판매)의 용액을 조제하였다.
이들 수용액(농도 0.5％)에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위를 가하고, 이들을 30℃, pH 6.0에서 작용시켰다. 작용 조건은 아래의 4가지의 계(系)에서 실시하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활(熱失活)하고, 계속하여 α-이소말토실 전이효소를 24시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활하였다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 24시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활하였다.
(3) α-이소말토실글루코 당질 생성효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열실활하였다.
(4) α-이소말토실 전이효소만을 24시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활하였다.
이들 열 실활시킨 반응액 중의 환상 4당의 생성량을 조사하기 위해서, 실험 1과 마찬가지로 하여 α-글루코시다아제·글루코아밀라아제 처리하고, 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그것들의 결과를 표 30에 나타낸다.
[표 30]
기 질 환상 4당 생성량 (%)
α-이소말토실글루코 당질 생성효소 작용후, α-이소말토실 전이효소를 작용 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 동시에 작용 α-이소말토실 글루코 당질 생성효소만을 작용 α-이소말토실글루코 전이효소만을 작용
말토오스 4.0 4.2 0.0 0.0
말토트리오스 10.2 12.4 0.0 0.0
말토테트라오스 11.3 21.5 0.0 0.0
말토펜타오스 10.5 37.8 0.0 0.0
아밀로오스 3.5 31.6 0.0 0.0
가용성 전분 5.1 38.2 0.0 0.0
전분 부분 분해물 6.8 63.7 0.0 0.0
글리코겐 10.2 86.9 0.0 0.0

표 30의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어느 당질도 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 또는 α-이소말토실 전이효소만의 작용으로는 환상 4당은 전혀 생성하지 않은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용하면 환상 4당이 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시킨 후에 α-이소말토실 전이효소를 작용시켰을 경우에는 약 11％ 이하로서 비교적으로 적은 것에 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 병용하면 어느 당질의 경우도 환상 4당의 생성량은 향상하고, 특히, 글리코겐의 경우, 약 87％로 증가하며, 전분 부분 분해물의 경우에는 약 64％로 증가하는 것이 판명되었다.
이 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 의한 환상 4당의 생성 메커니즘은, 양쪽 효소의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추측된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성효소는, 글리코겐이나 전분 부분 분해물등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인을 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 3위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인을 생성한다.
(3) 계속해서, α-이소말토실 전이효소는, 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 분자내 전이작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 α-1,4 글루칸 체인으로부터 떼어버리고, 환상화해서 환상 4당을 생성한다.
(4) 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1)에서부터 (3)의 반응을 받음으로써 다시 환상 4당이 생성한다.
α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 의해, 상기한 바와 같이 양쪽 효소가 반복해서 작용하여, 환상 4당의 생성량이 증가한다고 추측되었다.
실험 26 <전분액화 정도의 영향>
옥수수 전분을 농도 15％ 전분유(澱粉乳)로 해서 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 첨가하고 pH 6.0으로 조정하여, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』 ; 노보사제)를 전분 1 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하여 95℃에서 10분간 반응시키고, 이어서, 120℃에서 20분간 오토클레이브하여 약 35℃로 급냉하고, DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 고형물 1 그램당 2 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 20 단위를 가하고, 35℃에서 24시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그것들의 결과를 표 31에 나타낸다.
[표 31]
α-아밀라아제 사용량 전분당(當) (%) DE 환상 4당 생성율 (%)
0.2 3.2 54.5
0.4 4.8 50.5
0.6 7.8 44.1
1.0 12.5 39.8
1.5 17.3 34.4
2.0 20.5 30.8
표 31의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소의 병용에 의한 환상 4당의 생성은 전분의 액화의 정도에 의존하고, 액화의 정도가 낮을 수록, 즉, DE가 낮은 값일 수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높을 수록, 즉, DE가 높은 값일수록 전분으로부터의 환상 4당의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 DE 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 밝혀졌다.
실험 27 <전분 부분 분해물 농도의 영향>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』(DE 약 2 내지 약 5)의 최종 농도 0.5 내지 40％의 수용액을 조제하고, 각각에, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위 가하고, 이들 두 효소를 병용해서 30℃, pH 6.0에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하여 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하고, HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그것들의 결과를 표 32에 나타낸다.
[표 32]
파인덱스 농도 (%) 환상 4당 생성량(%)
0.5 63.6
2.5 62.0
5 60.4
10 57.3
15 54.6
20 51.3
30 45.9
40 39.5

표 32의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 0.5％인 저농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 64％인 것에 대해, 농도 40％의 고농도에서는 환상 4당의 생성량은 약 40％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 환상 4당의 생성량이 변화되는 것이 밝혀졌다. 이 결과로부터, 환상 4당의 생성량은 전분 부분 분해물이 저농도일수록 높아지는 경향에 있는 것이 밝혀졌다.
실험 28 <시클로덱스트린글루카노트란스페라아제 첨가 효과>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』 수용액(농도 15％)을 조제하고, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 고형물 1 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 C11주 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소 표품을 고형물 1 그램당 10 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래 시클로덱스트린글루카노트란스페라아제(CGTase)를 고형물 1 그램당 0 내지 0.5 단위 가하고, 이들 두 효소를 병용해서 30℃, pH 6.O에서 48시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 계속해서, 실험 1과 마찬가지로 α-글루코시다아제 및 글루코아밀라아제를 사용해서 처리하고, 잔존하는 환원성 올리고당을 가수분해하여 HPLC법으로 환상 4당을 정량하였다. 그것들의 결과를 표 33에 나타낸다.
[표 33]
CGTase 첨가량 (단위) 환상 4당 생성량 (%)
0 54.6
2.5 60.1
5 63.1
10 65.2

표 33의 결과로부터 명백한 바와 같이, CGTase를 첨가함으로써 환상 4당의 생성량이 증가하는 것이 밝혀졌다.
실험 29 <이소말토오스 유리 효소의 조제>
덱스트란 3.Ow/v％, 펩톤 0.7w/v％, 인산 2칼륨 0.2w/v％, 황산 마그네슘·7수염 0.05w/v％ 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 121℃에서 20분간 오토클레이브 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 글로비포르미스 T6(IAM 12103)을 접종하고, 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣고 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1v/v％을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0로 유지하면서 72시간 통기 교반 배양하였다. 배양 후, 배양액중의 이소말토오스 유리 효소로서의 이소말토덱스트라나아제의 활성은 약 16.5 단위/ml이며, 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, 이 효소는 약 16 단위/ml의 활성(총 활성 약 288,000 단위)이었다.
그리고 이소말토덱스트라나아제 활성의 측정은, 농도 0.1M 아세트산 완충액(pH 5.5)을 함유하는 농도 1.25w/v％ 덱스트란 수용액 4ml를 기질액으로 하고, 그 기질액에 효소액 1ml을 가해서 40℃에서 20분간 효소반응하고, 그 반응액으로부터 1ml을 채취하여 그것을 소모기-구리액 2ml에 가해서 반응을 정지시킨 후, 생성한 이소말토오스의 환원력을 소모기-넬슨법으로 정량함으로써 하였다. 이소말토덱스트라나아제의 활성 1 단위는, 상기의 조건하에서 1분간에 1μ몰의 이소말토오스에 상당하는 환원력을 생성하는 효소량으로 정의하였다. 배양 상청 약 18L을 UF막으로 약 2L로 농축한 후, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조효소액 약 400ml을 얻었다. 이 조효소액을 『Sepabeads FP-DA13』 겔을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피(겔량 2L)에 사용하였다. 이소말토덱스트라나아제 활성은, Sepabeads FP-DA13 겔에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하였다. 이 활성획분을 회수하고, 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치하였다. 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수하여 5mM 인산 완충액(pH 6.8)에 용해 후, 이 완충액에 대하여 투석하여 이소말토덱스트라나아제 활성으로서 161,000 단위를 함유하는 부분 정제 효소액 약 500ml을 얻었다.
실험 30 <α-이소말토실글루코 당질 및 환상 4당으로부터의 이소말토오스의 조제>
최종 고형물 농도 0.2％의 파노오스, α-이소말토실말토오스, α-이소말토실트리오스, α-이소말토실테트라오스 또는 환상 4당수용액에, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를, 고형물 그램당 100 단위(환상 4당의 경우, 100 단위 또는 3,000 단위)를 가하고, 40℃, pH 5.5에서 24시간 작용시키고, 100℃에서 2O분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는, 『MCI GEL CKO4SS』 칼럼(일본국의 三菱화학 주식회사제)을 이용하고, 칼럼내 온도 80℃, 용리액으로서의 물의 유속 0.5ml/분의 조건에서 하고, 검출은 시차 굴절계 『RI-8012』(일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 그 결과를 표 34에 나타낸다.
[표 34]
기질 효소량 (단위) 빈응에서 생긴 당질 (HPLC 면적 %)
G1 IM G2 G3 G4 A
IMG1 100 35 65 0 0 0 0
IMG2 100 0 51 49 0 0 0
IMG3 100 0 41 0 59 0 0
IMG4 100 0 35 0 0 65 0
환상 4당 100 0 22 0 0 0 78
3000 0 100 0 0 0 0
표 중에서, IMGl, IMG2, IMG3, IMG4는, 각각, 파노오스, α-이소말토실말토오스, α-이소말토글루코트리오스, 이소말토글루코테트라오스를 의미하고, G1, IM, G2, G3, G4는, 각각, 글루코오스, 이소말토오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스를 의미하며, A는 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성하는 과정에서의 중간체를 의미한다.
표 34의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질에 이소말토덱스트라나아제를 작용시킨 결과, 기질로서의 파노오스로부터는 글루코오스와 이소말토오스만이 생성하고, 기질로서의 α-이소말토실말토오스로부터는 이소말토오스와 말토오스만이 생성하며, 기질로서의 α-이소말토실트리오스로부터는 이소말토오스와 말토트리오스만이 생성하고, 기질로서의 α-이소말토실테트라오스로부터는 이소말토오스와 말토테트라오스만이 생성하는 것이 밝혀졌다. 한편, 기질로서의 환상 4당으로부터는 생성물 A를 중간체로 하여, 이소말토오스만이 생성하는 것이 밝혀졌다.
이어서, 기질로서의 환상 4당으로부터의 중간체인 생성물 A의 정제와 단리를 하였다. 즉, 분취용 HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-AR355-15S-15 12A』(주식회사 와이 에무 시사제)을 사용해서 생성물 A를 정제하여 단리함으로써, 상기의 환상 4당으로부터의 반응물로부터 순도 98.2％ 이상의 생성물 A를 고형물당 수율 약 7.2％로 얻었다.
생성물 A에 대해서, 통상적인 방법을 따라서 메틸화 분석과 NMR분석을 하였다. 메틸화 분석 결과는 표 35에 정리하였다. NMR 분석 결과에 대해서는 1H-NMR 스펙트럼을 도 46에 나타내었다. 또한, 13C-NMR 스펙트럼을 도 47에 나타내고, 그것들의 귀속을 표 36에 정리하였다.
[표 35]
분석 메틸화물의 종류 조성비
2,3,4-트리메틸화물 2.00
2,4,6-트리메틸화물 0.92
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.88

[표 36]
글루코오스 번호 탄소 번호 NMR 화학 시프트값 (ppm)
a 1a 100.7
2a 74.2
3a 75.8
4a 72.3
5a 74.5
6a 63.2
b 1b 102.1
2b 74.3
3b 75.9
4b 72.6
5b 74.2
6b 68.0
c 1c 100.6
2c 72.8
3c 83.0
4c 72.0
5c 73.1
6c 62.9
e 1e 94.9(α), 98.8(β)
2e 74.1(α), 76.6(β)
3e 75.8(α), 78.7(β)
4e 72.1(α), 72.1(β)
5e 72.6(α), 76.9(β)
6e 68.3(α), 68.3(β)
이들 결과로부터, 이소말토덱스트라나아제에 의한 환상 4당으로부터 이소말토오스를 생성할 때의 중간체인 생성물 A는, 환상 4당의 α-1,3 결합의 어느 하나가 가수분해해서 개환화한 4당류이고, 구조식 3으로 나타내어지는 α-글루코실- (1→6)-α-글루코실-(1→3)-α-글루코실-(1→6)-α-글루코오스(개환 4당)인 것이 밝혀졌다.
구조식 3:
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp
이상으로부터, 이소말토덱스트라나아제의 α-이소말토실글루코 당질에 대한 작용은 아래와 같이 판단된다.
이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 비환원 말단에 6-0-α-글루코실기를 가진 α-이소말토실글루코 당질에 작용하여 그 비환원 말단의 이소말토실 잔기와 글루코오스(말토올리고당) 잔기 사이의 α-1,4 결합을 특이적으로 가수분해함으로써 이소말토오스와 글루코오스(말토올리고당)를 생성한다. 또한, 이소말토덱스트라나아제는, 기질로서, 환상 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하여 개환함으로써 중간체로서 개환 4당을 생성하고, 또한, 개환 4당에도 작용하여 그 α-1,3 결합을 가수분해하여 이소말토오스를 생성한다.
실험 31 <각종 기질로부터의 이소말토오스의 생성>
각종 당질을 사용하여 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 및 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의한 이소말토오스의 생성에 대해서 시험하였다. 즉, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 아밀로오스, 또는 전분 부분 분해물(상품명 『파인덱스 #100』, 일본국의 松谷화학 주식회사제)과 염화 칼슘을 사용하고, 각각 수용액의 당질 최종 농도가 5％, 염화 칼슘 최종 농도가 1mM이 되도록 조제하였다.
이어서, 실험 7-2에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이 소말토실글루코 당질 생성효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위를 가하고, 이들을 40℃, pH 5.5에서 반응시켰다. 반응 조건은 아래의 두가지 계(系)에서 하였다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 당질에 65시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활하고, 계속하여 이소말토덱스트라나아제를 65시간 작용시킨 후, 효소를 열 실활하였다.
(2) α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용하여 당질에 65시간 작용시킨 후, 이들 두 효소를 가열 실활하였다.
이어서, 가열 처리한 효소 반응액 중의 이소말토오스 생성량을 HPLC법으로 정량하였다. 그것들의 결과를 표 37에 나타낸다.
[표 37]
기 질 이소말토오스 생성량 (%)
α-이소말토실글루코 당질 생성효소 작용시킨 후, 이소말토덱스트라나아제를 작용 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제를 병용
말토오스 6.6 7.0
말토트리오스 15.7 18.7
말토테트라오스 15.8 45.4
말토펜타오스 15.3 55.0
말토헥사오스 10.1 58.1
말토헵타오스 8.5 63.6
아밀로오스 4.0 64.9
전분 부분 분해물 3.8 62.7

표 37의 결과로부터 명백한 바와 같이, 시험한 어느 당질로부터도 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제의 작용에 의해 이소말토오스가 생성하였다. 그 생성량은, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시킨 후에 이소말토덱스트라나아제를 작용시켰을 경우에는 약 15％ 이하로서 비교적 낮은데 대해서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제를 동시에 작용시키면 어느 당질에 있어서도 이소말토오스의 생성량은 향상하고, 특히, 말토헵타오스, 아밀로오스, 전분 부분 분해물에서는 60％ 이상까지 증가하는 것이 밝혀졌다. 이 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에 있어서의 이소말토오스의 생성 메커니즘은 이들 두 효소의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추정된다.
(1) α-이소말토실글루코 당질 생성효소는, 아밀로오스나 전분 부분 분해물 등의 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기에 작용하여 그 글루코오스기를 다른 α-1,4 글루칸 체인의 비환원 말단 글루코오스기의 6 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜, 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인을 생성한다.
(2) 이소말토덱스트라나아제는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 α-1,4 글루칸 체인에 작용하여 그 이소말토실기와 α-1,4 글루칸 체인 사이의 α-1,4 결합을 가수분해함으로써, 이소말토오스와 글루코오스 중합도가 2 감소한 글루칸 체인을 생성한다.
(3) 떼어버려진 α-1,4 글루칸 체인은, 다시, (1) 내지 (2)의 반응을 받음으로써, 새롭게 이소말토오스가 생성한다.
α- 이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제의 병용에 의해, 상기한 바와 같이, 양쪽 효소가 반복하여 작용해서 이소말토오스의 생성량이 증가한다고 추정된다.
실험 32 <이소아밀라아제의 첨가 효과>
전분 부분 분해물 『파인덱스 ＃100』 수용액(최종농도 5％, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 실험 7-2에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험 29에서 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0 내지 250 단위 가하고, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그것들의 결과를 표 38에 나타낸다.
[표 38]
이소아밀라아제 첨가량 (단위) 이소말토오스 생성량 (%)
0 62.7
50 65.1
250 71.1

표 38의 결과로부터 명백한 바와 같이, 이소아밀라아제를 첨가함으로써 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 밝혀졌다.
실험 33 <전분 부분 분해물 농도의 영향>
농도가 다른 8 종류의 전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』(DE 약 2 내지 약 5) 수용액(최종농도 1 내지 40％의 수용액, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 각각에, 실험 7-2에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토오스 생성효소를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위 가하여, 40℃, pH 5.5에서 병용하여 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그것들의 결과를 표 39에 나타낸다.
[표 39]
파인덱스 농도 (%) 이소말토오스 생성량 (%)
1 73.0
2.5 72.8
5 71.1
10 67.0
15 63.7
20 60.7
30 55.4
40 50.7

표 39의 결과로부터 명백한 바와 같이, 전분 부분 분해물의 농도가 1％의 저농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 73％인데 대해, 농도 40％의 고농도에서는 이소말토오스의 생성량은 약 51％로서, 기질인 전분 부분 분해물의 농도에 의존해서 이소말토오스의 생성량이 변화하는 것이 밝혀졌다.
실험 34 <전분액화 정도의 영향>
옥수수 전분을 농도 15％ 전분유로 해서 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 첨가해서 pH 6.0으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.2 내지 2.0％을 가하고, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음에, 120℃에서 오토클레이브하고, 약 40℃로 급냉하여 DE 3.2 내지 20.5의 액화 용액을 얻고, 여기에 최종 전분농도 5％, pH 5.5로 조정한 후, 실험 7-2에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소 표품을 고형물 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 고형물 그램당 250 단위를 가하여, 40℃에서 65시간 반응시켰다. 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그것들의 결과를 표 40에 나타낸다.
[표 40]
α-아밀라아제 사용량 [전분 그램당의 %(w/w)] DE 이소말토오스 생성율 (%)
0.2 3.2 71.5
0.4 4.8 71.0
0.6 7.8 66.2
1.0 12.5 59.8
1.5 17.3 53.2
2.0 20.5 47.9
표 40의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 이소말토덱스트라나아제에 의한 이소말토오스 생성율은 전분의 액화도의 영향을 받고, 액화의 정도가 낮을 수록, 즉, DE가 낮은 값일 수록, 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율은 높고, 반대로, 액화의 정도가 높은, 즉, DE가 높은 값일 수록, 전분으로부터의 이소말토오스의 생성율이 낮은 것이 밝혀졌다. 구체적으로는, 전분의 부분 분해의 정도는 DE 약 20 이하, 바람직하게는 DE 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 DE 약 5 이하가 적합하다는 것이 밝혀졌다.
실험 35 <시클로덱스트린글루카노트란스페라아제와 글루코아밀라아제의 첨가 효과>
전분 부분 분해물 『파인덱스 #100』 수용액(최종농도 20％, 1mM 염화 칼슘 함유)을 조제하고, 실험 7-2에서 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, 바실루스 스테아로더어모필루스 유래 CGTase(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소)를 0 내지 0.5 단위 가하여, 이들 효소를 병용하여, 40℃, pH 5.5에서 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 계속해서, 글루코아밀라아제(상품명 『XL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고, 50℃에서 24시간 작용시킨 후, 100℃에서 20분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 생성한 이소말토오스를 HPLC법으로 정량하였다. 그것들의 결과를 표 41에 나타낸다.
[표 41]
CGTase 첨가량 (전분 그램당의 단위수) 이소말토오스 생성량 (%)
0 60.7
0.1 62.9
0.25 65.0
0.5 66.4

표 41의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 이소말토덱스트라나아제의 효소반응계에 CGTase를 첨가함으로써 이소말토오스의 생성량이 증가하는 것이 밝혀졌다. 그리고 상기 글루코아밀라아제는 CGTase 존재하에서 생성한, 이소말토오스에 1개 이상의 D-글루코오스 잔기를 결합한 당질로부터 D-글루코오스 잔기를 유리시켜 이소말토오스를 더욱이 생성시킬 목적으로 사용한 것이다.
실험 36 <이소말토오스와 이소말티톨의 생성>
옥수수 유래 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 7-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 1 단위와, 실험 7-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C11 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 전분 그램당 10 단위 가해서 48시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 이 효소 반응액의 일부를 취하여 HPLC법에 의해 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로 약 84％이었다.
그리고 HPLC법은, 『쇼덱스 KS-801 칼럼』(일본국의 일본국의 昭和電工 주식회사제)을 사용하고, 칼럼 온도 60℃, 물의 유속 0.5ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은, 시차 굴절계(상품명 『RI-8012』, 일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용해서 하였다.
이 효소 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제·아마노』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 그램당 1500 단위와, 글루코아밀라아제(상품명 『XL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 75 단위를 가해서 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 더욱이, 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하고, 온도 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시키고, 이어서, 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막(상품명 『호로셋푸 HR5155PI』, 일본국의 東洋紡績 주식회사제)을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법을 따라 탈색, 탈염, 여과, 농축함으로써, 고형분 약 3,700g을 함유하는 당액 약 6.2kg을 얻었다. 이 당액을, 이온교환 수지(상품명 『Amberlite CR-1310 [Na+형(形)]형(型)』, 오르가노사제)를 충전한 칼럼(겔량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건에서 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 상기 HPLC법으로 모니터하고, 환상 4당의 순도가 98％ 이상인 획분을 회수하여, 이것을 통상적인 방법에 따라 탈염, 탈색, 여과, 농축함으로써 고형분 약 2,500g을 함유하는 당액 약 7.5kg을 얻었다.
이 당액의 당 조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 99.5％ 이었다. 얻어진 환상 4당 함유 당액을 에바포레이터에서 농도 약 50％까지 농축한 후, 이 농축액 약 5kg을 원통상 플라스틱 용기에 넣고, 완만하게 회전시키면서 약 20시간 동안에 온도를 65℃로부터 20℃까지 강하시켜서 환상 4당을 결정 석출시켰다. 계속해서, 원심분리기를 이용해서 분밀(分蜜)하여 환상 4당 결정을 습중량으로서 1,360g 회수하고, 다시 60℃에서 3시간 건조하여 환상 4당 결정 분말을 1,170g 얻었다. 이 결정 분말의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당 결정 분말의 순도는 99.9％ 이상으로서 극히 고순도이었다.
이어서, 이 환상 4당 결정 분말을 탈이온수에 용해하고, 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험 29의 방법에서 조제한 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 500 단위 가하고 pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하여 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 0H형 이온교환 수지에 의해 탈염하고, 정제한 후, 다시 농도 약 50％로 농축하여, 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다. 이 시럽의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 고형물당, 이소말토오스 96.1％, 개환 4당 2.8％, 및 그 밖의 당질을 1.1％ 함유하고 있었다.
이 시럽상 이소말토오스 함유물(400g)을 통상적인 방법에 따라, 알칼리 전개한 라네이 니켈(상품명 『N154』, 일본국의 日揮화학사제)을 고형물 그램당 0.1 그램 가하고 오토클레이브에 넣어, 수소압을 100kg/cm2로 유지하고 100℃에서 4시간 교반하고, 계속해서 120℃에서 2시간 교반하여 수소첨가를 하였다. 방냉후, 오토클레이브로부터 수소 첨가물을 꺼내고, 두께 약 1cm의 활성탄층에 통액함으로써 라네이 니켈을 여과 제거하여, 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하고, 정제한 후, 다시 농도 약 73％로 농축하고, 이 농축액을 원통상 플라스틱 용기에 넣고, 종정으로서 결정 이소말티톨 분말을 고형물당 0.1％ 가하고 완만하게 회전시키면서 온도 35℃까지 약 20시간 동안 서냉하여 이소말티톨을 결정석출시켰다. 계속해서, 원심분리기를 사용해서 분밀(分蜜)하고, 이소말티톨 결정을 회수하여 80℃에서 20시간 진공건조해서 이소말티톨 결정을 약 168g 얻었다.
이 제품은, 순도가 고형물당 약 99.9％ 이상인 이소말티톨이었다. 이 제품의 분말 X선 회절도, 1H-NMR 스펙트럼, 및 13C-NMR 스펙트럼에 대해서 조사한 결과를 도 48 내지 도 50에 각각 나타낸다. 이들 결과로부터, 이 제품은 이소말티톨인 것으로 판단되었다.
이하, 실시예 A에서, 이소말토오스 또는 이소말토오스 함유 당질, 이소말티톨 및/또는 이소말티톨 함유 당질의 제조방법에 대해서 설명하고, 더욱이 실시예 B에서, 이소말티톨 및/또는 이소말티톨 함유 당질의 용도에 대해서 상세히 설명한다.
실시예 A-1
옥수수 유래 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 1 단위와, 실험 11-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 전분 그램당 12 단위 가해서 48시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활하였다.
이 효소 반응액의 일부를 취하여, HPLC법에 의해 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로 약 80％이었다.
한편, HPLC법은, 『쇼덱스 KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사제)을 사용하여 칼럼 온도 60℃, 물의 유속 0.5ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계(상품명 『RI-8012』, 일본국의 Tosoh 주식회사제)를 이용해서 하였다. 이 효소 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제·아마노』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 그램당 1500 단위와, 글루코아밀라아제(상품명 『XL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 75 단위를 가해서 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 다시 수산화 나트륨으로 pH를 5.8로 조정하고, 온도 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시킨 후에 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막(상품명 『호로셋푸 HR5155PI』, 일본국의 東洋紡績 주식회사제)을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라, 탈색, 탈염, 여과, 농축함으로써 고형분 약 3,500g을 함유하는 당액 약 6.Okg을 얻었다.
이 당액을 이온교환 수지(상품명 『Amberlite CR-1310(Na+형)형』, 오르가노사제)를 충전한 칼럼(겔량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건에서 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 상기 HPLC법으로 모니터하고, 환상 4당의 순도가 80％ 이상인 획분을 회수하여 이것을 통상적인 방법에 따라 탈염, 탈색, 여과, 농축하여 당액을 얻었다.
이 당액의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 환상 4당의 순도는 약 95.5％이었다. 얻어진 환상 4당 함유 당액을 감압건조하여 환상 4당 함유 분말을 얻었다. 이어서, 이 환상 4당 함유 분말을 탈이온수에 용해하여 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험 29의 방법으로 조제한 이소말토오스 유리 효소를 고형물 그램당 80 단위 가하고 pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하고, 정제하고, 다시 농도 약 43.O％로 농축함으로써, 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이 시럽의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 고형물당, 이소말토오스를 43.1％, 개환 4당을 37.8％, 환상 4당을 13.8％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-2
실시예 A-1의 방법으로 얻어진 환상 4당 함유 분말을 탈이온수에 용해하고, 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험 29의 방법으로 조제한 이소말토오스 유리 효소를 고형물 그램당 500 단위 가하고, pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농도 약 75％로 농축하여 시럽상 이소말토오스 고함유물을 고형물당 약 90％의 수율로 얻었다. 이 시럽의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 고형물당, 이소말토오스 92.8％, 개환 4당 2.7％, 및 그 밖의 당질을 4.5％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-3
옥수수 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가하여 pH 6.5으로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 더욱이 약 50℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 고형물 그램당 100 단위와, 슈우도모나스 아밀로데라모사스 유래 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, 바실루스 스테아로더어모필러스 유래 CGTase(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소)를 0.5 단위 첨가하고, 50℃, pH 5.5에서 65시간 작용시킨 후, 100℃에서 15분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 계속해서, 글루코아밀라아제(상품명 『XL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하고, 50℃에서 24시간 작용시킨 후, 100℃에서 20분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 반응물을 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농도 약 60％로 농축하여 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다. 이 시럽의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 고형물당, 이소말토오스를 62.9％, 글루코오스를 30.1％, 기타의 당을 7.0％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-4
실시예 A-3의 방법으로 얻어진 이소말토오스 고함유 시럽을 원당액(原糖液)으로 하고, 이소말토오스의 순도를 높이기 위해서, 강산성 캐타이온 교환 수지(상품명 『Amberlite CR-1310』(Na+형), 오르가노 주식회사제)를 사용해서 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 즉, 상기 수지를 내경 12.5cm의 재킷 부착 스테인레스제 칼럼 10개에 충전하고, 이들 칼럼을 직렬접속해서 수지층 전장(全長)을 16m로 하였다. 칼럼내 온도를 40℃로 유지하면서 상기 시럽을 수지량에 대하여 1.5v/v％ 가하고, 여기에 40℃의 온수를 SV O.2로 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하면서 이소말토오스 고함유 획분을 채취하여 이것을 정제하고, 농도 약 75％까지 농축함으로써 고형물당, 글루코오스 4.3％, 이소말토오스 90.5％, 기타의 2당류를 3.5％, 3당류 이상을 1.7％ 함유하는 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 45％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 우수한 보습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-5
실시예 A-1의 방법으로 얻어진 시럽상 이소말토오스 함유물을 실험 36의 방법에 준해서 수소첨가한 후, 통상적인 방법을 따라서 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농도 약 73％로 농축하고, 이것을 통상적인 방법을 따라서 분무건조해서 이소말티톨 43.3％, 환원 개환(開環) 4당 37.8％, 환상 4당 13.8％, 및 소르비톨 등의 기타의 당 알코올을 3.5％ 함유하는 이소말티톨 고함유 분말을 약 80％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 실질적으로 비환원성이고, 비(非)메일라아드성, 비흡습성, 저감 미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난(難)발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-6
타피오카 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘을 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 더욱이 약 40℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 실험 4-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 C9 유래의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 0.2 단위와, 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 첨가하여 pH 5.5, 온도 40℃에서 64시간 반응시켰다. 이 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음에, 글루코아밀라아제제(상품명 『글루코팀』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 고형물 그램당 10 단위 가하고 24시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 더욱이 농도 약 50％(w/v)까지 농축함으로써 글루코오스 11.0％,이소말토오스 66.5％, 기타의 2당류를 2.4％, 3당류 이상을 20.1％ 함유하는 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이어서, 이 이소말토오스 고함유 시럽을 실험 36의 방법에 준해서 수소첨가한 후, 통상적인 방법에 따라, 라네이 니켈을 제거하고, 활성탄으로 탈색하여, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농축, 진공건조해서 이소말티톨 고함유 분말을 고형물당 약 85％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 소르비톨 12.3％, 이소말티톨 66.7％, 기타의 당 알코올을 21.0％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 비환원성, 비(非)메일라아드성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-7
바실루스 글로비스포루스 C9(FERM BP-7143)를 실험 1의 방법에 준하여 퍼멘터에서 48시간 배양하였다. 배양 후, SF막을 사용해서 제균(除菌) 여과하여 약 18L의 배양여액을 회수하고, 다시, 그 여액을 UF막 농축함으로써, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 8.8 단위/ml와 α-이소말토실 전이효소를 26.7 단위/ml를 함유하는 농축 효소액 약 1L을 회수하였다.
옥수수 전분을 농도 약 27％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제(상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시키고, 이어서 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 더욱이 약 40℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화액을 얻고, 여기에 상기 α-이소말토실글루코 당질 생성효소와 α-이소말토실 전이효소를 함유하는 농축 효소액을 전분 그램당 0.25ml의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 실험 29의 방법으로 얻은 이소말토덱스트라나아제를 전분 그램당 100 단위와, 이소아밀라아제(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 250 단위와, CGTase(일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제)를 전분 그램당 0.5 단위가 되도록 가하여 pH 5.5, 온도 40℃에서 70시간 반응시켰다.
그 반응액을 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 온도 50℃로 조정한 다음에, 글루코아밀라아제제(상품명 『글루코팀』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 20 단위 가하여 24시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분 유지한 후, 냉각하고 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농도 약 50％까지 농축함으로써, 고형물당, 글루코오스 32.6％, 이소말토오스 59.4％, 기타의 2당류를 1.2％, 3당류 이상을 6.8％ 함유하는 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다.
이어서, 이 이소말토오스 고함유 시럽을 실험 36의 방법에 준해서 수소첨가한 후, 통상적인 방법에 따라, 라네이 니켈을 제거하여 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 더욱이 농도 약 50％까지 농축해서 이소말티톨 고함유 시럽을 고형물당 약 85％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 소르비톨 33.4％, 이소말티톨 59.1％, 기타의 당 알코올을 6.4％, 환상 4당을 1.1％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 비환원성, 비(非)메일라아드성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-8
실시예 A-7의 방법으로 얻어진 이소말토오스 고함유 시럽을 원당액으로 하고, 이소말토오스의 순도를 높이기 위해서, 강산성 캐타이온 교환 수지(상품명 『Amberlite CR-1310』(Na+형), 오르가노 주식회사제)를 사용해서 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 즉, 상기 수지를 내경 12.5cm의 재킷 부착 스테인레스제 칼럼 10개에 충전하고, 이들 칼럼을 직렬접속해서 수지층 전장을 16m로 하였다. 칼럼내 온도를 40℃로 유지하면서, 상기 시럽을 수지량에 대하여 1.5v/v％ 가하고, 여기에 40℃의 온수를 SV O.2로 흘려서 분획하고, 용출액의 당조성을 HPLC법으로 모니터하면서 이소말토오스 고함유 획분을 채취하여 이것을 정제하고, 농도 약 55％까지 농축함으로써, 고형물당, 글루코오스 4.8％, 이소말토오스 88.0％, 기타의 2당류를 4.1％, 3당류 이상을 3.1％ 함유하는 이소말토오스 고함유 시럽을 고형물당 약 55％의 수율로 얻었다.
이어서, 얻어진 이소말토오스 고함유 시럽을 실험 36의 방법에 준해서 수소 첨가한 후, 통상적인 방법에 따라, 라네이 니켈을 제거하여 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제함으로써 소르비톨 4.9％, 이소말티톨 88.1％, 기타의 당 알코올을 7.0％ 함유하는 이소말티톨 고함유 시럽을 고형물당 약 90％의 수율로 얻었다.
이 이소말티톨 고함유 시럽을 농도 약 73％로 농축하고, 이 농축액을 결정 석출관(晶析罐)에 넣고, 종정으로서 결정 이소말티톨 분말을 고형물당 0.1％ 가하여 온도 25℃, 약 20시간 동안 이소말티톨을 결정 석출시켰다. 계속해서, 원심분리기를 사용해서 분밀(分蜜)하여 이소말티톨 결정과 밀(蜜)을 따로따로 회수하였다. 이소말티톨 결정을 80℃에서 20시간 진공건조하여 이소말티톨 결정 분말을 고형물당 약 39％의 수율로 얻었다. 밀(蜜)은, 이소말티톨의 순도를 높이기 위해서, 상기 방법에 준해서 염형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 고형물당, 이소말티톨을 약 88％ 함유하는 이소말티톨 고함유 획분을 채취하고, 이것을 정제하여 농축하고, 결정화함으로써 분밀(分蜜)해서 이소말티톨 결정을 회수하고, 숙성하여 진공건조함으로써 이소말티톨 결정 분말을 고형물당 약 20％의 수율로 얻고, 이 결정 분말과, 먼저 얻었던 결정 분말을 잘 혼합함으로써, 양쪽 수율을 합계해서 약 59％의 고형물 수율로 이소말티톨 결정 분말을 얻었다.
이 제품은, 고형물당, 소르비톨 0.7％, 이소말티톨 98.0％, 기타의 당 알코올을 1.3％ 함유하고 있었다.
이 제품은, 비환원성, 비흡습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-9
옥수수 유래 피토글리코겐(큐피 주식회사제)의 수용액(약 100L)을 농도 4w/v％, pH 6.0, 온도 30℃로 조정한 후, 실험 11-2의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 전분 그램당 1 단위와, 실험 11-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 정제 α-이소말토실 전이효소를 전분 그램당 12 단위 가해서 48시간 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 열처리해서 효소를 실활하였다. 이 효소 반응액의 일부를 취하여 HPLC법에 의해 환상 4당의 생성량을 조사한 결과, 당조성으로 약 80％이었다.
그리고 HPLC법은, 『쇼덱스 KS-801 칼럼』(일본국의 昭和電工 주식회사제)을 사용하여 칼럼 온도 60℃, 물의 유속 0.5ml/분의 조건에서 실시하고, 검출은 시차 굴절계(상품명 『RI-8012』, 일본국의 Tosoh 주식회사제)를 사용해서 하였다.
이 효소 반응액을 pH 5.0, 온도 45℃로 조정한 후, α-글루코시다아제(상품명 『트란스글루코시다아제·아마노』, 일본국의 天野 엔자임 주식회사제)를 전분 그램당 1500 단위와, 글루코아밀라아제(상품명 『XL-4』, 일본국의 나가세 생화학공업 주식회사제)를 전분 그램당 75 단위를 가해서 24시간 반응시켜 잔존하는 환원성 올리고당 등을 가수분해하고, 더욱이, 수산화 나트륨으로 pH를 5.8으로 조정하여 온도 90℃에서 1시간 유지해서 효소를 실활시키고, 이어서, 불용물을 여과하여 제거하였다. 이 여액을 역침투막(상품명 『호로셋푸 HR5155PI』, 일본국의 東洋紡績 주식회사제)을 사용해서 고형분 농도 약 16％까지 농축한 후, 통상적인 방법에 따라, 탈색, 탈염, 여과, 농축해서 당액을 얻었다. 이 당액을, 농도 1％, pH 5.5, 온도 50℃로 조정한 후, 실험 29의 방법으로 조제한 이소말토덱스트라아제를 고형물 그램당 80 단위 가하여 pH 5.5, 50℃에서 70시간 반응시켰다. 95℃로 가열하여 10분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻게 되는 여액을, 통상적인 방법에 따라, 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 다시 농도 약 43.0％로 농축하여 시럽상 이소말토오스 함유물을 고형물당 약 95％의 수율로 얻었다. 이 시럽의 당조성을 HPLC법으로 측정한 결과, 고형물당, 이소말토오스를 약 35.5％ 함유하고 있었다.
이 시럽상 이소말토오스 함유물을 실험 36의 방법에 준해서 수소첨가한 후, 통상적인 방법에 따라서 라네이 니켈을 제거하여 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 농도 약 40％까지 농축하고, 이 농축액을 이온교환 수지(상품명 『Amberlite CR-1310[Na+형(形)]형(型)』, 오르가노사제)을 충전한 칼럼(겔량 약 225L)에 사용하고, 칼럼 온도 60℃에서 유속 약 45L/h의 조건에서 크로마토 분리를 하였다. 용출액의 당조성을 상기 HPLC법으로 모니터하고, 이소말티톨의 순도가 50％ 이상인 획분을 회수하여, 이것을 통상적인 방법에 따라, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염하여 정제하고, 더욱 탈색, 여과하여 고형물 농도 약 50％까지 농축함으로써, 고형물당 이소말티톨 65.3％, 환원 개환 4당 13.8％, 환상 4당 5.2％, 및 소르비톨 등의 기타의 당 알코올을 15.7％ 함유하는 이소말티톨 고함유 시럽을 고형물당 약 78％의 수율로 얻었다.
이 제품은, 비(非)메일라아드성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 A-10
실시예 A-8에서 얻어진 소르비톨 4.9％, 이소말티톨 88.1％, 기타의 당 알코올을 7.0％ 함유하는 이소말티톨 고함유 시럽을 농도 약 88％로 농축한 후, 결정 석출관에 넣고, 이소말티톨 분말결정을 2％ 첨가해서 50℃로 하여 천천히 교반하면서 2시간 유지한 후, 배트(vat)에 옮기고, 20℃에서 4일간 정치하여 결정석출 고화시키고, 이어서 절삭형 분쇄기로 분쇄하고, 건조하여 이소말티톨 결정 분말을 수율 약 90％로 얻었다.
이 제품은, 비환원성, 비흡습성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 각종 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-1 <감미료>
실시예 A-8의 방법에 의해 얻어진 이소말티톨 결정 분말 0.8 중량부에, α,α-트레할로오스 함수결정(등록상표 『Treha』, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 0.2 중량부, α-글리코실스테비오시드(상품명 『αG스위트』, 일본국의 東洋精糖 주식회사 판매) 0.01 중량부, 및 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르(상품명 『아스파르템』) 0.01 중량부를 균일히 혼합하고, 과립 성형기에서 과립상 감미료를 얻었다.
이 제품은, 난(難)흡습성이고, 우수한 보습성, 저감미성을 가지며, 실온 보존하여도 변질 열화의 우려가 없는 안정한 이소말티톨 함유 감미료이다.
실시예 B-2 <하드 캔디>
농도 55％ 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-7의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 50 중량부를 가열 혼합하고, 이어서 감압하에서 수분 2％ 미만이 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 0.6 중량부 및 적당량의 레몬 향료와 착색료를 혼화하고, 통상적인 방법에 따라서 성형해서 하드 캔디를 얻었다.
이 제품은 메일라아드 반응에 의한 착색이 적고, 씹는 느낌, 정미(呈味) , 풍미도 양호하고, 수크로오스의 결정석출도 일어나지 않으며, 흡습성이 적은 안정하고 고품질의 하드 캔디이다.
실시예 B-3 <츄잉검>
츄잉 검 베이스 3 중량부를 연해질 정도로 가열 용융하고, 여기에 무수결정 말티톨 2 중량부, 크실리톨 2 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 2 중량부, 및 α,α-트레할로오스 함수결정 1 중량부를 가하고, 더욱이 적당량의 향료와 착색료를 혼합하여, 통상적인 방법에 따라, 롤에 의해 섞어 개고, 성형, 포장해서 츄잉검을 얻었다.
이 제품은, 텍스처, 정미, 풍미가 양호하고, 낮은 충치 유발성, 저칼로리의 츄잉검으로서 적합하다.
실시예 B-4 <초콜렛>
카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부, 및 실시예 A-8의 방법으로 얻은 이소말티톨 결정 분말 50 중량부를 혼합하고, 얻게 되는 혼합물을 리파이너를 통과시켜 점도를 내린 후, 콘체에 넣어서 50℃에서 2일 주야로 혼련하였다. 그동안에 레시틴 0.5 중량부를 첨가해서 충분히 분산시켰다. 이어서, 온도 조절기로써 31℃로 조절하고, 버터가 굳어지기 직전에 모울드에 부어 넣고, 진동기로 탈기한 후, 10℃의 냉각 터널을 20분간 통과시켜서 고화시켰다. 이것을 모울드에서 꺼내어 포장해서 초콜렛을 얻었다.
이 제품은, 흡습성이 없고, 색, 광택 모두 좋으며, 내부조직도 양호하고, 입안에서 매끄럽게 녹아 고상한 단 맛과 부드러운 풍미를 가진다. 또한, 이 제품은 저칼로리, 낮은 충치 유발성 초콜렛으로서 유용하다.
실시예 B-5 <분말 펩티드>
40％ 식품용 대두 펩티드 용액(상품명 『하이뉴트 S』, 일본국의 不二製油 주식회사 판매) 1 중량부에, 실시예 A-6의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 2 중량부를 혼합하고, 플라스틱제 배트(vat)에 넣어 50℃에서 감압 건조하고, 분쇄해서 분말 펩티드를 얻었다.
이 제품은 메일라아드 반응에 의한 착색이나 품질열화가 적고, 저칼로리 제과재료로서 유용할 뿐만 아니라, 경구 유동식, 경관 유동식을 위한 난(難)소화성의 식물(食物) 섬유, 정장 재료, 건강식품 재료로서도 유용하다.
실시예 B-6 <욕(浴)용제>
유자의 껍질 쥬스 1 중량부에 대하여, 실시예 A-10의 방법으로 얻은 이소말티톨 결정 분말 10 중량부, 환상 4당 무수결정 10 중량부의 비율로 혼합하고, 환상 4당 5 내지 6 함수결정을 결정석출, 숙성시킨 후, 분말화하여 유자의 껍질 엑기스 함유 이소말티톨·환상 4당 분말을 얻었다.
이 분말 5 중량부에, 소염(燒鹽) 90 중량부, α,α-트레할로오스 함수결정 2 중량부, 무수 규산 1 중량부 및 α-글루코실헤스페리딘(상품명 『αG 헤스페리딘』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 0.5 중량부를 혼합해서 욕용제를 제조하였다.
이 제품은 유자의 향기도 풍부해서, 입욕용의 온수에 100 내지 10,000배로 희석해서 사용하면 좋고, 입욕후는 피부가 상큼하게 매끈매끈해서 한기를 느끼지 않는 고품질의 욕용제이다.
실시예 B-7 <화장용 크림>
모노스테아르산 폴리옥시에틸렌글리콜 2 중량부, 자기 유화형 모노스테아르산 글리세린 5 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 2 중량부, α-글루코실 루틴(상품명 『αG 루틴』, 일본국의 주식회사 林原 판매) 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 트리옥탄산 글리세린 10 중량부 및 방부제 적당량을 통상적인 방법을 따라서 가열 용해하고, 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 첨가하고, 호모게나이저에서 유화하고, 더욱이 향료의 적당량을 더해서 교반혼합하여 화장용 크림을 제조하였다.
이 제품은 항산화성을 가지고, 안정성이 높으며, 고품질의 햇볕에 탐 방지, 피부 미화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
실시예 B-8 <치약>
제2인산 칼슘 45 중량부, 라우릴 황산 나트륨 1.5 중량부, 글리세린 25 중량부, 폴리옥시에틸렌소르비탄라우레이트 0.5 중량부, 실시예 A-7의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 15 중량부, 사카린 0.02 중량부 및 방부제 0.05 중량부를 물 13 중량부와 혼합해서 치약을 얻었다.
이 제품은 계면활성제의 세정력을 저하함이 없고, 역겨운 맛을 개량하며, 사용후 느끼는 감도 양호하다.
실시예 B-9 <유동식용 고체제제>
실시예 A-5의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 분말 100 중량부, α,α-트레할로오스 함수결정 200 중량부, 말토테트라오스 고함유 분말 200 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화 칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴산 아미드 0.04 중량부로 된 배합물을 조제하고, 이 배합물 25 그램씩을 방습성 라미네이트 자루에 충전하고, 히이트 시일해서 유동식용 고체제제를 얻었다.
이 제품은 정장작용이 우수한 유동식이다. 사용시에는, 1 자루분을 약 150 내지 300ml의 물에 용해하여 경구적, 또는 비강, 위, 장 등에 경관투여해서 이용할 수 있다.
실시예 B-10 <정제>
아스피린 50 중량부에 실시예 A-8의 방법으로 얻은 이소말티톨 결정 분말 14 중량부, 콘 스타치 4 중량부를 충분히 혼합한 후, 통상적인 방법을 따라서 타정기(打錠機)에 의해 타정해서 두께 5.25mm, 1정 680mg의 정제를 제조하였다.
이 제품은 이소말치톨의 부형성을 이용한 것으로서, 흡습성이 없고, 물리적 강도도 충분하며, 더욱이 수중에서의 붕괴는 극히 양호하다.
실시예 B-11 <당의정>
중량 150mg의 소정(素錠)을 심제(芯劑)로 하고, 여기에 실험 36의 방법으로 얻은 결정 이소말티톨 40 중량부, 풀룰란(평균 분자량 20만) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄늄 3 중량부로 된 바탕액을 사용하여 정제 중량이 약 230mg이 될 때까지 당의(糖衣)하고, 이어서, 환상 4당 5 내지 6 함수결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 코우팅액을 사용하여 당의하며, 더욱이 왁스액으로 윤기를 내어서 광택이 있는 외관이 우수한 당의정을 얻었다. 이 제품은 내충격성도 우수하고, 고품질을 장기간 유지한다.
실시예 B-12 <외상치료용 고약>
실시예 A-7의 방법으로 얻은 이소말티톨 고함유 시럽 100 중량부 및 말토오스 300 중량부에 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 더욱이 10w/v％ 풀룰란 수용액 200 중량부를 가해서 혼합하여 적당한 퍼짐과 부착성을 나타내는 외상치료용 고약을 얻었다.
이 제품은 이소말티톨에 의해 요오드, 메탄올의 휘산이 방지되며, 경시 변화가 적고 상품가치가 높은 고약이다. 또한, 이 제품은, 요오드에 의한 살균 작용뿐만 아니라 말토오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하므로 치유 기간이 단축되어 창면도 깨끗하게 낫는다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 이소말토오스 및 이소말티톨의 신규의 제조방법과 그것들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세히는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591) 및/또는 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590) 유래의 α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서, 글로비스포루스 N75(FERM BP-7591), 아르드로박터 글로비포르미스 A19(FERM BP-7590), 및 아르드로박터 라모서스 S1(FERM BP-7592) 유래의 1종 또는 2종 이상의 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서, 비환원성 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원성 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이 생성한 이소말토오스를 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말토오스의 제조방법과, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 α-이소말토실 전이효소의 존재하 또는 비존재하에서 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시켜서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질, 및/또는 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}을 생성시키고, 이 생성물에 이소말토오스 유리 효소를 작용시켜서 이소말토오스를 생성시키며, 이것을 그대로 또는 이소말토오스를 채취한 후에 수소첨가해서 이소말티톨을 생성시켜, 이 생성한 이소말티톨을 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법, 및 이소말토오스 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질과, 그것들의 용도에 관한 발명이다. 이와 같은 본 발명에 의하면, 이 분야에 있어서 유용한 이소말티톨 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질을 공업적으로 대량으로 동시에 염가로 고수율로 제조할 수 있다.
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이와 같은 본 발명에 의한 이소말티톨 및/또는 이소말티톨 함유 혼합 당질은, 비환원성이고, 비(非)메일라아드 반응성, 저감미성, 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성 부여성, 당질결정 석출 방지성, 난발효성, 전분의 노화 방지성 등을 가지고 있으므로, 음식품, 건강식품, 건강보조 식품, 사료, 이료, 화장품, 의약품, 기호품 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 나타내는 발명이어서, 이 분야에 공헌하는 바 실로 엄청난 의의가 있는 발명이다.
<110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Process for producing isomaltose and isomaltitol and uses thereof <150> JP 321,182/01 <151> 2001-10-18 <150> JP 252,609/02 <151> 2002-08-30 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 1 Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile 1 5 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 2 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 3 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 4 Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 5 Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 6 Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus <400> 7 Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus globisporus 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gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc 540 ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg 600 ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag 660 tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta 720 gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac 780 ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc 840 cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg atg cgt cca cca aac 891 Met Arg Pro Pro Asn 1 5 aaa gaa att cca cgt att ctt gct ttt ttt aca gcg ttt acg ttg ttt 939 Lys Glu Ile Pro Arg Ile Leu Ala Phe Phe Thr Ala Phe Thr Leu Phe 10 15 20 ggt tca acc ctt gcc ttg ctt cct gct ccg cct gcg cat gcc tat gtc 987 Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro Ala His Ala Tyr Val 25 30 35 agc agc cta gga aat ctc att tct tcg agt gtc acc gga gat acc ttg 1035 Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val Thr Gly Asp Thr Leu 40 45 50 acg cta act gtt gat aac ggt gcg gag ccg agt gat gac ctc ttg att 1083 Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser Asp Asp Leu Leu Ile 55 60 65 gtt caa gcg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg gat tat cgt cca aat 1131 Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg Pro Asn 70 75 80 85 agc ata acg ccg agc gcg aag acg ccg atg ctg gat ccg aac aaa act 1179 Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn Lys Thr 90 95 100 tgg tca gct gta gga gct acg att aat acg aca gcc aat cca atg acc 1227 Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr Ala Asn Pro Met Thr 105 110 115 atc acg act tcc aat atg aag att gag att acc aag aat cca gta cga 1275 Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr Lys Asn Pro Val Arg 120 125 130 atg acg gtc aag aag gcg gac ggc act acg cta ttc tgg gaa cca tca 1323 Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu Phe Trp Glu Pro Ser 135 140 145 ggc gga ggg gta ttc tca gac ggt gtg cgc ttc ctt cat gcc aca ggg 1371 Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Ala Thr Gly 150 155 160 165 gat aat atg tat ggc atc cgg agc ttc aat gct ttt gat agc ggg ggt 1419 Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser Gly Gly 170 175 180 gac ctg ctg cgg aat tcg tcc aat cat gcc gcc cat gcg ggt gaa cag 1467 Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala His Ala Gly Glu Gln 185 190 195 gga gat tcc ggt ggt ccg ctt att tgg agt acg gca gga tat gga cta 1515 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr Gly Leu 200 205 210 tta gtc gat agc gat ggc ggc tac ccc tat aca gat agc aca acc ggt 1563 Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Ser Thr Thr Gly 215 220 225 caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct gag gga cgt cgt tat 1611 Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg Arg Tyr 230 235 240 245 gcg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg ctc gga acc ccc aag gaa 1659 Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro Lys Glu 250 255 260 att atg acc gac gta ggg gaa atc aca ggg aaa ccg cct atg ctg cct 1707 Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met Leu Pro 265 270 275 aag tgg tcg ctt gga ttc atg aac ttt gag tgg gat acg aat caa acg 1755 Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn Gln Thr 280 285 290 gag ttt acg aat aat gtg gat acg tat cgt gcc aaa aat atc ccc ata 1803 Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile Pro Ile 295 300 305 gat gct tac gcc ttc gac tat gac tgg aaa aag tac ggg gaa acc aac 1851 Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu Thr Asn 310 315 320 325 tat ggt gaa ttc gcg tgg aat acg act aat ttc cct tct gcg tca acg 1899 Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ser Thr 330 335 340 act tct tta aag tca aca atg gat gct aaa ggc atc aaa atg atc gga 1947 Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met Ile Gly 345 350 355 att aca aaa ccc cgc atc gtt acg aag gat gct tca gcg aat gtg acg 1995 Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr 360 365 370 acc caa ggg acg gac gcg aca aat ggc ggt tat ttt tat cca ggc cat 2043 Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly His 375 380 385 aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act gtg cgt agt atc gat 2091 Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr Val Arg Ser Ile Asp 390 395 400 405 cct tac aat gct aac gaa cgt gct tgg ttc tgg aat cat tcc aca gat 2139 Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp Asn His Ser Thr Asp 410 415 420 gcg ctt aat aaa ggg atc gta ggt tgg tgg aat gac gag acg gat aaa 2187 Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr Asp Lys 425 430 435 gta tct tcg ggt gga gcg tta tat tgg ttt ggc aat ttc aca aca ggc 2235 Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr Thr Gly 440 445 450 cac atg tct cag acg atg tac gaa ggg ggg cgg gct tac acg agt gga 2283 His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg Ala Tyr Thr Ser Gly 455 460 465 gcg cag cgt gtt tgg caa acg gct aga acc ttc tac cca ggt gcc cag 2331 Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly Ala Gln 470 475 480 485 cgg tat gcg act acg ctt tgg tct ggc gat att ggc att caa tac aat 2379 Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln Tyr Asn 490 495 500 aaa ggc gaa cgg atc aat tgg gct gcc ggg atg cag gag caa agg gca 2427 Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln Arg Ala 505 510 515 gtt atg cta tcc tcc gtg aac aat ggc cag gtg aaa tgg ggc atg gat 2475 Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly Met Asp 520 525 530 acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc acg acg aac aat ccg aat ccc 2523 Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro Asn Pro 535 540 545 gat tta tac gct cgg tgg atg cag ttc agt gcc cta acg cct gtt ttc 2571 Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro Val Phe 550 555 560 565 cga gtg cat ggg aac aac cat cag cag cgc cag cca tgg tac ttc gga 2619 Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr Phe Gly 570 575 580 tcg act gcg gag gag gcc tcc aaa gag gca att cag ctg cgg tac tcc 2667 Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile Gln Leu Arg Tyr Ser 585 590 595 ctg atc cct tat atg tat gcc tat gag aga agt gct tac gag aat ggg 2715 Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu Asn Gly 600 605 610 aat ggg ctc gtt cgg cca ttg atg caa gcc tat cca aca gat gcg gcc 2763 Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr Pro Thr Asp Ala Ala 615 620 625 gtc aaa aat tac acg gat gct tgg atg ttt ggt gac tgg ctg ctg gct 2811 Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu Ala 630 635 640 645 gca cct gtg gta gat aaa cag cag acg agt aag gat atc tat tta ccg 2859 Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys Asp Ile Tyr Leu Pro 650 655 660 tct ggg tca tgg att gac tat gcg cga ggc aat gca ata act ggc ggt 2907 Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn Ala Ile Thr Gly Gly 665 670 675 caa acc atc cga tat tcg gtt aat ccg gac acg ttg aca gac atg cct 2955 Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp Met Pro 680 685 690 ctc ttt att aaa aaa ggt gcc att att cca aca cag aaa gtg cag gat 3003 Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr Gln Lys Val Gln Asp 695 700 705 tac gta ggg cag gct tcc gtc act tcc gtt gat gtg gat gtg ttt ccg 3051 Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp Val Asp Val Phe Pro 710 715 720 725 gat acg acg cag tcg agt ttc acg tac tac gat gat gat ggc gcc agt 3099 Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly Ala Ser 730 735 740 tat aac tat gag agc ggc act tat ttt aag caa aat atg act gct cag 3147 Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln Asn Met Thr Ala Gln 745 750 755 gat aat ggg tca ggc tcg tta agt ttt act tta gga gca aag agt ggc 3195 Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys Ser Gly 760 765 770 agt tac acg ccg gct ctc caa tcc tat atc gtt aag ctg cac ggt tct 3243 Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His Gly Ser 775 780 785 gct gga act tct gtt acg aat aac agc gca gct atg aca tct tat gca 3291 Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala Met Thr Ser Tyr Ala 790 795 800 805 agc ttg gaa gca tta aaa gct gct gct ggg gaa ggc tgg gcg act ggg 3339 Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu Gly Trp Ala Thr Gly 810 815 820 aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa gtg acg gca ggt aca 3387 Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Val Thr Ala Gly Thr 825 830 835 gct tct tct aaa tct att gct gtt aca ggt gtt gct gcc gtg agc gca 3435 Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Val Ser Ala 840 845 850 act act tcg caa tac gaa gct gag gat gca tcg ctt tct ggc aat tcg 3483 Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Ser Gly Asn Ser 855 860 865 gtt gct gca aag gcg tcc ata aac acg aat cat acc gga tat acg gga 3531 Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr Thr Gly 870 875 880 885 act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc gct ggt gtc acc ttc 3579 Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val Thr Phe 890 895 900 tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat gtc tcc ttg cgt tat 3627 Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg Tyr 905 910 915 gcg aat gct tca ggc acg gct aag tca gtc agt att ttt gtt aat gga 3675 Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val Asn Gly 920 925 930 aaa aga gtg aag tcc acc tcg ctc gct aat ctc gca aat tgg gac act 3723 Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp Asp Thr 935 940 945 tgg tct aca caa tct gag aca ctg ccg ttg acg gca ggt gtg aat gtt 3771 Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Val Asn Val 950 955 960 965 gtg acc tat aaa tat tac tcc gat gcg gga gat aca ggc aat gtt aac 3819 Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn Val Asn 970 975 980 atc gac aac atc acg gta cct ttt gcg cca att atc ggt aag tat gaa 3867 Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile Gly Lys Tyr Glu 985 990 995 gca gag agt gct gag ctt tct ggt ggc agc tca ttg aac acg aac cat 3915 Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr Asn His 1000 1005 1010 tgg tac tac agt ggt acg gct ttt gta gac ggt ttg agt gct gta ggc 3963 Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Ser Ala Val Gly 1015 1020 1025 gcg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct agc gca gga agt tat cag 4011 Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser Ala Gly Ser Tyr Gln 1030 1035 1040 1045 gta gcg ctg cga tat gcg aat ggc agt gca gcg acg aaa acg ttg agt 4059 Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr Leu Ser 1050 1055 1060 act tat atc aat gga gcc aag ctg ggg caa acc agt ttt acg agt cct 4107 Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr Ser Phe Thr Ser Pro 1065 1070 1075 ggt acg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg caa acg gtg acg tta 4155 Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val Gln Thr Val Thr Leu 1080 1085 1090 aat gca ggg gca aac acg att gcg ttt aaa tac gac gcc gct gac agc 4203 Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Ala Asp Ser 1095 1100 1105 ggg aac atc aac gta gat cgt ctg ctt ctt tca act tcg gca gcg gga 4251 Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala Ala Gly 1110 1115 1120 1125 acg ccg gtt tct gag cag aac ctg cta gac aat ccc ggt ttc gag cgt 4299 Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe Glu Arg 1130 1135 1140 gac acg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg cat cca ggc acg caa 4347 Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp His Pro Gly Thr Gln 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Ile Asp Val Gly Phe Tyr Val Asp Ser Pro 1255 1260 1265 ggt gga act acg ctt cac att gat gat gtg cgc gta acc aaa caa ta 4730 Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val Thr Lys Gln 1270 1275 1280 aacaaacaac cagctctccc gttaatggga gggctggttg tttgttatga taatccatct 4790 atttagagtg gattaaacgt tttgaagtgc ttgctgaact tcttgcacaa tggataacgc 4850 cgcggtgcgg gcacttgaga aagcacgttc tgcaagctct cccttacctg tacagccgtc 4910 tccgcagaag tagaaaggaa cgttttccac gcgtatcggc agcagattat tggaagcaat 4970 gtttttcacg ctggaaacca tcgctttctt ggaaacccgt ttcacggctg tgacatcgcg 5030 ccagcctgga taatgtttat caaataaggc ttccatttgg aggttcttct cttccaggta 5090 cgctttgcgc tgctcctcgt tatcaaagcg gtcgcttaag tatgcgatac cttgcagcag 5150 ctgcccgcct tctggtacta gtgtgtgatc 5180 <210> 22 <211> 3869 <212> DNA <213> Bacillus globisporus <220> <221> CDS <222> (241)..(3519) <400> 22 tcatcgctac tggcaatcgg attcaaacaa atggctgcag ctcgcacaga cgattgtgga 60 aagggaatat ctgatttaac catacggcgg tcgcgattga ttgaatagga ttcgtggccg 120 cctaatattg aaagggggga 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tgg gaa gcg aac ctt ggc act ttt 576 Tyr Asn Ser Gly Asn Asn Thr Tyr Trp Glu Ala Asn Leu Gly Thr Phe 100 105 110 gca aaa ggg gac gtg atc agt tat acc gtt cat ggc aac aag gat ggc 624 Ala Lys Gly Asp Val Ile Ser Tyr Thr Val His Gly Asn Lys Asp Gly 115 120 125 gcg aat gag aag gtt atc ggt cct ttt act ttt acc gta acg gga tgg 672 Ala Asn Glu Lys Val Ile Gly Pro Phe Thr Phe Thr Val Thr Gly Trp 130 135 140 gaa tcc gtt agc agt atc agc tct att acg gat aat acg aac cgt gtt 720 Glu Ser Val Ser Ser Ile Ser Ser Ile Thr Asp Asn Thr Asn Arg Val 145 150 155 160 gtg ctg aat gcg gtg ccg aat aca ggc aca ttg aag cca aag atc aac 768 Val Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Lys Pro Lys Ile Asn 165 170 175 ctt tcc ttt acg gcg gat gat gtc ctc cgc gta cag gtt tct cca acc 816 Leu Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Leu Arg Val Gln Val Ser Pro Thr 180 185 190 gga aca gga acg tta agc agt gga ctt agt aat tac aca gtt tca gat 864 Gly Thr Gly Thr Leu Ser Ser Gly Leu Ser Asn Tyr Thr Val Ser Asp 195 200 205 acc gcc tca acc act tgg ctt aca act tcc aag ctg aag gtg aag gtg 912 Thr Ala Ser Thr Thr Trp Leu Thr Thr Ser Lys Leu Lys Val Lys Val 210 215 220 gat aag aat cca ttc aaa ctt agt gtg tat aag cct gat gga acg acg 960 Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Val Tyr Lys Pro Asp Gly Thr Thr 225 230 235 240 ttg att gcc cgt caa tat gac agc act acg aat cgt aac att gcc tgg 1008 Leu Ile Ala Arg Gln Tyr Asp Ser Thr Thr Asn Arg Asn Ile Ala Trp 245 250 255 tta acc aat ggc agt aca atc atc gac aag gta gaa gat cat ttt tat 1056 Leu Thr Asn Gly Ser Thr Ile Ile Asp Lys Val Glu Asp His Phe Tyr 260 265 270 tca ccg gct tcc gag gag ttt ttt ggc ttt gga gag cat tac aac aac 1104 Ser Pro Ala Ser Glu Glu Phe Phe Gly Phe Gly Glu His Tyr Asn Asn 275 280 285 ttc cgt aaa cgc gga aat gat gtg gac acc tat gtg ttc aac cag tat 1152 Phe Arg Lys Arg Gly Asn Asp Val Asp Thr Tyr Val Phe Asn Gln Tyr 290 295 300 aag aat caa aat gac cgc acc tac atg gca att cct ttt atg ctt aac 1200 Lys Asn Gln Asn Asp Arg Thr Tyr Met Ala Ile Pro Phe Met Leu Asn 305 310 315 320 agc agc ggt tat ggc att ttc gta aat tca acg tat tat tcc aaa ttt 1248 Ser Ser Gly Tyr Gly Ile Phe Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser Lys Phe 325 330 335 cgg ttg gca acc gaa cgc acc gat atg ttc agc ttt acg gct gat aca 1296 Arg Leu Ala Thr Glu Arg Thr Asp Met Phe Ser Phe Thr Ala Asp Thr 340 345 350 ggg ggt agt gcc gcc tcg atg ctg gat tat tat ttc att tac ggt aat 1344 Gly Gly Ser Ala Ala Ser Met Leu Asp Tyr Tyr Phe Ile Tyr Gly Asn 355 360 365 gat ttg aaa aat gtg gtg agt aac tac gct aac att acc ggt aag cca 1392 Asp Leu Lys Asn Val Val Ser Asn Tyr Ala Asn Ile Thr Gly Lys Pro 370 375 380 aca gcg ctg ccg aaa tgg gct ttc ggg tta tgg atg tca gct aac gag 1440 Thr Ala Leu Pro Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser Ala Asn Glu 385 390 395 400 tgg gat cgt caa acc aag gtg aat aca gcc att aat aac gcg aac tcc 1488 Trp Asp Arg Gln Thr Lys Val Asn Thr Ala Ile Asn Asn Ala Asn Ser 405 410 415 aat aat att ccg gct aca gcg gtt gtg ctc gaa cag tgg agt gat gag 1536 Asn Asn Ile Pro Ala Thr Ala Val Val Leu Glu Gln Trp Ser 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Asn Ala Gly Leu Thr Ala Ser Met Ser Gly Val Pro Tyr 645 650 655 tgg agc tgg gat atg gca ggc ttt aca ggc act tat cca acg gct gag 2256 Trp Ser Trp Asp Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Ala Glu 660 665 670 ttg tac aaa cgt gct act gaa atg gct gct ttt gca ccg gtc atg cag 2304 Leu Tyr Lys Arg Ala Thr Glu Met Ala Ala Phe Ala Pro Val Met Gln 675 680 685 ttt cat tcc gag tct aac ggc agc tct ggt atc aac gag gaa cgt tct 2352 Phe His Ser Glu Ser Asn Gly Ser Ser Gly Ile Asn Glu Glu Arg Ser 690 695 700 cca tgg aac gca caa gcg cgt aca ggc gac aat acg atc att agt cat 2400 Pro Trp Asn Ala Gln Ala Arg Thr Gly Asp Asn Thr Ile Ile Ser His 705 710 715 720 ttt gcc aaa tat acg aat acg cgc atg aat ttg ctt cct tat att tat 2448 Phe Ala Lys Tyr Thr Asn Thr Arg Met Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Tyr 725 730 735 agc gaa gcg aag atg gct agt gat act ggc gtt ccc atg atg cgc gcc 2496 Ser Glu Ala Lys Met Ala Ser Asp Thr Gly Val Pro Met Met Arg Ala 740 745 750 atg gcg ctt gaa tat ccg aag gac acg aac acg tac ggt ttg aca 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tca acg aac acg aac cat gca ggt tat act ggt aca 3216 Gln Ser Gly Val Ser Thr Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr Gly Thr 980 985 990 gga ttt gtg gac ggc ttt gag act ctt gga gac aat gtt gct ttt gat 3264 Gly Phe Val Asp Gly Phe Glu Thr Leu Gly Asp Asn Val Ala Phe Asp 995 1000 1005 gtt tcc gtc aaa gcc gca ggt act tat acg atg aag gtt cgg tat tca 3312 Val Ser Val Lys Ala Ala Gly Thr Tyr Thr Met Lys Val Arg Tyr Ser 1010 1015 1020 tcc ggt gca ggc aat ggc tca aga gcc atc tat gtg aat aac acc aaa 3360 Ser Gly Ala Gly Asn Gly Ser Arg Ala Ile Tyr Val Asn Asn Thr Lys 1025 1030 1035 1040 gtg acg gac ctt gcc ttg ccg caa aca aca agc tgg gat aca tgg ggg 3408 Val Thr Asp Leu Ala Leu Pro Gln Thr Thr Ser Trp Asp Thr Trp Gly 1045 1050 1055 act gct acg ttt agc gtc tcg ctg agt aca ggt ctc aac acg gtg aaa 3456 Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Leu Ser Thr Gly Leu Asn Thr Val Lys 1060 1065 1070 gtc agc tat gat ggt acc agt tca ctt ggc att aat ttc gat aac atc 3504 Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe Asp 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Ile Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu 310 315 320 aat aat tac ggc gaa ttc gct tgg aat acg gcc aat ttc cct tcc gcc 1482 Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala 325 330 335 gcc acg acg gcg ctg aag tcg cag atg gac gcc aag ggc att aaa atg 1530 Ala Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gln Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met 340 345 350 355 atc ggc ata acc aag cct cgc atc gcg acg aag gat ttt tcg aac aat 1578 Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn 360 365 370 cct acc gtg cag gga acg gac gcg gcg agc ggc ggt tat ttt tat ccg 1626 Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro 375 380 385 gga cat agc gaa tac aag gac tac ttc atc ccg gtc ttt gtg cgc agc 1674 Gly His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Ile Pro Val Phe Val Arg Ser 390 395 400 atc gac cct tat aac cct gct gca cgc tcc tgg ttc tgg aac cac tcc 1722 Ile Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser 405 410 415 aag gat gcg ttc gat aaa ggc atc gta ggc tgg tgg aac gac gag acg 1770 Lys Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr 420 425 430 435 gat gcg gta tcg tcg gga ggg gcc tcc tac tgg ttc ggc aat ttt acg 1818 Asp Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr 440 445 450 acc ggc cat atg tcc cag gcg ctt tac gag gga cag cgg gca tat acg 1866 Thr Gly His Met Ser Gln Ala Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Ala Tyr Thr 455 460 465 tcg aac gcc cag cgc gtc tgg cag aca gcg cgc acg ttc tat ccc ggg 1914 Ser Asn Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly 470 475 480 gcg cag cgt tat gcg acg acg ctc tgg tcg gga gac atc ggg att cag 1962 Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln 485 490 495 tat acc aag ggg gaa aga atc aac tgg gct gcc ggc atg cag gag cag 2010 Tyr Thr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln 500 505 510 515 cgg gcg gtg atg ctt tct tcg atc aac aac ggc cag gtc aaa tgg gga 2058 Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Ile Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly 520 525 530 atg gac aca ggc ggc ttc aac cag cag gac ggc acg 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Ser Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Ser Val Gln Thr Val 1080 1085 1090 gcg ctc gcc gcc ggt acg aac acg atc gcg ttc aag tac gat gcc ggc 3786 Ala Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly 1095 1100 1105 gac agc ggc agc ggc agc gtc aat ctg gac cgt ctg ttg ctc tct gcc 3834 Asp Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala 1110 1115 1120 gca gcg cca ggc gtg ccc gtg tcc gag cag aac ctg ctc gat aac ggg 3882 Ala Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Gly 1125 1130 1135 ggc ttt gaa cgc gat ccg tcg cag agc agc aac tgg acc gag tgg cat 3930 Gly Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gln Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His 1140 1145 1150 1155 ccg gct tcg cag gcg att gct tac ggc atc gac agc ggc tcc ggg atg 3978 Pro Ala Ser Gln Ala Ile Ala Tyr Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Met 1160 1165 1170 aat ccg cct gaa tcg cca tgg gca ggc gat aag cgc gcc tat ttc tat 4026 Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr 1175 1180 1185 gcg gca ggc ccg tat cag caa agc atc cat caa aca gtc agc gtg cct 4074 Ala Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Val Ser Val Pro 1190 1195 1200 gtc aat aat gcc aag tac aag ttc gaa gcc tgg gta ttg ctg aag aat 4122 Val Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn 1205 1210 1215 aca aca ccg aca acg gcc cgg gtg gag att caa aat tac ggc ggt tcg 4170 Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser 1220 1225 1230 1235 ccg atc ttc acg aac atc agt aaa gac ggc gtc tgg aaa tac atc agc 4218 Pro Ile Phe Thr Asn Ile Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser 1240 1245 1250 gtc agc gat att cag gtc acg aac ggc caa atc gat att ggc ttc tat 4266 Val Ser Asp Ile Gln Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Ile Gly Phe Tyr 1255 1260 1265 gtg gat tcg ccc gga ggc acc acg ctc cac atc gac gat gtg cgg gtc 4314 Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val 1270 1275 1280 acc aag caa taatccg gtaacactag ccctcccccg ccttgcggca ggagggcttt 4370 Thr Lys Gln 1285 ttgcttctgt aggttgtgaa ggcgataccg agcgatgaga 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gtc ctg ctg aat gcg gtg ccg aac acg ggg acg ctg tcc ccc aag 1188 Arg Val Leu Leu Asn Ala Val Pro Asn Thr Gly Thr Leu Ser Pro Lys 160 165 170 atc aac att tcg ttc acg gcg gac gat gtg ttc cgc gtt cag ctc tcc 1236 Ile Asn Ile Ser Phe Thr Ala Asp Asp Val Phe Arg Val Gln Leu Ser 175 180 185 190 cct acg gga tcg ggg acg ttg agc acg ggc ctg agt aat ttt acc gtc 1284 Pro Thr Gly Ser Gly Thr Leu Ser Thr Gly Leu Ser Asn Phe Thr Val 195 200 205 acg gac agt gcg tcc acg gcc tgg atc tct aca tcc aaa tta aag ctg 1332 Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ala Trp Ile Ser Thr Ser Lys Leu Lys Leu 210 215 220 aag gtg gat aag aat ccg ttc aaa ctg agc gtg tac aag ccg gac ggc 1380 Lys Val Asp Lys Asn Pro Phe Lys Leu Ser Val Tyr Lys Pro Asp Gly 225 230 235 acg acg ctg atc gcg cgc cag tat gac agc acg gcc aac cgc aat ctc 1428 Thr Thr Leu Ile Ala Arg Gln Tyr Asp Ser Thr Ala Asn Arg Asn Leu 240 245 250 gct tgg ctg acc aat ggc agc act gtc atc aat aaa atc gag gac cac 1476 Ala Trp Leu Thr Asn Gly Ser Thr Val Ile Asn Lys Ile Glu Asp 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Val Leu Trp Gln Val Pro Ile Gln Lys Trp Thr Ala 480 485 490 gct cct cat ctg cag aag gac aac gac gaa agc tat atg atc gcg caa 2196 Ala Pro His Leu Gln Lys Asp Asn Asp Glu Ser Tyr Met Ile Ala Gln 495 500 505 510 aat tat gcc gta ggc aac ggc agc gga ggc cag tac cgc atc cct agc 2244 Asn Tyr Ala Val Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gln Tyr Arg Ile Pro Ser 515 520 525 ggg caa tgg ttt gag aac agc ctg ctg ctg gac ttc acg aac ccg agc 2292 Gly Gln Trp Phe Glu Asn Ser Leu Leu Leu Asp Phe Thr Asn Pro Ser 530 535 540 gcc aaa aac tgg tgg atg tcc aag cgc gcc tat ctg ttt gat ggc gtc 2340 Ala Lys Asn Trp Trp Met Ser Lys Arg Ala Tyr Leu Phe Asp Gly Val 545 550 555 ggc atc gac ggg ttc aag acg gac gga ggg gag atg gtc tgg ggc cgc 2388 Gly Ile Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp Gly Arg 560 565 570 tgg aac acg ttc gcc aat ggc aaa aaa ggc gat gaa atg cgc aac cag 2436 Trp Asn Thr Phe Ala Asn Gly Lys Lys Gly Asp Glu Met Arg Asn Gln 575 580 585 590 tac ccg aac gat tac gtg aag gcc tac aac gaa tat gcg cgc tcg 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Gly Lys Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile Pro 345 350 355 atc gag gag tcg tac gtc ggt cgc aac ctg ccg gag cac gcc cgg atg 2773 Ile Glu Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met 360 365 370 gcg gcg gac ggt tac ctc gtg cgc tcc ggc tgc gct acg tgc ccg ccg 2821 Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro Pro 375 380 385 gtg tac ctg acg ggg aac ccc tgg tgg ggc aag ggc ggg atg atc gac 2869 Val Tyr Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met Ile Asp 390 395 400 405 tgg acg cag ccg gaa gcc ggc gcc gtc tgg cac gac gag cag cgc cag 2917 Trp Thr Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gln Arg Gln 410 415 420 cat ctc gtc gac gag ggc gta ctg ggc cac tgg ctc gat ctc ggc gaa 2965 His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly Glu 425 430 435 ccg gag atg tac gac ccg aac gac tgg acc gcc ggc gtc atc ccc ggc 3013 Pro Glu Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val Ile Pro Gly 440 445 450 aag cac gcg cac gcc gac tat cac aac gcg tac aac ctg 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660 tggtcgtcga cgttgccggg cacgcccacg ccgagaccga gcagggggac gccgtcgccg 720 gcggcgatga acgagcggag catgtcgctg agcttcgcga tcgcggtgcc cgttccggcg 780 tcgaagggct cggtgagcga tcgctgcacc cggccgtcga tgctgacctc gaccgcggtg 840 atgtggtcgg ctacgacctt aacgccgacg gcacggccgg cgtcggcgac gagaccgagc 900 agccgcgcgg gacgtccacc ctgcgagggg cggtgatcca gctcgaccag caggccatcg 960 gcgatgagct cccgggtgtg ctgcgtgacg agcgccggcg agacgccgag ctcgcgcgcg 1020 aggtcggccc gcgaggtcgg gccattgctg ccgatgtggg cgagcatggc cgatcgcgtc 1080 agatcggtgc gtggattcgg gtgggccaca ggaacccctt tgttcaggac tgaaagaacg 1140 gtagagcaca gcgagggcga acgtcaactc acagcctgat ctcccgggcc gagagcccgg 1200 cggccgaact cacctcttga cgagcccgtt cgactacgga atattcccgg ctaaatacag 1260 acccgaacaa aggggttccc atg tct gat gcc gtc ggc gct ccc cgc gcg ctg 1313 Met Ser Asp Ala Val Gly Ala Pro Arg Ala Leu 1 5 10 aac gat ccg cac cgc tcg cgt ctc gcc gcg ctt ccg cgc cgg acc gcg 1361 Asn Asp Pro His Arg Ser Arg Leu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Thr Ala 15 20 25 gga ttc gtc ctg gca ctg gtc 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cgc ctg tcg gtc tac gag ggc gac ggc acg acg ctc atc acc cgc cag 2081 Arg Leu Ser Val Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Thr Leu Ile Thr Arg Gln 255 260 265 tac gac ccc gcg gtc ttc cgg aac atc ggt tgg gcg agc gac ggc gaa 2129 Tyr Asp Pro Ala Val Phe Arg Asn Ile Gly Trp Ala Ser Asp Gly Glu 270 275 280 acg act gtg acc cgc atc gag gat cac ttc ctc aca ccc acg ggc gaa 2177 Thr Thr Val Thr Arg Ile Glu Asp His Phe Leu Thr Pro Thr Gly Glu 285 290 295 cgg ttc gag ggg ttc ggc gaa cgg tac gac cgg ctc gac cac cgg gga 2225 Arg Phe Glu Gly Phe Gly Glu Arg Tyr Asp Arg Leu Asp His Arg Gly 300 305 310 315 acc gac gtg cac aac tac gtc tac aac cag tac cag gac cag ggc gcg 2273 Thr Asp Val His Asn Tyr Val Tyr Asn Gln Tyr Gln Asp Gln Gly Ala 320 325 330 acg cgc cgc acc tac tac tcg gtg ccg tac ttc gcc aac tcc gcc ggc 2321 Thr Arg Arg Thr Tyr Tyr Ser Val Pro Tyr Phe Ala Asn Ser Ala Gly 335 340 345 tac ggc atc cac gtg ccg agc acg cgc tat gcg atc ttc aat ctc gcg 2369 Tyr Gly Ile His Val Pro Ser Thr Arg Tyr Ala Ile Phe Asn Leu Ala 350 355 360 acg cac ctc gac gac atg gcc gga ttc acg gtc gac acg gga ggc gcc 2417 Thr His Leu Asp Asp Met Ala Gly Phe Thr Val Asp Thr Gly Gly Ala 365 370 375 ctg gac tcc acg ctg acg tac cag ttc ttc acc ggc gac cag acc gag 2465 Leu Asp Ser Thr Leu Thr Tyr Gln Phe Phe Thr Gly Asp Gln Thr Glu 380 385 390 395 atg ctc gac gac ttc acg gcc gag acc ggc cgt ccg ctc ctt ccg ccg 2513 Met Leu Asp Asp Phe Thr Ala Glu Thr Gly Arg Pro Leu Leu Pro Pro 400 405 410 aag tgg gcg ttt gga ctc tgg ggc tcc gcc aac gag tgg aac aac cag 2561 Lys Trp Ala Phe Gly Leu Trp Gly Ser Ala Asn Glu Trp Asn Asn Gln 415 420 425 gcc gag gtc gag gcc tgg ctc gac cag gtg gag agc tcc ggc atc ccg 2609 Ala Glu Val Glu Ala Trp Leu Asp Gln Val Glu Ser Ser Gly Ile Pro 430 435 440 cac agc gtg ctc gtg ctc gag cag tgg agc gac gag gcg acg ttc tac 2657 His Ser Val Leu Val Leu Glu Gln Trp Ser Asp Glu Ala Thr Phe Tyr 445 450 455 ctc tgg aag gac gcg cag tac acc ccc acc gac ggc agc acg ccg ctg 2705 Leu Trp Lys Asp Ala Gln Tyr Thr Pro Thr Asp Gly Ser Thr Pro Leu 460 465 470 475 cag tac gac gac ctc acg ttc ccc agc gga ggt gcg tgg agc gac ccc 2753 Gln Tyr Asp Asp Leu Thr Phe Pro Ser Gly Gly Ala Trp Ser Asp Pro 480 485 490 aag cag atg att gcc gag gcg cac gcc cag aac gtc aag gtg ctc ctc 2801 Lys Gln Met Ile Ala Glu Ala His Ala Gln Asn Val Lys Val Leu Leu 495 500 505 tgg cag att ccg gtg ctg aag gag aac ttc acc tcc aac ccg gcc acg 2849 Trp Gln Ile Pro Val Leu Lys Glu Asn Phe Thr Ser Asn Pro Ala Thr 510 515 520 gcg ccg cag cag cac ctc aac gac aag gcg tat gcg cag gcc cag ggc 2897 Ala Pro Gln Gln His Leu Asn Asp Lys Ala Tyr Ala Gln Ala Gln Gly 525 530 535 tac ctg gtc gac gac ggc gcg ggg cag ccg tac cgc atc ccc acc gga 2945 Tyr Leu Val Asp Asp Gly Ala Gly Gln Pro Tyr Arg Ile Pro Thr Gly 540 545 550 555 cag tgg ttt gga gac agc acg gtg ccc gac ttc aca gat gcc gag gcc 2993 Gln Trp Phe Gly Asp Ser Thr Val Pro Asp Phe Thr Asp Ala Glu Ala 560 565 570 acg gac tgg tgg atg gac aag cgg cgg tac ctc gtc gag gag ctc ggt 3041 Thr Asp Trp Trp Met Asp Lys Arg Arg Tyr Leu Val Glu Glu Leu Gly 575 580 585 gtc gac ggc ttc aag acc gac ggg agc gag gcg ctc ttc ggg cgt gac 3089 Val Asp Gly Phe Lys Thr Asp Gly Ser Glu Ala Leu Phe Gly Arg Asp 590 595 600 ctg atc gtc agc gac ggg cgc cgc ggt gac gag atg cac aac gcc tac 3137 Leu Ile Val Ser Asp Gly Arg Arg Gly Asp Glu Met His Asn Ala Tyr 605 610 615 ccg aac gag tac acc tcc gcc tac aac gac ttc gtg cag gag acg acg 3185 Pro Asn Glu Tyr Thr Ser Ala Tyr Asn Asp Phe Val Gln Glu Thr Thr 620 625 630 635 ggc gcc gac ggc acg atc ttc agc cgg gcg ggc acc tcc ggc ggc cag 3233 Gly Ala Asp Gly Thr Ile Phe Ser Arg Ala Gly Thr Ser Gly Gly Gln 640 645 650 agc gaa tcc atc ttc tgg gcc ggg gac cag gcg tcg acg ttc ggc gct 3281 Ser Glu Ser Ile Phe Trp Ala Gly Asp Gln Ala Ser Thr Phe Gly Ala 655 660 665 ttc cag gag gcc gtc cgg gcc ggg cag agc gcg ggc cag tcg gga gtg 3329 Phe Gln Glu Ala Val Arg Ala Gly Gln Ser Ala Gly Gln Ser Gly Val 670 675 680 ccg ttc tgg gcc tgg gac ctc ggc ggc ttc acc ggg tcg ttc cca 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ctg gtc gca ccg att acg aac 3713 Gln Gln Tyr Met Phe Gly Ser Gln Leu Leu Val Ala Pro Ile Thr Asn 800 805 810 cag ggc cag acc gtg aaa gac gtc tac ctg ccc gcg ggc gag tgg tac 3761 Gln Gly Gln Thr Val Lys Asp Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu Trp Tyr 815 820 825 gac ttc tgg aac ggc gga cgc gcg agc ggc gag ggc gtg aag atg tac 3809 Asp Phe Trp Asn Gly Gly Arg Ala Ser Gly Glu Gly Val Lys Met Tyr 830 835 840 gac gcc gga ccc gac ggc atc ccc gta tac gct cgc gcc gga gcg gtc 3857 Asp Ala Gly Pro Asp Gly Ile Pro Val Tyr Ala Arg Ala Gly Ala Val 845 850 855 atc ccg ctc aac ctc aac gac gcg tat gag gtg ggc ggc acg atc ggc 3905 Ile Pro Leu Asn Leu Asn Asp Ala Tyr Glu Val Gly Gly Thr Ile Gly 860 865 870 875 aac gac gtg gag agc tac gac aac ctt gtg ttc cgc gtt tac ccc tcc 3953 Asn Asp Val Glu Ser Tyr Asp Asn Leu Val Phe Arg Val Tyr Pro Ser 880 885 890 ggt gag agc agc tac gag tac ttc gaa gac caa gcg aac gcg cac cgc 4001 Gly Glu Ser Ser Tyr Glu Tyr Phe Glu Asp Gln Ala Asn Ala His Arg 895 900 905 cgg atc gat gtc tcg gcc gac cgc gca gcg cgc acg gtc gag gtg tct 4049 Arg Ile Asp Val Ser Ala Asp Arg Ala Ala Arg Thr Val Glu Val Ser 910 915 920 gct ccc gcg ctc acg acc gcg agc acc ttc cag gtg tcg ggc acc aag 4097 Ala Pro Ala Leu Thr Thr Ala Ser Thr Phe Gln Val Ser Gly Thr Lys 925 930 935 ccc gac acc gtg acc gtc gcg ggc tcg gca ctg cct gag gtc aac agc 4145 Pro Asp Thr Val Thr Val Ala Gly Ser Ala Leu Pro Glu Val Asn Ser 940 945 950 955 gtg agc gcg ctg gcc gca tcc acc gag gcc tgg tac tgg gat gcg aag 4193 Val Ser Ala Leu Ala Ala Ser Thr Glu Ala Trp Tyr Trp Asp Ala Lys 960 965 970 cag cag ctg acg tac gtg aag gtc ggt gcg agc acc ggc gag cgc acg 4241 Gln Gln Leu Thr Tyr Val Lys Val Gly Ala Ser Thr Gly Glu Arg Thr 975 980 985 atc ctc ctg ctg ggc gtc gac aag gcc ggg tac gag gcc gag ttc gcg 4289 Ile Leu Leu Leu Gly Val Asp Lys Ala Gly Tyr Glu Ala Glu Phe Ala 990 995 1000 ggt cat acg gcc gtc tcg acg aac gcc gac cac ccg ggc tac acc ggg 4337 Gly His Thr Ala Val Ser Thr Asn Ala Asp His Pro Gly Tyr Thr Gly 1005 1010 1015 ctc ggc ttc gtc gac ggc ttc gcg aac gca gga gac gcg gtg gag ttc 4385 Leu Gly Phe Val Asp Gly Phe Ala Asn Ala Gly Asp Ala Val Glu Phe 1020 1025 1030 1035 gac gtg tgg gcc gag gag aac ggc gcg cac cag ctc cgc ttc cgc tac 4433 Asp Val Trp Ala Glu Glu Asn Gly Ala His Gln Leu Arg Phe Arg Tyr 1040 1045 1050 gga aac gga gcg gcg acc ccc gcc acc cgc acg atc cgg gtc gac gga 4481 Gly Asn Gly Ala Ala Thr Pro Ala Thr Arg Thr Ile Arg Val Asp Gly 1055 1060 1065 gcg cct ctg gga acg ctg tcg ctt ccg ccc acc ggg tcg tgg agt tcg 4529 Ala Pro Leu Gly Thr Leu Ser Leu Pro Pro Thr Gly Ser Trp Ser Ser 1070 1075 1080 tgg ggc acg gcc tcg atc gac gtg acc ctc cca ccc gga cgc cac gcc 4577 Trp Gly Thr Ala Ser Ile Asp Val Thr Leu Pro Pro Gly Arg His Ala 1085 1090 1095 gta cgg atc gag tac gcc gga ggc gat tcc ggc ggc gtc aac ctc gac 4625 Val Arg Ile Glu Tyr Ala Gly Gly Asp Ser Gly Gly Val Asn Leu Asp 1100 1105 1110 1115 aac ctc gtc ctc gcg cgc tgagcgc acacgggaaa gggagaagaa ccatgcctgc 4680 Asn Leu Val Leu Ala Arg 1120 tcttccgtgg cgccgcacga cggcgctcgc gctcaccacg gcggtgacgg ccgcgaccct 4740 ggtcgccgtc ggggtgaacg acgccggtca ggcggcggct gctcccctgg gcgtgcaacg 4800 cgcgcagttc cagtcggggt cgagctacct cgtcgtcgag gtgctcgatg acgacctcgt 4860 ccacttcgag ctggccgggg gcggcaccgc ccccggcacg ggctccccgc tgttcacgac 4920 gcctcaggtc gcgaagcacg actacgcggg acccgacgtg ttcacccaga ccgggtctgt 4980 tctgcagacc gcggcgatgc gcatcgaggt cgatcccgcg gatctgtgcg tgacggccac 5040 cgacatcacc cgcaccccga accttgtact gcacgaggcg tgtcccgccg acctcggcca 5100 ggcgtggaag gggctgaaca tcacgaggtc ggcgatggag aacgcctacg gtctcgggca 5160 gcagttcttc acgggcggca gcgcggacgg cgactgggtg ggccgcaccc gcaccccggg 5220 tggcacctac ggcaacgcga tggtgttcga ccccgagaac gggccggtcg gcaacacgca 5280 gatcccggtg ctcttcgcgg tcggcgatga caacgcgaac tacgggctgt tcgtcgatca 5340 gctgtacaag caggaatgga acctcaccgg cgacccgtgg acggtgcgca tgtggggcga 5400 ccaggtgcgc tggtacctca tgagcggcga cgacctgccc gaccttcgcc acgactacat 5460 ggagctgacg ggcaccccgc ccgtgccgcc gaagaaggcg ttcgggctct gggtgtcgga 5520 gttcggctac gacaactgga gcgaggtcga caatacgatc gcgggcctgc gctcggccga 5580 ctttccggtc gatggcgcga tgctcgacgt acagtggttc gggggcgtca ccgccgactc 5640 ggacgacacc cgcatgggca ccctcgattg ggacacgtcg aggtttcccg accctgcggg 5700 aaagatcgcc gacctcgccg aggacggcgt cggcatcatc ccgatcgagg agtcgtacgt 5760 cggtcgcaac ctgccggagc acgcccggat ggcggcggac ggttacctcg tgcgctccgg 5820 ctgcgctacg tgcccgccgg tgtacctgac ggggaacccc tggtggggca agggcgggat 5880 gatcgactgg acgcagccgg aagccggcgc cgtctggcac gacgagcagc gccagcatct 5940 cgtcgacgag ggcgtactgg gccactggct cgatctcggc gaaccggaga tgtacgaccc 6000 gaacgactgg accgccggcg tcatccccgg caagcacgcg cacgccgact atcacaacgc 6060 gtacaacctg ctgtgggcgc agagcatcgc cgacgggtac gccgacaacg gcgtgcagaa 6120 gcgtcccttc atgctgacgc gcgccgcggc cgc 6153

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  40. 아래의 (1) 내지 (4)의 공정을 포함해서 되는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법:
    (1) 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에, 바실루스속 또는 아르드로박터속의 미생물 유래의, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 증가하지 않고 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하는 작용을 가진 α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시키고, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지며, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 α-이소말토실글루코 당질을 생성시키는 공정;
    (2) 얻어지는 α-이소말토실글루코 당질에 이소말토덱스트라나아제를 작용시켜 이소말토오스를 생성시키는 공정;
    (3) 얻어지는 이소말토오스를 수소 첨가하여 이소말티톨을 생성시키는 공정; 및
    (4) 얻어지는 이소말티톨을 채취하는 공정.
  41. 제40항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소가 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말티톨의 제조방법.
    (1) 분자량
    SDS-겔 전기 영동법에 의해 74,000 내지 160,000 달톤의 범위 내에 분자량을 가진다.
    (2) 등전점
    앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 3.8 내지 7.8의 범위 내에 등전점을 가진다.
    (3) 최적 온도
    pH 6.0, 60분간 반응에서 40 내지 50℃의 범위 내에서 최적 온도를 가진다.
    pH 6.0, 60분간 반응에서 1mM Ca2+ 존재하, 45 내지 55℃의 범위 내에서 최적 온도를 가진다.
    (4) 최적 pH
    35℃, 60분간 반응에서 pH 6.0 내지 8.4의 범위 내에서 최적 pH를 가진다.
    pH 8.4, 60분간 반응에서, 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는,
    pH 8.4, 60분간 반응에서 1mM Ca2+ 존재하, 65℃에서 최적 온도를 가진다.
    (5) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mM Ca2+ 존재하, 50℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 55℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다. 또는,
    pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mM Ca2+ 존재하, 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    (6) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건에서, pH 4.5 내지 10.0의 범위 내에서 안정 pH 영역을 가진다.
  42. 제40항에 있어서, α-이소말토실글루코 당질 생성효소를 작용시킬 때, 바실루스속 또는 아르드로박터속의 미생물 유래의, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코시드 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 α-이소말토실글루코 당질로부터, α-이소말토실 전이함으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가지는 환상 4당을 생성하는 작용을 가진 α-이소말토실 전이효소, 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제 및 전분 지절 효소로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소를 병용하는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법.
  43. 제42항에 있어서, α-이소말토실 전이효소가 아래의 이화학적 성질을 가진 효소인 이소말티톨의 제조방법.
    (1) 분자량
    SDS-겔 전기 영동법에 의해 82,000 내지 136,000 달톤.
    (2) 등전점
    앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해 pI 3.7 내지 8.3.
    (3) 최적 온도
    pH 6.0, 30분간 반응에서 45 내지 50℃의 범위에서 최적 온도를 가진다.
    (4) 최적 pH
    35℃, 30분간 반응의 조건하에서 pH 5.5 내지 6.5의 범위 내에서 최적 pH를 가진다.
    (5) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서, 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    (6) pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건에서, pH 3.6 내지 10.0의 범위 내에서 안정 pH 영역을 가진다.
  44. 제40항에 있어서, 이소말토덱스트라나아제를 작용시킨 후에, 글루코아밀라아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법.
  45. 제40항에 있어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코시드 결합을 가진 글루코오스 중합도 2 이상인 당질이, 말토올리고당, 말토덱스트린, 아밀로덱스트린, 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 액화 전분, 호화 전분, 및 글리코겐으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 이소말티톨의 제조방법.
  46. 제40항에 있어서, 이소말토오스를 채취하는 공정 또는 이소말티톨을 채취하는 공정에 있어서, 알칼리 금속형 또는 알칼리 토류 금속형 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 이용하고, 또한, 분말화 공정 또는 결정화 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법.
  47. 제40항에 있어서, 이소말티톨을 채취하는 공정에 있어서, 이소말티톨을 시럽상, 분말상 또는 결정상으로 채취하는 것을 특징으로 하는 이소말티톨의 제조방법.
  48. 제40항에 있어서, 얻어지는 이소말티톨이 고형물당 이소말티톨을 40％(w/w) 이상 함유하는 이소말티톨 함유물인 이소말티톨의 제조방법.
  49. 제40항에 기재한 이소말티톨의 제조방법에 의해 얻을 수 있는 이소말티톨 함유 혼합 당질.
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