JP5418870B2 - １−Ｏ−α−グルコピラノシルＤ−プシコースの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースに関し、詳しくはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物から酵素化学的に製造されるD-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法に関する。
D-プシコースはフルクトースのC-3エピマーであり、天然にはほとんど存在しない希少糖である。近年、D-プシコースの大量生産技術が本発明者何森らによって確立され（非特許文献１）、その利用が広く検討されつつある。該糖は、ノンカロリーの甘味料として（非特許文献２）、食品への利用だけでなく、肥満に対する効果、動脈硬化への効果、糖尿病への効果など医療面における利用の可能性が期待される機能性の単糖類である。
従来、単糖に機能性は期待できず、単糖をオリゴ糖あるいは配糖体化することによって、便通改善や水性溶媒への溶解度の増加など、単糖には存在しなかった機能が生ずると考えられてきた。現在まで、本単糖(D-プシコース)を構成糖に含む二糖類は、パラチノース生成酵素によるグルコシルプシコースの生成が報告されているが（非特許文献３）、その構造や生成量の検討には至っていない。またStereptomyces hygroscopicus var. decoyicusの生産する配糖体として、プシコフラニン（6-アミノ-9-D-プシコフラノシルプリン）の報告がある（非特許文献４）。しかしながら、現在、これらのオリゴ糖や配糖体を工業的に生産するには十分といえない状況にある。
一般に糖転移反応は特定の化合物に含まれる糖を供与体として利用し、水酸基を有する化合物、すなわち受容体に単糖を転移させる。この際、供与体となる糖類は二糖以上あるいは配糖体であることが必須である。また、単糖を転移させるためには、リン酸化した単糖類やフッ化処理した単糖類を用いることが必要である。従って、これらの糖を利用するにはオリゴ糖の大量生産や応用性を狭める原因となることが考えられる。
現在、多くのオリゴ糖は本糖転移反応を経て生産されている。糖転移反応には、糖転移反応を触媒する新規な酵素をコードする遺伝子及びその製造法（特許文献１）、糖転移反応によって得られた糖脂質（特許文献２）、糖転移反応を利用した飲食物の製造方法（特許文献３、４）、糖転移反応及びそれを利用したナフトール型―糖結合物質の製造法が挙げられる。
また、βガラクトシダーゼの転移反応による乳果オリゴ糖の生産（非特許文献６）や藤田らによるβフルクトフラノシダーゼによるフルクトオリゴ糖の生産(非特許文献６)、新規オリゴ糖及びその製造法（特許文献５）などに実用化試験結果が報告されている。
また、βガラクトシダーゼの転移反応による乳果オリゴ糖の生産（非特許文献６）や藤田らによるβフルクトフラノシダーゼによるフルクトオリゴ糖の生産(非特許文献６)、新規オリゴ糖及びその製造法（特許文献５）などに実用化試験結果が報告されている。
本発明者はすでに、特許文献6に示すようにエンド1,4-β-D-キシラナーゼを用いて、新規二糖類であるキシロシルプシコースの合成に成功している。しかしながら、加水分解酵素を利用している転移反応であるため、D-プシコースを含む新規二糖類の収量が低いことや多種類の結合様式を有する反応物質が生成することを明らかにしている。
D-プシコースの大量生産技術が確立され、D-プシコースに機能性が存在することが明らかになったことで、単糖の状態で機能を有するD-プシコースをオリゴ糖あるいは配糖体化することにより、既存のオリゴ糖よりもさらに高い機能を備えた新規オリゴ糖の創成が期待されるが、D-プシコースへのD-グルコースの転移反応を検討した例は、パラチノース生成酵素によるグルコシルプシコースの生成のみであり、その立体構造や収量を検討した例は見あたらない（非特許文献3）。
本発明は、D-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの提供を目的としている。
本発明は、D-グルコースとD-プシコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの提供を目的としている。
そこで発明者らは、D-プシコースを構成糖としたオリゴ糖を製造する方法について研究を進める過程において、D-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水生媒体中で作用させることにより、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産ができることを見出し、本発明の完成に至った。
また、本発明は、下記の(１)の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造法を要旨としている。
(１) -プシコ−スとマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれるα-グルコシル糖化合物を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水性媒体中で作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、その後に、アミログルコシダーゼ(EC 3.2.1.3)を作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、下記構造式（１）、（２）、（３）または（４）で示される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを反応媒体上清液から分離、あるいは精製することを特徴とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
(１) -プシコ−スとマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれるα-グルコシル糖化合物を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水性媒体中で作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、その後に、アミログルコシダーゼ(EC 3.2.1.3)を作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、下記構造式（１）、（２）、（３）または（４）で示される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを反応媒体上清液から分離、あるいは精製することを特徴とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
大量生産法が確立され、機能性が存在することが明らかになったD-プシコースについてオリゴ糖あるいは配糖体化することにより、既存のオリゴ糖よりもさらに高い機能を備えた新規オリゴ糖の創成が期待されるが、D-プシコースとD-グルコースを構成糖とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを提供することができる。
本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させることにより、D-グルコシル基をD-プシコースに転移させることにより生産される。
D-グルコシル基をD-プシコースに転移させる作用を有するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは、市販のBacillus stearothermophilus由来のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社 林原生物化学研究所製）が適しているが、Contizyme（Amano enzyme社製）、ToruzymeR3（Novozyme社製）及びBacillus属の生産するシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼにも当該1-O-α-グルコピラノシルD-プシコース生産性を有するものがある。
次に本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造法について説明する。
本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させることにより生産される。かかる反応に用いられるシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは糖転移反応であり、本酵素生産菌の菌体内あるいは菌対外酵素を用いる他、酵素液の固定化等をおこない作用させてもよい。
本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはD-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させることにより生産される。かかる反応に用いられるシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼは糖転移反応であり、本酵素生産菌の菌体内あるいは菌対外酵素を用いる他、酵素液の固定化等をおこない作用させてもよい。
もちろん市販のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを用いても問題は無く、例えばBacillus 属 やKlebisilla属など、それ自体公知のシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産菌や組換酵素であってもよい。さらに本酵素液を各種クロマトグラフィーで精製し、精製酵素として作用させてもよい。
D-プシコースとα-グルコシル糖化合物(マルトース以上)を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを水性媒体中で作用させる場合、例えばpH5.5に調製した0.01〜0.1M酢酸緩衝液中でD-プシコース15.0%存在下、シクロデキストリン（株式会社林原生物化学研究所製）5.0%で10〜90℃10分以上作用させること等によって反応液中に1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースが得られる。得られた反応液から、常法に従い、カラムクロマトグラフィーなどの処理により、本発明の1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを精製することができる。
以下に実施例をあげて本発明の方法をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらに限定されるものではない。
試験に用いた市販酵素剤を表1に示す。
試験に用いた市販酵素剤を表1に示す。
1.5mlのマイクロチューブ内に50mgのα-グルコシル糖化合物、すなわち各重合度のマルトオリゴ糖（マルトース、マルトトリオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースあるいはマルトヘプタオース）、マルトデキストリン、シクロデキストリンあるいは可溶性澱粉及び50mgのD-プシコースを採取し、100マイクロリットルの50mM酢酸緩衝液pH5.5中を加えた懸濁溶液に、20マイクロリットルのシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研修所製）を加え（30U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後、反応液を沸騰湯浴中で10分間加熱処理し、反応液を遠心分離（1,500xg, 5分間）した後、上清を100倍希釈した。本上清溶液にイオン交換樹脂AG501（Bio-Rad社製）を添加し20分放置した後、0.45ミクロンのメンブランフィルターでろ過した溶液を高速液体クロマトグラフィーを用いて同定した。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の分析条件は以下のとおりである。
カラム：Shodex KS-802 2連結（昭和電工株式会社製）
溶離液：蒸留水
流速：1ml/分
検出器：示差屈折率計（日立製作所製）
シクロデキストリン及びD-プシコースの反応液をHPLCで分析したクロマトグラム及び各重合度のマルトオリゴ糖による1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生成結果をそれぞれ、図1及び図2に示した。図1における保持時間17.01のピーク成分は、D-プシコースとシクロデキストリンなど、α-グルコシル化合物を混合した場合にのみ生成することがわかった。また本ピーク成分を等量の0.2N塩酸と混合し、100℃で3時間加水分解、中和後、再びHPLCで分析したところ、D-プシコースとD-グルコースに相当する溶出位置にそれぞれピークが認められた。このことから、D-プシコースとα-グルコシル化合物の酵素反応によって、D-プシコースを構成糖とした1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースが特異的に生産されることがわかった。本二糖類化合物は、いずれのα-グルコシル化合物においても2〜10mg/ml濃度で1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを生成していた（図2）。
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の分析条件は以下のとおりである。
カラム：Shodex KS-802 2連結（昭和電工株式会社製）
溶離液：蒸留水
流速：1ml/分
検出器：示差屈折率計（日立製作所製）
シクロデキストリン及びD-プシコースの反応液をHPLCで分析したクロマトグラム及び各重合度のマルトオリゴ糖による1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生成結果をそれぞれ、図1及び図2に示した。図1における保持時間17.01のピーク成分は、D-プシコースとシクロデキストリンなど、α-グルコシル化合物を混合した場合にのみ生成することがわかった。また本ピーク成分を等量の0.2N塩酸と混合し、100℃で3時間加水分解、中和後、再びHPLCで分析したところ、D-プシコースとD-グルコースに相当する溶出位置にそれぞれピークが認められた。このことから、D-プシコースとα-グルコシル化合物の酵素反応によって、D-プシコースを構成糖とした1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースが特異的に生産されることがわかった。本二糖類化合物は、いずれのα-グルコシル化合物においても2〜10mg/ml濃度で1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを生成していた（図2）。
1.5mlのマイクロチューブ内に50mgのα-シクロデキストリン及び 50mgのD-プシコースを採取し、50マイクロリットルの50mM酢酸緩衝液pH5.5中を加えた懸濁溶液に、20マイクロリットルのBacillus stearothermophilus由来シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、Bacillus licheniformis を宿主として生産された組み換え酵素由来のToruzymeR3あるいはBacillus macerans 由来Contizymeをそれぞれ（5U相当量）加え、40℃で48時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは様々な起源のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼで合成されるが、その起源によって収量が異なった。本反応条件における1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはBacillus stearothermophilus由来シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、ToruzymeR3及びContizymeでそれぞれ、2.8mg/ml、1.8mg/ml及び0.18mg/mlであった。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは様々な起源のシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼで合成されるが、その起源によって収量が異なった。本反応条件における1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースはBacillus stearothermophilus由来シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、ToruzymeR3及びContizymeでそれぞれ、2.8mg/ml、1.8mg/ml及び0.18mg/mlであった。
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリンを段階的に希釈したもの10マイクロリットル及び25%D-プシコースを段階的に希釈したもの10マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-シクロデキストリンとD-プシコースの割合が1:4の場合に生産性が最大となった（図3）。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-シクロデキストリンとD-プシコースの割合が1:4の場合に生産性が最大となった（図3）。
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、所定のpHに調整したMcIlvaine緩衝液を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、緩衝液のpHが5〜6において、生産性が最大となった（図5）。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、緩衝液のpHが5〜6において、生産性が最大となった（図5）。
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、各温度条件で3時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応温度が上昇するに伴い徐々に増加し、60℃で最大となった後、徐々に減少する傾向を示した（図5）。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応温度が上昇するに伴い徐々に増加し、60℃で最大となった後、徐々に減少する傾向を示した（図5）。
1.5mlのマイクロチューブ内に25%(W/V)α-シクロデキストリン4マイクロリットル及び25%D-プシコース16マイクロリットルを含む溶液に、McIlvaine緩衝液pH5.5を10マイクロリットル添加した後、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを加え（15U相当量）、40℃で所定時間反応させた。また反応開始100時間において、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）10マイクロリットルを更に加え（15U相当量）反応を継続した。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応時間に伴って上昇したが、62時間でほぼ平衡に達し、新たなシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを添加した後においても、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性の増加は認められなかった。（図6）。
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性は、反応時間に伴って上昇したが、62時間でほぼ平衡に達し、新たなシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを添加した後においても、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの生産性の増加は認められなかった。（図6）。
15mlのコニカルチューブ内に0.4gのα-シクロデキストリン及び1.6gのD-プシコースを採取し、蒸留水で4倍に希釈したMcIlvaine緩衝液pH5.5に溶解し、14.6mlとした。本溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（林原生物化学研究所製）400マイクロリットルを加え（600U相当量）、40℃で40時間反応させた。反応液を沸騰湯浴中で10分間加熱処理することにより、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを失活させた後、2000Uのアミログルコシダーゼ（Sigma社製）を加え、40℃で18時間反応させた。反応液を再び沸騰湯浴中で10分間加熱処理しアミログルコシダーゼを失活させた後、遠心分離（15,000xg,10分間）し、上清液を回収した。本上清液におよそ10gのAG501イオン交換樹脂（Bio-Rad社製）を添加し1時間放置した。
イオン交換樹脂を除いた溶液に活性炭1gを添加し、1時間攪拌した。ろ紙及びメンブランフィルターで活性炭を除去した後、本溶液を5mlになるまで減圧濃縮した。本溶液をToyopearl HW40S カラムクロマトグラフィー（カラム：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は蒸留水を溶離液とし、カラム温度は40℃、さらに流速1mｌ/分でおこなった。溶離液を2mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計(アタゴPR-100)で糖濃度を測定した（図7）。2糖類に相当する画分を回収し再度、減圧濃縮した後、Dowex50W(Ca型)カラムクロマトグラフィー（カラム：：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は、蒸留水を溶離液とし、カラム温度25℃、流速1ml/分でおこなった。溶離液を3mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計（アタゴFP-100）で糖濃度を測定した（図8）。二糖類化合物に相当する溶出ピークを回収し、減圧濃縮した後、凍結乾燥によって51.0mgの白色粉末を得た。
イオン交換樹脂を除いた溶液に活性炭1gを添加し、1時間攪拌した。ろ紙及びメンブランフィルターで活性炭を除去した後、本溶液を5mlになるまで減圧濃縮した。本溶液をToyopearl HW40S カラムクロマトグラフィー（カラム：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は蒸留水を溶離液とし、カラム温度は40℃、さらに流速1mｌ/分でおこなった。溶離液を2mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計(アタゴPR-100)で糖濃度を測定した（図7）。2糖類に相当する画分を回収し再度、減圧濃縮した後、Dowex50W(Ca型)カラムクロマトグラフィー（カラム：：φ2.5x90cm）に供した。分離条件は、蒸留水を溶離液とし、カラム温度25℃、流速1ml/分でおこなった。溶離液を3mlずつフラクションコレクターで分画し、屈折率計（アタゴFP-100）で糖濃度を測定した（図8）。二糖類化合物に相当する溶出ピークを回収し、減圧濃縮した後、凍結乾燥によって51.0mgの白色粉末を得た。
各種糖質分解酵素による分解性
0.5mlの50mM酢酸緩衝液pH5.5に5mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを溶解し、1.5mlマイクロチューブに50マイクロリットルをそれぞれ採取し（0.5mg相当）、0.5U相当量の各種グルコシダーゼ（Barley由来β-アミラーゼ、Rhizopus sp.由来アミログルコシダーゼ、Rice由来α-グルコシダーゼ、Aspergillus niger由来β-グルコシダーゼ）をそれぞれに添加し、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
その結果、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-グルコシダーゼのみで分解され他の糖質分解酵素の作用は全く受けないことがわかった。
0.5mlの50mM酢酸緩衝液pH5.5に5mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを溶解し、1.5mlマイクロチューブに50マイクロリットルをそれぞれ採取し（0.5mg相当）、0.5U相当量の各種グルコシダーゼ（Barley由来β-アミラーゼ、Rhizopus sp.由来アミログルコシダーゼ、Rice由来α-グルコシダーゼ、Aspergillus niger由来β-グルコシダーゼ）をそれぞれに添加し、40℃で18時間反応させた。反応終了後の溶液は実施例1の分析方法に従って、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを分析した。
その結果、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、α-グルコシダーゼのみで分解され他の糖質分解酵素の作用は全く受けないことがわかった。
得られた新規二糖類化合物の性状が明らかになった。
構成糖
1.2mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを0.2N塩酸0.2mlに溶解し、減圧下2時間98℃で加水分解した。加水分解試料を中和した後、一定量を上記HPLCで分析したところ、D-グルコース及びD-プシコースに相当する溶出位置に、同じ割合でピークが認められた。このことから、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、D-グルコースとD-プシコースが1:1の割合で結合していることがわかった。
分子量
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、TSKgel Oligo-PWカラム（東ソー株式会社製）を用いてHPLCで分析した。なおグルコースオリゴマー(1-20)(生化学工業株式会社製)を標準物質として用いた。
HPLC分析によって算出される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、293と見積もられた。これはD-グルコースとD-プシコースがグリコシド結合した場合の理論値342にほぼ等しい値となった。
NMR測定
試料40mgを600マイクロリットルのD2Oに溶解し、1HNMR及び13CNMRスペクトルを測定した。
NMR測定条件は、以下のとおりである。
装置：JEOL NM-SCM40
観測周波数：１HNMR:399.65MHｚ 13CNMR:100.40MHz
基準:TSP
温度:29.8℃
上記測定条件における結果を図9及び図10に示した。
測定結果から、二糖類化合物の結合様式はグルコースの還元末端1位がα結合でプシコースに結合していることが考えられたが、結合部位が異なった複数の混合物であることがわかった。
メチル化分析
常法に従って、新規二糖類化合物を部分メチル化した後、トリフルオロ酢酸を用いて水分解し、生成したメチル化単糖をアルジトールアセテート誘導体とし、ガスクロマトグラフ質量分析計で測定した。
ガスクロマトグラフ質量分析計の測定条件は以下のとおりである。
装置：日本電子 Auto-MassIII 質量分析計
Hewlett-Packard HP5890Aガスクロマトグラフ
ガスクロ部
装置：Hewlett-Packard HP5890A
カラム 液相:SPB-5（スペルコジャパン）
タイプ:fused silica capillary 25m x 0.25 mm I.D.
キャリアーガス:He
カラム温度:60℃, 1分 → 280℃
8℃/分
注入口温度:280℃
注入量:1マイクロリットル
注入モード:splitless
質量分析計部
イオン化方式:EI
電子加速電圧:70V
イオン化電流:300マイクロA
イオン源温度:250℃
イオン加速電圧:3.0KV
走査範囲:m/z40〜500(1sec/scan)
走査間隔:1sec
新規二糖類をメチル化し加水分解後、メチル化単糖をアルジトールアセテート(部分メチル化アルジトールアセテート)に変換し、ガスクロマトグラフ質量分析計により、糖鎖結合位置を解析した。トータルイオンクロマトグラフ図11に示し、図12及び図13に各ピークのマススペクトルを示した。
以上の性状より以下の構造式が得られた。
構成糖
1.2mgの1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを0.2N塩酸0.2mlに溶解し、減圧下2時間98℃で加水分解した。加水分解試料を中和した後、一定量を上記HPLCで分析したところ、D-グルコース及びD-プシコースに相当する溶出位置に、同じ割合でピークが認められた。このことから、1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは、D-グルコースとD-プシコースが1:1の割合で結合していることがわかった。
分子量
1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、TSKgel Oligo-PWカラム（東ソー株式会社製）を用いてHPLCで分析した。なおグルコースオリゴマー(1-20)(生化学工業株式会社製)を標準物質として用いた。
HPLC分析によって算出される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの分子量は、293と見積もられた。これはD-グルコースとD-プシコースがグリコシド結合した場合の理論値342にほぼ等しい値となった。
NMR測定
試料40mgを600マイクロリットルのD2Oに溶解し、1HNMR及び13CNMRスペクトルを測定した。
NMR測定条件は、以下のとおりである。
装置：JEOL NM-SCM40
観測周波数：１HNMR:399.65MHｚ 13CNMR:100.40MHz
基準:TSP
温度:29.8℃
上記測定条件における結果を図9及び図10に示した。
測定結果から、二糖類化合物の結合様式はグルコースの還元末端1位がα結合でプシコースに結合していることが考えられたが、結合部位が異なった複数の混合物であることがわかった。
メチル化分析
常法に従って、新規二糖類化合物を部分メチル化した後、トリフルオロ酢酸を用いて水分解し、生成したメチル化単糖をアルジトールアセテート誘導体とし、ガスクロマトグラフ質量分析計で測定した。
ガスクロマトグラフ質量分析計の測定条件は以下のとおりである。
装置：日本電子 Auto-MassIII 質量分析計
Hewlett-Packard HP5890Aガスクロマトグラフ
ガスクロ部
装置：Hewlett-Packard HP5890A
カラム 液相:SPB-5（スペルコジャパン）
タイプ:fused silica capillary 25m x 0.25 mm I.D.
キャリアーガス:He
カラム温度:60℃, 1分 → 280℃
8℃/分
注入口温度:280℃
注入量:1マイクロリットル
注入モード:splitless
質量分析計部
イオン化方式:EI
電子加速電圧:70V
イオン化電流:300マイクロA
イオン源温度:250℃
イオン加速電圧:3.0KV
走査範囲:m/z40〜500(1sec/scan)
走査間隔:1sec
新規二糖類をメチル化し加水分解後、メチル化単糖をアルジトールアセテート(部分メチル化アルジトールアセテート)に変換し、ガスクロマトグラフ質量分析計により、糖鎖結合位置を解析した。トータルイオンクロマトグラフ図11に示し、図12及び図13に各ピークのマススペクトルを示した。
以上の性状より以下の構造式が得られた。
本発明化合物である1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースは新規物質であり、ビフィ
ズス菌の増殖や植物の代謝に効果のある糖として、食品及び農林分野、さらに輸液等の糖
質としての医療分野への適用が期待される。
ズス菌の増殖や植物の代謝に効果のある糖として、食品及び農林分野、さらに輸液等の糖
質としての医療分野への適用が期待される。
Claims (1)
- D-プシコ−スとマルトオリゴ糖、マルトデキストリン、シクロデキストリン、アミロース、アミロペクチン、可溶性澱粉、液化澱粉、糊化澱粉、及びグリコーゲンから選ばれる1種または2種以上の糖質であるα-グルコシル糖化合物を含有する溶液にシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.19)を水性媒体中で作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、その後に、アミログルコシダーゼ(EC 3.2.1.3)を作用させ、加熱処理をしてその酵素活性を失活し、下記構造式（１）、（２）、（３）または（４）で示される1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースを反応媒体上清液から分離、あるいは精製することを特徴とする1-O-α-グルコピラノシルD-プシコースの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007059717A JP5418870B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | １−Ｏ−α−グルコピラノシルＤ−プシコースの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2007059717A JP5418870B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | １−Ｏ−α−グルコピラノシルＤ−プシコースの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008222581A JP2008222581A (ja) | 2008-09-25 |
| JP5418870B2 true JP5418870B2 (ja) | 2014-02-19 |
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| JP2007059717A Active JP5418870B2 (ja) | 2007-03-09 | 2007-03-09 | １−Ｏ−α−グルコピラノシルＤ−プシコースの製造方法 |
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| JP2004300144A (ja) * | 2003-03-17 | 2004-10-28 | Kazukiyo Kobayashi | ベロ毒素を捕捉する高分子 |
| JP4318179B2 (ja) * | 2004-12-13 | 2009-08-19 | 国立大学法人 香川大学 | Ｄ−プシコースを含有する新規二糖類化合物及びその製造方法 |
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-
2007
- 2007-03-09 JP JP2007059717A patent/JP5418870B2/ja active Active
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