JP6842353B2

JP6842353B2 - エノラーゼ産生抑制用組成物

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Publication number: JP6842353B2
Application number: JP2017087480A
Authority: JP
Inventors: 吉野　崇; 崇吉野; 祥子松熊
Original assignee: Fancl Corp
Current assignee: Fancl Corp
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2021-03-17
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: JP2018184374A

Description

本発明はエノラーゼ産生抑制用組成物に関する。

エノラーゼ（Ｅｎｏｌａｓｅ）は、正式名称をホスホピルビン酸ヒドラターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｐｙｒｕｖａｔｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）といい、解糖系に関わる重要な酵素である。この酵素は、グルコースからピルビン酸に至るまでのカスケード反応において、最後から２番目のステップである、２−ホスホグリセリン酸がホスホエノールピルビン酸に変換される反応を触媒する。また、この酵素は、典型的なスーパーファミリーであるエノラーゼスーパーファミリーに属している。ヒトには５種類のホスホピルビン酸ヒドラターゼのアイソザイムが存在する。主なエノラーゼのアイソザイムとして、α、β、γの３タイプが良く知られている。α−エノラーゼは細胞質に偏在しており、エノラーゼ１ともいう。β−エノラーゼは筋肉細胞に存在しエノラーゼ３ともいう。γ−エノラーゼは、主としてニューロンに存在し、エノラーゼ２ともいう。

近年、エノラーゼのアイソザイムについての研究が進み、エノラーゼを指標とする診断や検査方法が提案されている。
特許文献１には、皮膚から採取した角層のエノラーゼ１の発現量を測定することによって皮膚の皮膚粘弾性（弾力性）の指標とできることが記載されている。また非特許文献１にはエノラーゼ１がアトピー性皮膚炎患者において上昇することが記載されている。
特許文献２には、ニューロン特異エノラーゼＮＳＥを測定することで緑内障の発症リスクを評価する技術が記載されている。
特許文献３にはα−エノラーゼを腎がんの血中マーカーとして利用する技術が記載されている。また非特許文献２には血清γエノラーゼが腫瘍マーカーとして利用可能であることが記載されている。
特許文献４には、シクロペンテノン型プロスタグランジンの細胞膜上の結合部位を明らかにし、該結合部位に作用する物質の活性を測定する方法としてエノラーゼ２を利用する技術が記載されている。
特許文献５にはエノラーゼ１がアトピー性皮膚炎のマーカーとして利用可能なことが記載されている。
特許文献６には、アルツハイマー病、レービー小体疾患、パーキンソン病および前頭側頭葉痴呆などの疾患の神経変性特異的マーカーとしてニューロン特異的マーカーが利用できることが記載されている。
以上の先行技術のほかにも、エノラーゼやエノラーゼのアイソザイムが疾患の診断やマーカーとして利用できることが開示されている。

また特許文献７には、エノラーゼの阻害剤が抗がん剤として利用可能であることが記載されている。
特許文献７には、３（トランス）−クロロホスホエノールピルベート、３（シス）−シアノホスホエノールピルベート、Ｄ−タルトロネートセミアルデヒドホスフェート、アミノエノールピルベート、Ｄ−グリシドールホスフェート、およびＬ−グリシドールホスフェートなどのエノラーゼの阻害剤が、髭や腋毛などの体毛の生育の抑制剤として利用可能であることが記載されている。
特許文献８には、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）を制御するか、又はこれによって制御される因子であるエノラーゼ１を抑制することでリュウマチを治療できることが記載されている。
このようにエノラーゼの測定は、疾患の診断の指標として利用可能であり、さらにエノラーゼの阻害や抑制剤は、疾患治療や、美容用途などに利用可能なことが、多くの先行技術によって明らかになってきた。
しかし、エノラーゼの増減と代謝の関係については、現段階では解明されている部分が少なく、さまざまな研究が試行錯誤的に行われているのが現状である。

特開２０１６−１１４５１７号公報特開２０１６−０４８２６５号公報特開２０１３−１４００３０号公報特開２０１１−０８３２３６号公報国際公開第２００７／０４６４６３号特表２００２−５１９７０２号公報特表２０１６−５０４４０２号公報特表２００７−５１２３６９号公報

ＩｎｔＡｒｃｈＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．２００９；１５０（１）：８９−１０１．日泌尿会誌、７９巻、２号、１９８８年、２２０−２２６ページ

本発明者らは、これらの先行技術に基づき、エノラーゼの生体における機能について各種の研究を行ってきた。その過程でエノラーゼ１の増減が、何らかの形で細胞間の結合性に影響を与えている可能性が考えられた。
本発明者らは、細胞外環境要因である乾燥や化学物質の接触といった物理的・化学的な外部刺激を与えることにより、皮膚細胞の産生するエノラーゼが増加することを知見した。そして皮膚細胞への外部刺激とエノラーゼの増加についてさらに研究を進めたところ、塩化コバルトを皮膚細胞の培養液に添加するとより精度良く、刺激量とエノラーゼ産生量の関係を再現できることを見いだした。この刺激とエノラーゼ産生の関係を利用し、刺激によって増加するエノラーゼ量を低下又は抑制させる物質について、各種化合物や天然物を対象にスクリーニングをおこなった。その結果複数の物質が特異的にエノラーゼ産生を抑制することを見いだし、本発明をなすに至った。
すなわち本発明は、乾燥等の外部刺激によって増加するエノラーゼを抑制するための組成物を提供することを課題とする。

本発明は、次の構成からなる。
（１）Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールから選択される１以上の物質を有効成分として含有するエノラーゼ産生抑制用組成物。
（２）エノラーゼがエノラーゼ１である（１）に記載のエノラーゼ産生抑制用組成物。
（３）エノラーゼ産生が、外部刺激によって引き起こされるものである（１）又は（２）に記載のエノラーゼ産生抑制用組成物。
（４）外部刺激が乾燥、界面活性剤又は化学物質による刺激である（１）〜（３）のいずれかに記載のエノラーゼ産生抑制用組成物。
（５）組成物が外用剤の形態である（１）〜（４）のいずれかに記載のエノラーゼ産生抑制用組成物。
（６）Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールから選択される１以上の物質を０．１〜３０質量％含有する（５）に記載の外用目的のエノラーゼ産生抑制用組成物。

本発明により、新たなエノラーゼ産生抑制用組成物が提供される。

乾燥、メチルパラベン（防腐剤）、ラウリル硫酸ナトリウム（界面活性剤）、塩化コバルトによるエノラーゼ１産生促進効果を確認した試験結果を示すグラフである。各種糖類のエノラーゼ１産生抑制効果をスクリーニングした試験結果を示すグラフである。

本発明は、Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールを含有するエノラーゼ産生抑制用組成物である。
本発明のエノラーゼ産生抑制用組成物の有効成分であるＤ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールは、糖として市販されている純度のものであればいずれも使用可能である。９８質量％以上の純度に精製されたものを用いることが好ましい。
本発明の組成物は、エノラーゼ産生を抑制しようとする部位、あるいは組織に、必要な濃度で到達させることが必要である。したがって注射剤又は外用剤のようにエノラーゼの低下を必要とする患部あるいは組織に直接投与できる製剤とすることが好ましい。

本発明のエノラーゼ産生抑制用組成物及び該組成物を含有する外用剤には、目的部位においてＤ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールがエノラーゼ産生抑制作用を発揮する濃度に達するように製剤化できれば、その含有量に特に制限はない。なお、グルコース、フルクトースの場合、インビトロ試験の結果から、細胞のエノラーゼ１産生を抑制するための最低濃度は、２５ｍＭである。他の糖類もほぼ同様である。したがって外用製剤としての濃度は、Ｄ−グルコース、フルクトースの場合、０．４５質量％以上の濃度になるように含有量を調整すれば良い。２糖類であるラクトースは０．９質量％以上、メリビオース、イソマルチトールの場合は、０．８６質量％以上である。尚、これらの糖類は毒性がほとんどなく比較的安価なため、製剤の特性に応じて３０質量％程度まで配合してもよい。
したがって本発明の外用に用いるエノラーゼ産生抑制用組成物にあっては、Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールから選択されるいずれか１以上の物質を０．１〜３０質量％含有させることが好ましい。
Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールのいずれか１以上を含む製剤は、製剤上の常套手段により調製することができる。医薬あるいは化粧料用無毒性担体としては、例えば、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、アルブミン、水、生理食塩水、油脂等を配合して、所望の濃度に調整すれば良い。また、必要に応じて、安定化剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤等の慣用の添加剤を適宜添加し、外用剤として調製することができる。
投与回数は、１日当たり１〜３回投与することで、外用剤の投与部位でエノラーゼの産生を抑制することができる。

以下に、試験例を示して本発明を具体的に説明する。
１．試験例１（各種刺激によるエノラーゼ産生増加試験）
細胞外部からの物理的刺激や化学物質による刺激によって、刺激量依存性で表皮角化細胞の産生するエノラーゼ（エノラーゼ１）が増加することを確認した。細胞に対する外部刺激としては、公知の乾燥処理、メチルパラベン（ＭＰ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）の４種の物理的処理又は化学物質処理を選択し、これら外部刺激によるエノラーゼの増加を確認した。

（１）使用細胞及び培養方法
ヒト表皮ケラチノサイト（Ｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；ＮＨＥＫ）（Ｌｏｎｚａ）を購入して試験に用いた。細胞は、ＥｐｉＬｉｆｅ（Ｒ）Ｍｅｄｉｕｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて培養し、継代の際には、０．０１％トリプシン／０．００４％ＥＤＴＡにより接着細胞を剥離させて回収し、これを試験に用いた。

（２）刺激試験
細胞培養用２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅ（住友ベークライト）に、３．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種し、２４時間後に、細胞刺激処理を行い、処理後、２４時間、４８時間又は７２時間、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下でインキュベートした。
刺激の条件は表１のとおりとした。なお刺激試験に用いる全ての試薬は、培地を用いて使用する濃度に溶解し、ニトロセルロース膜（０．４５μｍ）を用いてフィルター滅菌した。

培養上清をエノラーゼ１測定用サンプルとして回収した後、刺激後の細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬工業）を用いて洗浄した。各ウェルに２００μＬのＲＩＰＡＬｙｓｉｓａｎｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、４℃にて３０分間の振とうを行い、ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ中に細胞中のタンパクを抽出した。

（３）エノラーゼ１の測定
サンドイッチＥＬＩＳＡ法により細胞抽出液中のエノラーゼ１を定量した。１次抗体には抗エノラーゼ１モノクローナル抗体（ａｂｎｏｖａ社製Ｍ１０）、２次抗体には抗エノラーゼ１モノクローナル抗体（ａｂｎｏｖａ社製Ｍ０１）を用いた。さらに、ＢＣＡ法（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により各検体の総タンパク量を定量した。細胞中の総タンパク１μｇ当たりのエノラーゼ１量を刺激によるエノラーゼ１発現量とした。

（４）結果
測定結果は、３ウェルの平均値を求め、対照（刺激なし）に対するエノラーゼ１増加率として図１に示した。
乾燥処理では５分、１５分、３０分ともにエノラーゼ１が増加した。
ＭＰ刺激では０．００３％、０．０３％ともにエノラーゼ１が増加した。また処理時間に応じてエノラーゼ１の増加が確認された。
ＳＤＳ刺激では、１０μＭ、３０μＭともにエノラーゼ１が増加した。
ＣｏＣｌ_２刺激では、１００μＭ処理７２時間でエノラーゼ１が増加し、３００μＭ処理では４８時間及び７２時間処理でエノラーゼ１が増加した。
刺激の種類により、エノラーゼ１の増加量は異なるが、刺激時間が長くなるとエノラーゼ１の増加率が高くなることが分かった。
以上の試験結果から、皮膚角化細胞は外部刺激によってエノラーゼ１の産生が促進され、刺激強度、刺激時間に対応して増加するものと考えられた。

２．試験例２（エノラーゼ産生抑制作用を有する物質の探索試験）
上記ヒト表皮ケラチノサイトに対する試験により、物理的刺激又は化学物質刺激でエノラーゼ１産生が促進されることが判明した。外部刺激によって増加するエノラーゼ１量を低下又は抑制させる物質を探索した。
（１）細胞培養
試験例１と同様にヒト表皮ケラチノサイト（Ｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；ＮＨＥＫ）を使用して試験用の表皮細胞を調製した。
エノラーゼ産生を増加させる刺激は、試験例１の結果に基づいて塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）を選択した。２４時間後に３００μＭの塩化コバルトと探索対象物質（試験試料）を溶解した培地に交換し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で４８時間又は７２時間、インキュベートした。
探索対象物質は次の表２に示す糖類である。

なお上記の試験試料は、培地を用いて１００μＭになるように溶解し、ニトロセルロース膜（０．４５μｍ）を用いてフィルター滅菌した。

（２）細胞サンプルの回収
刺激処理終了後、培養上清を回収し、ついで細胞をＰＢＳ（−）（和光純薬工業）で洗浄した。各ウェルに２００μＬのＲＩＰＡＬｙｓｉｓａｎｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、４℃で３０分間振とうを行い、ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ中に細胞中のタンパクを抽出した。

（３）エノラーゼの定量
試験例１と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて細胞抽出液中のエノラーゼ１を定量した。また、ＢＣＡ法（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）により各検体の総タンパク量を定量し、細胞中の総タンパク１μｇ当たりのエノラーゼ１量を得た。

（４）結果
測定結果は、３ウェルの平均値を求め、対照（試験試料無添加）のエノラーゼ１量を１００としたときの、試験試料添加時のエノラーゼ１量を相対値として図２に示した。また対照の７０％以下に抑制した試験試料には「※」を付した。
Ｄ（−）−フルクトース、Ｄ（＋）−グルコース、イソマルチトール、ラクトース一水和物、メリビオースの５試料が強いエノラーゼ１抑制作用を有していた。
すなわち、上記の５種類の糖類は、皮膚角化細胞が外部刺激によって産生するエノラーゼ１を抑制することが判明した。したがってＤ（−）−フルクトース、Ｄ（＋）−グルコース、イソマルチトール、ラクトース一水和物、メリビオースがエノラーゼ１の産生抑制剤やエノラーゼ１の産生抑制用組成物として有用である。

３．試験例３（エノラーゼ産生抑制作用を有する物質の有効濃度試験）
前記試験例２で有効性が確認できたＤ（−）−フルクトース、Ｄ（＋）−グルコース、イソマルチトール、ラクトース一水和物、メリビオースの５つの試験試料について有効濃度を確認した。
試験方法は、各糖類を培養液に２５、５０、１００、２００ｍＭの濃度となるように細胞培養培地に溶解し、これを用いて上記試験例２と同様の試験によってヒト表皮ケラチノサイトに対するエノラーゼ１産生抑制試験を行った。
試験結果を表３に示した。

表３に示すとおり、各試料は２５〜２００ｍＭの濃度範囲でエノラーゼ１の産生を顕著に抑制した。したがって、これらの成分を外用剤に配合する場合０．４５〜３０質量％の濃度で配合することで、皮膚のエノラーゼ１産生を効果的に抑制できることが確認できた。

Claims

Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールから選択される１以上の物質を有効成分として含有するエノラーゼ１産生抑制用組成物。
エノラーゼ１産生が、外部刺激によって引き起こされるものである請求項１に記載のエノラーゼ産生抑制用組成物。
外部刺激が乾燥、界面活性剤又は化学物質による刺激である請求項１又は２に記載のエノラーゼ１産生抑制用組成物。
組成物が外用剤の形態である請求項１〜３のいずれかに記載のエノラーゼ１産生抑制用組成物。
Ｄ−グルコース、フルクトース、ラクトース、メリビオース、イソマルチトールから選択される１以上の物質を０．１〜３０質量％含有する請求項４に記載の外用目的のエノラーゼ１産生抑制用組成物。