CN102812021A

CN102812021A - 抗坏血酸不饱和脂肪酸单酯和二酯及其化妆品的应用

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Publication number: CN102812021A
Application number: CN2010800251989A
Authority: CN
Inventors: S·普瓦尼; S·多纳斯-马里昂; N·卡斯泰里齐; P·波格丹诺维奇
Original assignee: Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Current assignee: Pierre Fabre Dermo Cosmetique SA
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2012-12-05
Also published as: CA2764430A1; NZ596947A; WO2010142663A8; US20120076744A1; FR2946252A1; JP2012529462A; ZA201108868B; FR2946252B1; KR20130043079A; MA33401B1; RU2011152276A; AU2010257599A1; US8722729B2; EP2440551A1; BRPI1012965A2; EP2440551B1; SG176704A1; MX2011013085A; WO2010142663A1

Abstract

本发明涉及下列通式(I)的化合物：其中：R₁是包含至少一个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链；且R₂和R₃各自或同时是氢或C₁-C₃的烷基或苯基；且R₄：氢原子或COR₁ _’，其中R₁ _’是包含至少1个，有利地1-6个且优选1-4个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链。

Description

抗坏血酸不饱和脂肪酸单酯和二酯及其化妆品的应用

技术领域

本发明涉及抗坏血酸衍生物及包含抗坏血酸衍生物的药物或化妆品组合物，其制备方法及其特别作为药物或作为化妆品有效成分的应用。

背景技术

抗坏血酸是含有抗氧化剂特性的有机酸。抗坏血酸的天然来源是新鲜水果和蔬菜，特别是柑橘类水果。

由于其抗氧化剂特性，抗坏血酸经常在食品工业中被用作食品添加剂列表中代码E300的防腐剂。抗坏血酸也常由于其众所周知的抗自由基及角质分离特性而用于化妆品工业。

抗坏血酸是白色粉末形式，其在空气中或湿润环境中很容易变色。

不饱和脂肪酸相当于含有一个或多个不饱和度的脂肪酸。

术语单不饱和脂肪酸是用在当他们包含了一个不饱和度时。术语多不饱和脂肪酸是用在当他们包含了多个不饱和度时。

不饱和脂肪酸也来源于植物。

不饱和脂肪酸分为不同的类别。这些类别由起始于酸基异端第一不饱和度的位置来定义。

特别的，不饱和脂肪酸三个主要类别之间的区别在于：Ω3，Ω6和Ω9。Ω3，Ω6和Ω9系列的顺式不饱和脂肪酸包含了数个所谓的必需脂肪酸。这些脂肪酸之所以被称作必需的是因为他们仅仅能够通过摄取食物来提供。

众所周知，主成分是油酸(C18:1)的Ω9单不饱和脂肪酸有预防心血管疾病的有益效果。

同样众所周知，属于Ω3和Ω6类别的多元不饱和脂肪酸(PUFAs)对心血管疾病和癌症有预防作用。特别的，法国食品安全局(AFSSAP)建议观察食品中Ω3和Ω6不饱和脂肪酸之间的比例，即每5个亚油酸中一个α亚麻酸的比例。

除了他们新陈代谢作用以外，他们能够改变细胞内蛋白基因编码的表达。这些多元不饱和脂肪酸的基因效果表现在通过所谓PPARs(过氧化物酶体增生物激活受体)的核受体来进行。PPARs属于甾体化合物类激素类核受体的家族。他们与维甲酸的RXR受体(维甲酸X受体)形成异二聚体并调节基因表达。因此ω3PUFAs表现为炎症反应的负调控物，通过诱导NF-KB途径主要抑制剂IKBα的表达来抑制NF-KB活化途径(Ren J和Chung SH.JAgric Food Chem.200755：5073-80)。另外，ω3PUFAs对花生四烯酸的合成有抑制效应以有利于二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的合成(Calder PC.Lipids：2001：36，1007-24)。

不饱和脂肪酸，特别是多元不饱和脂肪酸，他们的皮肤病学特性为众人所知(Monpoint S，Guillot B，Truchetet F等人，Essential fatty acidsin dermatology.Ann Dermatol Venereol，1992，119：233-239)。特别的，亚油酸是细胞膜制备中的多元不饱和脂肪酸。亚油酸的缺点是导致皮肤干燥和过敏的存在。

发明内容

本发明的化合物是5和6位羟基由环状缩醛和更特别的是丙酮(缩丙酮)的环状缩醛保护的抗坏血酸不饱和脂肪酸的二酯或单酯。该官能团在弱酸性介质中，即在酸性pH在5.2-7之间的皮肤上易水解。因此环状缩醛将保护抗坏血酸防止其侧链氧化。使用环状缩醛使所得到的结构大小适合在脂相中有高溶解度。

脂肪酸的酯类也能够轻易地被皮肤上的酯酶分裂，以使得不饱和脂肪酸释放(Redoules，D.，Tarroux，R.，Assalit，M.F.和Perié，J.J.Characterization and assay of five enzymatic activities in the stratumcorneum using tape-stripping，Skin Pharmacol.Appl.Skin Physiol.，12，182-192(1999))。因此由皮肤上的酯酶使不饱和脂肪酸酯类分裂会使有效成分缓慢扩散，这符合药物传输的概念。

对于本发明通式(I)的化合物，皮肤酯酶在酯键上的反应，在使用不饱和脂肪酸单酯时，会导致一个不饱和脂肪酸和一个抗坏血酸分子释放；或者在使用不饱和脂肪酸二酯时，使两个不饱和脂肪酸和一个抗坏血酸分子通过2位单酯释放。

特别的，对于不饱和脂肪酸二酯，酯酶的反应将会首先导致不饱和脂肪酸单酯的形成以及抗坏血酸的释放，然后释放抗坏血酸和另一个不饱和脂肪酸(方案1)。

方案1：通过皮肤酯酶的分裂反应的例子

因此本发明的目的是下列通式(I)的化合物：

其中

-R₁是包含至少1个，有利地1-6个且优选1-4个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链；并且

-R₂和R₃各自或同时为：氢或C₁-C₃烷基或苯基；并且

-R₄是氢原子或COR₁’，其中R₁’是包含至少1个，有利地1-6个且

优选1-4个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链。

本发明所述“不饱和度”意思是双键C＝C。

本发明所述“不饱和脂肪酸”意思是直链羧酸(R₁CO₂H)或(R₁’CO₂H)酸，该酸包含12-24个碳原子，优选14-18个碳原子，更优选18个碳原子(包括羧酸官能团的碳原子)并且包括至少1个C＝C双键，优选1-4个C＝C双键，这些双键优选具有顺式结构。

本发明所述“不饱和脂肪酸的烃链”意思是与不饱和脂肪酸(R₁CO₂H)或(R₁’CO₂H)的酸官能团相连的烃链(R₁)或R₁’)。因此，R₁和R₁’表示为直烃链，其包含11-23，优选13-17并且进一步优选17个碳原子并且包含至少1个，优选1-4个C＝C双键，这些双键优选具有顺式结构。根据本发明，如果R₄表示为COR₁’，R₁和R₁’可以相同或不同。

不饱和脂肪酸可以是月桂烯酸(C_12:1)、肉豆蔻酸(C_14:1)、十六碳烯酸(C_16:1)、油酸(C_18:1)、蓖麻油酸(C_18:1)；甘碳烯酸(C_20:1)、芥酸(C_22:1)、α-亚麻酸(C_18:3)；亚麻油酸(C_18:4)、二十碳三烯酸(C_20:3)、二十碳四烯酸(C_20:4)、二十碳五烯酸(C_20:5)、二十二碳五烯酸(C_22:5)、二十二碳六烯酸(C_22:6)、二十四碳五烯酸(C_24:5)、二十四碳六烯酸(C_24:6)、亚油酸(C_18:2)、γ-亚油酸(C_18:3)、二十碳二烯酸(C_20:2)；二高-γ-亚油酸(C_20:3)、花生四烯酸(C_20:4)、二十二碳四烯酸(C_22:2)、二十二碳五烯酸(C_22:5)、肾上腺酸(C_22:4)和十八碳三烯酸(C_18:3)。

有利的是，本发明的化合物是R₁为选自油酸(C_18:1)、亚油酸(C_18:2)、α-亚麻酸(C_18:3)和γ-亚油酸(C_18:3)的不饱和脂肪酸的化合物。

有利的是，本发明的化合物是当R₄表示COR₁’，R₁’为选自油酸(C_18:1)、亚油酸(C_18:2)、α-亚麻酸(C_18:3)和γ-亚油酸(C_18:3)的不饱和脂肪酸的化合物。

本发明所述“烷基”意思是直链或支链饱和脂肪族烃链并且包含特定的碳原子数。可以提及的例子是甲基、乙基和丙基。

有利的是，本发明的化合物是R₂和R₃表示C₁-C₃烷基的化合物。

有利的是，本发明的化合物是R₂和R₃表示为甲基的化合物。

有利的是，本发明的化合物是R₁表示含有1-3个不饱和度的C₁₄-C₁₈不饱和脂肪酸的烃链的化合物。

有利的是，本发明的化合物是当R₄表示COR₁’，R₁’表示为含有1-3个不饱和度的C₁₄-C₁₈不饱和脂肪酸的烃链的化合物。

根据本发明的一个实施方案，通式(I)化合物是R₄代表COR₁’的化合物。

根据本发明的另一个实施方案，通式(I)化合物是R₄代表氢原子的化合物。

特别的，本发明的化合物能够从如下分子中选择：

1.R ₄ 表示COR ₁ ’的通式(I)的分子

-(9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-，3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯，

-(9Z，9’Z，12Z，12’Z，15Z，15’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12，15三烯酸酯，

-(6Z，6’Z，9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-6，9，12三烯酸酯，

-(Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基二油酸酯。

2.R4表示氢原子的通式(I)的分子

-(9Z，12Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12-二烯酸酯

-(9Z，12Z，15Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12，15-三烯酸酯

-(6Z，9Z，12Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-6，9，12-三烯酸酯

-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基油酸酯。

本发明的另一个目的是通式(I)的化合物用作药物。

本发明的另一个目的是通式(I)的化合物用作化妆品有效成分。

特别的，本发明的另一个目的是通式(I)的化合物用作褪色有效成分、抗衰老有效成分、抗氧化剂有效成分、保湿有效成分、抗炎有效成分、或刺激身体和/或头部毛发再生的有效成分。

本发明也涉及到药物或化妆品组合物，其特征为该组合物包含与特别适于经皮给药方式的药物上或化妆品上可接受的赋形剂结合的至少一种的通式(I)化合物。

本发明所述“药物上或化妆品上可接受的”是指可用于制备药物或化妆品组合物，其通常安全、无毒且既没有生物学也没有其他方面的不良反应，并且对特别是通过局部给药的治疗或美容使用可接受的。

本发明的药物或化妆品组合物可以与特别是能渗透皮肤以达到提高有效成分特性及可达性的赋形剂一起，为熟知的皮肤或头皮局部给药的形式(例如特别是洗剂、泡沫、凝胶剂、分散剂、乳剂、洗发剂、喷雾剂、精华液、面膜、润肤乳或霜剂)。本发明药物或化妆品组合物也能为通常用于去皱产品的注射凝胶形式(例如与透明质酸、胶原或藻酸盐等结合)。

除本发明的化合物，这些组合物通常包含水中或溶剂中(如乙醇、乙醚或甘油醇)生理学方面可接受的介质。他们也包含表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、凝胶剂、润湿剂、润滑剂、微量元素、挥发油、芳香剂、染色剂、除油剂、化学或矿物过滤剂，保湿剂或矿物质水等。

这些组合物也可能包含其他导致补足或选择性协同效果的有效成分。

有利的是本发明组合物包含0.01％-10重量％，优选0.1％-5重量％的通式(I)的化合物。

这些组合物更加特别用于皮肤和/或头部毛发和/或身体毛发褪色，治疗和/或预防皮肤衰老、保湿表皮、刺激头部和/或身体毛发再生，或治疗皮肤炎症。

本发明的另一个目的是治疗和/或预防皮肤老化的美容方法。

本发明的目的也涉及到使用含有至少一个通式(I)化合物的化妆品组合物使人体皮肤和/或身体毛发和/或头部毛发美白和发亮的方法。

本发明另一目的涉及到通过羧基官能团在活性化形态下的不饱和脂肪酸与通式(II)的抗坏血酸衍生物偶合制备通式(I)化合物的方法。

方案2：制备通式(I)化合物的方法

(DCM＝二氯甲烷)

(其中R₄可以代表COR₁’或氢原子)

本发明的偶合反应是在碱的存在以及任选地，偶合助剂存在下进行。

碱可以例如是嘧啶或三乙胺。

偶合助剂可以例如是4-二甲基氨基吡啶。

本发明所述“活性化形态”意思是改性羧酸功能团使其对亲核试剂有更高的活性。这些活性化形态为本领域技术人员所熟知并且特别可以为酰氯。

鉴于下列非限制的实施例，将会更好的理解本发明。

具体实施方式

实施例(1)：本发明化合物的合成。

-R4表示COR ₁ ’的通式(I)的分子

1.1常规方法A：从不饱和脂肪酸氯和嘧啶起始

1.1a分子1：

(9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯

途径1：在充氮条件下将5，6-O-亚异丙基-抗坏血酸(1.08g，5mmol，1eq.)和4-二甲基氨基吡啶(61mg，0.5mmol，0.1eq.)的10ml无水嘧啶溶液中，加入2.9g亚麻酰氯(10mmol，2eq.)，然后将混合物置于室温搅拌16小时。反应完毕后进行薄层色谱(TLC)。

在回到室温后，蒸发溶剂然后用乙醚/水混合物萃取残留物。有机相用1N HCL溶液冲洗然后用NaCl饱和溶液冲洗两次。用硫酸镁干燥后，蒸发溶剂得到油。

然后残留物用庚烷/乙酸乙酯混合物(100∶0-70∶30)在二氧化硅上或用制备高效液相色谱来纯化。得到的无色油形态的产物在真空中过夜干燥。

得到1.49g，产率为40％。

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)：δ：0.83(2t，6H)；1.27-1.39(m，34H)；1.68(m，4H)；2.06(m，8H)；2.53(2t，4H)；2.77(2t，4H)；4.01(dd，1H)；4.18(dd，1H)；4.35(td，1H)；5.14(d，1H)；5.35(m，8H)。

¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)：δ：14.01；22.6-33.6(脂肪族)；65.19；72.9；75.3；76.7；77；110.8；122.0；127-130；150.8；167.7；168，169。

途径2：5，，6-O-亚异丙基-抗坏血酸(1g)混悬置于二氯甲烷(19ml)。加入嘧啶(0.79ml)，反应介质变成非均匀白色(T＝15℃)。搅拌10分钟后，用冰浴将反应介质冷却至0℃。5分钟内加入亚麻酰氯(2.98ml)的二氯甲烷(6ml)溶液，之后移走冰浴且放置反应介质搅拌30分钟。

反应介质用水(3×50ml)和2％硫酸铜溶液(w/v)(2×50ml)冲洗，然后再用水冲洗(50ml)。有机相用硫酸镁干燥然后真空下浓缩得到棕色油(3.3g；产率96％)。

该油储存在-18℃的氮气中。

1.2常规方法B：从不饱和脂肪酸氯和三乙胺起始。

1.2a分子2：

(9Z，9’Z，12Z，12’Z，15Z，15’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12，15三烯酸酯

在充氮条件下将1.91ml亚麻酰氯(6mmol，3eq.，70％，工业用)加入到5，6-O-亚异丙基-抗坏血酸(432mg，2mmol，1eq.)和三乙胺(960μl，7mmol，3.5eq.)的20ml无水二氯甲烷溶液中，然后将混合物置于室温搅拌16小时。反应完毕后进行薄层色谱。

在回到室温后，蒸发溶剂然后用乙醚/水混合物萃取残留物。有机相用1N HCL溶液冲洗然后用NaCl饱和溶液冲洗两次。用硫酸镁干燥后，蒸发溶剂得到油。然后残留物用庚烷/乙酸乙酯混合物(100∶0-70∶30)在二氧化硅上或用制备高效液相色谱来纯化。得到的无色油形态的产物在真空中过夜干燥。

得到604mg，产率为41％。

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)：δ：0.91(2t，6H)；1.27-1.39(m，30H)；1.67(m，4H)；2.06(m，4H)；2.53(2t，4H)；2.79(2t，4H)；4.09(dd，1H)；4.18(dd，1H)；4.36(td，1H)；5.14(d，1H)；5.38(m，12H)。

1.2b分子3：

(6Z，6’Z，9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-6，9，12三烯酸酯

从2.5当量的γ亚麻酰氯(98％)起始。

无色油，产率为68％。

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)：δ：0.89(2t，6H)；1.27-1.44(m，20H)；1.47(m，4H)；1.68(m，4H)；2.06(m，8H)；2.55(m，4H)；2.80(m，8H)；4.01(dd，1H)；4.18(dd，1H)；4.36(td，1H)；5.14(d，1H)；5.37(m，12H)。

1.2.c分子4：

(Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基二油酸酯

从2.5当量的油酰氯(98％)起始。

纯化后为无色油，产率为53％。

¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)：δ：0.88(2t，6H)；1.26-1.55(m，46H)；1.67(m，4H)；2.00(m，8H)；2.53(m，4H)；2.77(2t，4H)；4.09(dd，1H)；4.18(dd，1H)；4.36(td，1H)；5.14(d，1H)；5.34(m，4H)。

实施例(2)：本发明化合物的合成

-R ₄ 表示氢原子的通式(I)的分子：

2.1分子5：

(9Z，12Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12-二烯酸酯

在充氮条件下在三颈烧瓶中制备5，6-O-亚异丙基-抗坏血酸(5.5g；25.44mmol)的110ml丙酮混悬物，然后加入3.53ml三乙胺。形成大量的白色沉淀物。然后3分钟内逐滴加入亚麻酰氯(3.55ml；11.06mmol)，随后混合物置于室温搅拌10分钟。混合物再次变澄明，然后形成少量盐酸三乙胺沉淀。通过烧结过滤器过滤固体并且处理滤液得到油。该油溶解在100ml乙酸乙酯中并用饱和NaCl溶液冲洗3次。有机相用硫酸钠干燥，过滤并且蒸发得到4.76g棕色固体，产率为90％。¹H NMR(300MHz，，氘代氯仿)：δ：0.90(t，3H)；1.27-1.39(m，20H)；1.70(m，2H)；2.06(m，4H)；2.58(t，2H)；2.78(t，2H)；4.13(dd，1H)；4.20(dd，1H)；4.43(m，1H)；4.65(d，1H)；5.37(m，4H)。

[M+Na]⁺＝501.2；[2M+Na]⁺＝979.7

[M-H]^-＝477.3；[2M-H]^-＝955.7

2.2分子6：

5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基油酸酯

从油酰氯起始进行与分子5相同的操作模式。

白色固体，产率：96％；

¹H NMR(300MHz，氘代氯仿)：δ：0.89(t，3H)；1.28-1.42(m，26H)；1.69(m，2H)；2.02(m，4H)；2.62(m，2H)；4.15(dd，1H)；4.22(dd，1H)；4.45(td，1H)；4.70(d，1H)；5.36(m，2H)。

[M+Na]⁺＝503.2

[M-H]^-＝479.3

2.3分子7

(9Z，12Z，15Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12，15-三烯酸酯

从亚麻酰氯起始进行与分子5相同的操作模式。

棕色固体。产率：91％。

¹H NMR(300MHz，氘代氯仿)：δ：0.99(t，3H)；1.30-1.42(m，14H)；1.72(m，2H)；2.08(m，4H)；2.62(m，2H)；2.82(m，4H)；4.15(dd，1H)；4.22(dd，IH)；4.45(td，1H)；4.70(d，1H)；5.38(m，6H)。

[M+Na]⁺＝499.1

[M+H]+＝477.2

实施例(3)：根据本发明的组合物

1.霜剂

QS：适量

*EDTA：乙二胺四乙酸

***PEG：聚乙二醇

2.乳液

QS：适量

**EDTA：乙二胺四乙酸

实施例(4)：生物实验结果

4.1生物实验目的

细胞外基质(ECM)是对组织具有结构性调节作用的动态结构。皮肤的ECM由纤维(胶原和弹性蛋白)和基本物质(水、矿物质盐、糖蛋白、透明质酸和蛋白聚糖)组成。他提供给皮肤自身的膨胀和机械特性：坚固、弹性和绷紧性。ECM由于其构成的大分子的合成和降解之间的平衡而持续进行重排。ECM由4种类型大分子组成：胶原、弹性蛋白、结构糖蛋白和葡糖氨基葡聚糖(如透明质酸)。

胶原是皮肤内大量含有的纤维蛋白质。他们大多数是I、III和V类纤维胶原。胶原组成了纤维网状物主要成分并且起到机械作用，以提供皮肤抵抗力和弹性。

ECM的降解会发生在一些生理过程的整个过程中(创伤治疗、胚胎发育、血管再生等)也会发生在病变过程中(关节炎、关节病、动脉硬化、癌症发展和转移的形成)(Fisher等人，N.Engl.J.Med.333：1419，1997；Shapiro SD Current Opinion in Cell Biology 10：602，1998)。ECM的成分大多数通过称作金属蛋白酶或MMPs的肽链内切酶类型的酶所降解(Nagase和Woessner，J.Biol.Chem.274：21491，1999)。MMPs在创伤治疗过程起效但他们也会造成皮肤松弛和皱纹的开始。MMPs是锌内肽酶类型的酶。

MMP-1，或间隙胶原酶，大多数能降解类型I纤维胶原的三股螺旋，且也能降解胶原II、II、VIII和X(

VM和Saarialho-Kere U，Exp.Dermatol.6：199，1997)。因此MMP-1对胶原降解的起始起到了至关重要的作用。该胶原活性也与创伤治疗有关。类型1溶基质素(MMP-3)降解糖蛋白如纤连蛋白和层粘连蛋白，一些蛋白聚糖，弹性蛋白，明胶和胶原IV和V。在皮肤层，MMP-1s和MMP-3s都是通过角质细胞和纤维母细胞表达。在皮肤老化期间，透明质酸数量的减少也会表现在表皮和真皮层。该减少是因为透明质酸合成的降低和透明质酸酶活性上升(Stern R，Maibach HI(2008)Hyaluronan in skin：aspects of aging and its pharmacologic modulation.Clin Dermatol 26：22)。

另外，许多研究证实在老化期间促炎症细胞因子(IL-6，IL-8...)上升(Franceschi等人，Mechanisms of ageing and development，92，2006)。该促炎症环境或“炎症”显示与老化，尤其在皮肤层的老化的一些信号的开始有关(Mocchegiani等人，Biomed Central，1：5，2004；Licastro等人，Neurobiol.Aging，2006)。白介素，细胞因子由T淋巴细胞生成，然后表达(IL-6或IL-8)。

为了证实通式(I)化合物对抗皮肤老化和炎症的活性，这些化合物的效果可通过用H₂O₂处理过的(以此模仿细胞衰老的过程)真皮纤维细胞中的MMP-1，MMP-3和IL8的基因表达来测定。这些通式(I)化合物的效果也可以透明质酸的合成和透明质酸酶活性来测定。透明质酸的合成的刺激会致使皮肤水合作用的改善和/或修复(Bissett DL.J.Cosmet.Dermatol.2006Dec.5(4)：309-15.Glucosamine：an ingredientwith skin and other benefits)。

同样的，为了证明本发明通式(I)化合物的褪色活性，这些化合物的效果通过比色分析鼠类黑素瘤细胞株(系B16-F10)对黑色素的合成来测定。

另外，通式(I)化合物对头部和/或身体毛发再生的效果通过测定他们对真皮毛乳头细胞增殖刺激和人体毛囊增长刺激的活性来评估。

4.2.1.人体纤维细胞中MMP-1，MMP-3和IL8基因表达的实验方案。

-细胞处理

人体真皮纤维细胞(从废弃的手术皮肤分离出来)在DMEM培养介质+10％FCS中培养。细胞用维生素C和待测化合物在37℃下前处理16小时，然后用H₂O₂刺激。然后细胞与维生素C和(9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯重置于DMEM中。压力结束72小时后，纤维母细胞进入衰老：衰老的纤维母细胞不再增殖但新陈代谢依然活跃(Hayflick，J.Invest.Dermatol.，73；8-14，1979)。然后细胞用

试剂盒(QIAGEN)的裂解缓冲液裂解。

-逆转录和实时定量PCR

根据Qiagen的Quantitect逆转录试剂盒指示，提取的RNAs转换为逆转录互补DNA。实时定量PCR分析用iQ Icycler荧光热循环仪(BIO-RAD)来进行。

用MMP-1，MMP-3，IL8编码的mRNAs的表达水平可以用实时定量PCR技术分析。为了使目的基因的表达水平标准化，选择Vandesompela等人，Genome Biol.3：RESEARCH0034(2002)开发的分析策略。使用第一次PCR所得到的ΔC_T值，Genorm软件3.4版(Vandesompele J等人，Genome Biol.3：RESEARCH00342002)的运算对比精确细胞测试实验条件的三个参比基因稳定性水平并决定最稳定的参比基因。在我们的模式中，三个被测参比基因如下：β-肌动蛋白(人体β-肌动蛋白)，GAPDH(人体甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶)和YWHAZ(酪氨酸3-单加氧酶，色氨酸-5-单氧酶活性蛋白ζ多肽)。

在各自实验条件下，第一步将从目的基因所得Ct值和从相关的参比基因所得Ct值标准化。

因此按照下列计算：

ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_参比基因

这些ΔCt值代表用于统计分析的原始非转化值。

计算的第二步确定在处理期间目的基因复制的数量的变化。ΔΔCt如此计算：

ΔΔCt＝ΔCt_{未处理的正常人体纤维母细胞}-ΔCt_{处理的正常人体纤维母细胞}

由于未处理对照组，因此该QR等于1。然后有可能计算出与对照组相比的目的基因的诱导或抑制因数。

4.2.2人体纤维母细胞中MMP-1，MMP-3和IL8的表达实验结果

-统计分析

统计分析采用称作“一元方差分析”检验来执行。方差分析采用邓奈检验，然后对每一个分析基因对比在H₂O₂存在下与化合物共存两种条件都具备的正常成人纤维母细胞的ΔCt值。然后该实验得出的“p值”对两个条件下所得结果有显著性差异。差异程度确立如下：

-显著性差异p＜0.05(*)

-很有显著性差异p＜0.005(**)

-很高的显著性差异p＜0.001(***)

-没有显著性差异p＞0.05。

-分析用本发明化合物处理或未处理的衰老人体真皮纤维母细胞中的MMP-1，MMP-3和IL-8的mRNAs的表达。

·mRNAs相对数量的分析

在用H₂O₂刺激之前和之后，人体真皮纤维母细胞在抗坏血酸或(9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯(表2中有效成分1)存在下孵育。为了分析提取物对用H₂O₂调节过的mRNAs表达的影响，比较被有效成分处理和H₂O₂刺激的样品与单独被H₂O₂刺激的样品。对每一个样品，用最稳定参比基因的mRNA的表达水平将目的mRNA的表达水平标准化。

·活性百分比的分析

也有可能通过待评价的活性成分计算不同mRNAs表达水平的抑制百分率，采用如下公式：

表1：年轻或衰老的纤维母细胞的MMP-1，MMP-3和IL-8的mRNAs的相对数量(RQ)，以及通过有效成分测试的mRNA表达水平的抑制百分率。

分子1((9Z，9′Z，12Z，12′Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯)实际上比抗坏血酸更能抑制MMP1，MMP3和IL-8的表达。

本发明涉及通式(I)化合物用于预防和/或治疗皮肤老化。

本发明也涉及到通式(I)化合物用于治疗皮肤炎症反应。

4.3.1分子B16-F10中黑色素检验的实验方案

-原理：

这是通过比色分析鼠类黑素瘤细胞株(系B16-F10)测定黑色素的合成的实验。该测试可以评测有效成分的褪色特性。

B16-F10细胞植在补充有FCS(胎牛血清)的DMEM介质的96-孔板并且37℃，5％CO₂下孵育24小时。然后细胞用α-MSH(刺激黑色素的合成，观察到刺激达到大约150％)刺激并用待测有效成分处理72小时。每个浓度的有效成分至少测定三次。全部黑色素由黑色素细胞裂解缓冲液裂解，然后通过读取405nm吸光度来测定。所有的蛋白都在裂解产物中确定并且结果以mg黑色素/mg蛋白来表示。活性百分比计算如下：

负值表明抑制，而正值表明诱导黑色素合成。

4.3.2B16-F10细胞中黑色素测定的结果。

表2：细胞内黑色素抑制百分率和IC₅₀值。

	100μM	50μM	20μM	10μM	IC50μM
						维生素C	-22	-5	-7	5	nd*
分子1	-71	-41	-21	-9	67
						分子2	nd	nd	-53	-11	20
分子3	nd	nd	-50	-25	20
						分子4	nd	-44	-6	16	53
分子5	-78	-35	-13	-4	66
						分子6	-49	-7	nd	nd	105

*nd不确定

这些测试(表2)的结果显示分子1，2，3，4，5，6对细胞内黑色素合成的抑制高于维生素C。

本发明也涉及到通式(I)化合物用于皮肤和/或身体毛发和/或头部毛发的褪色。

4.4.1透明质酸合成的测定方案

角质细胞HaCaT在DMEM培养介质+10％FCS中培养。该细胞由待测有效成分(表1)在37℃下处理48小时。合成的透明质酸(HA)在培养介质中用ELISA试剂盒测定。

活性百分比确定如下：

-与对照组相比的变化百分比

％p/C＝([HA]_有效成分/[HA]_对照组x100)-100

4.4.2人体角质细胞HaCaT系的透明质酸测定结果

表3：透明质酸合成的刺激百分率。

浓度	2μM	20μM	30μM	300μM
					维他命C	*	*	9	19
分子1	132	70	*	*

*nd不确定

这些测试(表3)结果显示维他命C在生物活性浓度下(30和300μM)对HaCaT角质细胞中透明质酸的合成没有影响。

分子1在2和20μM下强烈刺激透明质酸的合成：+132％+70％。

因此本发明涉及通式I化合物用于预防和/或治疗皮肤老化。本发明也涉及通式I化合物用于改善和/或修复皮肤水合作用(Bissett DL.J.Cosmet.Dermatol.2006 Dec.5(4)：309-15.Glucosamine：an ingredientwith skin an dother benefits)。

4.5.1透明质酸酶活性的测定方案：

透明质酸酶活性用残留的透明质酸(HA)测定。酶作用物固定到载体然后置于酶和大量待测化合物中。残留的HA(如未水解的HA)用HA-Elisa检测系统测定：透明质酸与酶有关的免疫吸收剂检查酶连锁免疫吸附剂测定血验(Echelon

)。

0.5单位的来源于牛的透明质酸酶(BTH，牛睾丸透明质酸酶)与待测化合物在37℃下预孵育。该混合物放置在固定于微孔板孔表面的HA上。酶反应发生在37℃，pH在7.2n。冲洗完毕后，是用透明质蛋白(NH)对残余的HA的识别步骤。被结合的NH的数量通过ELISA使用与碱性磷酸酶共轭的抗-NH抗体来测定。磷酸酶的对硝基磷酸二钠盐(pnNpp)酶作用物在405nm处光谱检测到。(Delpech B等人，Analytical Biochemistry 149，555(565(1985)；Robert Stern等人，Analytical Biochemistry 251，263-269(1997))。OD强度与残余的HA数量有关。残余的HA的数量直接关联到酶活性。在抑制剂存在下，残余的HA的数量越大，样品抑制越高。透明质酸酶的抑制百分率将被表达。

因此净酶活性以未用酶的平均总活性和有/或没有待测化合物的酶的总活性的差值来计算。

与待测化合物相关的酶抑制的百分比计算如下：

％抑制率＝(最大净酶活性)-存在待测化合物的净酶活性)/最大净酶活性

其中最大酶活性表示为0.5U平均净酶活性。

4.5.2透明质酸酶活性的测定结果

表4：不同剂量酶抑制的测量(平均百分比)

*不确定

这些实验结果(表4)显示维生素C在这些浓度下(100和500μM)对透明质酸酶(BTH)没有影响。

这些实验结果显示6-抗坏血酸棕榈酸酯在10-250μM之间有助于抑制透明质酸酶，且有剂量效应。

分子1，4，5和6在5μM到500μM之间强烈抑制透明质酸酶：分子1有剂量效应并且IC50在25-30μM范围内。

分子1，4，5和6与视为参比分子的抗坏血酸棕榈酸酯相比，活性相同或更高(A.Botzki等人，JBC Vol.279N°44，pp 45990-450007)。

这些实验结果显示分子1，4，5和6对透明质酸酶的抑制与抗坏血酸棕榈酸酯和维生素C相比相同或更高。因此之前所述分子的抗透明质酸酶活性比抗坏血酸和6-抗坏血酸棕榈酸酯更强。

因此本发明涉及到通式I化合物用于预防和/或治疗皮肤老化以及改善和/或修复皮肤水合作用。

4.6.1真皮毛乳头细胞增殖的体外刺激的方案。

人体真皮毛乳头细胞(Promocell)放置培养基中并且早期阶段放置在添加10％FCS的DMEM介质中培养。他们种植在添加10％FCS的DMEM介质的96孔板上。培养介质用无血清DMEM介质代替然后用含1％FCS和不同测试浓度的分子1，2，3和4的DMEM代替。孵育60小时后，掺入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)评估细胞增殖。

4.6.2真皮毛乳头细胞增殖实验的体外刺激结果。

图1中的图显示，不同分子(以a％对照组)的存在，增加了BrdU的掺入且刺激了细胞的细胞增殖。

分子1刺激真皮毛乳头细胞增殖且有剂量效应并且最佳活性在12.5μM浓度下(169％增殖)。类似，分子4在6.25μM浓度下用刺激诱导增殖113.9％。分子2和3也能诱导细胞增殖但比分子1和4范围小。

本发明也涉及到通式(I)化合物用于刺激头部和/或身体毛发再生。

4.7.1人体毛囊增长的刺激方案

从手术废物得到人体头皮的枕骨区域的活组织标本。毛囊通过双管放大显微镜解剖来分离。他们根据Philpott’s技术分别放置培养液中(Philpott MP等人，J Cell Sci.97：463-471，1990)。在毛发生长期的毛囊孵育在24孔培养皿中11天，培养皿含有10μg/mL胰岛素，10μg/mL转铁蛋白，10ng/mL氢化可的松，1mM谷丙氨酸二肽，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，250ng/mL两性霉素B的William’s介质和分子3或4。孵育介质要定期更新。每个毛囊的扩张(以μm为单位)在培养4天和8天时用提取的毛囊图像来测定。

4.7.2刺激人体毛囊增长的测试结果

图2中的图显示分子3和4在诱导4天和8天孵育后毛囊扩张的效果。

下表(表5)显示了每次实验条件所得增长百分率和与对照组相比的分子3和4所得刺激毛发生长的百分率。

表5：增长百分率和毛发增长刺激百分率

诱导天数	D4	D8	D4	D8
						％增长率	％增长率	％活性	％活性
未处理	44	77	0	0
					分子3	52	85	25	18
分子4	51	84	19	12

分子3和4在15μM浓度下培养4天后，明显刺激毛发生长分别刺激增长了25％和19％。

4.8.1毛球退化评估方案

当培养11天后动力学停止，毛囊退化用毛球(圆形，变形)形态学损伤观测来评估。细胞凋亡百分率用计算细胞凋亡毛囊的数量相对于总的毛囊数量来计算

4.8.2毛球退化的评估结果

下表(表6)显示分子4对11孵育时间天后残余毛囊的影响。

表6：孵育11天后残余毛囊

在11天时凋亡毛球的数量

(总毛囊的数量)

		数量	％凋亡率
				对照组	9(12)	75
分子4	15μM	6(12)	50

分子4可以明显限制毛发退化(50％毛发凋亡相对75％对照组)。因此，分子4显示有抗细胞凋亡的效果以保护残余毛发。

Claims

1.通式(I)化合物：

其中：

·R₁是包含至少1个，有利地1-6个且优选1-4个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链；且

-R₂和R₃各自或同时表示为：氢或C₁-C₃烷基或苯基；且

-R₄：氢原子或COR₁’，其中R₁’是包含至少1个，有利地1-6个且优选1-4个不饱和度的C₁₂-C₂₄不饱和脂肪酸的烃链。

2.根据权利要求1所述的通式(I)化合物，其特征在于R₂和R₃表示C₁-C₃烷基。

3.根据权利要求1或2所述的通式(I)化合物，其特征在于R₂和R₃表示甲基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于：

R₁：表示包含1-3个不饱和度的C₁₄-C₁₈不饱和脂肪酸的烃链。

5.根据权利要求1-4任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于：

R₁’：表示包含1-3个不饱和度的C₁₄-C₁₈不饱和脂肪酸的烃链。

6.根据权利要求1-5任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于不饱和脂肪酸选自：月桂烯酸(C_12:1)、肉豆蔻酸(C_14:1)、十六碳烯酸(C_16:1)、油酸(C_18:1)、蓖麻油酸(C_18:1)；甘碳烯酸(C_20:1)、芥酸(C_22:1)、α-亚麻酸(C_18:3)；亚麻油酸(C_18:4)、二十碳三烯酸(C_20:3)，二十碳四烯酸(C_20:4)、二十碳五烯酸(C_20:5)、二十二碳五烯酸(C_22:5)、二十二碳六烯酸(C_22:6)、二十四碳五烯酸(C_24:5)、二十四碳六烯酸(C_24:6)、亚油酸(C_18:2)、γ-亚油酸(C_18:3)、二十碳二烯酸(C_20:2)；二高-γ-亚油酸(C_20:3)、花生四烯酸(C_20:4)、二十二碳四烯酸(C_22:2)、二十二碳五烯酸(C_22:5)、肾上腺酸(C_22:4)和十八碳三烯酸(C_18:3)。

7.根据权利要求1-6任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于不饱和脂肪酸选自：油酸(C_18:1)、亚油酸(C_18:2)、α-亚麻酸(C_18:3)和γ-亚油酸(C_18:3)。

8.根据权利要求1-7任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于R₄表示COR₁’。

9.根据权利要求8所述的通式(I)化合物，其特征在于R₁和R₁’可以相同或不同。

10.根据权利要求1-7任一项所述的通式(I)化合物，其特征在于R₄是氢原子。

11.根据权利要求1-10任一项所述的通式(I)化合物，其特征在化合物选自：

·(9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12-二烯酸酯

·(9Z，9’Z，12Z，12’Z，15Z，15’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-9，12，15三烯酸酯

·(6Z，6’Z，9Z，9’Z，12Z，12’Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基双十八-6，9，12三烯酸酯

·(Z)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-5-氧代-2，5-二氢呋喃-3，4-二基二油酸酯

·(9Z，12Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12-二烯酸酯

·(9Z，12Z，15Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-9，12，15-三烯酸酯

·(6Z，9Z，12Z)-5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基十八-6，9，12-三烯酸酯

·5-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)-4-羟基-2-氧代-2，5-二氢呋喃-3-基油酸酯。

12.根据权利要求1-11任一项所述的化合物用作药物或用作化妆品有效成分。

13.根据权利要求1-11任一项所述的化合物用作褪色有效成分，抗衰老有效成分，保湿有效成分，抗炎有效成分，刺激头部和/或身体毛发再生的有效成分，或抗氧化剂有效成分。

14.一种局部给药组合物，其特征在于该组合物包含至少一种如权利要求1-11所定义的通式(I)化合物。

15.根据权利要求14所述的局部给药组合物，其特征在于该组合物包含至少0.01％-10重量％通式(I)化合物，并优选0.1-5重量％通式(I)化合物。

16.根据权利要求14或15任一项所述的局部给药组合物，其特征在于该组合物用于皮肤和/或头部毛发和/或身体毛发褪色，治疗和/或预防皮肤衰老、保湿表皮、刺激头部和/或身体毛发再生、或治疗皮肤炎症。

17.一种合成根据权利要求1-11任一项所述的通式(I)化合物的方法，其是通过偶合羧基官能团为活性化形态的不饱和脂肪酸和如下通式(II)的抗坏血酸衍生物：

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于偶合反应如下进行：碱和任选地，偶合助剂存在下，由羧酸官能团以氯化酰基形式活化的不饱和脂肪酸起始。