KR20130043079A

KR20130043079A - 아스코브산 상의 불포화 지방산 모노에스테르 및 디에스테르 또한 그의 미용적 용도

Info

Publication number: KR20130043079A
Application number: KR1020127000442A
Authority: KR
Inventors: 스떼팡 프와그니; 실비 또네-마리옹; 나딸리 까스떼 리찌; 파뜨리끄 보그노위끄
Original assignee: 삐에르화브르데르모-코스메띠끄
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2013-04-29
Also published as: WO2010142663A1; MX2011013085A; US8722729B2; NZ596947A; JP2012529462A; FR2946252B1; RU2011152276A; WO2010142663A8; EP2440551B1; AU2010257599A1; BRPI1012965A2; SG176704A1; CA2764430A1; ZA201108868B; US20120076744A1; MA33401B1; EP2440551A1; FR2946252A1; CN102812021A

Abstract

본 발명은 아스코브산의 유도체들 및 이를 포함하는 약제학적 또는 미용적 조성물들, 그들의 제조 방법 또한 상세하게는 약제로서 또는 활성 미용 성분으로서 그들의 용도들에 관한 것이다.

Description

아스코브산 상의 불포화 지방산 모노에스테르 및 디에스테르 또한 그의 미용적 용도 {Unsaturated fatty acid monoesters and diesters on ascorbic acid and cosmetic uses thereof}

아스코브산 (ascorbic acid)은 항산화 성질을 가지는 유기산이다. 아스코브산의 천연적 출처는 신선한 과일 및 채소, 상세하게는 감귤류 (citrus) 과일이다.

아스코브산은 종종 그의 항산화 성질 때문에 식물 첨가제 (food additives)의 리스트에서 코드 번호 E300 하의 보존제로서 농업-식품 산업에서 사용된다. 또한 아스코브산은 그의 기지의 항-라디칼 및 각질 용해 (keratolytic) 성질로 인해 미용 산업 (cosmetic industry)에 사용되고 있다.

아스코브산은 공기 중에서 또는 수분 존재 시 쉽게 착색되는 흰색 파우더의 형태로 존재한다.

불포화 지방산 (unsaturated fatty acids)은 하나 이상의 불포화 결합 (unsaturations)을 가지는 지방산에 해당한다.

용어, 단일-불포화된 지방산 (mono-unsaturated fatty acid)는 그들이 단일한 불포화 결합을 포함할 때 사용된다. 용어, 다중 불포화된 지방산 (polyunsaturated fatty acid)는 그들이 여러 개의 불포화 결합을 포함할 때 사용된다.

불포화된 지방산은 또한 식물 기원일 수 있다.

불포화된 지방산들은 서로 다른 부류 (classes)로 나뉘어진다. 이들 부류는 산 그룹과 마주하는 측면으로부터 시작하는 첫 번째 불포화 결합의 위치에 의해 정의된다.

상세하게는, 불포화된 지방산의 세 가지 주요한 부류들 간에는 서로 구분이 된다: 오메가 3, 오메가 6, 및 오메가 9. 오메가 3, 오메가 6, 및 오메가 9 시리즈의 시스형 불포화된 지방산들은 여러 개의 소위 말하는 필수 지방산들을 포함한다. 이들 지방산은 음식 섭취를 통해서만 공급될 수 있기 때문에 필수적이라고 언급된다.

주요한 성분이 올레산 (C18:1)인 오메가 9 단일-불포화된 지방산은 심혈관 질환의 예방에 유익한 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

오메라 3 및 오메가 6 부류에 속하는 다중 불포화된 지방산 (PUFAs)도 역시 심혈관 질환 및 암의 예방에 대한 예방 효과를 가지는 것으로 알려져 있다. 상세하게는 프랑스 식품 안전기관 AFSSAP에 의해 식품에서 오메가 3 및 오메가 6 불포화된 지방산 간의 비율, 즉 5개의 리놀레산 당 1개의 알파 리놀렌산의 비율을 살펴보는 추천된다.

그들의 대사적 효과에 추가하여, 그들은 세포내 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 변형할 수 있다. 이들 PUFAs의 유전자 효과는 PPARs (퍼옥시좀 증식인자 활성화된 수용체)라고 불리는 핵 수용체를 통하여 작동하는 것으로 보인다. PPARs는 스테로이드 유형의 호르몬 핵 수용체의 부류에 속한다. 그들은 레티노산의 RXR 수용체 (레티노 X 수용체)와 헤테로다이머 (heterodimers)를 형성하고 유전자 발현을 조정한다. 따라서 ω3 PUFAs는 염증성 반응의 음성 조절인자인 것으로 보이고, NF-κB 경로의 주요한 억제인자 IKBα의 발현을 유도하는 것을 통하여 NF-κB 활성화 경로를 저해한다 (Ren J and Chung SH. J. Agric. Food Chem. 2007 55: 5073-80). 또한, ω3 PUFAs는 아라키돈산의 합성에 저해하는 작용을 가지고 도코사헥사노산 (docosahexanoic acids) 및 에이코사펜타노산 (eicosapentanoic acids)의 합성의 유익을 준다 (Calder PC. Lipids: 2001: 36, 1007-24).

불포화된 지방산들, 상세하게는 다중 불포화된 (polysaturated) 지방산은 그들의 피부학적 성질에 대하여 알려져 있다 (Monpoint S, Guillot B, Truchetet F et al . Essential fatty acids in dermatology. Ann Dermatol Venereol, 1992, 119: 233-239). 상세하게, 리놀레산은 세포막의 제조에 관여하는 다중 불포화된 지방산이다. 리놀레산에서의 결함은 피부의 건조함 및 알레르기의 존재를 유도한다.

본 발명의 화합물은 위치 5 및 6번에서의 하이드록실이 고리형 아세탈, 보다 상세하게는 아세톤의 고리형 아세탈 (아세토나이드)에 의해 보호되는 아스코브산 상의 불포화된 지방산의 디에스테르 또는 모노-에스테르이다. 본 기능은 약산성 배지에서, 즉 5.2 내지 7 사이의 산성 pH를 가지는 피부 상에서 쉽게 가수분해 가능하다. 따라서 고리형 아세탈은 그의 측 사슬의 산화에 대항하여 아스코브산을 보호할 것이다. 고리형 아세탈의 사용은 구조가 지방 상 (fatty phases)에서 강한 용해도를 가지는 허용가능한 크기로 획득되는 것을 허용한다.

지방산의 에스테르도 역시 피부에 존재하는 에스테라제에 의해 쉽게 절단될 수 있고, 이는 불포화된 지방산의 방출을 허용한다 (Redoules, D., Tarroux, R., Assalit, M. F. and Perie J. J. Characterization and assay of five enzymatic activities in the stratum corneum using tape-stripping, Skin Pharmacol . Appl . Skin Physiol., 12, 182-192 (1999)).

따라서 피부에 존재하는 에스테라제에 의한 불포화된 지방산의 에스테르의 절단은 활성 성분의 느린 확산 (diffusion)을 허용하고, 이는 약물 전달 (drug delivery)의 개념에 해당한다.

본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물의 경우, 에스테르 결합 상에 피부 에스테라제의 작용은 불포화된 지방산의 모노-에스테르가 사용될 때 하나의 불포화된 지방산의 및 한 분자의 아스코브산의 방출을; 또는 불포화된 지방산의 디에스테르가 사용될 때 두 개의 불포화된 지방산의 및 2번 위치에서 모노-에스테르를 통한 한 분자의 아스코브산의 방출을 유도한다.

상세하게는 불포화된 지방산의 디에스테르의 경우, 에스테라제의 작용은 먼저 불포화된 지방산의 모노-에스테르의 형성 및 아스코브산의 방출, 다음으로 아스코브산의 및 또 다른 불포화된 지방산의 방출을 유도할 것이다 (화학식 1)

화학식 1

피부 에스테라제에 의한 절단 반응의 예

따라서 본 발명의 주제는 다음의 일반 화학식 (I)의 화합물이다:

여기에서

- R₁은 적어도 하나, 유익하게는 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 불포화 결합 (unsaturation)을 포함하는 C₁₂ 내지 C₂₄ 불포화된 지방산으로부터 유래한 탄화수소 사슬이고;

- R₂및 R₃는 독립적으로 또는 동시적으로 수소 또는 C1 - C3 알킬 또는 페닐을 나타내고; 또한

- R₄는 수소 원자 또는 COR₁'이고, 여기에서 R₁'은 적어도 하나, 유익하게는 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₂ 내지 C₂₄ 불포화된 지방산으로부터 유래한 탄화수소 사슬이다.

본 발명의 의미에서 "불포화 결합 (unsaturation)"에 의하여는 이중 결합 C = C를 의미한다.

본 발명의 의미에서 "불포화된 지방산 (unsaturated fatty acid)"에 의하여는 12개 및 24개 탄소 원자 사이, 바람직하게는 14개 내지 18개 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 18개의 탄소 원자 (카르복실산 기능의 탄소 원자를 포함함)를 포함하고 또한 적어도 하나의 C = C 이중 결합, 바람직하게는 1개 내지 4개의 C = C 이중 결합을 포함하며 이들 이중 결합은 시스형 입체형태 (configuration)를 가지는 직쇄상 카르복실산 (R₁CO₂H) 또는 (R₁'CO₂H) 산을 의미한다.

본 발명의 의미에서 "불포화된 지방산의 탄화수소 사슬 (hydrocarbon chain of an unsaturated fatty acid)"에 의하여는 불포화된 지방산 (R₁CO₂H) 또는 (R₁'CO₂H)의 산 기능에 연결된 탄화수소 사슬을 의미한다. 따라서 R₁ 및 R₁'는 11개 내지 23개, 바람직하게는 13개 내지 17개, 좀 더 바람직하게는 17개의 탄소 원자를 포함하고 또한 적어도 하나, 바람직하게는 1개 내지 4개의 C = C 이중 결합을 포함하며, 바람직하게 이들 이중 결합은 시스 입체형태를 가지는 직쇄상 탄화수소 사슬을 나타낸다. 본 발명에 따르면, R₄가 COR₁'을 나타내는 경우 R₁ 및 R₁'은 서로 동일하거나 다를 수 있다.

불포화된 지방산은 라우르올레산 (lauroleic acid) (C_12:1), 미리스트올레산 (myristoleic acid) (C_14:1), 팔미트올레산 (palmitoleic acid) (C_16:1), 올레산 (oleic acid) (C_18:1), 리신올레산 (ricinoleic acid) (C_18:1), 가드올레산 (gadoleic acid) (C_20:1), 에루크산 (erucic acid) (C_22:1), α-리놀렌산 (α-linolenic acid) (C_18:3); 스테아리돈산 (stearidonic acid) (C₁₈ _:4), 에이코사트리에노 (eicosatrienoic acid)(C₂₀ _:3), 에이코사테트라에노 (eicosatetraenoic acid) (C_20:4), 에이코사펜타에노산 (eicosapentaenoic acid) (C₂₀ _:5), 도코사펜타에노산 (docosapentaenoic acid) (C _22:5), 도코사헥사에노산 (docosahexaenoic acid) (C_22:6), 테트라코사펜타에노산 (tetracosapentaenoic acid) (C_24:5), 테트라코사헥사에노산 (tetracosahexaenoic acid) (C _24:6), 리놀레산 (linoleic acid) (C_18:2), 감마-리놀레산 (gamma-linolenic acid) (C_18:3), 에이코사디에노산 (eicosadienoic acid) (C_20:2); 디호모-감마-리놀레산 (dihomo-gamma-linolenic acid) (C_20:3), 아라키돈산 (arachidonic acid) (C_20:4), 도코사테트라에노산 (docosatetraenoic acid) (C_22:2), 도코사펜타에노산 (docosapentaenoic acid) (C_22:5), 아드렌산 (adrenic acid) (C_22:4) 및 칼렌디산 (calendic acid) (C_18:3)일 수 있다.

유익하게는, 본 발명의 화합물은 R₁이 올레산 (C_18:1), 리놀레산 (C_18:2), α-리놀렌산 (C_18:3) 및 γ-리놀렌산 (C_18:3)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 불포화된 지방산인 화합물들이다.

유익하게는, 본 발명의 화합물은 R₄가 COR₁'을 나타낼 때 R₁'이 올레산 (C_18:1), 리놀레산 (C_18:2), α-리놀렌산 (C_18:3) 및 γ-리놀렌산 (C_18:3)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 불포화된 지방산인 화합물들이다.

본 발명의 의미에서 "알킬 (alkyl)"에 의하여는 특정한 수의 탄소 원자를 포함하는 직쇄상 또는 분지쇄상, 포화된 지방족 탄화수소 사슬을 의미한다. 예를 들어, 메틸, 에틸 및 프로필이 언급될 수 있다.

유익하게, 본 발명의 화합물은 R₂및 R₃가 C₁ - C₃ 알킬을 나타내는 화합물들이다.

유익하게, 본 발명의 화합물은 R₂및 R₃가 메틸을 나타내는 화합물들이다.

유익하게, 본 발명의 화합물은 R₁이 1개 내지 3개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₄ 내지 C₁₈ 불포화된 지방산의 탄화수소 사슬을 나타내는 화합물들이다.

유익하게, 본 발명의 화합물은 R₄가 COR₁'을 나타내고, R₁'은 1개 내지 3개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₄ 내지 C₁₈ 불포화된 지방산의 탄화수소 사슬을 나타내는 화합물들이다.

본 발명의 한 가지 구현예에 따르면, 화학식 (I) 화합물은 R₄가 COR₁'을 나타내는 화합물들이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 화학식 (I) 화합물은 R₄가 수소 원자를 나타내는 화합물들이다.

상세하게, 본 발명의 화합물은 다음의 분자들로부터 선택될 수 있다:

1. R ₄ 가 COR ₁ '을 나타내는 일반 화학식 (I)의 분자

- (9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트,

- (9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z, 15Z, 15'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12,15-트리에노에이트,

- (6Z, 6'Z, 9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-6,9,12-트리에노에이트,

- (Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디올레이트.

2. R ₄ 가 수소 원자를 나타내는 일반 화학식 (I)의 분자

- (9Z, 12Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12-디에노에이트,

- (9Z, 12Z, 15Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12,15-트리에노에이트,

- (6Z, 9Z, 12Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-6,9,12-트리에노에이트,

- 5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 올레이트.

본 발명의 좀 더 나아간 주제는 약제로서 그의 용도를 위한 일반 화학식 (I)의 화합물이다.

본 발명의 좀 더 나아간 주제는 미용 활성 성분으로서 그의 용도를 위한 일반 화학식 (I)의 화합물이다.

상세하게는, 본 발명의 좀 더 나아간 주제는 탈색하는 (depigmenting) 활성 성분, 항-노화 (anti-age) 활성 성분, 항산화 (antioxidant) 활성 성분, 수분 공급하는 (hydrating) 활성 성분, 항-염증 (anti-inflammatory) 활성 성분, 또는 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진하는 활성 성분으로서 그의 용도들을 위한 일반 화학식 (I)의 화합물이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 일반 화학식 (I)의 화합물을, 상세하게는 경피적 투여 (transcutaneous administration)에 적응된 약제학적으로 또는 미용학적으로 허용가능한 부형제와 조합하여 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 또는 미용적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "약제학적으로 또는 미용학적으로 허용가능한 (pharmaceutically or cosmetically acceptable)"에 의하여는 일반적으로 안전하고 비-독성이며 생물학적으로 또는 다른 경우라도 바람직하고 또한 치료적 또는 미용적 용도, 명확하게는 국소적 적용에 의해 허용가능한 약제학적 또는 미용적 조성물의 제조에 유용한 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 또는 미용적 조성물은 상세하게는 활성 성분의 특성 및 접근성을 개선하기 위하여 피부 내에 침투를 허용하는 부형제를 가진, 보통 피부 또는 두피에 국소적 투여를 위해 알려져 있는 형태, 예로 상세하게는 로션 (lotions), 비누 (foams), 젤 (gels), 분산제 (dispersions), 에멀전 (emulsions), 샴푸 (shampoos), 스프레이 (sprays), 시럼 (serums), 마스크 (masks), 바디 밀크 (body milks) 또는 크림 (creams)으로 만들어질 수 있다. 본 발명의 약제학적 또는 미용적 조성물은 또한 (예를 들어 하이알루론산 (hyaluronic acid), 콜라겐 또는 알지네이트와 조합하여...) 보통 주름 필러 (wrinkle fillers)로서 사용되는 주입용 젤의 형태로 만들어질 수 있다.

본 발명의 화합물(들)에 추가하여, 이들 조성물은 일반 물 또는 용매 기초한 예로 알코올, 에테르 또는 글리콜에 녹인 생리학적으로 허용가능한 배지를 포함한다. 또한 그들은 표면활성 제제 (surfactant agents), 복합 제제 (complexing agents), 보존화 제제 (preserving agents), 안정화 제제 (stabilizing agents), 에멀전화제 (emulsifiers), 침전농축 제제 (thickeners), 젤화 제제 (gelling agents), 보습제 (humectants), 피부연화제 (emollients), 미량 원소 (trace elements), 에센셜 오일 (essential oils), 향수 (fragrances), 착색 제제 (coloring agents), 매트화 제제 (matifying agents), 화학적 또는 무기질 필터 (chemical or mineral filters), 수화 제제 (hydrating agents) 또는 스파 물 등에 녹인 생리학적으로 허용가능한 배지를 일반적으로 포함한다.

이들 조성물은 또한 보완적이거나 임의적으로 상승적 효과 (synergic effect)를 유도하는 기타 다른 활성 성분도 포함할 수 있다.

유익하게, 본 발명의 조성물은 일반 화학식 (I)의 화합물(들)의 무게로 적어도 0.01% 내지 10%, 바람직하게는 무게로 0.1%로부터 5%까지 포함한다.

보다 상세하게, 이들 화합물은 피부 및/또는 머리카락 및/또는 체모를 탈색하고, 피부 노화의 치료 및/또는 예방하고, 표피에 수분을 공급하고, 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진하고, 또는 피부의 염증을 치료하는 것을 의도한다.

본 발명의 좀 더 나아간 주제는 피부 노화를 치료하고 및/또는 예방하는 미용 방법이다.

본 발명의 주제는 또한 적어도 하나의 일반 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 미용 조성물을 적용하여 인간 피부 및/또는 체모 및/또는 머리카락을 미백하고 광택을 주는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 좀 더 나아간 주제는 카르복실산 기능이 활성화된 형태에 있는 불포화된 지방산을 화학식 (II)의 아스코브산의 유도체와 결합시켜서 화학식 (I) 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

화학식 2: 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법

(DCM = 디클로로메탄)

(여기에서 R₄는 COR₁' 또는 수소 원자를 나타낼 수 있다)

본 발명의 결합 반응 (coupling reaction)은 염기의 존재 시 또한 임의적으로 보조 결합 (coupling auxiliary)의 존재 시 시행된다.

예를 들어 염기는 피리딘 (pyridine) 또는 트리에틸아민 (triethylamine)일 수 있다.

본 발명의 의미에서 "활성화된 형태 (activated form)"에 의하여는 친핵체 (nucleophiles)에 관하여 더욱 활성을 가지도록 변형된 카르복실산을 의미한다. 이들 활성화된 형태는 당업자에게 잘 알려져 있고 상세하게는 염산일 수 있다.

도 1는 본 발명의 화합물의 존재 시 BrdU의 도입 및 자극된 세포성 증식에서의 증가를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화합물의 4일 및 8일 배양 이후에 털 소포 (hair follicles)의 성장에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예들에 비추어 더 잘 이해될 것이다.

실시예 (1): 본 발명의 화합물의 합성

- R ₄ 가 COR ₁ '을 나타내는 일반 화학식 (I)의 분자

1.1 일반적인 방법 A: 불포화된 지방산의 염소 및 피리딘으로부터 시작함

1.1a 분자 1:

(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트

경로 1: 2.9 g의 리노레오일 클로라이드가 10 ml의 무수 피리딘에 녹인 5,6-O-이소프로필리덴-아스코브산 (1.08　g, 5　mmol, 1　eq.) 및 4-디메틸아미노피리딘 (61　mg, 0.5　mmol, 0.1　eq.)의 용액에 질소 하에서 첨가되고, 다음으로 혼합물을 상온에서 16시간 동안 진탕 하에 놓아둔다. 반응은 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography, TLC)로 이어진다.

상온으로 복귀된 이후에, 용매는 증발된 다음 잔기가 에테르/물 혼합물로 추출된다. 유기 상은 1 N HCl 용액으로 그 다음 NaCl-포화된 용액으로 두 번 세척된다. 마그네슘 설페이트 위에서 건조시킨 이후에, 오일이 용매의 증발 이후에 획득된다.

그 다음 잔기가 헵탄/에틸 아세테이트 혼합물 (100 : 0 내지 70 : 30)을 사용하여 또는 제조용 HPLC에 의해 실리카 상에서 정제된다. 무색 오일의 형태로 획득된 산물은 진공내 (in vacuo)에서 하룻밤 동안 건조된다.

1.49 g이 40%의 수율로 획득된다.

¹H NMR (400　MHz, CDCl₃): δ: 0.83 (2t, 6H); 1.27-1.39 (m, 34H); 1.68 (m, 4H); 2.06 (m, 8H); 2.53 (2t, 4H); 2.77 (2t, 4H); 4.01 (dd, 1H); 4.18 (dd, 1H); 4.35 (td, 1H); 5.14 (d, 1H); 5.35 (m, 8H).

¹³C NMR (100　MHz, CDCl₃): δ: 14.01; 22.6 - 3.6 (지방족); 65.19; 72.9; 75.3; 76.7; 77; 110.8; 122.0; 127 - 130; 150.8; 167.7; 168, 169.

경로 2: 5,6-O-이소프로필리덴-아스코브산 (1 g)은 디클로로메탄 (19 ml)에서 현탁액으로 놓아둔다. 피리딘 (0.79 ml)이 첨가되고 반응 배지는 비균질하게 흰색으로 된다 (T = 15℃). 진탕 하에서 10분 이후에, 반응 배지는 얼음 수조를 사용하여 0℃로 식힌다. 디클로로메탄 (6 ml)에 녹인 리노레오일 클로라이드의 용액 (2.98 ml)이 얼음 수조가 제거되고 난 후 5분의 기간 경과 시 첨가되고 반응 배지는 30분 동안 진탕 하에 놓아둔다.

반응 배지는 2% 구리 설페이트 용액 (w/v) (2 x 50 ml)을 가진 물 (3 x 50 ml)을 사용하여 다음으로 다시 물 (50 ml)을 사용하여 세척된다. 유기 상은 마그네슘 설페이트 위에서 건조되고 다음으로 진공내 (in vacuo)에서 농축되어 갈색 오일이 된다 (3.3 g; 수율 96%).

본 오일은 질소 대기에서 -18℃로 저장된다.

1.2 일반적인 방법 B: 불포화된 지방산 염소 및 트리에틸아민으로부터 시작함

1.2a 분자 2:

(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z, 15Z, 15'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12,15-트리에노에이트

1.91 ml의 리노레오일 클로라이드 (6 mmol, 3 eq., 70%, 테크니칼)가 20 ml의 무수 디클로로메탄에 녹인 5,6-O-이소프로필리덴-아스코브산 (432 mg, 2　mmol, 1　eq.) 및 트리에틸아민 (960 μl, 7　mmol, 3.5　eq.)의 용액에 질소 하에서 첨가되고, 다음으로 혼합물은 상온에서 16시간 동안 진탕 하에 놓아둔다. 반응은 TLC로 이어진다.

상온으로 복귀된 이후에, 용매는 증발되고 잔기가 에테르/물 혼합물로 추출된다. 유기 상은 1 N HCl 용액으로 그 다음 NaCl-포화된 용액으로 두 번 세척된다. 마그네슘 설페이트 위에서 건조시킨 이후에, 오일이 용매의 증발 이후에 획득된다. 그 다음 잔기가 헵탄/에틸 아세테이트 혼합물 (100 : 0 내지 70 : 30)을 사용하여 또는 제조용 HPLC에 의해 실리카 상에서 정제된다. 무색 오일의 형태로 획득된 산물은 진공내 (in vacuo)에서 하룻밤 동안 건조된다.

604　mg이 41%의 수율로 획득된다.

¹H NMR (400　MHz, CDCl₃): δ: 0.91 (2t, 6H); 1.27-1.39 (m, 30H); 1.67 (m, 4H); 2.06 (m, 4H); 2.53 (2t, 4H); 2.79 (2t, 4H); 4.09 (dd, 1H); 4.18 (dd, 1H); 4.36 (td, 1H); 5.14 (d, 1H); 5.38 (m, 12H).

1.2b 분자 3:

(6Z, 6'Z, 9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-6,9,12-트리에노에이트

감마 리노레오일 클로라이드 (98%)의 2.5 당량으로부터 시작함.

68%의 수율로 무색 오일.

¹H NMR (400　MHz, CDCl₃): δ: 0.89 (2t, 6H); 1.27 - 1.44 (m, 20H); 1.47 (m, 4H); 1.68 (m, 4H); 2.06 (m, 8H); 2.55 (m, 4H); 2.80 (m, 8H); 4.01 (dd, 1H); 4.18 (dd, 1H); 4.36 (td, 1H); 5.14 (d, 1H); 5.37 (m, 12H).

1.2c 분자 4

(Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디올레이트

올레오일 클로라이드 (98%)의 2.5 당량으로부터 시작함.

정제 이후에 53%의 수율로 무색 오일.

¹H NMR (400　MHz, CDCl₃): δ: 0.88 (2t, 6H); 1.26 - 1.55 (m, 46H); 1.67 (m, 4H); 2.00 (m, 8H); 2.53 (m, 4H); 2.77 (2t, 4H); 4.09 (dd, 1H); 4.18 (dd, 1H); 4.36 (td, 1H); 5.14 (d, 1H); 5.34 (m, 4H).

실시예 (2): 본 발명의 화합물의 합성

- R ₄ 가 수소 원자를 나타내는 일반 화학식 (I)의 분자

2.1 분자 5

(9Z, 12Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12-디에노에이트

질소 하의 3개의 입구를 가진 플라스크에서 현탁액이 110 ml 아세톤에 녹인 5,6-O-이소프로필리덴-아스코브산 (5.5 g, 25.44 mmol)으로 제조되고 이후에 3.53 ml의 트리에틸아민이 첨가된다. 풍부한 흰색 침전물의 형성. 다음으로 리놀레오일 클로라이드 (3.55 ml, 11.06 mmol)가 3분 경과 시 한 방울씩 첨가된 다음 혼합물은 상온에서 10분 동안 진탕하면서 놓아둔다. 혼합물은 다시 투명하게 되고 다음으로 트리에틸암모니움 클로라이드의 적은 침전물이 형성된다. 고체가 소결된 필터를 통하여 여과되고 여과물은 오일을 획득하도록 수집된다. 본 오일은 100 ml의 에틸 아세테이트에 용해되고 포화된 NaCl 용액으로 3번 세척되었다. 유기 상은 마그네슘 설페이트 위에서 건조되고 여과되고 증발되어 90%의 수율을 주는 4.76 g의 갈색 고체가 된다.

^IH NMR (300　MHz, CDCl₃): δ: 0.90 (t,3H); 1.27-1.39 (m, 20H); 1.70 (m, 2H); 2.06 (m, 4H); 2.58 (t, 2H); 2.78 (t, 2H); 4.13 (dd, 1H); 4.20 (dd, 1H); 4.43 (m, 1H); 4.65 (d, 1H); 5.37 (m, 4H).

[M+Na]⁺ = 501.2; [2M+Na]⁺ = 979.7

[M-H]^-= 477.3; [2M-H]^-= 955.7

2.2 분자 6

5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 올레이트

분자 5와 동일한 작동 모드가 올레오일 클로라이드로부터 시작함.

흰색 고체, 수율: 96%.

^IH NMR (300　MHz, CDCl₃): δ: 0.89 (t, 3H); 1.28 - 142 (m, 26H); 1.69 (m, 2H); 2.02 (m, 4H); 2.62 (m, 2H); 4.15 (dd, 1H); 4.22 (dd, 1H); 4.45 (td, 1H); 4.70 (d, 1H); 5.36 (m, 2H).

[M+Na]⁺ = 503.2

[M-H]^-= 479.3

2.3 분자 7

(9Z, 12Z, 15Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12,15-트리에노에이트

분자 5와 동일한 작동 모드가 리놀렌오일 클로라이드로부터 시작함.

갈색 고체, 수율: 91%.

^IH NMR (300　MHz, CDCl₃): δ: 0.99 (t, 3H); 1.30 - 1.42 (m, 14H); 1.72 (m, 2H); 2.08 (m, 4H); 2.62 (m, 2H); 2.82 (m, 4H); 4.15 (dd, 1H); 4.22 (dd, IH); 4.45 (td, 1H); 4.70 (d, 1H); 5.38 (m, 6H).

[M+Na]⁺ = 499.1

[M+H]⁺ = 477.2

실시예 (3): 본 발명에 따른 조성물

1. 크림

QS: 충분량

* EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산

*** PEG: 폴리에틸렌 글리콜

2. 밀크

QS: 충분량

** EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산

실시예 (4): 생물학적 테스트의 결과

4.1 생물학적 테스트의 표적

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직을 위한 구조적, 조절적 역할을 가지는 역학적 구조 (dynamic structure)이다. 진피의 ECM은 섬유 (콜라겐 및 엘라스틴) 및 기본적인 물질 (물, 무기질 염, 당단백질, 하이알루론산 및 프로테오글리칸)으로 형성된다. 이것은 피부에 팽창 (turgescence) 및 기계적 특성: 견고성 (firmness), 탄력성 (elasticity) 및 긴장성 (tonicity)을 부여한다. ECM은 영속적으로 그의 구성 마크로분자 (macromolecules)의 합성 및 분해 간의 평형과 관련된 재배열을 거친다. ECM은 네 가지 유형의 마크로분자로 형성된다: 콜라겐, 엘라스틴, 구조적 당단백질 및 글리코아미노글리칸 (하이알루론산과 같음).

콜라겐은 진피에 매우 풍부한 섬유성 단백질이다. 대부분의 경우, 그들은 타입 I, III 및 V의 원섬유성 콜라겐이다. 콜라겐은 섬유성 네트워크의 필수적인 성분을 형성하고 피부에 저항성 및 탄력성을 부여하는 기계적 역할을 한다.

ECM의 분해는 일정 생리학적 과정 (상처 치유, 배아 발생, 혈관생성...)의 경과 시 설정되지만 병리학적 과정 (관절염, 관절증 (arthrosis), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 종양 발생 및 전이 형성) 동안에도 역시 설정되어 있다 (Fisher et al., N. Engl. J. Med. 333: 1419, 1997; Shapiro SD Current Opinion in Cell Biology 10: 602, 1998). ECM의 성분은 대부분 매트릭스 금속 단백분해효소 (matrix metalloproteinases) 또는 MMPs라고 불리는 엔도펩티다제 유형 (endopeptidase type)의 효소에 의해 분해된다 (Nagase and Woessner, J. Biol. Chem. 274: 21491, 1999). MMPs는 상처 치유 과정에서 활발한 역할을 담당하지만, 피부 약화 (skin slackening) 및 주름의 생성에도 작용한다. MMPs는 아연 엔도펩티다제 유형의 효소이다.

MMP1, 또는 간질 콜라겐분해효소 (interstitial collagenase)은 대부분 타입 I 원섬유성 콜라겐의 삼중 나선구조를 분해하고 콜라겐 II, II, VIII 및 X도 역시 분해한다 (Kahari V.M. and Saarialho-Kere U., Exp . Dermatol. 6: 199, 1997). 따라서 MMP-1은 콜라겐의 분해의 개시에서 결정적인 역할을 담당한다. 이러한 콜라겐분해 활성도 역시 상처 치유와 관련되어 있다. 타입 I 스트로멜라이신 (stromelysin) (MMP-3)은 피브로넥틴 (fibronectin) 및 라미닌 (laminin)과 같은 당단백질, 일정 프로테오글리칸 (proteoglycans), 엘라스틴 (elastin), 젤라틴 (gelatin) 또한 콜라겐 IV 및 V을 분해한다. 피부 수준에서, MMP-1s 및 MMP-3s는 각질세포 (keratinocytes) 및 섬유원세포 (fibroblasts) 둘 다에 의해 발현된다. 피부 노화과정 동안, 하이알루론산의 양에서의 감소도 역시 표피 및 진피 수준 둘 다에서 관찰된다. 이러한 감소는 하이알루론산 합성에서의 감소 및 하이알루로니다제 (hyaluronidase) 활성에서의 증가의 결과이다 (Stern R, Maibach HI (2008) Hyaluronan in skin: aspects of aging and its pharmacologic modulation. Clin Dermatol 26: 22).

또한, 수많은 연구들이 노화과정 동안 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) (IL-6, IL-8...)에서의 증가를 입증하고 있다 (Franceschi et al, Mechanisms of ageing and development, 92, 2006). 이러한 전-염증성 상황 또는 "염증 노화 (inflammaging)"는 상세하게는 피부 수준에서 일정 노화 징후의 발생과 직접적으로 관련된 것으로 보인다 (Mocchegiani et al., Biomed Central , 1:5, 2004; Licastro et al., Neurobiol . Aging, 2006). T 림프구에 의해 생산되는 사이토카인, 인터루킨 (IL-6 또는 IL-8)이 다음으로 발현된다.

피부 노화 및 염증에 대항하는 일반 화학식 (I)의 화합물의 활성을 입증하기 위하여, 이들 화합물의 효과가 H₂O₂로 처리된 인간 진피 섬유모세포에서 세포성 노화 (cellular senescence)의 과정을 모방하여 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 유전자 발현 으로 측정되었다. 이들 일반 화학식 (I)의 화합물의 효과는 또한 하이알루론산의 합성 및 하이알루로니다제 활성으로도 측정되었다. 또한 하이알루론산의 합성의 촉진은 피부 수분 공급 (skin hydration)이 개선되고 및/또는 회복되는 것을 허용한다 (Bissett DL. J. Cosmet. Dermatol. 2006 Dec. 5(4): 309-15. Glucosamine: an ingredient with skin and other benefits).

유사하게는 본 발명에 따른 일반 화학식 (I)의 화합물의 탈색하는 활성을 입증하기 위하여, 이들 화합물의 효과가 마우스 흑색종 (melanoma)의 세포주: B16-F10 세포주 상에서 비색측정 분석법 (colorimetric assay)에 의해 멜라닌의 합성으로 측정되었다.

또한, 일반 화학식 (I)의 화합물의 머리카락 및/또는 체모의 재-성장에 미치는 효과도 진피 유두상 세포 (demis papillar cells)의 증식 촉진 및 인간 털 소포 (hair follicle)의 성장 촉진에 미치는 그들의 활성을 측정하여 평가되었다.

4.2.1. 인간 섬유모세포에서 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 유전자 발현을 위한 테스트 프로토콜.

- 세포 처리

인간 진피 섬유모세포 (수술로 제거된 피부로부터 분리됨)가 10% FBS를 더한 DMEM 배양 배지에서 배양되었다. 세포는 비타민 C 및 테스트될 화합물로 37℃에서 16시간 동안 존-처리되었고, 다음으로 H₂O₂로 자극되었다. 그 다음 세포는 비타민 C 및 (9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트를 가진 DMEM으로 배지 교환되었다. 스트레스를 주고 72시간 이후에, 섬유모세포는 노화 (senescence)에 들어갔다: 노화된 섬유모세포는 더 이상 증식하지 않지만 대사적으로는 활성을 여전히 가진다 (Hayflick, J. Invest . Dermatol ., 73; 8-14, 1979). 다음으로 세포는 RNeasy? 키트 (퀴아젠사)의 용해 완충용액으로 용해되었다.

- 역전사 (Reverse transcription) 및 실시간 PCR (real-time PCR)

추출된 RNAs는 퀴아젠 사에 의한 퀀티텍트 역전사 키트 (Quantitect Reverse Transcription kit)의 지침을 따라 상보적인 DNA로 전환되었다. 실시간 PCR 분석은 iQ 아이사이클러 (iQ Icycler) 형광 써모사이클러 (fluorescence thermocycler) (바이오-래드사)를 사용하여 시행되었다.

MMP-1, MMP-3, IL-8을 코딩하는 mRNAs의 발현 수준이 실시간 PCR 기법을 사용하여 분석되었다. 관심있는 유전자 (gene of interest)의 발현 수준을 정상화하기 위하여, Vandesompela et al., Genome Biol. 3: RESEARCH0034 (2002)에 의해 개발된 분석 전략이 선택되었다. 첫 번째 PCR 과정 동안 획득된 △C_T 수치를 사용하여, 게놈 소프트웨어 버전 3.4의 알고리즘 (Vandesompele J et al., Genome Biol. 3: RESEARCH0034 2002)은 세포 테스트의 정확한 실험적 조건 하에서 세 가지 기준 유전자 (reference genes)의 안정성 수준을 비교하고 가장 안정한 기준 유전자의 결정을 허용한다. 본 발명자의 모델에서, 세 가지 테스트된 기준 유전자들은 다음과 같았다: β-액틴 (인간 β-액틴), GAPDH (인간 글루세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화효소) 및 YWHAZ (타이로신-3-모노옥시게나제, 트립토판-5-모노옥시게나제 활성화 단백질 제타 폴리펩타이드).

첫 번째 단계는 관심있는 유전자에 대해 획득된 Ct 수치를 기준 유전자에 대해 획득된 Ct 수치와 대비하여 각 실험적 조건에 대하여 정상화한다.

따라서 다음의 내용이 계산되었다:

△Ct = Ct_관심있는 _유전자 - Ct_{기준 유전자}

이들 △Ct 수치는 통계학적 분석을 위해 사용되는 원래의 (raw) 미-변환된 수치를 나타낸다.

두 번째 단계의 계산은 처리과정 동안 관심있는 유전자의 사본수에서 편차 (variation)를 결정한다. 이와 같이 하기 위하여, △△Ct가 계산된다:

△△Ct = △Ct_{미-처리된 NHF} - △Ct_{처리된 NHF}

따라서 미-처리된 대조군의 경우, 이러한 QR이 1과 동등하다. 다음으로 이러한 대조군과 대비하여 관심있는 유전자의 유도 또는 저해 인자를 계산하는 것이 가능하다.

4.2.2 인간 섬유모세포에서 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 발현에 관한 테스트 결과

- 통계학적 분석

통계학적 분석은 "원-웨이 ANOVA (one-way ANOVA)"라고 불리는 테스트를 사용하여 수행되었다. 다음으로 듀넷 테스트 (Dunnett test)를 사용하는 편차 분석은 각 분석된 유전자에 대하여, H₂O₂의 존재 시 둘 다의 경우에서 화합물을 사용하여 정상 성인 섬유모세포 (normal adult fibroblasts)의 △Ct 수치를 비교하는 것을 허용한다. 다음으로 본 테스트는 둘 다의 조건에 대해 획득된 결과의 유의성을 특성분석하는 "P 수치 (P value)" 를 준다. 유의성의 정도는 다음과 같이 확립되었다:

- p < 0.05(*)의 경우 유의함

- p < 0.005(**)의 경우 매우 유의함

- p < 0.001(***)의 경우 고도로 유의함

- p > 0.05의 경우 유의하지 않음.

- 본 발명의 화합물로 처리된 또는 미-처리된 노화된 인간 진피 섬유모세포에서 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 mRNAs 발현의 분석

● mRNAs의 상대적인 양의 분석

인간 진피 섬유모세포는 H₂O₂로 자극되기 이전 및 이후에 아스코브산 또는 (9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트 (= 표 1에서 활성 성분 1)의 존재 시 배양되었다. 이들 추출물이 H₂O₂에 의해 조정된 mRNAs의 발현에 미치는 효과를 분석하기 위하여, 활성 성분으로 처리되고 H₂O₂로 자극된 시료들은 단지 H₂O₂로만 자극된 시료와 비교되었다. 각 시료의 경우, 관심있는 mRNA의 발현 수준은 가장 안정한 기준 유전자의 mRNA의 발현을 사용하여 정상화되어야 한다.

● 활성 백분율의 분석

다음의 공식을 사용하여, 측정된 활성 성분에 의한 서로 다른 mRNAs의 발현 수준의 저해 백분율을 계산하는 것도 역시 가능하다.

% 저해 =

[(RQ^H2O2 - RQ^미-처리) - (RQ^{H2O2+활성성분} - RQ^미-처리)] x 100/(RQ^H2O2 - RQ^미-처리)

표 1은 젊거나 노화된 섬유모세포의 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 mRNAs의 상대적인 양, 또한 테스트된 활성 성분에 의한 mRNA 수준의 저해 백분율을 나타낸다.

MMP-1
MMP-1	RQ	% 저해
H₂O₂	3.6
아스코브산 (3 μM)	3.2	18
분자 1 (3 μM)	0.9	105**
MMP-3
MMP-3	RQ	% 저해
H₂O₂	5.9
아스코브산 (3 μM)	3.5	50*
분자 1 (3 μM)	1.9	81***
IL-8
IL-8	RQ	% 저해
H₂O₂	3.1
아스코브산 (3 μM)	1.2	92***
분자 1 (3 μM)	0.9	102***

분자 1 ((9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트)은 아스코브산보다 MMP-1, MMP-3 및 IL-8의 발현을 더욱 실질적으로 저해한다.

본 발명은 피부 노화 (skin ageing)를 예방하고 및/또는 치료하는 일반 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

또한 본 발명은 염증성 피부 반응을 치료하는 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

4.3.1 분자 B16-F10에서 멜라닌 분석을 위한 테스트 프로토콜

- 원리

이것은 마우스 흑색종의 세포주: B16-F10 세포주 상에서 비색측정 분석법에 의해 멜라닌의 합성을 측정하는 테스트이다. 본 테스트는 활성 성분의 탈색하는 성질의 평가를 가능하게 한다.

B16-F10 세포는 FCS (우태아 혈청)가 보충된 DMEM 배지를 넣은 96-웰 플레이트 상에 접종되었고 37℃, 5% CO₂에서 24시간 배양되었다. 다음으로 세포는 α-MSH로 자극되었고 (멜라닌의 합성을 자극하기 위함, 관찰된 자극은 약 150%이었음) 테스트될 활성 성분으로 72시간 처리되었다. 활성 성분은 각 농도에서 적어도 세 번 반복 시험되었다. 용해 완충용액에 녹인 세포내 멜라닌으로 이어지는 전체 멜라닌은 그 다음 405 nm에서 흡광도를 리딩하여 분석되었다. 전체 단백질이 용출물에서 결정되었고 결과는 mg 메라닌/ mg 단백질로 표시된다. 활성 백분율은 다음과 같이 계산되었다:

% 활성 =

(대조군 정상화된 평균-처리된 정상화된 평균)/대조군 정상화된 평균 X 100

음성 수치는 저해를 표시하는 한편, 양성 수치는 멜라닌의 유도된 합성을 표시한다.

4.3.2 B16-F10 세포에서 멜라닌 분석의 결과

표 2는 세포내 멜라닌의 저해 백분율 및 IC₅₀ 수치를 나타낸다.

	100 μM	50 μM	20 μM	10 μM	IC50 μM
비타민 C	-22	-5	-7	5	nd*
분자 1	-71	-41	-21	-9	67
분자 2	nd	nd	-53	-11	20
분자 3	nd	nd	-50	-25	20
분자 4	nd	-44	-6	16	53
분자 5	-78	-35	-13	-4	66
분자 6	-49	-7	nd	nd	105

* nd는 미-측정된 것이다.

이들 테스트의 결과 (표 2)는 분자 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 의한 세포내 멜라닌의 합성 저해가 비타민 C의 결과보다 더욱 큰 것을 보여준다.

본 발명은 또한 피부 및/또는 체모 및/또는 머리카락을 탈색하는 일반 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

4.4.1 하이알루론산의 합성을 위한 분석 프로토콜

각질세포 (keratinocytes) HaCaT는 10% FCS를 더한 DMEM 배양 배지에서 배양된다. 세포는 테스트될 활성 성분 (표 1)으로 37℃에서 48시간 동안 처리된다. 합성된 하이알루론산 (HA)은 엘라이자 (ELISA) 유형 키트 (에켈론? (Echelon?))를 사용하여 배양 배지에서 분석된다.

활성 백분율은 다음과 같이 결정되었다.

- 대조군과 비교한 편차 백분율

% p/C = ([HA]_{활성 성분}/[HA]_대조군 x 100) - 100

4.4.2 인간 각질세포 HaCaT 세포주 상의 하이알루론산의 분석 결과

표 3은 하이알루론산 합성의 촉진 백분율을 나타낸다.

농도	2 μM	20 μM	30 μM	300 μM
비타민 C	*	*	9	19
분자 1	132	70	*	*

*는 nd 미-측정된 것이다.

이들 테스트의 결과 (표 3)는 생물학적으로 활성을 가진 농도에서 사용되는 비타민 C (30 및 300 μM)는 각질세포 HaCaT에서 하이알루론산의 합성에 미치는 효과가 전혀 없는 것을 보여준다.

2 및 20 μM 농도에서, 분자 1은 하이알루론산의 합성을 강하게 촉진시킨다: + 132% + 70%

따라서 본 발명은 피부 노화의 예방 및/또는 치료를 위한 일반 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피부 수분 공급을 개선하고 및/또는 회복하는 일반 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다 (Bissett DL. J. Cosmet. Dermatol. 2006 Dec. 5 (4): 309-15. Glucosamine: an ingredient with skin an dother benefits).

4.5.1 하이알루로니다제 활성을 위한 분석 프로토콜

하이알루로니다제 활성은 잔존 하이알루론산 (HA)의 분석에 의해 측정된다. 기질은 담체에 고정된 다음 효소 및 테스트될 일정 량의 화합물의 존재 시 반응시킨다. 잔존 HA, 예로 미-가수분해된 HA가 HA-엘라이자 검출 시스템: 하이알루로난 효소-연결된 면역흡착 분석법 (Hyaluronan enzyme-inked immunosorbent assay) (에켈론 바이오사이언스? (Echelon Biosciences?))을 사용하여 분석된다.

소 기원 (bovine origin)의 0.5 유닛의 하이알루로니다제 (BTH, 소 정소 하이알루로니다제)가 37℃에서 테스트될 화합물과 전-배양되었다. 본 혼합물은 마이크로플레이트 웰의 표면에 고정된 HA 상에 침적된다. 효소 반응은 pH 7.2에서 37℃로 시행되었다. 세척 이후에 하이알루로넥틴 (hyaluronectin, NH)에 의한 잔존 HA의 인식 (recognition) 단계가 이어졌다. 결합된 NH의 양은 알칼라인 포스파타제와 결합된 항-NH 항체를 사용하는 엘라이자에 의해 측정되었다. 포스파타제의 p-니트로페닐 포스페이트 디소듐 염 (pnNpp) 기질은 405　nm에서 분광분석 검출 (spectrometric detection)을 허용한다 (Delpech B et al ., Analytical Biochemistry 149, 555(565 (1985); Robert Stern et al . Analytical Biochemistry 251, 263-269 (1997)). OD 강도는 잔존 HA의 양과 상호관련되어 있었다. 잔존 HA의 양은 효소적 활성과 직접적으로 연관되어 있다. 저해제의 존재 시, 잔존 HA의 양이 많아질수록 시료는 더욱 저해시킨다. 하이알루로니다제의 저해 백분율이 표현될 것이다.

따라서 효소 부재 시 평균 전 (gross) 활성 및 테스트될 화합물의 존재 또는 부재 시 효소의 전 활성 간의 차이를 나타내는 순 (net) 효소적 활성이 계산되었다.

테스트될 화합물과 관련된 효소적 저해 백분율은 다음과 같이 계산되었다:

% 저해 = (최대의 순 효소적 활성 - 테스트될 화합물의 존재 시 순수 효소적 활성)/최대의 순 효소적 활성

여기에서 최대의 순 효소적 활성은 0.5 U의 평균 순수 효소적 활성을 나타낸다.

4.5.2 하이알루로니다제 활성의 분석 결과

표 4는 서로 다른 용량에서 (백분율로서 평균) 효소적 저해의 측정을 나타낸다.

농도	분자 1	분자 4	분자 5	분자 6	6-아스코빌 팔미테이트	아스코브산
500 μM	122	*	*	*	*	4
250 μM	119	*	*	*	112	*
200 μM	*	*	*	*	79	*
150 μM	*	*	*	*	*	*
100 μM	113	*	*	*	73	1
50 μM	76	111	76	106	71	*
40 μM	86	*	*	*	*	*
30 μM	66	*	*	*	*	*
25 μM	46	*	*	*	57	*
20 μM	44	*	*	*	*	*
10 μM	21	72	31	34	31	*
5 μM	14	*	*	*	*	*

*는 미-결정된 것이다.

이들 테스트의 결과 (표 4)는 이들 농도 (100 및 500 μM)에서 사용된 비타민 C가 하이알루로니다제 (BTH)에 전혀 효과를 미치지 않는 것을 보여준다.

이들 테스트의 결과는 6-아스코빌 팔미테이트 (6-ascorbyl palmitate)가 10으로부터 250 μM까지 용량 효과를 가지고 하이알루로니다제를 유익하게 저해하는 것을 보여준다.

분자 1, 4, 5 및 6의 5 μM 내지 500 μM은 하이알루로니다제를 강하게 저해한다: 분자 1은 용량 효과를 가지고 그의 IC₅₀은 25 내지 30 μM의 범위에 있다.

분자 1, 4, 5 및 6은 기준 분자 (reference molecule)로서 고려되는 아스코빌 팔미테이트와 동등하거나 더욱 활성을 가진다 (A. Botzki et al, JBC Vol. 279 N°44, pp 45990-450007).

이들 테스트의 결과는 분자 1, 4, 5 및 6에 의한 하이알루로니다제의 저해가 아스코빌 팔미테이트 및 비타민 C의 작용과 동등하거나 더욱 큰 것을 보여준다. 따라서 기술된 분자의 항-하이알루로니다제 활성은 아스코브산 및 6-아스코빌 팔미테이드의 활성보다 크다.

따라서, 본 발명은 피부 노화의 예방 및/또는 치료를 위한 또한 피부 수분 공급을 개선하고 및/또는 회복하기 위한 일반 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.

4.6.1 진피 유두상 세포 증식의 시험관내 (in vitro) 자극을 위한 프로토콜

인간 진피 유두상 세포 (프로모세포 (Promocell))는 배양해 두었고 10% FCS가 보충된 DMEM 배지에서 초기 계대 배양을 유지시켰다. 다음으로 그들은 10% FCS가 보충된 DMEM 배지를 넣은 96-웰 플레이트에 12시간 동안 접종되었다. 배양 배지는 무혈청 DMEM 배지로 교환되었으며 다음으로 10% FCS가 보충된 DMEM 배지 및 서로 다른 테스트된 농도에서 분자 1, 2, 3 및 4로 교환되었다. 60시간 동안 배양한 이후에, 세포 증식이 BrdU의 도입에 의해 측정되었다.

4.6.2 진피 유두상 세포의 시험관내 자극된 증식 테스트의 결과

첨부된 도 1에서 도면은 서로 다른 분자의 존재 시 BrdU의 도입 및 자극된 세포성 증식에서 증가 (대조군의 a%로서)를 보여준다.

분자 1은 진피 유두상 세포의 증식을 용량 효과 및 12.5 μM의 농도에서 최고의 활성을 가지고 촉진시킨다 (169% 증식). 유사하게, 분자 4는 6.25 μM의 농도에서 113.9%의 자극으로 증식을 유도한다. 분자 2 및 3도 역시 세포의 증식을 유도하지만 분자 1 및 4보다는 낮은 정도이다.

본 발명은 또한 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진하는 일반 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

4.7.1 인간 털 소포의 성장 촉진을 위한 프로토콜

인간 두피의 후두골 부위의 생검이 수술 폐기물로부터 획득되었다. 털 소포 (hair follicles)는 확대한 양안 관찰 하에서 미세-해부에 의해 분리되었다. 그들은 필포트 기법 (Philpott's technique) 이후에 개별적으로 배양되었다 (Philpott MP et al, J Cell Sci. 97:463-471, 1990). 성장기에 있는 털 소포는 10　μg/mL 인슐린, 10　μg/mL 트랜스페린 (Transferrin), 10 ng/mL 하이드로코티손 (Hydrocortisone), 1　mM 글루타맥스 I (Glutamax I), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 250　ng/mL 암포테리신 B (Amphotericin B)이 보충된 윌리암 배지 (William's medium)의 존재 시 또한 분자 3 또는 4의 존재 시 24-웰 배양 디쉬에서 11일 동안 배양되었다. 배양 배지는 규칙적으로 새로 교환되었다. 각 털 소포의 길이 성장 (lengthening) (μm 단위로)은 털 소포의 포획된 영상으로 4일 및 8일 배양에서 측정되었다.

4.7.2 인간 털 소포의 자극된 성장을 위한 테스트 결과

첨부된 도 2에서 도면은 4일 및 8일 배양 이후에 털 소포의 성장에 미치는 분자 3 및 4의 효과를 보여준다.

다음의 표 (표 5)는 대조군과 비교하여 각 처리 조건에 대해 획득된 성장 백분율 또한 분자 3 및 4를 사용하여 획득된 촉진된 털 성장에 대한 백분율을 준다.

표 5는 성장 백분율 및 털 성장 촉진 백분율을 나타낸다.

배양 일수	D4	D8	D4	D8
	% 성장	% 성장	% 활성	% 활성
미-처리군	44	77	0	0
분자 3	52	85	25	18
분자 4	51	84	19	12

분자 3 및 4는 15 μM의 농도에서 4일 배양 이후에 각각 25% 및 19% 촉진된 성장으로 털 성장을 유의하게 촉진시킨다.

본 발명은 또한 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진시키는 일반 화학식 (I)의 화합물의 용도에 관한 것이다.

4.8.1 모공 퇴화 (hair bulb degeneration)의 측정을 위한 프로토콜

역학 (Kinetics)적 활동이 11일 배양 이후에 정지될 때 소포의 퇴화가 모공의 형태학적 손상 (원형화 (rounding), 변형 (defromation))을 관찰하여 평가되었다. 세포 사멸 (apoptosis) 백분율이 소포의 전체 수에 대비한 세포 사멸된 털 소포의 수를 측정하여 계산된다.

4.8.2 모공 퇴화의 측정 결과

다음의 표 (표 6)은 11일의 배양 기간 이후에 털 소포의 생존에 미치는 분자 4의 효과를 보여준다.

표 6은 11일의 배양 이후에 털 소포의 생존을 나타내고, D11에서 세포 사멸된 모공의 수 (전체 소포의 수)로 표시된다.

		수	% 세포 사멸
대조군		9 (12)	75
분자 4	15 μM	6 (12)	50

분자 4는 털 퇴화의 현저한 제한을 가능하게 하였다 (세포 사멸된 털의 50% 대비 대조군의 경우 75%). 따라서, 분자 4는 털 생존을 유지하도록 허용하는 항-세포 사멸 효과를 가지는 것으로 관찰된다.

Claims

일반 화학식 (I)의 화합물:

여기에서:
- R₁은 적어도 하나, 유익하게는 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 불포화 결합 (unsaturation)을 포함하는 C₁₂ 내지 C₂₄불포화된 지방산의 탄화수소 사슬이고;
- R₂ 및 R₃는 독립적으로 또는 동시적으로 수소 또는 C1 - C3 알킬 또는 페닐을 나타내고; 또한
- R₄는 수소 원자 또는 COR₁'이고, 여기에서 R₁'은 적어도 하나, 유익하게는 1개 내지 6개, 바람직하게는 1개 내지 4개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₂ 내지 C₂₄불포화된 지방산의 탄화수소 사슬이다.
제 1항에 있어서,
R₂및 R₃는 C₁ - C₃ 알킬을 나타내는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
R₂및 R₃는 메틸을 나타내는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
R₁은 1개 내지 3개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₄ 내지 C₁₈ 불포화된 지방산의 탄화수소 사슬을 나타내는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서,
R₁'은 1개 내지 3개의 불포화 결합을 포함하는 C₁₄ 내지 C₁₈ 불포화된 지방산의 탄화수소 사슬을 나타내는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
상기 불포화된 지방산은 라우르올레산 (lauroleic acid) (C_12:1), 미리스트올레산 (myristoleic acid) (C_14:1), 팔미트올레산 (palmitoleic acid) (C_16:1), 올레산 (oleic acid) (C_18:1), 리신올레산 (ricinoleic acid) (C_18:1), 가드올레산 (gadoleic acid) (C_20:1), 에루크산 (erucic acid) (C_22:1), α-리놀렌산 (α-linolenic acid) (C_18:3); 스테아리돈산 (stearidonic acid) (C_18:4), 에이코사트리에노 (eicosatrienoic acid)(C_20:3), 에이코사테트라에노 (eicosatetraenoic acid) (C_20:4), 에이코사펜타에노산 (eicosapentaenoic acid) (C_20:5), 도코사펜타에노산 (docosapentaenoic acid) (C _22:5), 도코사헥사에노산 (docosahexaenoic acid) (C_22:6), 테트라코사펜타에노산 (tetracosapentaenoic acid) (C_24:5), 테트라코사헥사에노산 (tetracosahexaenoic acid) (C _24:6), 리놀레산 (linoleic acid) (C_18:2), 감마-리놀레산 (gamma-linolenic acid) (C_18:3), 에이코사디에노산 (eicosadienoic acid) (C_20:2); 디호모-감마-리놀레산 (dihomo-gamma-linolenic acid) (C_20:3), 아라키돈산 (arachidonic acid) (C_20:4), 도코사테트라에노산 (docosatetraenoic acid) (C_22:2), 도코사펜타에노산 (docosapentaenoic acid) (C_22:5), 아드렌산 (adrenic acid) (C_22:4) 및 칼렌디산 (calendic acid) (C_18:3):으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
상기 불포화된 지방산은 올레산 (C_18:1), 리놀레산 (C_18:2), α-리놀렌산 (C_18:3) 및 γ-리놀렌산 (C_18:3)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
R₄는 COR₁'을 나타내는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 8항에 있어서,
R₁ 및 R₁'은 서로 동일하거나 다를 수 있는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
R₄는 수소 원자인 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,
(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12-디에노에이트,
(9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z, 15Z, 15'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-9,12,15-트리에노에이트,
(6Z, 6'Z, 9Z, 9'Z, 12Z, 12'Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디옥타데카-6,9,12-트리에노에이트,
(Z)-2-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-5-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3,4-디일의 디올레이트,
(9Z, 12Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12-디에노에이트,
(9Z, 12Z, 15Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-9,12,15-트리에노에이트,
(6Z, 9Z, 12Z)-5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 옥타데카-6,9,12-트리에노에이트
5-(2,2-디메틸-1,3-디옥소란-4-일)-4-하이드록시-2-옥소-2,5-디하이드로퓨란-3-일 올레이트: 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
약제로서 또는 미용 활성 성분으로서 용도를 위한 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서,
탈색하는 활성 성분, 항-노화 활성 성분, 수분 공급하는 활성 성분, 항-염증 활성 성분, 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진하는 활성 성분, 또는 항-산화 활성 성분으로서 용도를 위한 일반 화학식 (I)의 화합물.
제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 일반 화학식 (I)의 화합물의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 국소적 투여용 조성물.
제 14항에 있어서,
일반 화학식 (I)의 화합물을 무게로 적어도 0.01% 내지 10%, 바람직하게는 일반 화학식 (I)의 화합물을 무게로 0.1%로부터 5%까지 포함하는 것을 특징으로 하는 국소적 투여용 조성물.
제 14항 또는 제 15항에 있어서,
피부 및/또는 머리카락 및/또는 체모를 탈색하고, 피부 노화의 치료 및/또는 예방하고, 표피에 수분을 공급하고, 머리카락 및/또는 체모의 재-성장을 촉진하고, 또는 피부의 염증을 치료하는 것을 의도하는 것을 특징으로 하는 국소적 투여용 조성물.
카르복실산 기능이 활성화된 형태로 있는 불포화된 지방산을 다음의 화학식 (II)의 아스코브산의 유도체와 결합시켜서 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 일반 화학식 (I)의 화합물을 합성하는 방법.
제 17항에 있어서,
상기 결합 반응은 카르복실산 기능이 염산의 형태로 활성화된 불포화된 지방산으로부터 시작하여 염기 또한 임의적으로 보조 결합의 존재 시 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.