TWI445553B - 一種用於美白及／或抗發炎的醫藥組合物 - Google Patents
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Description
本發明是一種具有美白或/及抗發炎之功效的醫藥組合物。
市面上最常見的美白成分包含維生素C、麴酸或熊果葉酸，這些成分絕大多數亦係藉由影響酪胺酸酶(Tyrosinase)以達到美白的功效，而該些化合物經實驗證明對人類的黑色素細胞並不具有細胞毒殺作用。
目前的相關技術，UC,San Diego的William Fenical教授(Center for Marine Biotechnology and Biomedicine)曾於加勒比海的柳珊瑚(Pseudopterogorgia elisabethae)中發現一系列抗發炎化合物，如式一；另一方面，有研究發現源自於一種海洋天然物前驅物，如式二，該分子結構中具有硫原子，進一步研究發現該化合物具有相當好的抗發炎活性，並於動物試驗中具治療病理性神經痛、多發性硬化症及粥狀動脈硬化之功能；然該前驅物因化合物極性極高，而降低化合物穿過細胞膜的能力，進而降低抗發炎的活性。
另一方面，在進行美白活性化合物之功效評估方面，絕大多數因時間及成本考量皆以體外(in vitro)實驗方法以評估化合物美白之活性。由於化合物一般使用於人體，即使是美白保養品的研發，許多體外實驗數據更需要進一步利用活體動物(in vivo)進行驗證以推向臨床使用。到目前為止，嚙齒類(如大、小白鼠)是廣泛被採用及發展較完善的實驗動物模式；然而，利用嚙齒類進行動物實驗時，其先天上的缺陷，如不具有黑色素細胞及長毛，及相關實驗動物的使用規範、成本、時效及個體變異太大等問題，讓許多宣稱具美白活性的化合物都缺乏活體驗證。目前已有相關專利申請案，如中華民國發明專利公開第201117111號「用於篩選一作為皮膚美白劑之後選物的魚體影像分析系統及其應用」，其揭示一種用於篩選皮膚美白劑的魚體影像分析系統，透過該系統所獲得的數據提供更精確且客觀評估皮膚美白劑的美白效用。
是以，本發明提供一種抑制黑色素生成的醫藥組合物，其可降低黑色素表現量，同時紓緩發炎之功效，並抑制因發炎反應而導致的色素沉澱現象。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含：有效量之式I的化合物，
其中R1
係H或C1-6
烷基；及R2
係H或C1-6
烷基，及醫藥上可接受之載劑。
本發明之一具體實施例中，本發明之化合物包含下述結構式：
在本發明的一較佳實施例中，該化合物的R1
為CH3
及R2
為H。
在較佳實施例中，本發明之醫藥組合物的有效量為1至100 μM。
本發明的醫藥組合物，其具有美白個體皮膚或具有抗發炎之能力，其中所述之「個體」為哺乳類動物。
在一具體實施例中，本發明的醫藥組合物可為化妝品、保養品、保健食品或其組合之原料。
在一具體實施例中，本發明之醫藥組合物可呈粉狀、錠劑、膠囊或液體之任一樣態。
基於上述，本發明所提供的化合物是一種含硫化合物，其可抑制良好的抗發炎活性；此外，本化合物模仿胺基酸結構，如苯丙胺酸結構，進而改善先前技術之化合物(式二)較不易穿透細胞的缺點。
本發明之化合物在體外細胞實驗的發炎測試中，更可抑制內毒素(lipopolysaccharide，LPS)所誘發巨噬細胞大量產生的發炎性蛋白，如誘發性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxidase synthase,iNOS)，因此對於新藥開發具有相當大的潛力。
如本文中所述之「美白」、「膚色淡化」、「淨白」、「增白」、「退黑」、「驅黑」或「淡化黑色素」可被互相交替使用。
如本文中所述之「醫藥上可接受之載劑」意旨為了藥物製造過程之需要、便於藥物劑量調配，或不同投藥劑型等需求，根據習知醫藥組合技術將醫藥組合物與醫藥可接受載劑混合，合適的醫藥可接受載劑為此項技術領域中所熟知，其中該載劑可有廣範之形式。某些醫藥可接受載劑之處方可見於由美國醫藥協會及英國醫藥協會(American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Society of Great Britain)所出版的醫藥賦形劑手冊(The Hand Book of Pharmaceutical Excipients)中。舉例而言，錠劑、膠囊、凝膠、溶液或懸浮液亦可包含下述成分：醫藥可接受賦形劑或載劑，其為無毒性、惰性固體或半固體、稀釋劑、封裝物質(encapsulating material)、凝膠基劑或任何形式之配方佐劑，例如：微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、葡萄糖、脫脂奶粉、澱粉、矽石、無水磷酸氫鈣、磷酸鎂、硬脂酸、硬脂酸鎂，或人工香料等物質。
本說明書及申請專利範圍中所用之詞語「包含」、「具有」、「包括」或「含有」為包括在內的或開放式的，且其不排除額外未引用之元件或方法步驟。
如本文中所述之術語『抑制』、『減少』或『防止』或該等術語之任何變體當用於申請專利範圍及/或說明書中時包括任何可量測之減少或完全抑
制以達成所需之結果。
如說明書及/或申請專利範圍中所使用之術語『有效』意謂足以實現所需、所期望或所預計之結果。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
先將苯硫酚(2.00克，98%，17.8 mmole)及三乙基胺(0.25毫升，1.78 mmole)加入含有10毫升丙酮的圓底瓶。接著於0℃的冰槽攪拌，將含有甲基乙烯基酮(1.38毫升，90%，17.8 mmole)的丙酮(4毫升)緩慢加入瓶內。完成加入步驟後，將反應溫度上升至室溫並連續反應16小時，接著將不含溶劑的產物精油矽膠管柱層析(以已烷/EtOAc=25：1沖提)以獲得本發明之產物4-(phenylthio)butan-2-one(2.80克，產率87.0%)，反應過程如下。
▪無色油質。
▪質譜分析儀：IR(KBr)ν max
為3057,2934,1715,1583,1481,1361,1159,739,691 cm-1
。1
H NMR(CDCl3
,300 MHz)δ
7.31(1H,m),7.29(2H,m),7.24(1H,m),7.16(1H,m),3.10(2H,t,J
=7.2 Hz),2.72(2H,t,J
=7.2 Hz),2.09(3H,s)。
▪碳13核磁共振光譜：13
C NMR(CDCl3
,75 MHz)δ
206.2(qC),135.5(qC),129.1(CH),129.1(CH),128.7(CH),128.7(CH),126.0(CH),42.7(CH2
),29.8(CH3
),27.1(CH2
)。
▪電噴灑質譜儀：ESIMSm/z
203[M+Na]+
。
▪分子式：C10
H12
OS。
將小鼠黑色素瘤細胞細胞(B16-F10細胞)施予不同濃度的化合物，如圖1顯示施予濃度在1~20 μM化合物-1時沒有細胞毒殺能力。利用Alamar Blue(Biosource,Camarillo,CA)使活細胞內粒線體脫氫酶(Dehydrogenase)由藍色轉變為粉紅色，再藉由其吸光值之不同便可推算出活細胞數目。將小鼠黑色素瘤細胞種在96孔盤中(5,000顆/孔)，待細胞完全附著於培養盤底部後，依照不同組別分別加入欲測試之化合物濃度(最終皆含0.1% DMSO)。在37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱中培養24小時後，加入10%之alamar blue，並繼續培養3小時，最終利用酵素免疫判讀機(FLISA reader,
Thermo,Multiskan Ex)測量波長為595 nm之吸光值。透過公式(I)計算後，便可得細胞存活率：[(實驗組-背景值)/(控制組-背景值)]＊
100………公式(I)。
在6公分培養盤內植入密度為2x105
(個/盤)的細胞，並添加5毫升的DMEM培養基。於培養箱培養24小時後，分別添加最終濃度為10 μM、20 μM及50 μM的化合物-1(含0.1% DMSO)於培養基中，及另外將N-苯基硫脲(phenylthiourea,PTU)及麴酸(Kojic acid)作為正控制組，其中PTU及Kojic acid僅添加0.1%DMSO，每組同時進行三重複。
加入上述化合物後的第72小時，將各培養盤以0℃的磷酸鹽緩衝溶液潤洗兩次。再取1毫升的PBS用以刮下細胞，並收集至離心管。以4℃、3000 rpm之條件下離心8分鐘後，將上層PBS移除，每管分別以等體積之裂解緩衝液(20 mM Tris-0.1% Triton X-100)均勻混合，靜置冰浴五分鐘後，再離心30分鐘(4℃、13000 g)。離心後的細胞沉澱物於-80℃保存或將直接進行黑色素表現量之實驗，而該實施例是利用其上清液，測定內含有的酪胺酸脢蛋白活性，並定量出每一離心管內澄清液之蛋白質含量後(Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Randall RJ(1951)Protein measurement with the Folin phenol reagent.The Journal of biological chemistry 193：265-275.)，分別取出蛋白質含量同為40 μg之澄清液，再加入以1X PBS配置的2.5 mM L-dopa，兩者體積共為100 μL，均勻混合後載入96孔盤中，置於恆溫箱搖晃反應1小時後，再利用酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader,Thermo,Multiskan Ex)偵
測波長440 nm之吸光值。
結果如表一，酪胺酸酶活性百分率數值若愈小，表示生成黑色素之含量愈小，美白活性之功效愈顯著。又如圖2所示，酪胺酸酶活性隨著化合物-l之濃度提升而抑制效果更為顯著，然N-苯基硫脲對酪胺酸酶活性的抑制效果影響較小。
將上述離心完後之細胞沉澱物，加入適量1 N氫氧化鈉水溶液，並置於水浴槽80℃加熱半小時，使其黑色素完全溶解後，取至96孔盤中。利用酵素免疫分析測讀儀偵測波長440 nm之吸光值。結果如表二所示，細胞黑色素表現量百分比數值若愈小，表示黑色素表現量愈少，美白活性之功效愈顯著。由表二顯示在各試劑的濃度相較下，化合物-1的劑量低於N-苯基硫脲(100 μM)及麴酸(100 μM)時，化合物-1的美白活性功效與其他試劑並無差異。又如圖3所示，細胞黑色素表現量隨著化合物-1之濃度提升而降低，
化合物-1在濃度為50 μM時即與PTU 100 μM的條件下，具相似的黑色素表現量，故本發明醫藥組合物所含的化合物-1係一種一需求劑量低且美白功效顯著之化合物。
利用斑馬魚(Danio rerio
A/B strain)為實驗種魚，飼養於具有循環系統及過濾器的壓克力水缸內，水溫控制在28.5℃，光暗週期分別為14與10小時。在斑馬魚受精後之第9小時，取其胚胎放入96孔盤中，每格孔槽內包含三顆胚胎及100 μL漢克氏緩衝液(Hank’s buffer)，將欲檢測之成分配置完成後，取100 μL注入孔槽中，充分混合均勻後，蓋上孔盤蓋以降低因水分散失影響濃度變化，置入恆溫光照培養箱控制每日的光週期與暗週期分別為14與10小時，持續浸泡48小時讓斑馬魚吸收欲檢測之成份。
▪控制組：斑馬魚胚胎給予0.1% DMSO。
▪對照組：斑馬魚胚胎加入0.1% DMSO及熊果素(Arbutin)或N-苯基硫脲(PTU)。
▪實驗組：斑馬魚胚胎各別加入含有0.1% DMSO的、化合物-1、化合物-2、化合物-3及化合物-4之化合物。
經過48小時後(即受精後57小時)，取出仔魚以麻醉劑(MS-222,168ppm Tricaine)麻醉後，個別依序放置於凹玻片之凹槽中，使用1.5%甲基纖維(Methyl cellulose)幫助固定魚體，以注膠尖頭(Loading tip)調整魚體使之背部朝上、左右對稱、尾部垂直延伸的姿勢。利用實體顯微鏡(Z16 APO,Leica,Heerbrugg，瑞士)使用10倍目鏡及2.5倍物鏡，搭配影像擷取系統(idea SPOT,Diagnostic instruments Inc.，美國)及其控制軟體(SPOT software VERSION 4.6，Diagnostic instruments Inc.，美國)，固定其影像曝光時間，取得魚體影像，拍攝後轉存成TIF檔。
接著，利用影像分析軟體(Image J 1.43；國立衛生研究院，Bethesda,MD，美國)，使影像結果數值化。首先，開啟Image J軟體，開啟Image選項內Hyperstacks的Channels以及Image選項中的Threshold兩個子視窗。在Channels中，將模式設定為Grayscale，把所有圖片統一在紅色通道(Red channel)模式後，再次選擇Grayscale進行定量分析。點選Threshold視窗，調整最低閾值(lower threshold values)及最高閾值(upper threshold values)，分別為0及85，亮度強度落在最高和最低閾值之間的像素，其以紅色訊號表示，此時，圈選定量目標之魚體範圍，選擇Analyze選項內的Measure後，定
量結果會顯示於Results視窗內。依據上述操作方式，在同樣的閾值範圍下，分析各組斑馬魚的黑色素含量。
結果如表三所示，將得到的初始數據利用Excel計算，以控制組的平均值為100%基準值，其他組別的像素平均值除以基準值，再換算百分率後，即可比較出黑色素表現程度。又如圖4A-圖4C所示，控制組為僅含1% DMSO有機溶劑，其中熊果素及N-苯基硫脲為對照組，由結果再次驗證本發明醫藥組合物所含的化合物-1係一種低劑量、高美白功效之化合物。
接續美白活性影像分析之方法，在施以藥物後48小時之影像拍攝完畢後，各組分別再給定相同初始組別設立之條件於96孔盤內育養，每隔24小時拍攝一次魚體影像，持續5日，比較其黑色素表現量之多寡。當日控制組設定為100%，而該百分比換算係指當日給藥組及當日控制組之比值，結果如表四及圖5所示。
接續美白活性影像分析之方法，在施以藥物後48小時之影像拍攝完畢後，各組分別育養於6公分培養盤並加入同體積之漢克氏緩衝溶液中，每隔24小時拍攝一次魚體影像，持續5日，比較其黑色素表現量之多寡。當日控制組設定為100%，而該百分比換算係指當日給藥組及當日控制組之比值，結果如表五及圖5所示。如圖5所示，與持續給藥之持續力實驗比較，無持續給藥之持續力相對減緩，黑色素表現量明顯逐漸提升，顯示本發明醫藥組合物所使用的化合物應可代謝並不具殘留性。
使用酯多糖誘發小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞株離體發炎模式進行測試。控制6公分培養皿之小鼠巨噬細胞RAW 264.7數目在3x106
個，先給予各化合物，如化合物-1、化合物-2、化合物-3及化合物-4，再給予酯多醣(LPS)16-18小時後收集細胞。
使用4%磷酸鹽緩衝溶液(137mM氯化鈉，2.68mM氯化鉀，10 mM磷酸氫二鈉，1.76 mM磷酸氫二鉀，pH7.2)收集至1.5毫升離心管中，待以3000rpm離心8分鐘後去除上清液，再加入4℃的200μl裂解緩衝液(50mM Tris，pH7.5,150mM氯化鈉，1% TritonX-100，0.1 mM EDTA，0.1mM EGTA，100 μg/ml苯甲基磺醯化氟，1 μg/ml抑肽酶，20 mM氟化鈉，0.2 mM釩化鈉)打破細胞膜後，在4℃之下，以14,000rpm離心30分鐘，取出上清液並仿照Lowry等人的方法(Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Randall RJ(1951)Protein measurement with the Folin phenol reagent.The Journal of biological chemistry 193：265-275.)
進行蛋白質定量。使用Bio-Rad DC蛋白質檢驗套組(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)及酶測讀儀(enzyme-linked immunosorbent assay reader,Thermo Electron Corporation,USA)分析上清液的吸光值，以測定各標本之蛋白質量。將經校正後取樣本總體積之三分之一體積的標本緩衝液(2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚藍，10% 2-巰基乙醇，50mM Tris，Bio-Rad Laboratories,inc)。利用7%、10%之聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)以80伏特電壓分離蛋白質。將SDS-PAGE上之蛋白質以135毫安培電流轉置到PVDF膜(0.45mm孔徑，Immobilon-P,Millipore,Bedford,MA,USA)上。轉印後的PVDF膜以含5%脫酯奶粉TTBS溶液(Tris-Tween buffer saline)(20mM Tris-HCl，137 mM氯化鈉，pH 7.4，0.1% Tween 20)在室溫下覆蓋40分鐘，再與1：1000稀釋比例的針對誘發型一氧化氮合成酶和第二型環氧化酶作用的一級抗體在室溫下反應兩小時。隨後以TTBS溶液清洗三次，接著以HRP-conjugated之anti-rabbit IgG抗體(1：2000)在室溫中反應一小時三十分鐘，二級抗體結束後以TTBS溶液清洗三次，最後利用呈色液(Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate,Millipore Corporation,Billerica,MA 01821 U.S.A.)與PVDF膜反應，並以影像分析處理設備(UVP Biospectrum AC System,UVP Inc,U.S.A.)偵測冷光反應，紀錄蛋白質的表現量，以電腦分析軟體(VisionWorks LS Acquisition and analysis software,copyright 2007,LLC,U.S.A.)偵測並計算相對量。並以單獨加入酯多醣組別為100%，最後以β-肌動蛋白(β-actin)作為內控制組。
結果如表六所示，其顯示本案的化合物-1、化合物-2、化合物-3及化合物-4皆可抑制iNOS的表現量。圖6更顯示經由LPS誘發成功的巨噬細胞，其iNOS表現量明顯劇增，同時合併給予10 μM化合物-1則顯著抑制iNOS表現量。
基於上述實施例結果，顯示本發明醫藥組合物所含的化合物-1有助於減緩發炎反應的活性表現及具有美白之功效。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之細胞、動物及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠
製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
圖1顯示不同濃度的化合物-1對於人類黑色素細胞的細胞活性(第四天)。
圖2顯示本發明化合物-1對於細胞酪胺酸脢的測試結果。
圖3顯示本發明化合物-1降低細胞黑色素表現量。
圖4A顯示本發明化合物-1及其他藥物在斑馬魚上的黑色素表現程度。
圖4B顯示化合物-2及其他藥物在斑馬魚上的黑色素表現程度。
圖4C顯示化合物-3、化合物-4及其他藥物在斑馬魚上的黑色素表現程度。
圖5顯示於斑馬魚上持續施以藥物及無持續施以藥物的美白活性持續力測試。
圖6顯示本發明化合物-1減緩發炎反應的活性表現。
Claims (10)
- 一種組合物用於製備美白及抗發炎之醫藥組合物的用途，其中該組合物包含：有效量之式I的化合物，
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中R1 是CH3 ，R2 是H。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物之有效量為1至100μM。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其具有美白個體皮膚。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其具有抗發炎之能力。
- 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該個體為哺乳類動物。
- 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中抗發炎之能力係降低一氧化氮合成酶之表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其具有抑制黑色素之能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物為化妝品、保養品、保健食品或其組合之原料。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物係呈粉狀、錠劑、膠囊或液體之任一樣態。
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