KR101916531B1 - 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물 - Google Patents
갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물은 갈색 거저리를 에탄올, 메탄올, 증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하고, 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물로서 멜라닌 합성을 촉진하여 백화증 예방 및 흑모 생성을 위한 화장품 소재로서 개발하는데 이용 될 수 있다.
Description
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 멜라닌 합성 촉진 효능을 지닌 성분을 천연물로부터 개발하기 위한 갈색 거저리로부터 추출된 유효성분을 함유하는 백화증을 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물에 관한 것으로 멜라닌 합성을 촉진하여 백화증 예방 및 흑모 생성을 위한 화장품 소재로서 개발하는데 이용 될 수 있다.
일본, 중국, 대한민국, 중동 등 아시아 인종의 대부분이 검은색의 모발을 가지며 노화, 빛에 의한 손상, 스트레스 등 여러 요인에 의해서 모발의 백화가 일어난다. 이러한 모발의 백화 현상을 숨기기 위하여 현재로는 염색이 가장 효과적인 방법으로 알려져 있다. 하지만, 염색은 일시적인 방법으로 새로 자라나는 머리에는 효과가 없고 근본적인 백화증을 해결할 수 없다. 따라서 백화증을 예방하고 흑모 생성을 촉진하는 약물 및 화장품에 대한 수요가 증가하고 있다.
멜라닌은 모발과 피부의 색을 결정하며 생성된 체내의 활성산소의 생성을 막는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부 세포가 빛의 UV에 의해 자극을 받아 세포 내 활성산소 농도가 증가하는 피부노화의 진행에 대하여 활성산소의 농도를 낮추어 주는 역할을 한다. 세포내 멜라닌 합성에 관여하는 여러 종류의 단백질 중 티로시나아제(tyrosinase)는 멜라닌 합성을 촉진하는 가장 주요한 단백질로 티로시나아제(tyrosinase)의 발현에는 안구증 연관 전사 요소 (Microphthalmia-Associated Transcription Factor, MITF)가 중요한 역할을 하며 안구증 연관 전사 요소 (MITF)는 티로시나아제(tyrosinase)의 전사를 촉진한다. 또한, glycogen synthase kinase-3b (GSK-3b)에 의해 촉진되며 GSK-3b는 단백질 인산화효소 B(AKT)에 의해 억제를 받는 것으로 알려져 있다. MITF는 전사 인자(transcription factor)로서 티로시나아제(tyrosinase)와 tyrosinase related protein 1, tyrosinase related protein 2의 전사를 촉진 시키는 역할을 하며, GSK-3b는 이 MITF를 인산화시켜 티로시나아제(tyrosinase)의 촉진제(promoter)를 활성화시키는 역할을 하여 최종적으로 멜라닌 합성을 촉진시키는 작용을 한다. 또한, 세린-트레오닌 인산화효소(serine-threonine kinase)의 일종인 단백질 인산화효소 B(AKT)는 활성화되면 Glycogen synthasis kinase-3b (GSK-3b)를 억제하여 멜라닌 합성을 억제하는 작용을 한다. mTOR(mammalian target of rapamycin) 단백질은 인산화 되면 AKT를 인산화 시켜 활성화 시키는 역할을 하여 멜라닌 합성을 억제하는 데에 기여를 하게 된다.
갈색 거저리 (Tenebrio molitor)는 절지동물문 (Arthropoda) 곤충강 (Insecta) 딱정벌레목 (Coleoptera) 거저리과 (Tenebrionidae) 의 곡물거저리속 (Tenebrio)이다. 몸은 어두운 갈색이며 길이는 약 15mm의 곤충으로 성충은 보통 곡류 속에 알을 낳는데 이 알은 1~2주 후 부화한다. 부화한 유충을 밀웜(mealworm)이라고 부르며 유충은 9~20번의 탈피를 통해 번데기가 되어 식용 시판명으로 고소애라고 한다. 단백질과 지방 함량이 높아 식품원료로 가치가 높다고 평가되어 미래 식량자원으로도 각광받고 있으며, 식품의약품안전처는 2014년 7월 16일 갈색 거저리 유충을 한시적 식품원료로 사용할 수 있도록 인정하였다. 밀웜은 단백질(50.3%)과 지방(33.7%)이 풍부하여 혈관 질환 및 성인병 예방에 도움을 주며, 무기질과 식이섬유 또한, 풍부해 식이요법에 적절한 식재료로 심장 질환의 예방과 치료에 좋은 불포화 지방산이 다량 함유되어 있다. 또한, 항염, 항산화, 항암 등의 효능에 대한 연구가 보고되고 있지만 멜라닌 합성과 흑모 생성에대한 연구와 기술은 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 발명은 거저리 애벌레인 밀웜(mealworm)을 열수추출하여 B16-F10 세포에 처리하여 멜라닌 합성과 관련된 단백질 실험과 멜라닌 생성에 관여하는 실험의 결과를 통하여 갈색 거저리로부터 추출된 유효성분을 함유하는 백화증을 예방하고 흑모 생성을 위한 촉진 조성물로서 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명자들은 멜라닌 합성 촉진 효능을 지닌 성분을 천연물로부터 개발하기 위한 갈색 거저리로부터 추출된 유효성분을 함유하는 백화증을 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 화장품 소재로서 개발하고자 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 추출물은 에탄올, 메탄올, 증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 추출물은 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 추출물은 각질 형성 세포에 대하여 10-3 v/v 내지 10-5 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 추출물은 에탄올, 메탄올, 증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공한다.
또한, 상기 추출물은 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물은 갈색 거저리를 에탄올, 메탄올,
증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하고, 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물로서 멜라닌 합성을 촉진하여 백화증 예방 및 흑모 생성을 위한 화장품 소재로서 개발하는데 이용될 수 있다.
도면 1은 갈색 거저리 추출물의 세포 독성 측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정을 위한 WST-1 assay를 시행 결과이고,
도면 2는 갈색 거저리 추출물이 B16-F10 세포의 활성산소(ROS) 농도의 영향을 알아보기 위한 Flow cytometry analysis의 결과이며,
도면 3은 갈색 거저리 추출물의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F10세포를 이용하여 멜라닌 양을 측정한 결과이며,
도면 4는 갈색 거저리 추출물를 이용하여 멜라닌 합성에 관여하는 단백질인 Tyrosinase, AKT1/2/3, TNFa, p-mTOR, mTOR에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이다.
도면 2는 갈색 거저리 추출물이 B16-F10 세포의 활성산소(ROS) 농도의 영향을 알아보기 위한 Flow cytometry analysis의 결과이며,
도면 3은 갈색 거저리 추출물의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16-F10세포를 이용하여 멜라닌 양을 측정한 결과이며,
도면 4는 갈색 거저리 추출물를 이용하여 멜라닌 합성에 관여하는 단백질인 Tyrosinase, AKT1/2/3, TNFa, p-mTOR, mTOR에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수
있는바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 이와 같은 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 이 용어들은 하나의 구성요소들을 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 '연결되어' 있다거나, 또는 '접속되어' 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 '직접 연결되어' 있다거나, '직접 접속되어' 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, '포함한다' 또는 '가지다' 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소,
부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일 실시 예를 상세히 설명한다.
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 추출물은 에탄올, 메탄올, 증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물이다. 일 실시예에 따른 본 발명의 추출용액은 증류수가 바람직하며 추출 과정은 실시예 1에 자세히 설명하고 있다. 갈색 거저리 50g을 잰 후 250ml 메디아병(media bottle)에 넣고 갈색 거저리양의 2배인 100ml 증류수(dH2O)를 가하고 잘 섞는다. 고온 고압 조건에서 고압증기 멸균기(autoclave, DAIHAN Scientific) 열수추출을 실시하고 6.500 RPM, 10분, 4℃에서 원심분리 하여 수용액 층을 0.2um syringe filter (Sartorius, Minisart® Syringe Filter)로 여과하여 시료에 처리하였다 [실시예 1 참조].
다른 일 실시예에 따른 본 발명의 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물이다. 멜라닌 세포의 배양은 Mus musculus (생쥐,mouse) B16-F10 세포를 100mm에 DMEM high glucose (WELGEN)에 10% fetal bovine serum (GemCell), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO)를 넣고 37℃ 항온배양기(incubator, Thermo Fisher Scientific), 95% 공기, 5% 이산화탄소의 조건에서 배양하였다 [실시예 2 참조]. 또한, B16 F10 cell을 96well plate(SPL life science)에 1x103수만큼 100ul Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose (10%FBS, 1% penicillin-streptomycin) 배지에 12시간 동안 배양한 후, 갈색 거저리 추출물을 계열 희석법으로 희석하여, 처리 후 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 v/v의 농도가 되도록 1ul씩 처리하였다. 대조군 용액인 Vehicle은 증류수를 1ul 처리하였다. 처리 후 24시간 동안 배양한 후, water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) solution (DoGenBio, EZcytox)을 well당 10ul씩 넣어준 후 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 micro plate 분광 광도계 (spectrophotometer, SUNLIZE, Tecan)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다 [실시예 4 참조]. 또한, 갈색 거저리 추출물의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 유동세포 계수법을 실시하여 B16-F10 cell을 60mm 세포 배양 접시(cell culture plate, SPL life science)에 5x104수 만큼 4ml DMEM high glucose (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지에 12시간 동안 배양한 후, 갈색 거저리 추출물을 계열 희석법으로 희석하여, 처리 후 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 v/v의 농도가 되도록 4ul씩 처리하였다. 대조군 용액 (Vehicle)은 증류수를 4ul 처리 하였다. 추출물 처리 후, 12시간 동안 배양한 후, 2-7-dicholordihydrofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma Aldrich)를 4ul 넣어주고 30분간 배양기에서 반응시켰다 [실시예 5 참조]. 따라서, 농도 의존적으로 멜라닌 합성이 증가되어 10-7v/v 농도로 처리 시 최대로 증가하여 약 2배의 증가율을 보였고, 이와 같은 결과를 통하여 B16-F10 세포에서 갈색 거저리 추출물이 멜라닌 합성을 확인하였다 [도면 3 참조].
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 상기 추출물은 각질 형성 세포에 대하여 10-3 v/v 내지 10-5 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물인 것을 특징으로 한다. 상기 추출물은 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에 대하여 갈색 거저리 추출물을 10-5 v/v 이하의 농도로 처리하는 것이 바람직하다. 갈색 거저리 추출물의 세포 생존에 미치는 영향과 갈색 거저리 추출물의 세포 독성 측정에 사용될 농도 범위 결정을 위해서 WST-1 assay를 시행 하였다. 각질 형성 세포인 HaCaT 세포에 대한 세포 독성을 측정한 결과 10-5 v/v 이하의 농도로 처리 시 갈색 거저리 추출물은 세포 생존율이 100% 이상으로 나타났다. 또한, B16-F10 세포의 경우 10-6, 10-7, 10-8 v/v의 농도에서 90% 이하로 감소하고 최대 65% 가량 감소하였다. 이 결과를 통하여 갈색 거저리 추출물이 정상 세포에는 세포독성을 나타내지 않고 오히려 흑색종(melanoma)세포 인 B16-F10에는 독성을 나타냄을 확인하였다. 그리고 같은 농도대에서 멜라닌 합성 촉진 효과를 확인하여 갈색 거저리 추출물이 정상세포에 독성을 가지지 않는 것을 확인하였다[도면 1 참조].
또한, 본 발명은 갈색 거저리 추출물을 처리하여 멜라닌 합성에 관여하는 것으로 알려진 티로시나아제 (Tyrosinase), 단백질 인산화효소 B (AKT1/2/3), 종양괴사인자α(tumor necrosis factor α, TNF-α, Santa cruz biotechnology, sc-1351), phosphorylation of mammalian target of rapamycin (p-mTOR, Cell Signaling TECHNOLOGY, #2974), mammalian target of rapamycin (mTOR, Santa cruz biotechnology, sc-130865)의 발현에 갈색 거저리 추출물이 영향을 주는지 알아보기 위하여 시료를 12 시간 동안 처리한 B16 melanoma 세포를 용해 완충제(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 150 mM NaCl2, 1% Triton X-100)로 용해하고 원심 분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)를 이용해 전기영동하고 이를 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) membrane으로 이전시켰다. 5% 탈지유(skim milk)가 함유된 트리스(tris) 완충용액에서 1 시간 저지시키는(blocking) 과정을 거친 후, 티로시나아제 (Tyrosinase, Santa cruz biotechnology, sc-7833), 단백질 인산화효소 B(AKT, Santa cruz biotechnology, sc-8312), 종양괴사인자α(tumor necrosis factor α, TNF-α, Santa cruz biotechnology, sc-1351), phosphorylation of mammalian target of rapamycin (p-mTOR, Cell Signaling TECHNOLOGY, #2974), mammalian target of rapamycin (mTOR, Santa cruz biotechnology, sc-130865), β-actin (Santa cruz biotechnology, sc-47778) 항체와 각각 반응시켰다 [실시예 6 참조]. Tyrosinase, AKT 2, TNF-α의 발현양이 증가되고 AKT1/3, p-mTOR, mTOR의 발현양이 감소 되었다. 이를 통해 갈색 거저리 추출물이 티로시나아제 (Tyrosinase) 단백질의 발현양을 증가시켜 멜라닌 합성을 촉진을 확인하였다. 갈색 거저리 추출물을 처리하였을 때 B16-F10세포에서 AKT의 발현양이 감소하고 AKT를 활성화시키는 mTOR과 활성화된 상태인 p-mTOR 단백질의 발현양도 측정한 결과 두 단백질 모두 갈색 거저리 추출물을 처리하였을 때 감소함이 확인되었다 [도면 4 참조]. 또한, Flow cytometry analysis를 이용하여 갈색 거저리 추출물이 B16-F10세포의 신체 내에서는 활성산소 (ROS) 농도에 영향을 주는지 알아 보기 위하여 유동세포계수법 (Flow cytometry analysis)을 이용하여 확인 한 결과 10-7v/v에서 가장 감소하고 농도 의존적으로 감소하였다. 10-9v/v 농도에서 대조군 용액 vehicle 수준으로 다시 증가하였으며 이를 통해 활성산소 (ROS)감소로 세포가 안정화됨에 따라 멜라닌 합성 세포의 대사 기전이 안정화되어 멜라닌의 합성을 촉진함을 확인하였다 [도면 2, 실시예 7 참조].
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 추출물은 에탄올, 메탄올, 증류수 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물인 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 추출물은 멜라닌 세포에 대하여 10-5 v/v 내지 10-9 v/v 농도로 갈색 거저리 추출물을 처리하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물을 피부 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품으로 사용하는 경우, 갈색 거저리 추출물을 기초제품 화장료(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩), 바디제품 화장료(바디 로션, 바디 오일, 바디 젤), 색조제품 화장료(파운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발제품 화장료(샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤), 등에 화장료의 건조중량에 대하여 0.05 ~ 10.0 중량% 함량으로 배합하여 사용할 수 있다. 화장품을 위한 갈색 거저리 추출물은 갈색 거저리 50g을 잰 후 250ml 메디아병(media bottle)에 넣고 갈색 거저리양의 2배인 100ml 증류수(dH2O)를 가하고 잘 섞는다. 고온 고압 조건에서 고압증기 멸균기(autoclave, DAIHAN Scientific) 열수추출을 실시하고 6.500 RPM, 10분, 4℃에서 원심분리 하여 수용액 층을 0.2um syringe filter (Sartorius, Minisart® Syringe Filter)로 여과하여 사용할 수 있다.
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 정의되는 "기능성 식품"은 기능성 식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 기능성 식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다. 또한, 본 발명은 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진 효과를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 기능성 식품으로 제조 및 가공이 가능하다. 본 발명의 추출물을 포함하는 기능성 식품은 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진을 위한 목적으로 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명은 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 인산일수소칼슘, 인산이수소칼슘, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 더 포함 할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백화증 예방 및 치료용 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수도 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
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실시예
1> 갈색
거저리의
추출 방법
갈색거저리 50g을 잰 후 250ml 메디아병(media bottle)에 넣고 갈색 거저리양의 2배인 100ml 증류수(dH2O)를 가하고 잘 섞는다. 이후 110℃ 0.4kgf/cm3 15분동안 고온 고압 조건에서 고압증기 멸균기(autoclave, DAIHAN Scientific) 열수추출을 실시하고 6.500 RPM, 10분, 4℃에서 원심분리 한다. 원심분리가 종료 후 수용액 층을 수거한 뒤 거름종이로 걸러서 옮겨 담았다. 0.2um syringe filter (Sartorius, Minisart® Syringe Filter)로 여과하여 적절 농도로 시료에 처리하였다.
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실시예
2> 세포 배양
Mus musculus (생쥐,mouse) B16-F10 세포를 100mm 세포 배양 접시(cell culture plate, SPL life science)에 DMEM high glucose (WELGEN)에 10% fetal bovine serum (GemCell), 1% penicillin-streptomycin (GIBCO)를 넣고 37℃ 항온배양기(incubator, Thermo Fisher Scientific), 95% 공기, 5% 이산화탄소의 조건에서 배양하였다. 0.05% Trypsin-EDTA (WELGENE)를 이용하여 계대 배양하였다.
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실시예
3> 유동세포 계수법(
Flow
cytometry
analysis
)
B16-F10 cell을 60mm 세포 배양 접시(cell culture plate, SPL life science)에 5x104수 만큼 4ml DMEM high glucose (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지에 12시간 동안 배양한 후, 갈색 거저리 추출물을 계열희석법으로 희석하여, 처리 후 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 v/v의 농도가 되도록 4ul씩 처리하였다. 대조군 용액 (Vehicle)은 증류수를 4ul 처리 하였다. 추출물 처리 후, 12시간 동안 배양한 후, 2-7-dicholordihydrofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma Aldrich)를 4ul 넣어주고 30분간 배양기에서 반응시켰다. 그 후, 배지를 제거하고 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS) 1ml 로 배양액 접시를 세척한 뒤 500ul trypsin-EDTA (WELGENE)를 넣어주고 1분간 배양기에서 반응시켰다. 그 후 세포를 1.5ml 관(tube, Axygen)에 옮긴 뒤 5,000rpm에서 5분간 원심분리하고 상층 액을 제거하였다. 그리고 200ul 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 넣어주고 재부유(resuspension)한 뒤 5,000rpm에서 5분간원심분리 한 뒤 300ul PBS-1%BSA(bovine serum albumin, Roche Applied Science)-0.01% sodium azaide로 재부유(resuspension)한 뒤 flow cytometry(GUAVA easycyte)를 이용하여 2-7-dicholordihydrofluorescein diacetate(DCF-DA, Sigma Aldrich)의 형광(green fluorescence HLog, median)값을 측정하였다. 갈색거저리 추출물을 처리하지않은 대조군 용액 (Vehicle)을 1로 기준으로 비교하여 나타내었다.
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실시예
4> 세포 생존력 측정(
Cell
viability
assay
)
B16 F10 cell을 96well plate(SPL life science)에 1x103수만큼 100ul Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) high glucose (10%FBS, 1% penicillin-streptomycin) 배지에 12시간 동안 배양한 후, 갈색 거저리 추출물을 계열 희석법으로 희석하여, 처리 후 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 v/v의 농도가 되도록 1ul씩 처리하였다. Vehicle은 증류수를 1ul 처리 하였다. 처리 후 24시간동안 배양한 후, water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) solution (DoGenBio, EZcytox)을 well당 10ul씩 넣어준 후 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 micro plate 분광 광도계 (spectrophotometer, SUNLIZE, Tecan)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
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실시예
5> 멜라닌 함량 측정(
Melanin
Content
assay
)
B16-F10 cell을 60mm plate에 1x105수 만큼 파종(seeding)후 4ml DMEM high glucose(10%FBS, 1% penicillin-streptomycin)배지에 12 시간 동안 배양한다. , 갈색 거저리 추출물을 계열 희석법으로 희석하여, 처리 후 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 v/v의 농도가 되도록 4ul씩 처리하였다. 대조군 용액 (Vehicle)은 증류수를 4ul 처리 하였다. 처리후 24 시간 동안 배양한 후, 인산완충생리식염수 (phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 뒤 트립신(Trypsin)-EDTA로 세포를 수거하여 세포수를 측정한 후, 원심분리 5000rpm, 5분간 원심분리 한 뒤, 상층액 제거 후, 1ml 의 균질화 용액(homogenization buffer, 50mM Sodium phosphate pH 6.5, 1% Triton X-100, 2mM phenylmethane sulfonyl fluoride or phe nylmethylsulfonyl fluoride PMSF)넣고 혼합 후 상온에 10분 방치 한다. 원심분리 12000rpm15분 후 상층액을 제거한 뒤, 10% 다이메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide, DMSO)를 포함한 1N 수산화나트륨(NaOH) 200 ul 넣고 상온에 15분 방치한다. 96well에 15분 옮긴 뒤, micro plate 분광 광도계 (spectrophotometer, SUNLIZE, Tecan)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
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실시예
6>
웨스턴
블롯
분석(
Western
blot
analysis
)
시료를 12 시간 동안 처리한 B16 melanoma 세포를 용해 완충제(lysis buffer,50 mM Tris-HCl, pH 8.8, 150 mM NaCl2, 1%Triton X-100)로 용해하고 원심 분리하였다. 여기서 얻은 상층액을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)를 이용해 전기영동하고 이를 Polyvinylidene Fluoride(PVDF) membrane으로 이전 시켰다. 5 % 탈지유(skim milk)가 함유된 트리스(tris) 완충용액에서 1 시간 저지시키는(blocking) 과정을 거친 후, 티로시나아제 (Tyrosinase, Santa cruz biotechnology, sc-7833), 단백질 인산화효소 B(AKT, Santa cruz biotechnology, sc-8312), 종양괴사인자α(tumor necrosis factor α, TNF-α, Santa cruz biotechnology, sc-1351), phosphorylation of mammalian target of rapamycin (p-mTOR, Cell Signaling TECHNOLOGY, #2974), mammalian target of rapamycin (mTOR, Santa cruz biotechnology, sc-130865), β-actin (Santa cruz biotechnology, sc-47778) 항체와 각각 반응시켰다. 겨자무과산화효소 (Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 2차 항체 goat-anti rabbit(Santa cruz biotechnology, sc-2004), goat-anti mouse(Santa cruz biotechnology, sc-2005), mouse-anti goat(Santa cruz biotechnology, sc-2354) 를 가하고 enhanced chemi luminescent kit을 사용하여 1 ~ 3분 동안 반응시킨 후 X-ray 필름으로 현상하였다.
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실시예
7> 세포 활성산소 측정(
Intracellular
ROS
content
assay
)
유동세포계수법 (Flow cytometry analysis)을 이용하여 갈색거저리 추출물이 B16-F10세포의 ROS 농도에 영향을 주는지 알아보았다. 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA, Sigma Aldrich, 35845)를 30분간 처리하고 DCF-DA의 형광을 측정하여 세포 내 활성산소 (ROS) 농도를 측정하였다.
Claims (9)
- 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방용 의약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 갈색거저리 열수 추출물은 갈색거저리와 증류수를 1:2의 비율로 110℃의 온도에서 0.4kgf/cm3의 압력으로 15분동안 열수추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방용 의약 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 갈색거저리 열수 추출물은 갈색거저리와 증류수를 1:2의 비율로 110℃의 온도에서 0.4kgf/cm3의 압력으로 15분동안 열수추출하는 것을 특징으로 하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 화장품 조성물.
- 삭제
- 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 기능성 식품 조성물.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160140309A KR101916531B1 (ko) | 2016-10-26 | 2016-10-26 | 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160140309A KR101916531B1 (ko) | 2016-10-26 | 2016-10-26 | 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180045675A KR20180045675A (ko) | 2018-05-04 |
| KR101916531B1 true KR101916531B1 (ko) | 2018-11-07 |
Family
ID=62199699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160140309A KR101916531B1 (ko) | 2016-10-26 | 2016-10-26 | 갈색 거저리 (Tenebrio molitor) 추출물을 유효성분으로 함유하는 백화증 예방 및 흑모 생성 촉진용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101916531B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210122953A (ko) | 2020-04-01 | 2021-10-13 | 오원 | 갈색거저리 사료 및 이의 제조방법 |
-
2016
- 2016-10-26 KR KR1020160140309A patent/KR101916531B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Eur. Jo. Biochem. Vol. 267, pp3695-3703. (2000).* |
| KOREAN SOCIETY OF APPLIED ENTOMOLOGY |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210122953A (ko) | 2020-04-01 | 2021-10-13 | 오원 | 갈색거저리 사료 및 이의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180045675A (ko) | 2018-05-04 |
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