CN112881357A - 一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法及应用。该方法通过温度压力应激制造果蝇肠道活性氧（ROS）上升模型，然后给该模型饲喂功能食品或药物，解剖肠道进行ROS荧光探针二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）的染色，评估ROS水平的变化。通过本发明建立的模型和评估手段，具有操作简单，可重复性强的优点，可用于大规模研究筛选功能食品或者药物的抗氧化作用，具有很好的应用前景。

Description

一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法及应用。
背景技术
氧化应激是由细胞和组织中的活性氧（ROS）的产生和积累与生物系统解毒这些产物的能力之间的不平衡引起的现象。氧离子、过氧化物和含氧自由基等是常见的ROS，它们通常是由生物系统代谢产生的副产物，可以发挥多种生理作用，如细胞信号传导。诸如蛋白质磷酸化，多种转录因子的激活，细胞凋亡，免疫力和分化等过程都取决于适当的ROS产生。ROS在细胞内的存在需要保持在较低水平，当ROS产量增加时，它们会对重要的细胞结构（如蛋白质，脂质和核酸）产生有害作用。大量证据表明，氧化应激可能在多种疾病（例如，癌症，糖尿病，代谢紊乱，动脉粥样硬化和心血管疾病）的发作和/或发展中起着不同程度的重要作用。环境压力因素（如紫外线，电离辐射，污染物和重金属）和异生物素（如抗生药）也会大大增加ROS的产生，从而导致细胞和组织损伤（氧化应激）。尽管氧化应激在临床上有用作治疗诸如癌症等一些疾病，并取得一定程度的临床成功，但是大家还是倾向于将氧化应激描述为对人体有害。
抗氧化剂是抑制氧化的化合物，抗氧化剂可以预防或减缓ROS，减少其对细胞造成的损害。功能性食品（Functional food）是指具有特定营养保健功能的食品，即适宜于特定人群食用，具有调节肌体功能，不以治疗为目的的食品。许多功能性食品都含有抗氧化剂，如果一个人定期食用这些食品，它们可能会增加其抗氧化水平，从而有可能帮助预防因氧化应激而引起的损害。有些功能性食品甚至可以将天然抗氧化剂添加到食品中，以代替合成产品。这些抗氧化剂可以增强内源性抗氧化剂系统的活性，从而提供针对氧化应激的额外保护。多年来也已经开发了多种抗氧化类药物，它们对氧化应激具有实际或假定的有益作用，例如常见的维生素E，类黄酮和多酚。但是，如何在活体动物系统中快捷有效地评价功能性食品或药物的抗氧化能力一直是个重要的问题。因此，本发明提供了一种快速制造ROS上升的活体动物模型的方法，同时公布了一种在该ROS上升动物模型上快捷检测功能性食品或药物抗氧化能力的方法。通过本发明建立的模型和抗氧化评估方法，能够快捷有效地评估功能食品或者药物的抗氧化能力，操作简单，可重复性强，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是快速建立ROS升高的活体动物模型，并提供一种活体检测功能食品抗氧化能力的方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
通过温度压力应激制造果蝇肠道活性氧上升模型：收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇（Canton-S）雄虫60只，分为两组，处理组放在添加功能食品或药物的果蝇食物中，对照组为正常食物（未添加功能食品或药物的果蝇食物），然后置于37℃培养箱中热激处理15小时后取出。
测定方法：然后按照肠道ROS水平检测方法进行DHE染色并拍照，用ImageJ（https://imagej.net/）荧光强度分析软件获取荧光强度数值，并分析处理组和对照组的荧光差异得到所测物质抗氧化能力的强弱。其中荧光强度越强，代表ROS水平越高；荧光强度越低，代表抗氧化能力越强。
所述肠道ROS水平检测：配制60 µmol/L浓度的DHE（Sigma，货号37291）染色液；在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖盘中解剖出果蝇中肠，放入带PBS缓冲液的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；吸干PBS缓冲液，加入DHE染色液，避光室温（25℃）染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度，荧光强度越强，ROS水平越高。
本发明的优点在于：
本发明所构建的ROS升高果蝇模型的一个特点是快速而且稳定。特点之二是饲喂方式简便，筛选工作相对快捷，可以快速地进行大量的筛选。
附图说明
通过以下实例结合附图所作的详细描述，可以更清楚地理解本发明的目的、优点及特征。实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
图1 温度压力应激制造果蝇肠道活性氧上升模型。
图2 蜂王浆抗氧化作用。
图3 褪黑素抗氧化作用。
图4 硫辛酸抗氧化作用。
图5 技术流程图。
具体实施方式
实施例1
温度应激处理制造ROS上升的果蝇模型
通过温度压力应激制造果蝇肠道活性氧上升模型：收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇（Canton-S）雄虫30只，放在正常食物中，然后置于37℃培养箱中处理15小时后取出（过久可能引起果蝇死亡）。
正常食物为含有0.75%大豆粉（g/ml）、4.5%玉米粉（g/ml）、1.5%酵母（g/ml）、0.5%丙酸（v/v）、0.1%尼泊金甲酯（g/ml）、0.02%玉米糖浆（v/v）、1.25%蔗糖（g/ml）、1.25%葡萄糖（g/ml）、0.5%琼脂（g/ml）的食物。
肠道ROS水平检测：
将1 mg DHE（Sigma，货号37291）溶解在1 mL的DMSO中，配制成3 mmol/L的母液，取20 µL溶于1 mL的PBS中得到60 µmol/L浓度DHE染色液，现配现用，需避光；
在含有磷酸盐缓冲液（PBS：用800 mL蒸馏水溶解 8 g NaCl，0.2 g KCl, 1.44 gNa2PHO4和0.24 g KH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1 L，高压蒸汽灭菌，室温保存）的解剖盘中解剖出果蝇中肠（在解剖前，果蝇迅速冰冻至死，然后进行解剖），放入带PBS的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；
吸干PBS缓冲液 ，加入DHE染色液，避光室温（25℃）染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；
用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；
盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度，如图1所示：经过温度应激处理后，果蝇中肠的ROS水平升高，荧光强。
实施例2
蜂王浆抗氧化作用
对蜂王浆的抗氧化作用进行分析。具体方案：首先，配制含有蜂王浆的食物，新鲜蜂王浆以终质量分数20%的量掺入含有0.75%大豆粉（g/ml）、4.5%玉米粉（g/ml）、1.5%酵母（g/ml）、0.5%丙酸（v/v）、0.1%尼泊金甲酯（g/ml）、0.02%玉米糖浆（v/v）、1.25%蔗糖（g/ml）、1.25%葡萄糖（g/ml）、0.5%琼脂（g/ml）的食物中。对照为正常食物（即不添加新鲜蜂王浆的食物）。
收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇（Canton-S）雄虫60只，分为两组，处理组放在添加蜂王浆的果蝇食物中，对照组为正常食物，然后置于37℃培养箱中热激处理15小时后取出。然后按照肠道ROS水平检测方法进行DHE染色并拍照，用ImageJ（https://imagej.net/）荧光强度分析软件获取荧光强度数值，并分析处理组和对照组的荧光差异得到所测物质抗氧化能力的强弱。其中荧光强度越强，代表ROS水平越高；荧光强度越低，代表抗氧化能力越强。
所述肠道ROS水平检测：配制60 µmol/L浓度的DHE（Sigma，货号37291）染色液；在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖盘中解剖出果蝇中肠，放入带PBS缓冲液的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；吸干PBS缓冲液，加入DHE染色液，避光室温（25℃）染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度。
检测结果如图2所示，添加蜂王浆组的荧光强度低，表明蜂王浆具有降低ROS产生的能力。
实施例3
褪黑素抗氧化作用
对褪黑素的抗氧化作用进行分析。具体方案：首先，配制含有褪黑素（上海生工生物，货号A600605）的食物，褪黑素以终浓度为100μg/mL的量掺入含有0.75%大豆粉（g/ml）、4.5%玉米粉（g/ml）、1.5%酵母（g/ml）、0.5%丙酸（v/v）、0.1%尼泊金甲酯（g/ml）、0.02%玉米糖浆（v/v）、1.25%蔗糖（g/ml）、1.25%葡萄糖（g/ml）、0.5%琼脂（g/ml）的食物中。对照为正常食物（即不添加褪黑素的食物）。
收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇（Canton-S）雄虫60只，分为两组，处理组放在添加褪黑素的果蝇食物中，对照组为正常食物，然后置于37℃培养箱中热激处理15小时后取出。然后按照肠道ROS水平检测方法进行DHE染色并拍照，用ImageJ（https://imagej.net/）荧光强度分析软件获取荧光强度数值，并分析处理组和对照组的荧光差异得到所测物质抗氧化能力的强弱。其中荧光强度越强，代表ROS水平越高；荧光强度越低，代表抗氧化能力越强。
所述肠道ROS水平检测：配制60 µmol/L浓度的DHE（Sigma，货号37291）染色液；在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖盘中解剖出果蝇中肠，放入带PBS缓冲液的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；吸干PBS缓冲液，加入DHE染色液，避光室温（25℃）染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度。
检测结果如图3所示，添加褪黑素组的荧光强度低，表明褪黑素具有降低ROS产生的能力。
实施例4
硫辛酸抗氧化作用
对硫辛酸的抗氧化作用进行分析。具体方案：首先，配制含有硫辛酸（上海生工生物，货号A506197）的食物，硫辛酸以终浓度为2 mmol/L的量掺入含有0.75%大豆粉（g/ml）、4.5%玉米粉（g/ml）、1.5%酵母（g/ml）、0.5%丙酸（v/v）、0.1%尼泊金甲酯（g/ml）、0.02%玉米糖浆（v/v）、1.25%蔗糖（g/ml）、1.25%葡萄糖（g/ml）、0.5%琼脂（g/ml）的食物中。对照为正常食物（即不添加硫辛酸的食物）。
收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇（Canton-S）雄虫60只，分为两组，处理组放在添加硫辛酸的果蝇食物中，对照组为正常食物，然后置于37℃培养箱中热激处理15小时后取出。然后按照肠道ROS水平检测方法进行DHE染色并拍照，用ImageJ（https://imagej.net/）荧光强度分析软件获取荧光强度数值，并分析处理组和对照组的荧光差异得到所测物质抗氧化能力的强弱。其中荧光强度越强，代表ROS水平越高；荧光强度越低，代表抗氧化能力越强。
所述肠道ROS水平检测：配制60 µmol/L浓度的DHE（Sigma，货号37291）染色液；在含有磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖盘中解剖出果蝇中肠，放入带PBS缓冲液的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；吸干PBS缓冲液，加入DHE染色液，避光室温（25℃）染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度。
检测结果如图4所示，添加硫辛酸组的荧光强度低，表明硫辛酸具有降低ROS产生的能力。
所以，将待筛选的功能食品或药物掺在果蝇食物中进行饲喂，按照图5的大致步骤和技术的关键特征进行能食品或药物抗氧化能力检测的方案是可行的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法，其特征在于：添加功能食品或药物后，通过温度压力应激制造果蝇肠道活性氧上升模型，测定肠道活性氧的变化。
2.根据权利要求1所述的一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法，其特征在于：具体方法为：收集羽化后2-5日龄的野生型果蝇雄虫60只，分为两组，处理组放在含有添加功能食品或药物的果蝇食物中，对照组为未添加功能食品或药物的果蝇食物，然后置于37℃培养箱中热激处理，15小时后取出，按照肠道ROS检测方法进行DHE染色并拍照，用ImageJ荧光强度分析软件获取荧光强度数值，并分析处理组和对照组的荧光差异得到所测物质抗氧化能力的强弱。
3.根据根据权利要求2所述的一种活体检测功能食品或药物抗氧化能力的方法，其特征在于：所述肠道ROS检测方法：配制60 µmol/L浓度的DHE染色液；在含有PBS缓冲液的解剖盘中解剖出果蝇中肠，放入带PBS缓冲液的1.5 mL离心管中，解剖速度要快，控制在30分钟内；吸干PBS缓冲液，加入DHE染色液，避光室温染色10分钟；吸干DHE染色液，用 PBS 缓冲液快速清洗 3 次；用镊子夹取肠道于载玻片上，滴加抗荧光猝灭剂并混匀，将肠道摆放成易于观察的形状；盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边沿，在荧光显微镜下观察荧光强度，荧光强度越强，ROS水平越高；荧光强度越低，代表抗氧化能力越强。
4.如权利要求1所述方法在测定功能食品或药物抗氧化能力上的应用。
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