KR20190048618A - 초파리를 통한 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법 및 항산화 증진 방법 - Google Patents

초파리를 통한 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법 및 항산화 증진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초파리를 통한 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법 및 항산화 증진 방법에 관한 것으로서, (a)초파리의 알에 저선량 방사선을 조사하는 단계; (b)상기 저선량 방사선을 조사한 초파리의 알을 성체로 배양시키는 단계; (c)상기 초파리의 성체를 산화스트레스 환경에 노출시키는 단계; 및 (d)상기 산화스트레스 환경에 노출된 성체의 산화스트레스를 평가하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법과 저선량 방사선을 초파리의 알에 조사하여 항산화 활성을 증진시키는 초파리 항산화 증진 방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법에 의해 저선량 방사선과 산화스트레스간의 관계를 파악할 수 있고 기초 연구 자료를 제공할 수 있으며 초파리에게 저선량 방사선 조사시 산화스트레스 환경에서도 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있는 효과가 있다.

Description

초파리를 통한 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법 및 항산화 증진 방법{The method of analysis of antioxidative effect of low doses of radiation on drosophila and promotion of antioxidants}
본 발명은 초파리를 통한 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법 및 항산화 증진 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 저선량 방사선을 조사하여 초파리의 항산화 능력을 증진시키고 이에 따른 저선량 방사선의 항산화 효과를 분석하는 방법에 관한 것이다.
최근 100 mSv이하의 저선량방사선 조사에 의해 개체성장을 촉진시킬 수 있는 가능성 뿐만 아니라 초파리의 수명 연장 효과를 확인한 연구 결과가 다수 발표되고 있다.(Zhikrevetskaya et al., (2015) PLoS One, Seong et al., (2011) Biogerontology, Moskalev, (2007) Biogerontology). 초파리는 약 2~3개월의 짧은 수명을 가지기 때문에 노화 연구의 모델로서 가치가 높기 때문에 다양한 생물학 연구에 주로 활용된다.(Partridge et al., (2011) Exp. Gerontol.)
노화의 주된 원인 중 하나인 산화스트레스는, 노화 뿐 아니라 알츠하이머병과 같은 노인성 질환의 대표적인 환경적 요인으로 지목되고 있다.(Moskalev, (2007) Biogerontology, Finkle & Hobrook, (2000) Nature) 산화스트레스란 인체의 에너지 생성과정에서 체내 활성산소가 급격히 증가하여 인체내 산화 균형이 무너진 상태를 의미하며 이는 현대인들의 식습관과 생활환경으로 인해 다수 발현되고 있는 문제점 중 하나이다. 그 결과 산화스트레스로 인해 단백질 및 세포소기관의 산화적 손상을 방지하기 위해 단백질 항상성 유지의 중요성이 대두되고 있다.
초파리를 이용한 실험에 있어서 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2) 혹은 파라쿼트(Paraquat) 등을 첨가한 배지로 산화스트레스 환경을 유도할 수 있다. 상기한 환경에서 초파리의 항산화 반응을 확인할 수 있는 실험 방법은 앞서 보고된 바 있다. (Sohal, (1996) Science, Biteau et al., (2011) Exp. Gerontol.)
다만, 상기한 바와 같이 저선량 방사선에 의해 초파리의 수명이 증가하였다는 보고는 다수 있으나, 노화의 주된 원인으로 여겨지는 산화스트레스와 저선량방사선의 연관성에 대한 연구는 아직 이루어지지 않아 초파리 실험 모델에서 저선량 방사선 조사와 산화스트레스 유도를 동시에 진행한 연구 사례가 부족하다. 그 결과 방사선 조사 시기 및 적정 선량, 산화스트레스 유도시간 등 기초 자료가 부족하여 유사한 연구과제 해결에 있어서도 어려움이 있다.
Zhikrevetskaya et al., (2015) PLoS One Seong et al., (2011) Biogerontology Moskalev, (2007) Biogerontology Finkle & Hobrook, (2000) Nature Sohal, (1996) Science Biteau et al., (2011) Exp. Gerontol. Partridge et al., (2011) Exp. Gerontol. Hwang et al., (2013) PLoS Genet. Chaudhuri et al., (2007) J. Neurosci. Ma et al., (2016) Int. J. Mol. Med. Saberi et al., (2008) Am. J. Physiol. Cell Physiol.
본 발명의 목적은, 초파리의 알에 저선량 방사선을 조사함으로써, 항산화 효과를 증진시켜 노화를 방지함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 저선량 방사선의 항산화 효과 분석 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a)초파리의 알에 저선량 방사선을 조사하는 단계; (b)상기 저선량 방사선을 조사한 초파리의 알을 성체로 배양시키는 단계; (c)상기 초파리의 성체를 산화스트레스 환경에 노출시키는 단계; 및 (d)상기 산화스트레스 환경에 노출된 성체의 산화스트레스를 평가하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 (a)단계는 0.01 내지 0.2 Gy의 저선량 방사선을 조사하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면 상기 (c)단계의 산화스트레스 환경은 1%이하의 과산화수소를 포함한 배지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 일실시예에 따르면 상기 (d)단계의 산화스트레스 평가는 초파리의 생존율, 운동성, 체내 활성산소종 축적량 및 AKT/p70S6K 단백질의 활성화 중 적어도 하나 이상을 측정하여 평가하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 저선량 방사선을 초파리의 알에 조사하여 항산화 활성을 증진시키는 초파리 항산화 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 저선량 방사선은 0.01 내지 0.2 Gy 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법에 의해 저선량 방사선과 산화스트레스간의 관계를 파악할 수 있고 그를 이용하여 산화스트레스로 인한 다양한 질환의 치료법을 고안해낼 수 있다. 또한 산화스트레스 방어 효과 검증을 위한 산화스트레스 평가 방법 등 기초 연구 자료를 제공할 수 있는 효과가 있다.
이와 더불어 초파리에게 저선량 방사선 조사시 산화스트레스 환경에서도 항산화 효과가 있다.
도 1은 산화스트레스 환경에서 초파리 생존율을 도시한 것이다.
도 2는 산화스트레스 환경에서 초파리 운동성을 도시한 것이다.
도 3은 산화스트레스 환경에서 초파리 체내 ROS 축적량을 도시한 것이다.
도 4는 산화스트레스 환경에서 AKT 및 p70S6K의 활성화를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따르면 (a)초파리의 알에 저선량 방사선을 조사하는 단계; (b)상기 저선량 방사선을 조사한 초파리의 알을 성체로 배양시키는 단계; (c)상기 초파리의 성체를 산화스트레스 환경에 노출시키는 단계; 및 (d)상기 산화스트레스 환경에 노출된 성체의 산화스트레스를 평가하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법을 제공한다.
상기 (a)단계에서 야생형 초파리(Oregon R)의 알(embryo)에 저선량방사선을 조사한다. 바람직하게는 0.01 내지 0.2Gy의 저선량 방사선을 조사하고 더욱 바람직하게는 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사한다.
상기 (b)단계에서는 상기 (a)단계에서 방사선을 각각 조사한 초파리의 알을 25℃ 인큐베이터에서 성체가 될 때까지 배양하였다.
상기 (c)단계에서는 상기 초파리의 성체 중 수컷 초파리를 산화스트레스 환경에 노출시킨다. 상기 산화스트레스 환경이란 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2) 혹은 파라쿼트(Paraquat)를 첨가한 배지내 환경을 의미한다. 파라쿼트의 경우 배지 내 농도가 20mmol/L일 수 있고, 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)의 경우 1 %이하일 수 있다. 산화스트레스 환경의 배지에 초파리 성체를 10 내지 20 마리/vial의 비율로 첨가한다. 바람직하게는 생존율 측정시 약 9일동안, 운동성 및 AKT/p70S6K(AKT 혹은 p70S6K) 단백질의 활성화 측정시 72시간 동안, 체내 활성산소종 축적량 측정시 0 내지 72시간 동안 초파리 성체를 산화스트레스 환경에 노출시키며 측정하였다.
상기 (d)단계에서 성체의 산화스트레스를 평가한다. 산화스트레스 평가는 초파리의 생존율, 운동성, 체내 활성산소종(ROS) 축적량 및 AKT/p70S6K 단백질의 활성화 중 적어도 하나 이상을 측정하여 평가할 수 있다.
도 1에서 산화스트레스 환경에서의 초파리 생존율을 도시한다. 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사한 경우 저선량 방사선을 조사하지 않을 때에 비해 초파리의 생존율이 높은 것을 확인할 수 있다. 이는 저선량 방사선에 의해 초파리가 산화스트레스에 대한 저항성을 가지게 됨을 의미한다. 반면 10 Gy의 고선량 방사선을 조사한 경우 방사선을 조사하지 않을 때보다 생존율이 낮아졌다. 이는 고선량 방사선을 조사하면 조사하지 않을 때보다 초파리가 산화스트레스에 더 취약해짐을 유추할 수 있다.
도 2는 산화스트레스 환경 내의 초파리의 운동성을 도시한 것이다. 상기 초파리 생존율 실험과 동일하게 저선량 방사선 조사 후 배양한 성체 초파리 중 수컷을 72시간 동안 산화스트레스 환경에 노출시킨다. Climbing ability test 방법을 이용하여 각 초파리의 운동성을 측정하였다. 산화스트레스 환경 내에서 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사한 경우 초파리의 climbing ability는 대략 68%로 저선량 방사선을 조사하지 않은 경우의 climbing ability인 약 48%에 비해 개선됨을 확인할 수 있다. 이는 산화스트레스가 없는 환경에서의 climbing ability인 약 78%와 유사하다. 반면 10 Gy의 고선량 방사선을 조사한 경우 방사선을 조사하지 않을 때보다 운동성이 낮아짐을 확인할 수 있다.
도 3은 산화스트레스 환경에서 초파리 체내 활성산소종(ROS-Reactive Oxygen Species)의 축적량을 도시한 것이다. ROS는 노화의 주된 원인으로 지목되고 있는 원인 중 하나이다. 이러한 ROS의 초파리 체내 축적량을 DCF-DA microplate assay를 통해 측정하였다. 산화스트레스 환경에 노출된 시간대별로 ROS 축적량을 비교한 결과 0.05 Gy의 저선량 방사선을 조사한 경우, 산화스트레스에 의한 체내 ROS 축적이 지연되는 것을 확인할 수 있다.
산화스트레스 환경에서 저선량 방사선의 신호전달경로를 확인하기 위해 Cell survival 신호 단백질인 AKT(단백질인산화효소B)와 p70S6K의 활성화 즉 인산화 정도를 비교, 분석하였다. AKT와 p70S6K 단백질은 산화스트레스에 의해 활성도가 감소되기 때문이다. 분석결과는 도 4에서 확인할 수 있다. 산화스트레스 환경에서도 0.05Gy의 저선량 방사선을 조사한 경우 p-AKT, p-p70S6K로 인해 신호전달경로가 활성화 됨을 알 수 있다.
상기 산화스트레스 평가를 통해 저선량 방사선 조사시 산화스트레스에 대한 초파리의 저항성 증진 효과 즉 항산화 증진 효과를 확인할 수 있었다. 또한 저선량 방사선에 의한 산화스트레스 방어 기작에 AKT 신호 기작이 연관되어 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 저선량 방사선의 항산화 효과 분석
6시간 이하의 야생형 초파리(Oregon R)의 알(embryo)에 각각 저선량방사선 0.05 Gy와 고선량방사선 10 Gy(137Cs, 0.0159 Gy/s)를 조사하였다.
상기 방사선을 조사한 초파리의 알을 25℃ 인큐베이터에서 성체가 될 때까지 배양한다.
1% 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 포함한 배지로 산화스트레스와 유사한 환경을 유도한다. 성체 수컷 초파리를 1% 과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 포함한 배지로 옮겨 72시간동안 노출시킨다(20마리/vial).
산화스트레스 환경에서의 초파리 생존율, 운동성, 체내 활성산소종 축적량, AKT/p70S6K 단백질의 활성화를 측정한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. (a)초파리의 알에 저선량 방사선을 조사하는 단계;
    (b)상기 저선량 방사선을 조사한 초파리의 알을 성체로 배양시키는 단계;
    (c)상기 초파리의 성체를 산화스트레스 환경에 노출시키는 단계; 및
    (d)상기 산화스트레스 환경에 노출된 성체의 산화스트레스를 평가하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법.

  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (a)단계는 0.01 내지 0.2 Gy의 저선량 방사선을 조사하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 (c)단계의 산화스트레스 환경은 과산화수소를 포함하되, 1% 이하의 과산화수소를 포함한 배지인 것을 특징으로 하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 (d)단계의 산화스트레스 평가는 초파리의 생존율, 운동성, 체내 활성산소종 축적량 및 AKT/p70S6K 단백질의 활성화 중 적어도 하나 이상을 측정하여 평가하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선의 항산화 효과 분석방법.
  5. 저선량 방사선을 초파리의 알에 조사하여 항산화 활성을 증진시키는 초파리 항산화 증진 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 저선량 방사선은 0.01 내지 0.2 Gy 인 것을 특징으로 하는 초파리 항산화 증진 방법.

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