CN111944738A - 一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用 - Google Patents

一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用。该猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法为：通过AAPH诱导猪上皮细胞持续产生稳定的内源性的自由基，检测细胞氧化损伤程度，并确定氧化损伤的应激模型；其中，本发明通过一系列试验确定了构建AAPH诱导的猪小肠上皮细胞氧化应激模型的最适浓度，通过建立的这个氧化应激模型，评估氧化损伤，为进一步深入研究氧化应激对动物肠道健康影响提供了方便且稳定的肠上皮细胞模型，这对维护人类健康、减少畜牧业生产上由于氧化应激造成的直接损失和间接损失有重要意义。

Description

一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞模型建立技术领域，尤其涉及一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用。
背景技术
近年来，随着我国畜牧养殖业的飞速发展，畜禽应激反应的问题日趋严重。大量的研究表明，畜禽应激会引发多种疾病，严重制约了养殖业的发展。在养殖过程中，许多因素如环境变化、营养缺乏、微量元素缺失、多不饱和脂肪酸摄入过高、化学药品使用等都可能导致畜禽产生氧化应激(oxidative stress,OS)。在氧化应激状态下，畜禽体内氧自由基产生及清除机制之间的动态平衡被破坏，细胞内积累大量的活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)，破坏细胞正常结构、影响细胞正常功能。长时间的应激使动物体内ROS进一步增加，动物生长性能下降，免疫系统受损，抵抗力下降，从而诱发应激综合症、引起畜禽疾病和死亡。有报道显示，畜禽疾病、死亡造成的直接经济损失在发达国家和发展中国家年交易额中的占比分别高达17％和35％以上。
肠道系统具有机体最大的黏膜表面，由能够持续自我更新的单层肠上皮细胞构成，是肠道微环境和黏膜免疫系统之间的屏障，一定程度上保护机体免受肠道内有毒物质和外界环境的伤害。肠黏膜屏障通过肠上皮细胞感受和响应外界刺激，是机体抵御潜在有害微生物和抗原的第一道防线，也是机体应激状态下最早和最易受到氧化损伤的器官。饮食、药物、病原体、环境变化等应激因素会刺激肠上皮细胞和免疫细胞产生大量的ROS和促炎症介质，破坏肠上皮稳定，导致肠黏膜屏障受损，引发炎症性肠病、消化系统退行性疾病甚至是癌症。
因此，肠上皮细胞是研究猪肠道氧化应激的理想模型。猪上皮细胞IPEC-J2是来自新生猪空肠的细胞系，可引起对内毒素的强烈反应和氧化应激源，使该细胞系成为研究上皮细胞对炎症和氧化应激的反应合适的体外模型。
目前构建肠上皮细胞氧化应激模型，有动物模型和体外细胞模型两种方法，但与体外细胞模型相比，采用动物模型往往会存在一些不便与局限。首先，当今社会日益关注动物福利，实验中需要使用大量动物做试验，试验时难免会给动物带来痛苦，不符合动物福利的要求；其次，肠道内部复杂的环境，动物模型无法清楚直观地判断是氧化应激还是过肠道菌群转化或者其他原因影响了上皮细胞，具有很大的不确定性；而且，构建动物模型如要获得稳定的统计数据，试验成本会较大，因为要数据稳定通常需要充足的样本量，实验过程中的工作也相对细胞模型繁琐，试验周期也较长，还需要大量熟悉采样的工作者进行采样，成本让部分研究者难以承担；又因为动物氧化应激模型基本都是全身性的，现如今体内实时监控技术还未发展成熟，构建动物实验的氧化应激模型无法准确地实时测定肠中的ROS含量,不利于得到准确的实验结果。细胞模型相比动物氧化应激模型具有较多优点，第一，可直接测定细胞活力、活性氧含量等；第二，因细胞实验具有针对性，细胞模型得到的结果准确性和稳定性都较高，可重复性强，可多次重复实验直至得到好的实验结果，试验成本也相对较低；第三，细胞模型还可直接研究肠道菌群、评定营养物质跨膜运输水平、方便监测肠道细胞在应激状态下的情况等。构建肠道细胞模型，能解决动物模型研究的成本高、不稳定、难以进行机理研究等问题，是建立肠上皮细胞氧化应激模型首选的方法。
氧化应激模型可以分为两类，其中一类是引入外源性物质或外源性自由基的药物致使机体氧化应激。另一类是通过刺激，诱导内源性的自由基产生，而导致机体氧化应激。常用直接释放自由基的药物建立氧化应激模型，如硝酸甘油、过氧化氢、博来霉素、AAPH、臭氧等。
过氧化氢是能直接释放自由基的物质，在透过细胞膜与细胞内铁离子时产生芬顿反应形成高活性的自由基，是易于获得、且在体内分解为单一的自由基氧化剂，被广泛使用的建立氧化应激模型。但氧化氢稳定性差，相对易降解，致使实验中重复性较差，而且试剂不可长期保存，在商业试剂盒中较少使用过氧化氢。
臭氧是可以直接作用于生物体，通过与DNA相互作用直接引起DNA功能障碍，使DNA复制受影响的一种强氧化剂，似乎是建立氧化应激模型一个很好的物质，但因臭氧是气体，使用臭氧建立氧化应激模型对实验操作以及环境条件要求较高，因此限制了其使用范围，并非理想的氧化应激造模剂。
还有一些可以通过释放自由基发挥作用的临床药物也可以用于建立氧化应激模型，如博来霉素和硝酸甘油等，但这些药物的稳定性有所欠缺，所以不是建立稳定的氧化应激模型最理想的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用，旨在解决现有常用直接释放自由基的药物在建立细胞氧化应激模型的过程中所存在的如背景技术中描述的各种问题。
本发明是这样实现的，一种猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法，该方法为：通过AAPH诱导猪上皮细胞持续产生稳定内源性的自由基，检测细胞氧化损伤程度，并确定氧化损伤的应激模型。
优选地，所述通过AAPH药物刺激并诱导猪上皮细胞产生内源性的自由基具体包括以下步骤：
(1)将AAPH药物用双抗完全培养基稀释，得到浓度为30～34mM的为诱导溶液；
(2)将传代后的细胞用双抗完全培养基稀释为细胞悬液，将100μL细胞悬液接种在培养孔并培养24h；
(3)往培养孔加入100μL所述诱导溶液培养24h，其中，细胞悬液的细胞密度为2×104/孔。
优选地，所述诱导溶液中AAPH药物浓度为30mM。
优选地，所述细胞氧化应激损伤程度的检测指标包括细胞活力、细胞活性氧ROS含量、细胞mtDNA拷贝数变化、细胞增殖量。
本发明进一步公开了上述方法得到的猪上皮细胞氧化应激模型。
本发明进一步公开了上述猪上皮细胞氧化应激模型在筛选缓解肠道氧化应激物质中的应用。
本发明进一步公开了上述猪上皮细胞氧化应激模型在研究肠道氧化应激的作用机理中的应用。
在畜牧生产中，氧化应激会对动物产生诸多不良影响，特别是在胃肠道中，强烈的氧化应激会引发炎症、胃肠道功能紊乱甚至癌症等诸多胃肠道系统疾病，影响营养物质的消化和吸收，严重影响动物的正常生长和发育。本发明克服现有技术的不足，提供一种稳定的猪上皮细胞氧化应激模型及其建立方法及其应用，本发明以仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2为细胞模型，通过不同浓度的AAPH处理IPEC-J2细胞，建立AAPH诱导的猪肠上皮细胞氧化应激模型。该氧化应激模型的建立为深入研究肠道氧化应激的作用机理提供研究材料，并为进一步筛选缓解肠道氧化应激物质提供细胞模型。本发明所采用的是可以直接释放自由基的水溶性小分子偶氮类化合物AAPH，AAPH在生理温度下可直接分解为以下三类产生氮气和两种含碳的自由基：过氧化氢自由基、烷基自由基、烷氧基自由基，并且一部分碳自由基可以相互结合产生稳定产物，一部分可以与氧分子反应产生过氧自由基，由此可以保持持续稳定的水溶性自由基产生速率，使得在释放初期，AAPH会以稳定的速率释放，且分解半衰期长达175h，并最终利于建立稳定的氧化应激模型。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明通过一系列试验确定了构建AAPH诱导的猪小肠上皮细胞氧化应激模型的最适浓度，通过建立的这个氧化应激模型，评估氧化应激损伤，为进一步深入研究氧化应激对动物肠道健康影响提供了方便且稳定的肠上皮细胞模型，这对维护人类健康、减少畜牧业生产上由于氧化应激造成的直接损失和间接损失有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例中AAPH诱导对IPEC-J2细胞生长状态的影响；其中，图1A的AAPH浓度为0，图1B的AAPH浓度为24mM，图1C的AAPH浓度为30mM，图1D的AAPH浓度为36mM；
图2是本发明实施例中AAPH诱导对IPEC-J2细胞活力的影响，与对照组相比,***P<0.001；
图3是本发明实施例中AAPH诱导对IPEC-J2细胞增殖的影响；与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01，**P<0.01；
图4是本发明实施例中AAPH诱导对IPEC-J2细胞内活性氧(ROS)水平的影响，与对照组相比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；
图5是本发明实施例中AAPH诱导对IPEC-J2细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数的影响，本发明分别选取线粒体编码基因ND2、ND3、COX1和ATPase6用于定量分析，以保守的单拷贝核基因GCG作为内参基因，与对照组相比***P<0.001。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料和方法
1、主要材料
猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)、双抗完全培养基500ml：450ml高糖培养基DMEM+50ml胎牛血清FBS+5ml双抗(青霉素和链霉素)、基础DMEM、pH7.2的PBS、HBSS、0.25％Trypsin-EDTA、碧云天动物基因组DNA快速抽提试剂盒、碧云天活性氧检测试剂盒、碧云天EdU-488细胞增殖检测试剂盒、iTap Universal SYBR Green Supermix定量预混液、Cell CountingKit-8细胞增殖-毒性检测测试剂盒等。
其中，基础DMEM、pH7.2的PBS、HBSS均购于赛默飞市世尔(苏州)仪器有限公司；碧云天动物基因组DNA快速抽提试剂盒、碧云天活性氧检测试剂盒、碧云天EdU-488细胞增殖检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；Universal SYBR Green Supermix定量预混液购自Bio-Rad公司；Cell Counting Kit-8细胞增殖-毒性检测测试剂盒购于上海东仁化学科技有限公司。
2、主要仪器
5％CO2培养箱、显微镜、水浴锅、超净台、细胞计数器、普通移液器、加样枪、SpectraMAX M5酶联免疫检测仪、荧光定量PCR仪、SYNERGY H1多功能酶标仪等。
其中，SpectraMAX M5酶联免疫检测仪购自北京嘉鹏同创科技发展有限公司；荧光定量PCR仪购自新加坡Bio-Rad公司；SYNERGY H1多功能酶标仪购自美国Bio Tek公司。
3、猪上皮细胞(CCK-8细胞)活力检测
3.1、细胞处理
(1)将猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)进行复苏，培养细胞生长至80％～90％时进行细胞传代，后吸取10μL传代剩余的细胞液于细胞计数板中计算每mL细胞液中的细胞数量；
(2)细胞计数完毕，在加样槽中加入使用双抗完全培养基稀释的细胞，将细胞悬液接种在96孔板中(100μL/孔)，密度为1×104/孔，边缘孔加入等体积的PBS，置于培养箱中培养24h；
(3)在培养箱中培养24h后，称取适量AAPH药物并用双抗完全培养基稀释；
(4)本次试验也是药物浓度预试验，需要筛选药物最适浓度，把设计的AAPH浓度在加样槽内配好：22、24、26、28、30、32、34、36、38mM；
(5)使用加样枪小心去除孔内原液，除了不加AAPH试剂的CT对照孔外，每孔加入100μL相应浓度的AAPH溶液，再次放入培养箱中培养24h。
3.2、细胞活力检测
(1)配制CCK-8溶液：
细胞培养板在培养箱中培养24h后，使用双抗完全培养基以1：10的比例配制，避光操作，因考虑移液枪误差，实际孔数66孔，按70孔配制；配制CCK-8溶液的具体组分如表1所示：
表1CCK-8溶液组分表
Figure BDA0002573753170000071
配制完毕，使用加样枪小心把细胞板内原液吸出，每孔加入50μL CCK-8溶液，放于培养箱内孵育1h；
(2)孵育1h后，目测是否染色至橙色且溶于细胞，当呈橙色且溶于细胞，放于酶联免疫检测仪检测。
3.3、公式计算细胞活力
得出检测数据后，使用公式计算出细胞活力值，公式如下所示：
Figure BDA0002573753170000072
4、EdU-488细胞增殖检测
4.1、细胞处理
(1)在细胞传代完毕后，用双抗完全培养基稀释剩余细胞液；
(2)细胞计数后，将细胞悬液接种在98孔板中(100μL/孔)，密度为2×104/孔，边缘孔加入等体积的PBS，放入培养箱中培养24h；
(3)在培养箱中培养24h后，称适量AAPH药物并用双抗完全培养基稀释，配好所需AAPH的浓度：28、30、32、34mM；
(4)使用加样枪小心去除细胞板孔内原液，除了CT对照组和空白对照组外，每孔加入100μL配好的相应浓度的AAPH溶液，再次放入培养箱中培养24h。
4.2、细胞增殖检测
(1)配制2X的EdU工作液：
培养板放在培养箱中培养24h后，按说明书以1:1000比例配制，因考虑移液枪误差，实际孔数30孔，实际按34孔配制，如表2所示：
表2配制2X的EdU工作液组分表
Figure BDA0002573753170000081
(2)配好EdU后，使用加样枪小心把细胞板原液吸出，除空白孔外每孔加入50μLEdU，放培养箱中孵化2～3h；
(3)2～3h后取出细胞板并去除EdU液，关闭超净台抽风，每孔加入50μL固定液PFA，室温放置15min。
(4)去除固定液，用封闭液洗涤细胞3次，每次3～5min。
(5)洗涤完毕，加入通透液(50μL/孔)，室温放置10～15min。
(6)去除通透液，使用洗涤液洗涤细胞2次，每次3min，在最后一次洗涤细胞时关闭超净台灯光并开抽风，开始按说明书中的组分和体积配制所使用的细胞板孔数所需的量clik反应液，如表3所示：
表3配制clik反应液组分表
Figure BDA0002573753170000082
Figure BDA0002573753170000091
(7)配制完毕，去除洗涤液；
(8)加入clik反应液(50μL/孔)，轻轻摇晃细胞板确保反应混合物覆盖细胞，室温避光孵育30min；
(9)30min后，用PBS水洗涤3次，每次3～5min；
(10)洗涤完毕，使用Hoechst33342进行细胞核染色，室温避光孵育10分钟；
(11)光学显微镜下观察并拍摄图片。
4.3、细胞计数
把拍摄的细胞以及细胞核上传至ImageJ细胞计数软件进行细胞计数。在得出细胞数量数据后，使用公式计算出细胞增殖比例，公式如下所示：
细胞增殖比例＝细胞数/细胞核数。
5、细胞活性氧ROS检测
5.1、细胞处理
(1)细胞传代后，使用双抗完全培养基稀释细胞液，后进行细胞计数；
(2)细胞计数后，将细胞悬液接种在96孔黑板中(100μL/孔)，密度为2×104/孔，边缘孔加入等体积的PBS，置于培养箱中培养24h；
(3)在培养箱中培养24h后，称取适量AAPH药物并用双抗完全培养基稀释；
(4)已在预试验中筛选出药物最适浓度，此次试验需在加样槽内配好所需AAPH的浓度：28、30、32、34mM；
(5)小心去除孔内原液，除了对照孔不加AAPH试剂外，均加入相应浓度的AAPH溶液(100μL/孔)，再次置入培养箱中培养24h；
5.2、细胞活性氧ROS检测
(1)配制10μM/L的DCFH-DA
按说明书的比例1:1000配制，因考虑移液枪误差，实际孔数36孔，实际按40孔配溶液，如表4所示：
表4稀释DCFH-DA组分表
Figure BDA0002573753170000101
(2)显微镜观察细胞情况后，使用加样枪把细胞板内原液小心吸出，除了空白对照孔均加入50μL稀释好的DCFH-DA，培养箱孵化20min；
(3)配制阳性对照试剂Rosup，如下表5所示：
表5稀释Rosup组分表
Figure BDA0002573753170000102
(4)20min后用无血清DMEM清洗3次，每次3min；
(5)清洗完毕，在阳性对照孔内加入Rosup 50μL，其余孔均加50μL无血清DMEM，培养箱孵育20min；
(6)20min后，在酶联免疫检测仪检测荧光值。
5.3、公式计算细胞活性氧含量
得出检测数据后，使用公式计算出细胞活性氧含量，公式如下所示：
Figure BDA0002573753170000103
6、检测线粒体DNA拷贝数变化
6.1、细胞处理
(1)在细胞传代完毕后，使用双抗完全培养基稀释细胞液，后进行细胞计数；
(2)细胞计数后，将细胞悬液接种在48孔黑板中(150μL/孔)，密度为5×104/孔，培养箱中培养24h；
(3)24h后，称取适量AAPH药物并用双抗完全培养基稀释，配好所需AAPH的浓度：28、30、32、34mM；
(4)使用加样枪小心去除细胞板孔内原液，除了对照孔CT外，每孔加入150μL相应浓度的AAPH溶液，再次放入培养箱中培养24h。
6.2、细胞DNA抽提
使用碧云天动物基因组DNA快速抽提试剂盒。
(1)配制消化液
按30个样本数量在15mL离心管中配制消化液，因考虑移液枪误差，实际孔数30孔，实际按34孔配制，如表6所示：
表6配制消化液组分表
Figure BDA0002573753170000111
(2)消化液配制完毕后，准备30个1.5mL离心管并标记好；
(3)使用加样枪将细胞原液小心吸出，用HBSS清洗(100μL/孔)，后每孔加入50μL配制好的消化液(确保消化液浸没细胞)；
(4)显微镜下观察细胞完全消化脱落后，将细胞移至标记好的1.5mL离心管中；
(5)在55℃的干式恒温器中放置15min；
(6)再把干式恒温器调至95℃，放置5min；
(7)5min后，取出离心管，每管加入50μLStop Solution并混匀器中混匀，放于-20℃用于荧光定量PCR。
6.3、荧光定量PCR
(1)冰箱中取出装有细胞碎片的离心管，每管加入200μL灭菌超纯水稀释并混匀，13000g离心1～2min以沉淀消化的细胞碎片。
(2)用一个2mL离心管按反应体系配制反应混合物Mix，因考虑移液枪误差，实际孔数60孔，按66孔配制，如表7所示：
表7配制反应混合物Mix组分表
Figure BDA0002573753170000121
(3)配制完毕，放入高速混匀机里混匀，再放入离心机中短暂离心；
(4)在PCR板中加Mix15μL/孔，细胞样品5μL/孔(此步骤需在冰上操作)；
(5)加完Mix和细胞样品后，把PCR板在离心机中离心1分钟以混匀细胞样品与Mix，放入定量PCR仪中检测线粒体DNA拷贝数。
6.4、公式计算细胞线粒体DNA拷贝数
得出检测数据后，使用公式计算出细胞线粒体DNA拷贝数，公式如下所示：
Figure BDA0002573753170000122
7、数据分析
所得数据利用GraphPad.Prism.8.0软件中的单因素方差分析(One way ANOVA)，进行统计学分析，Tukey进行多重检验，数据表示为mean±SEM(n＝6)。*P<0.05时差异显著。
二、结果与分析
1、AAPH对细胞活力的影响
由图1可知，没有添加AAPH的对照组细胞基本正常贴壁生长，24mM AAPH试验组，细胞开始漂浮死亡，AAPH浓度为30mM时，细胞开始死亡脱落；AAPH浓度为36mM时，细胞大量死亡、脱落。表明，随AAPH浓度增加IPEC-J2细胞活力下降。
由图2可以看出，与对照组相比，AAPH浓度在22～28mM时，细胞活力逐渐上升，在浓度为26mM和28mM时差异显著；AAPH浓度在30～38mM时，细胞活力逐渐下降，与对照组相比，均差异显著(P<0.05)。由此，初步确定AAPH浓度30mM是造成细胞活力下降的剂量范围。
2、AAPH对细胞增殖的影响
由图3(A)可看出，与CT对照组相比，AAPH试验组细胞与细胞核数目随着AAPH浓度的升高而下降。图3(B)发现，与CT对照组相比，AAPH浓度在28mM～30mM时，细胞增殖率均显著下降，且具有明显的剂量依赖效应，但是30mM以后的增殖率相比浓度28mM至30mM稍有上升，初步估计是因为药物浓度的平台效应，药物浓度30mM以后达到了浓度平台效应，平台效应之后剂量效应减弱，但增殖率仍比没有加AAPH药物的对照组低，且统计结具有显著性差异。表明，外源添加AAPH浓度为28～34mM时，IPEC-J2细胞活性降低，增殖率下降。
3、AAPH对细胞活性氧ROS的影响
由图4可知，不同浓度的AAPH试验组ROS水平均显著高于对照组(P<0.05)，且ROS水平随着AAPH浓度的升高而增加。由此可见，AAPH可以显著诱导IPEC-J2细胞氧化应激，增加细胞内ROS水平。
4、AAPH对细胞线粒体DNA拷贝数的影响
由图5可知，与对照组相比，AAPH试验组细胞线粒体DNA(ND3、ND2、COX1、ATP)拷贝数均显著降低(P<0.001)，降低约50％。
由此推测，外源添加AAPH诱导IPEC-J2细胞发生氧化应激，进而导致细胞线粒体损伤，mtDNA拷贝数显著降低。
三、结论
本发明拟建立AAPH诱导的IPEC-J2细胞氧化应激模型，把细胞接种于细胞板上置于培养箱中培养24h后，在细胞板孔内加入不同浓度的AAPH药物，通过检测CCK-8细胞活力、细胞活性氧ROS含量、细胞mtDNA拷贝数变化、EdU-488细胞增殖等指标，分析AAPH对细胞活力、细胞ROS含量、细胞mtDNA数量的影响。以上检测结果表明，加了AAPH药物后，细胞的细胞活力以及细胞增殖率均下降；ROS含量升高；mtDNA拷贝数也下降，且所有试验结果显示在AAPH浓度30mM时变化显著。
进一步分析实验结果，在检测CCK-8细胞活力时，发现AAPH浓度在22～28mM时细胞活力有所上升，其中的原因可能是AAPH浓度在22～28mM时带来的异常ROS使细胞处于应激状态进而使细胞产生抗氧化酶，让细胞活力上升，而AAPH浓度30mM开始带来的异常ROS能使细胞受到氧化损伤，则细胞活力下降，所以初步确定AAPH浓度30mM是造成细胞活力下降的剂量范围，在检测细胞ROS含量时中发现，ROS含量随着AAPH药物浓度的升高而升高，结合细胞活力随着AAPH浓度升高而下降的实验结果，可以初步判定细胞活力随着AAPH浓度升高而下降的原因是AAPH会释放自由基，使活性氧浓度异常上升，DNA损伤无法正常复制，从而影响细胞正常生长繁殖，甚至死亡。
为了进一步验证AAPH诱导的氧化应激影响细胞活力，本发明做了EdU细胞增殖检测试验。在EdU细胞增殖检测试验中发现加了AAPH的实验组细胞增殖率随着AAPH浓度的升高而下降，且在AAPH浓度30mM时达到药物平台效应，再次证明AAPH会使细胞活性降低，AAPH浓度30mM是建立氧化应激模型的最适浓度。因细胞活力反映了细胞的损伤程度，所以细胞活力可作为细胞氧化应激损伤程度的考察指标。
以上所有试验的结果均表明AAPH会使细胞损伤，影响细胞活力和细胞活性氧含量以及mtDNA拷贝数变化，并且细胞损伤的程度有明显药物剂量效应，说明本研究成功建立了猪小肠上皮细胞氧化应激模型。
综上，本发明通过一系列试验确定了构建AAPH诱导的猪小肠上皮细胞氧化应激模型的最适浓度为30mM，通过建立的这个氧化应激模型，评估氧化应激损伤，为进一步深入研究氧化应激对动物肠道健康影响提供了方便且稳定的肠上皮细胞模型，这对维护人类健康、减少畜牧业生产上由于氧化应激造成的直接损失和间接损失有重要意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于，该方法为：通过AAPH诱导猪上皮细胞持续产生稳定内源性的自由基，检测细胞氧化损伤程度，并确定氧化损伤的应激模型。
2.如权利要求1所述的猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于，所述通过AAPH药物刺激并诱导猪上皮细胞产生内源性的自由基具体包括以下步骤：
（1）将AAPH药物用双抗完全培养基稀释，得到浓度为30~34 mM的为诱导溶液；
（2）将传代后的细胞用双抗完全培养基稀释为细胞悬液，将100μL细胞悬液接种在培养孔并培养24h；
（3）往培养孔加入100μL所述诱导溶液培养24h，其中，细胞悬液的细胞密度为2×104/孔。
3.如权利要求2所述的猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于，所述诱导溶液中AAPH药物浓度为30mM。
4.如权利要求1所述的猪上皮细胞氧化应激模型的建立方法，其特征在于，所述细胞氧化应激损伤程度的检测指标包括细胞活力、细胞活性氧ROS含量、细胞mtDNA拷贝数变化、细胞增殖量。
5.权利要求1~4任一项所述方法得到的猪上皮细胞氧化应激模型。
6.权利要求5所述的猪上皮细胞氧化应激模型在筛选缓解肠道氧化应激物质中的应用。
7.权利要求5所述的猪上皮细胞氧化应激模型在研究肠道氧化应激的作用机理中的应用。
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