CN110904185A - 一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒 - Google Patents

一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，属于畜禽疾病体外诊断技术领域，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和显色指示剂；所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯；将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。采用本发明提供的试剂盒能够根据颜色判断鸭致病菌对药物是否敏感，所需时间不超过13h。

Description

一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试 剂盒
技术领域
本发明属于畜禽疾病体外诊断技术领域，尤其涉及一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒。
背景技术
鸭细菌性疾病一直是养鸭业面临的严重问题，给养鸭业造成了严重的经济损失，并随着集约化程度提高而危害逐渐加大。鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌感染是目前鸭养殖中常见的细菌性传染病，在实际生产中常以原发或继发于其他疾病出现，且往往存在两种甚至三种细菌的混合感染。且这些细菌的血清型均非常多，各血清型之间一般缺乏交叉保护作用，这给疫苗防控带来了困难，使用抗菌药物仍然是预防和治疗鸭细菌性疾病的主要手段。但由于鸭养殖中抗菌药物的滥用，细菌耐药性问题也越来越严重，细菌产生耐药的周期愈来愈短，耐药谱愈来愈宽，给养殖者合理选择药物造成了很大的障碍。
体外抗菌药物敏感性试验(简称药敏试验)是指导临床合理选择药物不可缺少的试验手段。目前常规药敏试验方法是纸片扩散法和肉汤稀释法，虽然这些方法原理比较简单，其试验过程及结果判断也被标准化，但是其最大缺陷在于操作繁琐、耗时较长。常规的药敏试验方法从细菌分离到获得药敏试验结果一般需要2-3天。鸭细菌性疾病一般发病急，传染快，在等待药敏试验结果的过程中，鸭可能已发生大面积发病和死亡。此外，鸭细菌性疾病混合感染的情况非常普遍，分离细菌后再作常规药敏试验，可能会漏掉部分感染菌的药敏试验结果。在生产实际中，往往不需要作细菌分离鉴定，而只需要知道鸭感染的细菌对哪种药物敏感，然后选择敏感药物进行紧急治疗。然而目前很少见到直接使用病料进行药敏快速检测的方法，主要原因是无法克服病料组织对检测的干扰。
过去，人们一直在探索建立快速药敏试验检测方法，这些方法主要包括基于细菌还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)还原刃天青显色方法、基于检测活体细菌活性氧含量的化学发光法、基于检测活体细菌三磷酸腺苷 (ATP)含量的生物发光法、基于检测耐药基因的PCR检测方法、基于检测耐药基因的微阵列杂交成像方法、基于检测耐药相关酶的免疫层析方法、基于检测耐药相关酶的质谱法，流式细胞光度法等。但是这些方法或者需要配备专门的仪器，或者操作繁琐、耗时长，或者检测成本过高，不能满足兽医临床对药敏试验方法具有简便、快速、经济特性的需要。所以开发出一种无需进行细菌分离鉴定，直接进行药敏检测，且操作简便、快速的药敏检测试剂盒势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，采用本发明提供的试剂盒能够根据颜色判断鸭致病菌对药物是否敏感，所需时间不超过13h。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和显色指示剂；
所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和 0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯；
将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
优选的，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的的浓度为0.5～1.5mg/mL。
优选的，所述灭菌培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤。
优选的，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量为8～12mL。
优选的，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。
优选的，所述抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素 4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素 2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
优选的，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种。
优选的，所述无菌透明EP管的容量为1.5mL。
优选的，所述显色指示剂含有1.2mM的碘硝基氯化四氮唑和0.2mM的吩嗪硫酸甲酯。
本发明提供了一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的灭菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和显色指示剂；所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯；将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的药物的敏感性折点。
本发明的试剂盒检测鸭致病菌对抗菌药物的敏感性的机理：
本发明依据活体微生物细胞产生NADH，并在微生物细胞内以NADH 为底物的脱氢酶作用下，将四氮唑盐(INT)还原成有色的不溶性的四氮唑甲臜(PMS)的原理，通过四氮唑甲臜的生成量(颜色深浅)反映出微生物活体细胞数量，从而反映出抗菌药物对被检测微生物的敏感性。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的药敏快速检测试剂盒能够同时对临床上鸭常见致病菌的药物敏感性进行检测，无需繁琐的细菌分离鉴定步骤，简化了常规药敏试验的操作流程。
(2)本发明的药敏快速检测试剂盒仅根据颜色变化即可判定试验结果，无需特殊的仪器设备，操作简便，使用方便，特别适合于基层兽医诊疗机构和养殖场使用。
(3)根据敏感折点设定预包被药物浓度，一方面可以直接筛选出敏感药物，另一方面较梯度浓度法节省了药敏检测板和试剂，节省了检测成本，也利于环境保护。
(4)利用本发明的药敏快速检测试剂盒检测，全过程所需时间不超过 13h，为临床正确选择抗菌药物预防和治疗争取了宝贵时间。
附图说明
图1为大肠杆菌ATCC25922菌株的菌液浓度-吸光度值标准曲线。
生物保藏证明
大肠杆菌EC-AE45，拉丁文为Escherichia coli，于2019年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCC NO：M2019753。
沙门氏菌S-CXW6，拉丁文为Salmonella sp.，于2019年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCC NO：M2019752。
鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4，拉丁文为Riemerella anatipestifer，于2019 年9月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，邮编430027，保藏编号为CCTCCNO：M2019751。
具体实施方式
本发明提供了一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和显色指示剂；所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯；将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
在本发明中，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的的浓度优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL。在本发明中，所述灭菌培养基优选包括胰蛋白胨大豆肉汤。在本发明中，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基优选罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量优选为 8～12mL，更优选为10mL，所述螺纹盖玻璃瓶的容量优选为20mL。在本发明中，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基利于多种微生物增殖。在本发明中，鸭疫里默氏杆菌(RA)生长较缓慢，加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，可为RA提供生长因子，促进RA的增殖。
在本发明中，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括优选阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。在本发明中，所述抗菌药物的敏感性折点优选为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林 4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素 4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素 2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
在本发明中，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中优选含有抗菌药物溶液，将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基与抗菌药物溶液等体积混合后，即可达到美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。本发明对所述抗菌药物溶液使用的溶剂没有特殊限定，能够溶剂药物并不影响药物性质即可。在本发明中，所述无菌透明EP管的容量优选为1.5mL。
在本发明中，所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和 0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯，优选含有1.2mM的碘硝基氯化四氮唑和 0.2mM的吩嗪硫酸甲酯。本发明对所述显色指示剂在试剂盒中的放置量没有特殊限定，采用常规试剂盒中放置试剂的量即可。
在本发明中，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种，本发明对上述鸭致病菌的来源没有特殊限定，采用常规即可，在本发明具体实施方式中，所述鸭致病性大肠杆菌的保藏编号优选为CCTCCM2019753，所述鸭疫里默氏杆菌的保藏编号优选为CCTCCM2019751，所述沙门氏菌的沙门氏菌保藏编号优选为 CCTCCM2019752。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括：将病死鸭肝组织 0.1ml～0.2ml接种于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，使抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点，于37℃孵育过夜；孵育完毕后，加入显色指示剂，混匀，37℃孵育0.5h后，肉眼观察结果。在本发明中，不含药物的阴性对照管中的溶液的颜色为红色时，试验成立；包被抗菌药物的无菌透明EP管中的溶液的颜色越接近于阴性对照管颜色，药物越不敏感；颜色越接近于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基原色，药物越敏感。
在本发明中，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基与显色指示剂的体积比优选为400:20。本发明优选使用无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织，本发明优选避免采集使用过抗菌药物的病料，对检测可产生干扰。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的胰蛋白胨大豆肉汤、包被抗菌药物的无菌透明 EP管和显色指示剂。
其中显色指示剂含有1.2mM的碘硝基氯化四氮唑和0.2mM的吩嗪硫酸甲酯；
将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管后，抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点；包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明，抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL，无菌透明EP管的容量为1.5mL；
含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量为 10mL，螺纹盖玻璃瓶得容量为20mL。
实施例2
菌液浓度-吸光度值标准曲线绘制：
以标准菌株大肠杆菌ATCC25922绘制菌液浓度-吸光度值标准曲线。将 ATCC25922菌株接种于10mLTSB培养基，37℃，200r·min-1振荡培养过夜。取1mL菌液，5000r·min-1离心3min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。然后用生理盐水稀释，用麦氏比浊法得浓度分别为9×108CFU/mL、7×108CFU/mL、5×108CFU/mL、3×108CFU/mL、1.5×108CFU/mL、0.75×108CFU/mL的菌悬液，每个菌液浓度重复3次。以生理盐水调零，于 600nm波长测定各浓度菌悬液的吸光度值(OD值)，取平均值。以吸光度值为横坐标、以菌液浓度为纵坐标，绘制菌液浓度-吸光度值标准曲线，并进行线性回归得标准曲线方程，结果见图1。
实施例3
细菌世代时间测定
将大肠杆菌ATCC25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45(CCTCC M2019753)、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4(CCTCCM2019753)、沙门氏菌 ST-CXW6(CCTCCM2019752)、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474接种于10mL TSB培养基，37℃，200r·min-1振荡培养过夜。取培养物接种到10mLTSB培养基中，并用上述菌液浓度-吸光度值标准曲线调整起始菌液浓度为 5×105CFU/mL，37℃，200r·min-1振荡培养，每个培养物重复3次。至菌液略显浑浊时(相当于1号麦氏比浊管浓度)，取1mL菌液，5000r·min-1离心3min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。以生理盐水调零，于 600nm波长测定菌悬液的OD值，并根据上述菌液浓度-吸光度值标准曲线换算成菌液浓度，取3次测定的平均值。培养物接种时间相当于细菌对数生长期起始时间T1，取样测定的时间相当于对数生长末期时间T2；起始菌液浓度计为X1，对数生长末期菌液浓度计为X2。细菌在对数生长期以二等分分裂方式繁殖，菌液浓度满足关系式：X2＝2nXl，细菌繁殖代次 n＝3.31×(lgX2-lgX1)，世代时间G＝(T2-T1)/[3.31×(lgX2-lgX1)]。经测定，各菌株世代时间分别为：ATCC25922，19.7min；EC-AE45，19.1min；RA-WLJ4， 50.1min；ST-CXW6，26.4min；CVCC474：28.1min。
实施例4
本发明比较了四氮唑盐类的氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘硝基氯化四氮唑(INT)、硝基四氮唑蓝(NBT)、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)的显色效果。以大肠杆菌 ATCC25922为研究对象，将大肠杆菌ATCC25922接种于TSB培养基，37℃， 200r·min-1振荡培养过夜，备用。分别配制15mMTTC、2.4mMINT、5mM NBT、12mMWST-8贮备液，其中TTC、INT、NBT溶液配制时加入50％(V/V) 二甲亚砜助溶。取培养物用TSB调整菌液终浓度为108CFU/mL，加入TTC、 INT、NBT、WST-8储备液，使终浓度如表1所示，反应总体积为400μL。混匀，37℃孵育0.5h后观察结果。以“-”表示不显色，以“+”表示显色，并根据“+”个数区分显色强度。结果见表2，结果显示INT的显色效果最佳。因此，确定INT为本发明的显色指示剂，确定最佳显色浓度为0.12mM。
此外，NBT、WST-8须在加入电子载体吩嗪硫酸甲酯后，才能被细菌体产生的NADH还原显色。吩嗪硫酸甲酯可以加快TTC、INT的显色时间和显色强度，有效的浓度范围为10-32μM。
表1显色指示剂终浓度(mM)
显色指示剂 1 2 3 4 5 6
TTC 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 0.1
INT 0.24 0.2 0.16 0.12 0.08 0.04
NBT 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05
WST-8 1.2 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1
表2显色强度比较
显色指示剂 1 2 3 4 5 6
TTC +++ +++ +++ +++ ++ +
INT ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++
NBT - - - - - -
WST-8 - - - - - -
注：“-”表示不显色。
实施例5
细菌最低检出浓度确定
将大肠杆菌ATCC25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株接种于10mLTSB培养基，37℃，200r·min-1，培养过夜。取1mL菌液，3000r·min-1离心10min，弃上清，并加入等量的0.85％生理盐水重悬。以生理盐水调零，于600nm波长测定菌悬液的OD值，并根据上述菌液浓度-吸光度值标准曲线换算成菌液浓度。用TSB培养基稀释培养过夜的菌液，得浓度分别为 1×108CFU/mL、8×107CFU/mL、6×107CFU/mL、4×107CFU/mL、2×107CFU/mL、 1×107CFU/mL的菌液，并以无菌TSB培养基作为空白对照，每个菌液浓度重复3次。取各稀释度菌液400μL，加入40μL的显色指示剂(包含有1.2mM 的碘硝基氯化四氮唑和0.2mM的吩嗪硫酸甲酯的无菌溶液)，混匀，37℃孵育0.5h后观察结果。以使3个重复的培养基均能产生肉眼可分辨的红色时的最低菌液浓度为该菌株的最低检出浓度。最低检出浓度分别为： ATCC25922，4×107CFU/mL；EC-AE45，8×107CFU/mL；RA-WLJ4， 6×107CFU/mL；ST-CXW6，6×107CFU/mL；CVCC474：4×107CFU/mL。
实施例6
细菌感染病死鸭组织中的细菌含量一般在105-107CFU/mL，接种到增菌培养基的初始菌液经过增菌培养后，菌液浓度一般高于104CFU/mL。本发明试验菌株中，鸭疫里默氏杆菌的世代时间最长。以世代时间50.1min计算， 37℃孵育11h，细菌以二分裂方式繁殖了13.2个世代，细菌增殖了213.2倍，菌液终浓度达到了9.4×107CFU/mL，超过了细菌的最低检出浓度，因此确定加药孵育时间为11h，为了工作方便，或可将加药孵育时间11h调整为孵育过夜。其他细菌37℃孵育11h后，菌液终浓度远大于最低检出浓度。
实施例7
试剂盒检测与微量肉汤稀释法检测结果比对
以标准菌株大肠杆菌ATCC25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474 菌株为对象，比较了本发明试剂盒与微量肉汤稀释法对抗菌药物敏感性检测的一致性，被测试的药物包括阿莫西林、头孢噻呋、多西环素、氟苯尼考、恩诺沙星、大观霉素、庆大霉素。
将大肠杆菌ATCC25922、鸭致病性大肠杆菌EC-AE45、鸭疫里默氏杆菌RA-WLJ4、沙门氏菌ST-CXW6、禽多杀性巴氏杆菌CVCC474接种于10 mLTSB培养基，37℃，200r/min振荡培养过夜。采用麦氏比浊法调整菌液浓度为105CFU/mL，取400μL菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，每个检测管重复一次。ATCC25922、EC-AE45、ST-CXW6、CVCC474 菌株37℃培养6h，RA-WLJ4菌株培养过夜后，每孔加入显色指示剂40μL， 37℃孵育0.5h后读取结果。以“-”表示不显色，以“+”表示显色，并根据“+”个数区分显色强度。本发明的药敏快速检测试剂盒的检测结果如表 3。
表3药敏快速检测试剂盒检测结果
Figure BDA0002336229550000101
Figure BDA0002336229550000111
另采用微量肉汤稀释法测定各菌株的抗菌药物敏感性。按照美国临床和实验室标准协会(CLSI)制订的指南进行药物原液制备和稀释，并设置空白对照组(不加药物组)。挑取培养好的受试菌制备成0.5麦氏单位菌悬液，按照最终菌液浓度为5×105CFU/mL进行接种。接种完毕后将培养基放入 37℃培养箱中培养16h-20h。检查空白对照组生长情况，以肉眼观察读取所需数据。微量肉汤稀释法检测结果如表4。
表4抗菌药物的最低抑菌浓度(μg/mL)
Figure BDA0002336229550000112
Figure BDA0002336229550000121
比较本发明的快速药敏试剂盒与微量肉汤稀释法的敏感性结果，两者的符合率为100％。
实施例8
动物攻毒试验
以鸭致病性大肠杆菌EC-AE45菌株为攻毒菌株，用生理盐水调整菌液浓度为5×105CFU/mL，选取20日龄健康樱桃谷鸭5只，按0.2mL/只肌肉注射菌液。攻毒后2d，鸭出现死亡，用无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织 0.1mL-0.2mL，接种于含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中，拧紧螺纹盖，充分振摇后，稍稍拧松螺纹盖，37℃振荡培养1h；静置5min后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，每管加入400μL，每个检测管重复一次；37℃孵育6h后，每管加入40μL的显色指示剂；混匀，37℃孵育0.5h后，肉眼观察结果。以“-”表示不显色，以“+”表示显色，并根据“+”个数区分显色强度，结果如表5。结果显示，本发明的药敏快速检测试剂盒能够快速地筛选敏感药物，且检测结果与体外药敏试验结果一致。
表5快速药敏检测试剂盒检测结果
Figure BDA0002336229550000122
实施例9
临床应用
2019年7月，武汉市江夏区某肉鸭养殖场存栏肉鸭约2000羽，29日龄发病，发病率30％左右，已病死数十只。剖检病理变化以心包炎、肝周炎、气囊炎为特征，初步诊断为鸭致病性大肠杆菌。无菌棉签拭子蘸取病死鸭肝组织0.1mL-0.2mL，接种于10mL含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中，拧紧螺纹盖，充分振摇后，稍稍拧松螺纹盖，37℃振荡培养1h；静置5min 后，取上清菌液加入到包被抗菌药物的无菌透明EP管中，每孔加入400μL； 37℃孵育过夜后，每孔加入40μL的显色指示剂；混匀，37℃孵育0.5h后，肉眼观察结果。结果显示，强力霉素、恩诺沙星、头孢噻呋为高度敏感药物。选用强力霉素拌料给药治疗，给药后4天，病情得到有效控制，全群鸭精神状况和采食恢复正常。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于碘硝基氯化四氮唑显色的鸭致病菌药敏快速检测试剂盒，其特征在于，包括含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基、包被抗菌药物的无菌透明EP管和显色指示剂；
所述显色指示剂含有1mM～1.4mM的碘硝基氯化四氮唑和0.1mM～0.3mM的吩嗪硫酸甲酯；
将含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基加入包被抗菌药物的无菌透明EP管，所述抗菌药物的浓度为美国临床和实验室标准协会制定的药物的敏感性折点。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的的浓度为0.5～1.5mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述灭菌培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的灭菌培养基罐装螺纹盖玻璃瓶中，灌装量为8～12mL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被抗菌药物的无菌透明EP管中的抗菌药物包括阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢喹肟、四环素、多西环素、土霉素、氟苯尼考、红霉素、多粘菌素、恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星、壮观霉素、安普霉素、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶或复方新诺明。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗菌药物的敏感性折点为：阿莫西林4μg/mL、氨苄西林4μg/mL、头孢噻呋2μg/mL、头孢喹肟2μg/mL、四环素4μg/mL、多西环素4μg/mL、土霉素4μg/mL、氟苯尼考2μg/mL、红霉素1μg/mL、多粘菌素2μg/mL、恩诺沙星1μg/mL、环丙沙星1μg/mL、二氟沙星1μg/mL、达氟沙星1μg/mL、大观霉素32μg/mL，安普霉素16μg/mL、庆大霉素2μg/mL、磺胺间甲氧嘧啶256μg/mL、磺胺二甲嘧啶256μg/mL和复方新诺明40μg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鸭致病菌包括鸭致病性大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无菌透明EP管的容量为1.5mL。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色指示剂含有1.2mM的碘硝基氯化四氮唑和0.2mM的吩嗪硫酸甲酯。
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