CN112206250A

CN112206250A - 苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用

Info

Publication number: CN112206250A
Application number: CN202011158356.XA
Authority: CN
Inventors: 冷晓红
Original assignee: Ningxia Polytechnic (ningxia Radio And Television University)
Current assignee: Ningxia Polytechnic (ningxia Radio And Television University)
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-01-12

Abstract

本发明公开了苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用。属于兽药制药技术领域。本发明经药效学研究表明，对于大肠杆菌引起的禽肠道疾病具有预防与治疗作用。本发明的苦豆子提取物在可用于治疗对多种抗生素耐药的禽肠道疾病。本发明对引起禽肠道疾病的病原菌大肠杆菌的抑菌效果明显，且对土霉素、金霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素产生耐药性的大肠杆菌仍有显著的抑菌效果。

Description

苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用

技术领域

本发明涉及兽药制药技术领域，更具体的说是涉及苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用。

背景技术

肠道疾病是家禽最为常见的疾病，通常由大肠杆菌等多种致病菌引起，这类疾病可造成家禽死亡或影响正常的生长发育。目前，对禽肠道疾病除检疫净化外，抗菌药物的应用仍然是预防和治疗的重要手段。但随着各类抗生素类药物的广泛应用及饲料中长期添加使用，禽肠道疾病致病菌的耐药性在逐年增加，家禽的肉、蛋等产品中的抗生素蓄积残留，危害人体健康。

中草药大多数为天然的绿色有机植物，不仅具有防病治病，促进生长发育，提高生产性能，调节机体免疫力的作用，而且长期使用毒副作用小，不容易产生抗药性，在畜禽产品中无残留基本能达到无公害的效果。开发中药特别是开发对现有抗生素治疗有耐药性的抑菌药物，成为目前畜禽业研究的主要方向。

因此，提供一种中草药提取物，具有对抗生素耐药的禽肠道疾病具有良好的效果成为本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明利用苦豆子提取物制备对抗生素耐药的禽肠道疾病药物或抑菌剂。禽肠道疾病是由大肠杆菌等致病菌引发的一种肠道疾病，长期使用抗生素治疗已产生了强烈的抗生素耐药性，使临床治疗效果下降。而本发明不仅对禽肠道疾病标准菌有显著效果，同时也对分离的耐药(禽大肠肝) 菌有防治作用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

苦豆子提取物在制备治疗禽肠道疾病药物中的应用。

优选的：禽肠道疾病由对抗生素耐药的致病菌引起。

优选的：抗生素为多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、头孢噻呋和氟苯尼考任一。

优选的：致病菌为耐药禽大肠杆菌属。

优选的：禽肠道疾病包括：家禽细菌性痢疾、家禽肠毒综合征、卡他性肠炎

本发明还提供了苦豆子提取物在制备禽肠道疾病致病菌的抑菌剂中的应用。

优选的：致病菌为对抗生素耐药的致病菌。

优选的：致病菌为大肠杆菌属。

本发明还提供了上述应用中的苦豆子提取物最小抑菌浓度范围为 6.25～12.5mg/mL。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用，取得的技术效果：利用苦豆子提取物所具有的清热解毒、抑菌消炎和提高机体免疫力的功效来预防和治疗禽肠道疾病，体外抑菌试验表明：对引起禽肠道疾病的病原菌大肠杆菌的抑菌效果明显，且对土霉素、金霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等抗生素产生耐药性的大肠杆菌仍有显著的抑菌效果。服用后无抗菌素残留，苦豆子提取物最小抑菌浓度(MIC)范围为6.25～12.5mg/mL。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了苦豆子提取物在制备禽耐药疾病的药物或抑菌剂中的应用。

实施例所需仪器设备例如超净工作台、移液器、刻度移液管、小试管、试管架、平皿、接种棒、酒精灯、镊子、滴管、水浴锅、分析天平、高压灭菌器、37℃恒温培养箱、水浴锅等均为常规仪器设备；所需原料如苦豆子提取物，均为市售渠道获得，或常规试验方法提取而得。实施例关于基因检测引物参考现有文献并适当优化(例如：牛建宁，鸡源大肠杆菌的分离鉴定及四环素类耐药基因检测研究.2014.咸阳：西北农林科技大学，不在一一列举)。

试验前准备：

肉汤培养基制法：称取一定量Mueller-Hinton(MH)培养基，加入蒸馏水1000.0mL。充分溶解后，15磅压力灭菌15分钟备用。4℃保存备用。

琼脂培养基制法：肉汤培养基100.0mL、琼脂1.8～2.2g。在肉汤培养基高压灭菌前，加入琼脂煮溶，再高压消毒。冷却并无菌检查后，4℃保存备用。

菌液配制：大肠杆菌ATCC25922及14株临床分离株用肉汤培养基接种，培养后在LB营养琼脂平板上划线培养16～18小时。用接种环挑取单个菌落，接种于1mL的LB肉汤中，37℃孵育16～24h，制得供试菌液；

实施例中涉及的试验方法，例如：

细菌含量的测定及稀释

以活菌平板计数法对供试菌液进行平板菌落计数，细菌含量为 10^8～9CFU/mL。然后用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶1000～10000稀释后备用。并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。

最小抑菌浓度(MIC)测定

采用试管二倍稀释法和微量肉汤稀释法进行抗菌药最小抑菌浓度(MIC) 测定。

实施例1

1.试验菌株

从临床病例中获得的禽源大肠杆菌分离株14株，编号分别为4、16、36、 47、1、2、95、96、57、67、69、79、89、91；质控菌：大肠杆菌ATCC25922。

2禽源大肠杆菌分离株携带耐药基因检测

为了解14株禽源大肠杆菌分离株携带耐药基因情况，设计并合成细菌对常见抗菌药的耐药基因引物，以PCR方法对各菌株的耐药基因进行检测。

四环素类耐药基因检测

四环素类耐药基因检测引物如下：

四环素类耐药基因检测PCR反应体系如下：

四环素类耐药基因检测PCR扩增条件

tet(A)和tet(M)基因多重PCR扩增反应条件如下：

Tet(B)、tet(C)和tet(D)基因多重PCR扩增反应条件如下：

扩增反应结束后将产物放入4℃冰箱保存备用，配制1.5％琼脂糖凝胶， 120V/220mA进行琼脂糖凝胶电泳25min，电泳完成后将胶块放入EB(溴化乙锭)染液浸泡30min，捞出用清水洗净，用凝胶成像系统观察结果。

酰胺醇类耐药基因检测

酰胺醇类耐药基因检测引物如下

PCR反应体系：

PCR扩增条件

PCR扩增反应条件如下：

扩增反应结束后将产物放入4℃冰箱保存备用，配制1％琼脂糖凝胶， 120V/220mA进行琼脂糖凝胶电泳25min，电泳完成后将胶块放入EB(溴化乙锭)染液浸泡30min，捞出用清水洗净，用凝胶成像系统观察结果。

β-内酰胺类耐药基因检测

β-内酰胺类耐药基因引物如下：

PCR反应体系：

PCR扩增条件

TEM、SHV和OXA-1基因；CTX-M1，2、CTX-M9；CTX-Mg8/25；ACC、 Fox、Mox、DHA、CMT、EBC多重PCR扩增反应条件如下：

GES和OXA-48基因多重PCR扩增反应条件如下：

IMP、VIM和KPC基因多重PCR扩增反应条件如下：

扩增反应结束后将产物放入4℃冰箱保存备用，配制1.5％琼脂糖凝胶， 120V/220mA进行琼脂糖凝胶电泳25min，电泳完成后将胶块放入EB(溴化乙锭)染液浸泡30min，捞出用清水洗净，用凝胶成像系统观察结果如下：

结果表明，2号菌株未携带耐药基因，其余13个分离菌均携带耐药基因。以下试验以ATCC25922标准菌、2号分离菌(未携带耐药基因)及其余的13 个分离菌(均携带耐药基因)作为苦豆子提取物抑菌试验菌。

实施例2

受试药物：苦豆子提取物。

对照药物：多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、美罗培南、头孢噻呋、氟苯尼考。

抗菌药物贮存液制备

采用无菌双蒸水配制受试抗菌药物贮存液(苦豆子提取物)。苦豆子提取物物浓度为400mg/mL，同时对照药物浓度为1280μg/mL。配制好的抗菌药物贮存液经无菌处理后应贮存于-20℃以下环境，保存期不超过6个月。

苦豆子提取物：取无菌试管12支，排成一排，每管加入MH肉汤1mL，在第1管加入抗菌药物原液1mL混匀，然后吸取1mL加至第2管，混匀后再吸取1mL加至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取 1mL弃去。此时第1管至第10管药物浓度分别为200、100、50、25、12.5、 6.25、3.125、1.56、0.78、0.39mg/mL。最后在每管内加入上述稀释好的菌液各1mL(除了第11管)。第1管至第10管药物浓度分别为100、50、25、 12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195mg/mL。另设阳性对照(菌液+ MH肉汤)、阴性对照(只含MH肉汤)。

8种抗菌药物：取96孔板，在每一行的12个孔中，除第一孔加入MH肉汤180μL外，其余每孔加入MH肉汤100μL，在第1孔加入抗菌药物原液20 μL混匀，然后吸取100μL加至第2孔，混匀后再吸取100μL加至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去。最后在每孔内加入上述稀释好的菌液各100μL(除了第11孔)。另设阳性对照(菌液+MH肉汤)、阴性对照(只含MH肉汤)。每药重复3次。

孵育

将接种好的稀释管塞好试管塞，把试管和96孔板置于37℃恒温培养箱孵育16～20h。

结果判断标准

检查生长对照的细菌生长情况是否良好，同时还检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为该药物对受试菌的MIC。三次试验的平均值即为受试菌的MIC值。

试验结果

采用试管二倍稀释法进行苦豆子总碱对大肠杆菌ATCC25922及14株临床分离株的最小抑菌浓度(MIC)测定，结果如下：

结果表明：14株禽源大肠杆菌临床分离株对多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、头孢噻呋、氟苯尼考表现出不同程度的耐药性。其中，4株禽源大肠杆菌临床分离株对多粘菌素、美罗培南较敏感，但对多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、头孢噻呋、氟苯尼考则表现出不同程度的耐药性。

而苦豆子提取物对14株禽源大肠杆菌临床分离株均有相似的抑菌活性， MIC范围为6.25～12.5mg/mL。

综上所述，本发明通过对苦豆子提取物的体外抑菌试验和耐药基因检测，发现苦豆子提取物是具有高效的抑制禽肠道疾病致病菌作用的药物或抑菌剂 (也可进一步加工或复配)，尤其是对已产生耐抗生素禽肠道疾病仍具有较好的抑菌作用，这说明苦豆子是开发用于预防和治疗耐抗生素的高效新药的一个来源。可用于治疗和预防禽肠道疾病，并可替代抗生素的使用，具有极大的推广价值。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的。

Claims

1.苦豆子提取物在制备治疗禽肠道疾病药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述禽肠道疾病由对抗生素耐药的致病菌引起。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗生素为多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、头孢噻呋和氟苯尼考任一。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述致病菌为耐药禽大肠杆菌属。

5.如权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述禽肠道疾病包括：家禽细菌性痢疾、家禽肠毒综合征、卡他性肠炎。

6.苦豆子提取物在制备禽肠道疾病致病菌的抑菌剂中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述致病菌为对抗生素耐药的致病菌。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗生素为多西环素、链霉素、恩诺沙星、多粘菌素、阿莫西林、头孢噻呋和氟苯尼考任一。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述致病菌为大肠杆菌属。

10.权利要求1～5任一所述的应用或权利要求6～9任一所述的应用中的苦豆子提取物最小抑菌浓度范围为6.25～12.5mg/mL。