CN116515770A - 一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3、组合物、药物制剂及其应用 - Google Patents
一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3、组合物、药物制剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌噬菌体(Escherichiacoliphage)GXHZ‑tn3、组合物、药物制剂及其应用，所述大肠肝菌噬菌体GXHZ‑tn3已于2023年3月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCCNo:63262‑B1。本发明大肠杆菌噬菌体GXHZ‑tn3对宿主菌HZTN01具有较好的消杀效果，耐碱性稳定性高，安全性好，且室温条件下长期保存也可较稳定保持在高效价水平，对雏鸡感染禽致病性大肠杆菌也具有很好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及大肠杆菌噬菌体的技术领域，特别涉及一种大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3、组合物、药物制剂及其应用。
背景技术
大肠杆菌(E.coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌，常定居在宿主的肠道及粪便中，是肠道菌群的一部分，一般多不致病。致病性大肠杆菌可分为肠道内致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E.coli,IPEC)及肠道外致病性大肠杆菌(ExtraintestinalPathogenic E.coli,ExPEC)。APEC属于肠道外致病性大肠杆菌，感染禽类引起禽大肠杆菌病。APEC经口腔、鼻腔或泄殖腔途径进入后，在禽类的胃肠道、呼吸道和生殖道的粘膜部位定植，但不引起疾病。但在存在应激源时APEC将作为机会性病原体转移到肠外部位引发肠道外感染。
噬菌体(bacteriophage,phage)是地球上存在的种类最丰富的生物，作为细菌的天然杀手，自发现以来就用于治疗细菌感染。噬菌体使用细菌宿主的复制系统进行复制，破坏宿主细胞(裂解循环)，或驻留在细菌基因组中(溶原状态)。与抗生素相比，噬菌体容易获得和分离；不易产生耐药性；宿主特异性强，只清除目标细菌，不会对人及动物体内的其他正常菌群造成威胁；安全性高，是人和动物正常的共生体。目前，治疗和防控禽大肠杆菌病均以药物和疫苗为主，使用抗生素类药物是目前最主要的一种防治途径，但是随着抗生素类药物的广泛使用，大肠杆菌的耐药性逐渐増强，针对大肠杆菌日益严重的耐药问题，本发明以在雏鸵鸟组织病样中分离到的一株多重耐药的禽致病性大肠杆菌HZTN01为宿主，在广西某鸵鸟场化粪池污水中分离得到一株裂解性噬菌体GXHZ-tn3，对其基本生物学特性(最佳感染复数，一步生长曲线，温度稳定性和pH敏感性)和消菌效果(在液体培养基中的杀菌能力)进行分析和介绍。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提供一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3、组合物、药物制剂及其应用，旨为禽致病性大肠杆菌所致的感染提供新的治疗方案。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3，所述大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3已于2023年3月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCC No:63262-B1。
进一步地，所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3是在鸵鸟场化粪池污水中分离得到的。
进一步地，所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的耐受温度≤60℃。
进一步地，所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的耐受pH为5～10。
本发明还提供一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的应用，所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3应用于分离感染大肠杆菌病鸵鸟的宿主多重耐药大肠杆菌HZTN01的消杀，具有较好的消杀效果，可应用于制备防治多重耐药大肠杆菌的药物。
本发明还提供一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3在制备预防或治疗大肠杆菌感染的疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种噬菌体组合物，所述噬菌体组合物包括大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3。
本发明还提供一种噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂有效成分包括大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3或噬菌体组合物。
进一步地，所述噬菌体药物制剂，还包含药学上接受的载体。
进一步地，所述噬菌体药物制剂的剂型为溶液剂或凝胶剂，用药途径为注射或外用。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
本发明大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3对宿主菌HZTN01具有较好的消杀效果，耐碱性稳定性高，安全性好，且室温条件下长期保存也可较稳定保持在高效价水平，对雏鸡感染禽致病性大肠杆菌也具有很好的治疗效果。
保藏信息说明
大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3于2023年3月10日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:63262-B1。
附图说明
图1是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3噬菌斑图。
图2是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3透射电镜图。
图3是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3最佳感染复数图。
图4是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3一步生长曲线图。
图5是温度对本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3活性影响示意图。
图6是pH对本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3活性影响示意图。
图7是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coliphage)GXHZ-tn3培养基中抑菌效果示意图。
图8是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GXHZ-tn3应用于治疗雏鸡的存活率示意图。
图9是本发明大肠杆菌噬菌体(Escherichia coli phage)GXHZ-tn3应用于治疗雏鸡的组织载菌量示意图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实验所用宿主菌为多重耐药临床株，为大肠杆菌临床株HZTN01，于广西贺州某鸵鸟养殖场一感染大肠杆菌病雏鸵鸟组织病样中分离得到，与本发明大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3已于2023年3月10日已办理保藏，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号5楼广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo:63262-B1。
LB(Luriabroth)液体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
0.6％LB半固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，琼脂粉6g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌。
1.2％LB固体培养基(1L)：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂粉12g，加ddH2O至1L，调节pH至7.0，121℃，20min高压灭菌后，冷却至50℃，倾倒平板，冷却凝固后，倒置备用。
SM缓冲液(1L)：称取6.055g Tris-HCI(pH为7.5)定容至100ml，加入5.800g NaCl，2.000g MgSO4后，加入ddH2O定容至1L。
DNase I、RNaseA、PEG8000、磷钨酸(PTA，2％w/v)为市售所得。
实施例1
大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的分离
样品采自广西某鸵鸟场化粪池中污水，样品于4℃、12000rpm离心10min，上清再重复离心3次，最终上清分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤；取5mL滤液，加入保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌0.1mL，加入2×LB液体培养基5mL，放置于37℃培养16h，次日，4℃、12000rpm离心上述培养16h后所得培养物10min，上清液用0.22μm滤膜过滤除菌，得到含有噬菌体的原液也即噬菌体悬液。
取保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌划线接种于1.2％LB固体培养基上，培养过夜后，挑取单克隆接种于5mL LB(Luriabroth)液体培养基中，37℃振荡培养8h后作为宿主菌培养物备用。
将1.2％LB固体培养基分为2个区域，吸取上述备用的宿主菌培养物0.1mL和3mL0.6％LB半固体混合均匀后平铺于1.2％LB固体培养基上，待其晾干后取上述噬菌体悬液10μL滴于其中一个区域待自然晾干后，置于37℃培养箱培养后，观察滴加噬菌体区域有无空斑形成，若有空斑形成，证明有噬菌体存在。
重新另取一份上述噬菌体悬液0.1ml连续10倍稀释，分别取出10-2、10-4、10-6稀释液0.1ml加入0.1ml保藏于中国典型培养物保藏中心的宿主菌，静置15min，加入45℃左右的0.6％半固体LB培养基3.5ml，均匀铺在预先制备好的1.2％LB固体培养基上，37℃培养8h后观察噬菌斑生长情况；挑取单个透亮无晕环、大小均一、边缘整齐的噬菌斑放入装有0.1mL宿主菌培养物和LB液体培养基的EP管中，37℃过夜共培养；第二天取共培养物离心过滤，将滤液用SM缓冲液10倍稀释，与0.1ml宿主菌做双层，如此重复5次左右，即可获得噬菌斑大小均一的噬菌体，4℃保存备用。
用双层平板法检测上述备用的噬菌体，结果如图1所示，该噬菌体在琼脂培养基中可以形成针尖状透亮空斑，周围无晕环，边缘清晰规则，为典型的裂解性噬菌体。
实施例2
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3的扩增纯化
取实施例1备用的噬菌体0.1ml和实施例1备用的宿主菌培养物0.1ml于试管中作用15min，加入10ml LB液体培养基，37℃培养6h，4℃、12000rpm离心20min，取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液即为噬菌体裂解液。
PEG纯化：在噬菌体裂解液中加入DNase I、RNaseA至终浓度均为1μg/ml，37℃温育30min，加入终浓度为1M的NaCl冰浴1h(即加入氯化钠使混合溶中氯化钠的最终浓度为1M)，4℃、12000rpm离心10min，取上清加入终浓度为10％的PEG8000，4℃过夜，然后4℃、12000rpm离心10min，弃上清，倒置5min，尽可能的除去多余的水，然后向剩余的固体物质加入SM缓冲液重悬，加入等体积的氯仿温和震荡30s，4℃、5000rpm离心15min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获纯化的噬菌体悬液。
双层平板法检测噬菌体效价：上述纯化的噬菌体悬液进行10倍梯度稀释，取各梯度的噬菌体稀释液0.1ml与宿主菌液0.1ml充分混匀，铺双层琼脂平板，37℃恒温培养8h左右，对每个琼脂平皿进行噬菌斑计数，选择出现30-300左右噬菌斑的平皿，根据稀释的倍数计算得到的噬菌体初始浓度即得噬菌体效价，噬菌体的效价(PFU/ml)＝稀释倍数×噬菌斑个数×10，噬菌体效价为2.1×109PFU/ml。
实施例3
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3的透射电镜观察
实施例2纯化后的噬菌体悬液做电镜观察，将实施例2纯化后的噬菌体悬液滴在铜片上，自然沉淀10min，用滤纸吸去多余的液体，滴一滴2％的磷钨酸(PTA，2％w/v)染色，室温干燥后使用透射电子显微镜观察；观察结果如图2(100kV)所示，该噬菌体有呈正二十面体的头部，头部直径约为50nm，尾部120nm，根据国际病毒分类委员会(ICTV)2015年发表的《病毒分类一国际病毒分类委员会第八次报告》，该噬菌体属于肌尾病毒家族(Myoviridae)，命名为GXHZ-tn3。
实施例4
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3最佳感染复数的测定(感染复数为感染初期噬菌体的数与宿主菌数比值)
取实施例1中备用的宿主菌培养物，调整浓度到1×109CFU/mL，按照感染复数分别为1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例分别加入实施例1备用的噬菌体和实施例1中备用的宿主菌培养物，加入LB液体培养基使培养体系的总体积相同，在37℃静止培养6h，于10000rpm离心10min，收集上清稀释到适当浓度，用双层法测定效价，结果如图3所示，大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的最佳感染复数为1。
实施例5
大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3一步生长曲线的测定
将实施例1中备用的宿主菌培养物与过量的实施例1备用的噬菌体混合(MOI>10，确保所有细菌与噬菌体吸附)，37℃温浴15min后12000rpm离心1min，弃上清(未吸附的噬菌体)，LB液体培养基洗涤沉淀(相互吸附的细菌及噬菌体颗粒)1次，用10ml预热的LB液体培养基重悬沉淀，迅速置于37℃摇床中振荡培养，从0min开始，每隔10min取120μl培养物，4℃、10000rpm离心2min去除细菌，取上清稀释至适当浓度(适当浓度即在平板上形成30-300个噬菌斑的浓度)，双层法测定噬菌体效价，测120min，共取样13次，以取样时间为横坐标，噬菌体的效价的对数为纵坐标，绘制一步生长曲线得出噬菌体的潜伏期、暴发期、爆发量。一步生长曲线结果如图4所示，其感染宿主菌潜伏期为10min，爆发期为30min，爆发量为122PFU/cell。
实施例6
大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的温度、酸碱度耐受实验
取10个无菌EP管，各加入0.5ml实施例1备用的噬菌体，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下作用60min，期间每30分钟取出100μl立即置于水浴中冷却，然后测定噬菌体效价；检测结果如图5所示：该噬菌体能耐受60℃高温，60min内效价基本稳定，当温度≥60℃时，随温度的升高噬菌体活性逐渐下降；当温度达到80℃时，1h后噬菌体完全失活。
取11份0.1ml实施例1备用的噬菌体分别放入pH为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的SM缓冲液(0.9ml)中，37℃作用1h，然后用双层法测定反应后噬菌体的效价；检测结果如图6所示：大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3在pH值为5～10的环境中效价变化较小，活性基本不变；当环境pH>10或pH<5时，噬菌体的效价随酸、碱性的增强而下降；pH>12或pH<3时，噬菌体全部失活，效价为0，因此可知该噬菌体的适宜pH范围为5～10。
实施例7
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3在培养基中的抑菌效果
实验分为5个测试组，浓度分别1×106、1×107、1×108噬菌体组、阳性对照组、阴性对照组。每组进行3次重复实验。噬菌体组中每孔加入不同浓度的100μL噬菌体液与100μLLB肉汤，阳性对照组与阴性对照组均加入200μL LB肉汤。除了阴性对照组，再向所有测试孔中接种5μL HZTN01菌液。加样完毕后在酶标仪上测试OD600初始值，将96孔板送入37℃恒温箱中培养，每1小时取出测试OD600值的变化，测定16小时，每次测试也重复3次进行，之后绘制曲线图，结果如图7所示。阳性对照组即培养液中仅有宿主菌没有噬菌体，液体培养基在加入宿主菌后5h内OD600显著上升，并维持在一个较高水平；噬菌体处理组的大肠杆菌数在7h后缓慢上升，在12h内都呈缓慢增长趋势，表明GXHZ-tn3在液体培养基中具有良好的抑菌效果。此外，噬菌体的抗菌效果表现出MOI依赖性，在MOI为0.1时的效果最优。
实施例8
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3的安全性试验
3日龄雏鸡，共20只，随机分为两组，每组10只，其中一组腹腔注射噬菌体109PFU/mL/0.25mL/只(将实施例1备用的噬菌体调整浓度至109CFU/ml后所得)，对照组腹腔注射等体积PBS，连续观察7天，脱颈致死雏鸡，观察内脏、消化道及黏膜变化情况。结果显示，此计量的噬菌体对雏鸡日常行为没有影响，解剖检查各组织器官均无异常。
实施例9
大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3控制禽致病性大肠杆菌HZTN01感染实验
实验选在广西壮族自治区兽医研究所动物房进行，实验对象为3日龄雏鸡；取30只3日龄雏鸡，随机分成5组，每组6只，给予充足的食物和饮水，饲养1周后为各实验组雏鸡分别从气管内注射不同剂量的菌液实施例1备用的宿主菌培养物(1×109、1×108、1×107、1×106cfu/只)，对照组腹腔注射等量的无菌PBS，观察实验雏鸡的死亡情况，引起一组雏鸡全部死亡的最小剂量即为最小致死量(MLD)；结果显示如表1所示，最小致死量(MLD)为1×109cfu/只。
表1雏鸡气管内注射不同剂量大肠杆菌的最小致死量确定
取21只3日龄雏鸡，随机分成3组，每组10只，给予充足的食物和饮水，饲养1周后以最小致死量(MLD)作为雏鸡的感染计量，对第1～2组雏鸡进行腹腔注射实施例1备用的宿主菌培养物(最小致死量浓度)，第3组注射等量的PBS，然后在第三小时开始对第1组雏鸡分别腹腔注射噬菌体制剂0.5ml进行治疗，第2组不进行任何治疗，连续观察7天雏鸡的死亡情况并记录分析。七天后无菌摘取各组雏鸡肝脏和脾脏进行定量载菌比较分析，结果如图8所示，噬菌体治疗组对雏鸡的保护率提升至70％，不治疗组雏鸡死亡率为90％，阴性对照组没有死亡，说明大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3能很好的控制禽致病性大肠杆菌对雏鸡的感染，降低死亡率，如图9所示，噬菌体治疗组雏鸡肝脏和脾脏载菌量均明显低于不治疗组。观察雏鸡的心脏、肝脏和盲肠表面，相比不治疗组雏鸡的心脏、肝脏和盲肠表面，噬菌体治疗组明显得到改善和治疗。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3，其特征在于，所述大肠肝菌噬菌体GXHZ-tn3已于2023年3月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCCNo:63262-B1。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3，其特征在于：所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3是在鸵鸟场化粪池污水中分离得到的。
3.根据权利要求1或2所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3，其特征在于：耐受温度≤60℃。
4.根据权利要求1或2所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3，其特征在于：耐受pH为5～10。
5.一种根据权利要求1～4任一项所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3的应用，其特征在于：所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3应用于分离感染大肠杆菌病鸵鸟的宿主多重耐药大肠杆菌HZTN01的消杀。
6.一种根据权利要求1～4任一项所述大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3在制备预防或治疗大肠杆菌感染的疾病的药物中的应用。
7.一种噬菌体组合物，其特征在于：所述噬菌体组合物包括权利要求1～4任一项所述的大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3。
8.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂有效成分包括权利要求1～4任一项所述的大肠杆菌噬菌体GXHZ-tn3或权利要求7所述的噬菌体组合物。
9.根据权利要求8所述噬菌体药物制剂，其特征在于：还包含药学上接受的载体。
10.根据权利要求9所述噬菌体药物制剂，其特征在于：所述噬菌体药物制剂的剂型为溶液剂或凝胶剂，用药途径为注射或外用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN117987379A (zh) * | 2024-02-21 | 2024-05-07 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 靶向ExPEC的噬菌体的制备方法及应用 |
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2023
- 2023-04-20 CN CN202310426728.XA patent/CN116515770A/zh active Pending
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