TWI487539B - 用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物及其用途、保養品 - Google Patents

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Wei Hsien Wang
Zhi Hong Wen
Yi Shan Wen
Tai Ting Chou
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Description

用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物及其用途、保養品
本發明係關於一種珊瑚萃取物以及其用途、保養品。更具體地說，係關於一種皮軟珊瑚(Briareum excavatum)，該萃取物具有提高皮膚保濕、彈性、抑制酪胺酸酶活性、減少黑色素形成，並減緩發炎細胞浸潤與控制傷口面積等功效。
由於海洋生態環境的特殊性使得海洋生物產生的次級代謝產物的生物合成途徑和酶反應系統與陸地生物相比有顯著的的差異，導致海洋生物往往能夠產生一些化學結構新穎、生物活性多樣的具有與陸生生物完全不同結構特徵的海洋次級代謝產物。
珊瑚屬於腔腸動物門，有9000餘種，是海洋中最常見的生物之一，約占海洋生物種類的22.4%，是可以大量利用的海洋生物資源。軟珊瑚目(gorgonian)俗稱海扇、海鞭、海柳，是珊瑚動物中的一大分支。在對珊瑚化學成分的研究中，自美國的Weinheiner等於1969年從軟珊瑚目中發現豐富的具有獨特結構和強烈生理活性的前列腺素前體以來，吸引了眾多天然產物化學 家把研究物件從陸地生物轉向海洋生物，大量被發現的海洋天然產物具有廣泛的生物活性，主要作用於神經系統、心血管系統、免疫系統等，且許多有顯著的抗腫瘤活性。
近年來對軟珊瑚的研究仍很活躍，例如，從Briareum屬的軟珊瑚目中發現眾多有活性的briarane型二萜，但囿於野生珊瑚來源的限制，故有學者嘗試對軟珊瑚目中的皮軟珊瑚(Briareum excavatum)進行實驗室人工養殖，然而迄今並無任何文獻資料或專利前案曾經揭示，可以從皮軟珊瑚得到具有抑制酪胺酸酶活性、加速傷口癒合並可抗發炎之萃取產物或經純化的化合物。
鑑於上述先前技術的不足，本發明之一目的為提供一種珊瑚萃取物，其係由皮軟珊瑚(Briareum excavatum)萃取而得，具有提高皮膚保濕、彈性、抑制酪胺酸酶活性、減少黑色素形成，並減緩發炎細胞浸潤與控制傷口面積等功效。該珊瑚萃取物係藉由下列步驟所製得：a.以一有機混合溶劑萃取乾燥皮軟珊瑚(Briareum excavatum)樣品，獲得有機層初萃取液，其中該有機混合液係包含等比例之C1 -C4 醇類和C1 -C4 之含氯烷類；b.以水和低級酯類分配萃取該有機層初萃取液，獲得一低級酯類粗萃物，該低級酯類粗萃物係含有5~50%之一珊瑚活性成分。
本發明之另一目的在於提供一種珊瑚萃取物之萃取方法，其方法簡便易於量產。該方法包含：a.以一有機混合液萃取乾燥皮軟珊瑚(Briareum excavatum)樣 品，獲得有機層初萃取液，其中該有機混合液係包含等比例之C1 -C4 醇類和C1 -C4 之含氯烷類；b.以水和低級酯類分配萃取該有機層初萃取液，獲得一低級酯類粗萃物，該低級酯類粗萃物係含有5~50%之一珊瑚活性成分。
於一較佳實施樣態中，其中b.步驟之該低級酯類粗萃物可進一步以一管柱層析分析加以純化，其係以一沖提液沖提該低級酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該沖提液之沖提梯度係由正己烷/乙酸乙酯之一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇之一第二混合溶劑所提供。
於一具體實施樣態中，a.步驟之C1 -C4 醇類可為甲醇，但不僅限於此，其他C1 -C4 醇類，如乙醇、丙醇等亦可。於另一具體實施樣態中，a.步驟之C1 -C4 之含氯烷類係為二氯甲烷，但不僅限於此，其他C1 -C4 之含氯烷類，如二氯甲烷、氯仿等亦可。
於一較佳實施樣態中，b.步驟之低級酯類可為乙酸乙酯。
於另一實施樣態中，第一混合溶劑中正己烷之溶劑梯度可為0%-99%。意即，正己烷：乙酸乙酯分別可以99：1至0：100之任一比例形成梯度，例如：99：1至93：7、90：10至70：30、60：40至50：50、10：90至0：100間之任一比例。
於另一實施樣態中，乙酸乙酯/甲醇之混合溶劑中乙酸乙酯之溶劑梯度比例為0%-90%。意即，乙酸乙酯：甲醇分別可以90：10至0：100之任一比例形成梯度，例如：90：10至50：50、40：60至0：100間之任一比例。
於一較佳實施樣態中，該珊瑚活性成分可將該低級酯類粗萃物進一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑之沖提梯度可為：正己烷：乙酸乙酯為90：10至70：30之劃分(fraction)。較佳地，前述珊瑚活性成分經沖提後於該低級酯類粗萃物所佔比例可為5-30%。
於一較佳實施樣態中，該珊瑚活性成分可將該低級酯類粗萃物進一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑之沖提梯度可為：正己烷：乙酸乙酯為60：40至50：50之劃分(fraction)。較佳地，前述珊瑚活性成分經沖提後於該低級酯類粗萃物所佔比例係為20-50%。
本發明之另一目的在於提供一種珊瑚萃取物之用途，其係將前述之珊瑚萃取物施用於一活體之皮膚，以使皮膚美白。
本發明之另一目的在於提供一種珊瑚萃取物之用途，其係將前述之珊瑚萃取物施用於一活體之皮膚，以使皮膚保濕。
本發明之又一目的在於提供一種珊瑚萃取物之用途，其係將前述之珊瑚萃取物施用於一活體之皮膚，以改善皮膚彈性。
本發明之又一目的在於提供一種使用前述之珊瑚萃取物在製備抗發炎之藥物的用途。
本發明之再一目的在於提供一種使用前述之珊瑚萃取物在製備治療皮膚創傷之藥物的用途。
本發明之再一目的在於一種保養品，其係包含前述之珊瑚萃取物，其中珊瑚萃取物可具0.00001~10%之重量比。
第一圖係養殖型皮軟珊瑚(Briareum excavatum)有效成分之粗萃及分離步驟。
第二圖係BP1之1 H-NMR圖譜。
第三圖係BP2之1 H-NMR圖譜。
第四圖係BP3之1 H-NMR圖譜。
第五圖係BP4之1 H-NMR圖譜。
第六圖係BP5之1 H-NMR圖譜。
第七圖係BP6之1 H-NMR圖譜。
第八圖係BP7之1 H-NMR圖譜。
第九圖係皮軟珊瑚各粗萃取進行動物皮膚過敏性測試結果。
第十圖係離體酪胺酸酶活性測試之實驗結果。
第十一圖係離體黑色素含量測試之實驗結果。
第十二圖係BP2活體美白活性分析之實驗結果。
第十三圖係BP3活體美白活性分析之實驗結果。
第十四圖係以老鼠之纖維母細胞：NIH/3T3進行離體傷口癒合測試實驗之結果，圖中(A)(B)為控制組，不給予測試物；(C)(D)BP2低劑量組，濃度為10μg/ml；(E)(F)BP2高劑量組，濃度為20μg/ml；(G)(H)BP3低劑量組，濃度為10μg/ml；(I)(J)BP3高劑量組，濃度為20μg/ml；(K)各組之統計數據。
第十五圖係以人類臍靜脈內皮細胞株：EA.hy926進行離體傷口癒合測試實驗之結果，圖中(A)(B)為控制組，不給予測試物；(C)(D)BP2低劑量組，濃度為10μg/ml；(E)(F)BP2高劑量組，濃度為20μg/ml；(G)(H)BP3低劑量組，濃度為10μg/ml；(I)(J)BP3高劑量組，濃度為20μg/ml；(K)各組之統計數據。
第十六圖係以3mg/0.2ml的BP2、BP3、純乳液治療之傷口癒合試驗之實驗結果。
第十七圖係以40μg/0.2ml的BP2、BP3、粗萃物、純乳液治療之傷口癒合試驗之實驗結果。
第十八圖係利用HE染色(5X)之大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片，圖A為控制組、圖B為燒燙傷組、圖C為BP2組、圖D為BP3組，給予天然物濃度皆為3mg/0.2ml。
第十九圖係利用HE染色(5X)之大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片，圖A為控制組、圖B為燒燙傷組、圖C為BP2組、圖D為BP3組、圖E為粗萃物組，給予天然物濃度皆為40μg/0.2ml。
第二十圖係3種雛型保養品與空白組及乳霜基質在保濕比較。
第二十一圖係3種雛型保養品與空白組及乳霜基質在彈力的比較。
接著，本發明之實施例依下列例子詳細描述，但不限於此。本發明之上述及其他目的、特徵及優點將因以下敘述及後附圖式 而變得更加清楚。
製備例1：以有機溶劑萃取皮軟珊瑚
將大量養殖於0.6噸養殖水缸的生物樣品Briareum excavatum皮軟珊瑚(1021.49g，濕重)進行冷凍乾燥，並將乾燥的珊瑚組織磨碎(得乾重417.75g)，接著以有機溶劑甲醇/二氯甲烷(1：1)混合比例在室溫下萃取，經多次重複萃取至添加的有機溶劑呈現澄清後，得到有機層初萃取液。再將初萃取液過濾後進行減壓濃縮，得到的粗萃物以水和乙酸乙酯進行分配萃取，經過分配萃取與減壓濃縮後得到乙酸乙酯層的粗萃物(15.75g)。再進行下述分離流程後可取得BP2(2.44g，約佔粗萃物的15.5%)及BP3(5.6g，約佔粗萃物的35.6%)。
製備例2：粗萃物分離流程
參見第一圖，利用管柱層析法對乙酸乙酯層進行初步的分離，選用的填充劑為矽膠(Merck,230-400mesh)，以正己烷/乙酸乙酯與乙酸乙酯/甲醇的混合溶劑為沖提液作梯度沖提，共分為七個劃分(fraction)，各劃分的沖提條件如下所示：
劃分1(BP1)：Hexane：EtOAC(正己烷：乙酸乙酯)99：1~93：7。
劃分2(BP2)：Hexane：EtOAC(正己烷：乙酸乙酯)90：10~70：30。
劃分3(BP3)：Hexane：EtOAC(正己烷：乙酸乙酯)60：40~50：50。
劃分4(BP4)：Hexane：EtOAC(正己烷：乙酸乙酯)40：60~20：80 。
劃分5(BP5)：Hexane：EtOAC(正己烷：乙酸乙酯)10：90~0：100。
劃分6(BP6)：EtOAC：MeOH(乙酸乙酯：甲醇)90：10~50：50。
劃分7(BP7)：EtOAC：MeOH(乙酸乙酯：甲醇)40：60~0：100。
之後每一個劃分經過減壓濃縮後以核磁共振儀作檢測，得到1 H-NMR圖譜的訊號(請參見第二圖至第八圖)作為判斷指標成分存在依據，以利進行更進一步的生物活性實驗的依據。
測試例1：離體抗發炎活性測試
1.天然物篩選及細胞株使用
針對梯度沖提步驟後粗萃取物，使用酯多糖誘發小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞株離體發炎模式進行篩選工作。控制6公分培養皿之小鼠巨噬細胞RAW 264.7數目在3 x 106 個，先給予粗萃取物，再給予酯多醣(LPS)16-18小時後收集細胞。
2.西方點墨法蛋白質表現量分析
使用4%磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS)(137mM NaCl,2.68mM KCl,10mM Na2 HPO4 ,1.76mM KH2 PO4 ,pH=7.2)收集至1.5ml離心管中，待以3000rpm離心8分鐘後去除上清液，再加入溫度4℃之lysis buffer 200μl(50mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl,1% TritonX-100,0.1mM EDTA,0.1mM EGTA,100μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride,1μg/ml Aprotinin,20mM NaF,0.2mM Na3 VO4 )打 破細胞膜後，在溫度4℃之下，以14,000rpm離心30分鐘，取出上清液並仿照Lowry等人的方法(Lowry et al.,1951)進行蛋白質定量。
使用Bio-Rad DC protein assay kit(Hercules，CA，USA)及酶測讀儀(Thermo Electron Corporation,USA)分析上清液的吸光值，以測定各標本之蛋白質量。將經校正後取樣本總體積之三分之一體積的標本緩衝液(sample buffer；2% SDS,10% glycerol,0.1% bromophenol bule,10% 2-mercaptoethanol,50mM Tris,Bio-Rad Laboratories,inc)。利用7%、10%之SDS-PAGE以80伏特電壓分離蛋白質。將SDS-PAGE上之蛋白質以135毫安培電流轉置overnight到PVDF膜(0.45mm pore size,Immobilon-P,Millipore,Bedford,MA,USA)上。
轉印後的PVDF膜以含5%脫酯奶粉TTBS溶液(Tris-Tween buffer saline)(Tris-HCl 20mM,NaCl 137mM，pH 7.4，0.1% Tween 20)在室溫下覆蓋40分鐘，再與1：1000稀釋比例的針對誘發型一氧化氮合成酶和第二型環氧化酶作用的一級抗體在室溫下反應兩小時。隨後以TTBS溶液清洗三次，接著以HRP-conjugated之anti-rabbit IgG抗體(1：2000)在室溫中反應一小時三十分鐘，二級抗體結束後以TTBS溶液清洗三次，最後利用呈色液(Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate,Millipore Corporation,Billerica,MA 01821 U.S.A.)與PVDF膜反應，並以影像分析處理設備(UVP Biospectrum ACSystem,UVP Inc,U.S.A.)偵測冷光反應，紀錄蛋白質的表現量，以電腦分析軟體(VisinWorks LS Acquisition and analysis software,copyright 2007,LLC,U.S.A.)偵測並計算相對量。並以單獨加入酯多醣組別為100%，最後以α-actin作為內控制組。
其結果比較不同劃分層之粗萃取物在離體抗發炎的成果，進一步作為活體實驗模式和其他離體實驗模式做為參考。
3.使用的目標抗體
(1)誘發型一氧化氮合成酶(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA：catalog no.6103322：polyclonal antibody)，稀釋比例1：2000。
(2)第二型環氧化酶(Cayman Chemical,USA；catalog no.160106；polyclonal antibody)，稀釋比例1：2000。
(3)β-actin(sigma,St.Louis,MO,USA；catalog no.A5316-2ML；monoclonal antibody)，稀釋比例1：2000。
4.試驗結果
參見第九圖，其係比較不同劃分層之粗萃取物在離體抗發炎的效果，結果發現20μg/ml的BP2(劃分2)及BP3(劃分3)即具有非常明顯的離體抗發炎效果。
測試例2：美白活性分析A.離體酪胺酸酶活性測試(in vitrotyrosinase activity assay)
1.試驗步驟
試驗步驟參照Wang(2010)的研究報告，其整體皆引作為本案 的參考資料。將B16-F10種入24小格培養盤(24 well plate)的孔洞中，每小格種入1*105 個細胞，放置於37℃、5% CO2 的培養箱24小時後，將原有的細胞培養液移除，並加入含有粗萃物的細胞培養液，再放入培養箱培養48小時。給藥結束後移除原有細胞培養液，並加200μl PBS潤洗一次，然後加入100μl trypsin作用1~2分鐘使細胞脫離底面，然後加入200μl細胞培養液中和trypsin反應，並將含細胞的培養液裝入微量離心管內以3000rpm離心5分鐘後去除上清液，加入200μl PBS潤洗一次，再以3000rpm離心5分鐘，去除上清液，加入100μl 1% triton X-100/PBS，混合均勻使細胞破碎。接著在4℃下以10000rpm離心10分鐘，取上清液進行蛋白質定量。在同濃度下的蛋白質，取等體積上清液和L-dopa(2mg/ml)混合，反應一小時後利用酶測讀儀測波長475nm的吸光值做統計整理。
2.試驗結果
參見第十圖，其係利用加入不同濃度BP2及BP3於黑色素瘤細胞，48小時後進行酪胺酸酶活性分析之實驗結果，其中X軸為各濃度藥物，Y軸為離體酪胺酸酶活性/黑色素含量，若產生之生成物愈多，則表示催化強度愈強量。由此結果發現在相同蛋白質濃度下，給予BP2及BP3的組別皆具有抑制酪胺酸酶的活性，且隨著濃度提升呈現劑量依存(dose-dependent)的趨勢。
B.離體黑色素含量測試(in vitromelanin content assay)
1.試驗步驟
試驗步驟參照Wang(2010)的研究報告，其整體皆引作為本案 的參考資料。將B16-F10種入24小格培養盤的孔洞中，每小格種入1*105 個細胞，放置於37℃、5% CO2 的培養箱24小時後，將原有的細胞培養液移除，加入含有粗萃物的細胞培養液，再放入培養箱培養48小時後，以200μl PBS潤洗一次，然後加入100μl trypsin作用1~2分鐘使細胞脫離盤底，然後加入200μl細胞培養液中和trypsin反應，裝入微量離心管內以3000rpm離心5分鐘，去除上清液。再加入200μl PBS潤洗一次，並以3000rpm離心5分鐘，去除上清液後，加入100μl 1N NaOH在80℃下反應一小時。利用酶測讀儀測波長405nm的吸光值做統計整理。
2.試驗結果
參見第十一圖，其係利用加入不同濃度BP2及BP3於黑色素瘤細胞48小時後進行黑色素(melanin)含量測定之實驗結果。將細胞加入氫氧化鈉並加熱溶解後，利用分光光度計測定波長為490nm的吸收值時，吸收值愈高則說明黑色素含量也愈高。由數據顯示結果與酪胺酸酶活性相吻合，隨著藥物濃度愈高，降低的酪胺酸酶活性愈顯著，而黑色素的表現量亦隨著下降。
C.蘑菇酪胺酸酶抑制能力分析
1.實驗步驟
在96 well plate中，於每個孔洞中加入70μl的PB、20μl各種不同濃度的檢品溶液，混合均勻。接著加入10μl之12U酪胺酸酶，放入37℃培養箱中反應30分鐘。再加入10μl的15mM L-dopa，繼續放入培養箱中反應30分鐘後，於波長492nm之下測其吸光值的變化量。以H2 O或50%EtOH作為控制組。以下式之抑 制酪氨酸酶百分率求得待測物之抗氧化率。抑制脂質過氧化率(%)愈高，表示抗氧化性愈強。
抑制酪氨酸酶百分率(Inhibition of Tyrosinase %,IT%)=[1-(樣品於492nm的吸光值)/(未添加樣品之控制組於492nm的吸光值)]×100。
2.實驗結果
酪胺酸酶為黑色素形成的速率決定因子，如果待測物可抑制酪胺酸酶的活性，便可減少dopaquinone類化合物的產生，在492nm的波長下所測得的吸光值則相對減少，由吸光值的高低可推算出待測物抑制酪胺酸酶活性的能力，進而可抑制黑色素生成。實驗結果發現，在500μg/ml及1000μg/ml的BP2及BP3具有顯著抑制酪胺酸酶活性，其實驗結果可參見下表1：
D.活體美白活性分析
1.實驗步驟
a.種魚飼養：
實驗使用魚齡四個月以上之斑馬魚(AB strain Danio rerio)為實驗種魚，飼養於具有過濾器以及循環系統之壓克力水 缸中，水溫控制於28.5℃。光暗週期分別控制為14與10小時。
b.藥品配製：
欲檢測之藥品須先溶於100% DMSO溶液中，最終濃度必須同時考慮到DMSO以及藥品濃度。
c.藥物給予：
取受精後9小時之胚胎，注入96小格培養盤中，每小格內有3個胚胎及100μl的Hank’s buffer，再將配好之藥品取100μl注入孔洞中，充分混合均勻後蓋上孔盤蓋避免水分散失造成濃度改變。置入低溫光照培養箱(Model RI-80,Firstek,Taiwan)，控制光暗週期分別為14與10小時(必須與種魚之光週期相同)，且溫度維持於28.5℃，持續浸泡給藥48小時。
d.魚體影像擷取
下藥後48小時(即受精後57小時)，取出幼魚以麻醉劑(MS-222,168ppm Tricaine)麻醉後個別依序放置於凹玻片(Micro Scientific Laboratories,Inc.,U.S.A.)之凹槽中，利用1%甲基纖維(Methyl Cellulose)(Sigma,U.S.A.)幫助固定魚體再利用實體顯微鏡(Z16 APO,Leica,Heerbrugg,Switzerland)觀察，搭配影像擷取系統(idea SPOT,Diagnostic instruments Inc.,U.S.A.)及其控制軟體(SPOT software VERSION 4.6,Diagnostic instruments Inc.,U.S.A.)，來取得魚體影像。本實驗曝光時間設為3.372msec。
e.數據處理：
將取得的魚體影像利用影像處理軟體(Image J 1.43g；National Institute of Health,Bethesda,MD,USA)開啟，在最低閾值設為0，最高閾值設為85的範圍下，定量分析各組斑馬魚的黑色素值。
2.實驗結果：
參見第十二及十三圖，觀察斑馬魚的黑色素值，熊果素在20mM(約等於5446μg/ml)時色素含量剩50%左右，而隨著BP2及BP3的濃度愈高，色素含量逐漸下降至70%，本實驗結果BP2及BP3美白程度雖然沒有較正控制組優越，但其濃度為熊果素的五百分之一倍，因此這兩種粗萃物具有極佳的美白潛力的有效成分。
測試例3：促傷口癒合活性分析
A.促傷口癒合活性分析
1.實驗步驟
以纖維母細胞(fibroblast，NIH/3T3)及人類臍靜脈內皮細胞株(human umbilical vein cell line，EA.hy926)之移動作用(in vitro wound healing assay)做法參考Rodriguez(2005)10)的研究，其整體皆引用做本案的參考資料。將細胞種入12小格培養盤(12 well plate)的孔洞中，每小格種入5*105個細胞，放置於37℃、5% CO2 的培養箱24小時後，將原有的細胞培養液移除，並利用200μl tip劃出一道水平的傷痕。接著加入200μl PBS潤洗一次，再加入含有粗萃物的細胞培養液後拍照，再放置於37℃、5% CO2 的培養箱24小時後於同一區塊拍照，利用影像分析軟體(TScratch version 1.0)分析照片取得數據後做統計整理。
2.實驗結果
參見第十四圖，其係以老鼠之纖維母細胞：NIH/3T3進行離體傷口癒合測試實驗結果，圖中(A)(B)為控制組，不給予測試物；(C)(D)BP2低劑量組，濃度為10μg/ml；(E)(F)BP2高劑量組，濃度為20μg/ml；(G)(H)BP3低劑量組，濃度為10μg/ml；(I)(J)BP3高劑量組，濃度為20μg/ml。並利用SPOT Advanced軟體計算影像中刮痕部分之面積，求出第24小時細胞覆蓋刮痕之面積後進行統計分析，如圖(K)。結果顯示，給予BP2之低劑量組與高劑量組的細胞覆蓋面積都比控制組明顯提升。
參見第十五圖，其以人類臍靜脈內皮細胞株：EA.hy926進行離體傷口癒合測試實驗結果，圖中(A)(B)為控制組，不給予測試物；(C)(D)BP2低劑量組，濃度為10μg/ml；(E)(F)BP2高劑量組，濃度為20μg/ml；(G)(H)BP3低劑量組，濃度為10μg/ml；(I)(J)BP3高劑量組，濃度為20μg/ml。並利用SPOT Advanced軟體計算影像中刮痕部分之面積，求出第24小時細胞覆蓋刮痕之面積後進行統計分析。結果顯示，給予BP2、BP3低劑量組與控制組之細胞覆蓋面積相比較之下均有顯著增加。
B.活體促傷口癒合活性分析
1.傷口癒合試驗：
a.實驗動物準備：實驗動物為400-450g的Wistar大白鼠公鼠，飼養在中山大學海洋資源館動物室中。光週期維持12小時光照12小時黑暗，大白鼠可以自由取用飲水及食物。並以空調系統控制飼養環境的溫度和溼度，使環境溫度保持在23℃。
b.燒燙傷傷口製造：本活體促傷口癒合活性分析參照Huang(2008)11)，其整體皆引用做本案的參考資料。將大白鼠隨機分組後，以2.5% isoflurane麻醉下(麻醉機：Isotec 4,Ohmeda)使用動物剃毛機背部除毛，再使用刮鬍刀剃除乾淨。利用酒精消毒後，使用手術刀片將大白鼠背部移除直徑2公分之全層皮膚，治療組依照實驗設計立即給予藥物，受傷組則不做任何治療，手術完成後每隻大白鼠獨立飼養。
c.對傷口給予天然物：每日相同時間取天然物(該天然物係珊瑚粗萃物與申請人提供的空白基劑進行混合使用，其中該空白基劑詳細成分參見下述)均勻敷於傷口上。每次治療前先將傷口用滅菌生理鹽水清洗把前日剩餘之天然物清潔，同時除去異物，再用無菌棉棒將生理食鹽水拭乾後，於傷口上均勻敷藥。
d.傷口觀察與面積計算：依實驗設計之日期於燒燙傷後，將大鼠麻醉後置於翻拍架上，以數位相機(Coolpix P6000,Nikon,Japan)在相同條件下(光圈7.2、快門1/60秒)拍攝一系列照片。使用數位影像擷取系統軟體(Diagnostic Instruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)，分析攝影所得傷口照片以計算傷口面積。各觀察時間點傷口面積的數據呈現部分，則是分別以相對於第0天傷口面積的百分比方式表現。同時測量大白鼠體重，並觀察大白鼠有無外觀或行為上明顯異樣。
2.實驗結果
參見第十六圖其係以175℃銅塊置於大白鼠背上10秒，分別創造4個燙傷傷口，之後每天給予各傷口3mg/0.2ml的BP2、BP3、 純乳霜作治療之結果。其結果證實燙傷後時間(day)與傷口恢復面積(%)的關係，在給藥後8天內，BP3對抑制發炎與控制傷口面積的效果較好，而BP2則是在8天後有較佳的療效。
如第十七圖所示，另以不同濃度的40μg/0.2ml的BP2、BP3、粗萃、純乳液對燙傷傷口治療。圖中證實燙傷後時間(day)與傷口恢復面積(%)的關係，從第2天開始到實驗結束，BP3及BP2組，都有加速治療傷口的能力。
C.組織切片試驗：
1.試驗步驟：
a.病理組織切片與HE染色：
依實驗設計於受傷後特定天數將大白鼠予以人道犧牲後，以4℃含有肝素(0.2U/ml)的PBS由主動脈灌流，直到靜脈流出不帶血色之PBS。再以4℃之4%仲甲醛(paraformaldehyde)灌流固定。最後用手術刀將受傷區域仔細取下，浸泡於10%福馬林固定液存放在4℃環境下固定數天。
接下來進行固定組織進行脫水與滲蠟處理，利用組織自動處理系統將皮膚組織進行脫水及滲蠟，接著以石蠟組織包埋機將組織包埋成石蠟塊。然後以石蠟切片機進行組織切片後，使用蘇木紫-伊紅染色法進行組織切片染色。完成後以封片膠封片，再將完成的樣品玻片置於光學顯微鏡觀察，結合數位影像擷取系統拍攝和紀錄切片結果。
病理組織切片分析之操作流程參考Bayat(2005)12)之方法， 其整體皆引用做本案的參考資料。在400X視野下，從每個皮膚組織樣本的真皮層內隨機選取20個區塊，並進一步針對嗜中性白血球、巨噬細胞以及淋巴球等白血球數目進行定量。另外為了評估受傷皮膚恢復狀況，所以分別在每個皮膚組織樣本的表皮、真皮和橫紋肌等3個部位各隨機選取20個點，進行量測這3層分別之厚度。關於以上這些病理組織切片分析，皆是由對動物分組不知情的試驗者進行操作。
b.免疫組織化學染色法：
將皮膚組織以4%仲甲醛後固定兩小時後，轉置至4℃的30%蔗糖溶液中隔夜後。為減低免疫組織化學上之差異，本案採用修改自先前研究(Sung et al.,2003；Chen et al.,2008)13,14)的方法進行操作。故將各組皮膚組織包埋於同一個組織塊中。包埋完畢的組織塊則使用冷凍切片機在-30℃下進行組織切片，每切片厚度為5μm。將冷凍切片樣本於室溫下乾燥1小時後，置於4%仲甲醛溶液中10分鐘。再以PBS稀釋之山羊血清(4%)於室溫下反應1小時後，分別覆蓋於含有抗體之PBS(含有0.01% Triton X-100與2%山羊血清)置於4℃下隔夜。而後，分別以帶有綠色螢光之二級單株抗體(Alexa Fluor 488-conjugated secondary monoclonal antibody)或帶有紅色螢光之二級多株抗體(rhodamine-conjugated secondary polyclonal antibody)覆蓋切片在室溫下反應1小時。二級多株抗體結束後利用Leica DM-6000B螢光顯微鏡(Leica,Wetzlar,Germany)觀察，並使用SPOT Xplorer數位影像擷取系統(Diagnostic Instruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)擷取影像。在觀察綠色螢光 時，設定螢光顯微鏡的雷射波長於488nm；而進行觀察紅色螢光影像時，則是設定雷射波長為568nm。每次擷取螢光影像時都使用2.5倍物鏡固定相同曝光時間，影像尺寸在每種實驗條件下均保持相同。不知情的觀察者在未被告知實驗內容下使用Image J這套軟體(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)針對各組免疫活性進行計算。
2.試驗結果：
第十八圖利用HE染色(5X)探討粗萃物對於大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片的影響，第十八圖A為控制組、第十八圖B為燒燙傷組、第十八圖C為BP2組、第十八圖D為BP3組，給予天然物濃度皆為3mg/0.2ml。由HE拍照結果可以看到，相對於無受傷的控制組(圖A)，燒燙傷組(圖B)與治療組(圖C、圖D)之上皮層均有增厚之現象，尤其燒燙傷組(圖B)比治療組(圖C)厚上許多，相對於燒燙傷組，治療組(圖C)的表皮層表面較為平滑。在燒燙傷組和治療組中皆可發現肉芽組織，顯示燒燙傷會引起真皮組織受損，與誘使發炎細胞浸潤(inflammatory cell infitration)，而治療組浸潤的程度低於燒燙傷組。
第十九圖利用HE染色(5X)探討粗萃物對於大白鼠燒燙傷皮膚組織病理切片的影響，第十九圖A為控制組、第十九圖B為燒燙傷組、第十九圖C為BP2組、第十九圖D為BP3組、第十九圖E為粗萃物組，給予天然物濃度皆為40μg/0.2ml。由HE拍照結果可以看到，相對於無受傷的控制組(圖A)，燒燙傷組(圖B)與治療組(圖E)之上皮層均有大量噬中性白血球產生，而治療組(圖C、圖D)的上皮層中則噬中性白血球較少，且治療組(圖C)已經有毛囊再生 。
依據以上結果，顯示BP2與BP3對於燙傷傷口都有加速復原的情形，並且在低濃度40μg/0.2m的時似乎比在3mg/0.2ml時有更好的療效。
測試例4：皮軟珊瑚有效成分雛型保養品功效性試驗
1.膚質檢測儀進行膚質改善監控：
以Aramo-TS多功能膚質檢測儀進行膚質功效性評估，10位受測者的手臂內側分區每日塗抹測試樣品(空白基劑、珊瑚乳霜：BP2(200μg/ml)乳霜、BP3(200μg/ml)乳霜、珊瑚粗萃(200μg/ml))乳霜))，並於每週進行測試，持續進行6週，結果以paired Student’sT-Test統計分析塗抹後與背景值的差異，空白基劑及皮軟珊瑚有效成分雛型保養品之有效成分整理如下表2，其中空白基劑與珊瑚乳霜的差異僅在於為珊瑚萃取物的有無。
2.試驗結果
結果如第二十圖及第二十一圖所示，受試者使用添加皮軟珊瑚有效成分的雛型保養品4週之後，有明顯改善受測者於皮膚的保濕度及彈性，尤其以珊瑚的BP2乳霜功效最好。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。

Claims (15)

  1. 一種用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其係藉由下列步驟所製得：a.以一有機混合液萃取乾燥皮軟珊瑚(Briareum excavatum)樣品，獲得有機層初萃取液，其中該有機混合液係包含等比例之C1 -C4 醇類和C1 -C4 之含氯烷類，其中前述C1 -C4 醇類係為甲醇；b.以水和低級酯類分配萃取該有機層初萃取液，獲得一低級酯類粗萃物，該低級酯類粗萃物係含有5~50%之一珊瑚活性成分。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中b.步驟之該低級酯類粗萃物係進一步以一管柱層析分析加以純化，其係以一沖提液沖提該低級酯類粗萃物，以得一沖提物，其中該沖提液之沖提梯度係由正己烷/乙酸乙酯之一第一混合溶劑與乙酸乙酯/甲醇之一第二混合溶劑所提供。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中a.步驟之C1 -C4 之含氯烷類係為二氯甲烷。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中b.步驟之低級酯類係為乙酸乙酯。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該第一混合溶劑中正己烷之溶劑梯度為0%-99%。
  6. 如申請專利範圍第2項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該第二混合溶劑中乙酸乙酯之溶劑梯度比例為0%-90%。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該珊瑚活性成分係將該低級酯類粗萃物進一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑之沖提梯度係為：正己烷：乙酸乙酯為90：10至70：30之劃分(fraction)。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該珊瑚活性成分經沖提後於該低級酯類粗萃物所佔比例係為5-30%。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該珊瑚活性成分係將該低級酯類粗萃物進一步由該第一混合溶劑加以沖提而得，其中該第一混合溶劑之沖提梯度係為：正己烷：乙酸乙酯為60：40至50：50之劃分(fraction)。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用於皮膚美白、保濕、改善彈性以及傷口癒合之珊瑚萃取物，其中該珊瑚活性成分經沖提後於該低級酯類粗萃物所佔比例係為20-50%。
  11. 一種珊瑚萃取物之用途，其係將如申請專利範圍第1項所述之珊瑚萃取物在製備使皮膚美白之藥物的用途。
  12. 一種珊瑚萃取物之用途，其係將如申請專利範圍第1項所述 之珊瑚萃取物施用於一活體之皮膚，以使皮膚保濕。
  13. 一種珊瑚萃取物之用途，其係將使如申請專利範圍第1項所述之珊瑚萃取物施用於一活體之皮膚，以改善皮膚彈性。
  14. 一種使用如申請專利範圍第1項所述之珊瑚萃取物在製備治療皮膚創傷之藥物的用途。
  15. 一種保養品，其係包含如申請專利範圍第1~10項任一項所述珊瑚萃取物，其中該珊瑚萃取物具0.00001~10%之重量比。
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