CH703390B1 - Auf Haarfollikel-Stammzellen wirkende Zusammensetzung zur Stimulation des Haarwachstums. - Google Patents

Abstract

Eine auf Haarfollikelstammzellen wirkende Zusammensetzung zur Stimulation des Haarwachstums umfasst eine synergistische Kombination aus: i) einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Expression von Proteinmarkern fördert, die mit dem Wachstum und der Proliferation von Follikelstammzellen assoziiert sind, und ii) einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Proliferation von mesenchymalen Zellen der Hautpapille stimuliert, sowie einen kosmetisch annehmbaren Träger. Dabei umfasst die biologisch aktive Komponente i) ein Peptid-Extrakt aus Reis, während die biologisch aktive Komponente ii) Corosolsäure umfasst.

Description

Gebiet der Erfindung

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft eine auf Haarfollikelstammzellen wirkende Zusammensetzung zur Stimulation des Haarwachstums.

[0002] Die vorliegende Erfindung stammt aus dem Bereich der Trichologie und insbesondere aus dem Bereich der topisch anwendbaren Präparate zur Stimulation des physiologischen Neuwachstums der Haare.

[0003] Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine topisch anwendbare, auf humane Haarfollikelstammzellen wirkende trichologische Lotion zur Stimulation des physiologischen Neuwachstums der Haare in den von Ausdünnung und/oder Kahlheit betroffenen Bereichen.

Stand der Technik

[0004] Der Lebenszyklus des Haares umfasst bekanntlich drei unterschiedliche Phasen, die aufeinander folgen und als Anagen (Wachstumsphase), Katagen (Rückbildungsphase) und Telogen (Ruhephase) bezeichnet werden. Auf die Wachstumsphase des Haares folgt eine Regressionsphase, in deren Verlauf der unterste Teil des Follikels den programmierten Zelltod erfährt.

[0005] Das Wachstum des Haares und der Lebenszyklus des Haarfollikels werden von Follikelstammzellen selbst gesteuert, die in seinem beständigen, als Wulstregion (engl.: «bulge») bezeichneten Teil lokalisiert sind. Die Wulststammzellen sind von geringer Grösse und befinden sich in einem Zustand der zellulären Inaktivität, bei welchem es sich um die Ruhephase der Zelle handelt, die alternativ als GO-Phase des Zellzyklus definiert wird (Garza L.A. Cotsarelis et al., The Journal of Clinical Investigation, 2011). Die Zellen der Wulstregion waren die ersten Haarfollikelzellen, die identifiziert wurden. Im Nachhinein konnte ihre Fähigkeit, den Haarfollikel, die interfollikuläre Epidermis und die Talgdrüsen zu bilden, nachgewiesen werden (Oshima et al., 2001; Cotsarelis, 2006). Die Zellen der Wulstregion zeichnen sich im Vergleich zu den Zellen anderer Regionen des Haarfollikels und der Epidermis durch die beste Fähigkeit für ein In-vitro-Wachstum aus. Die zum zellulären Schicksal durchgeführten Experimente auf Basis einer Markierung mit Nucleotid-Impulsen haben gezeigt, dass die Zellen der Wulstregion zur Ausbildung des unteren Follikels führen, welcher die äussere Haarwurzelscheide, die Haarwurzel, die Haarmatrix und das Haarmark umfasst (Ito et al., 2004). Die Fluoreszenzmarkierung der Wulstregionzellen unter Verwendung der promotorischen Aktivität des K15-Gens ergab, dass sich die von der Wulstregion stammenden Zellen in allen Arten der Epithelzellen des neuen unteren Haarfollikels und des Haarstiels finden und zudem in der Epidermis und in den Talgdrüsen vorhanden sind (Liu et al., 2003).

[0006] Roth et al. (2005) haben bestätigt, dass die Wulstregion des humanen Haarfollikels Keratinozyten-Stammzellen enthält, während die Haarmatrix einen Bezirk von sogenannten Transit-Amplifikations (TA)-Zellen darstellt, die sich im Zuge der Proliferation und Differenzierung befinden.

[0007] Lyle et al. (1998) haben gezeigt, dass humane Haarfollikel in der Telogen- und Anagenphase das Cytokeratin-15 KRT15-Protein und erhöhte Spiegel von β1-Integrin in der Basalschicht der Zellen exprimieren, welche die Haarzwiebel (sekundärer Haarkeim) in der Telogen- und der Anagenregion umgeben. Ab dem Zeitpunkt, wo das gesamte untere Follikelepithel unterhalb des Isthmus während der Katagenphase des Haarzyklus degeneriert, sind die telogenen Follikel eine reiche Quelle von Stammzellen. Die Matrix-Keratinozyten, die sich an der Unterseite der anagenen Haarzwiebelzellen befinden, stellen die TA-Zellen dar, welche schnell proliferieren und sich zu Epithelschichten des Haarfollikels differenzieren.

[0008] Es ist auch bekannt, dass die Follikel in die Anagenphase eintreten, wenn chemische Signale aus der dermalen Papille die im telogenen Follikelwulst ruhenden Stammzellen aktivieren und sie zur Vermehrung anregen, was eine Generation von Zellen hervorruft, die das neue Haar produzieren wird. Diese Zellen sind Transit-Amplifikationszellen oder Vorläuferzellen der Follikelmatrix, die das neue Haar erzeugen wird. Die Bulge-Zellen haben normalerweise einen sehr langsamen Zyklus, können aber wie gesagt durch die Hautpapille zur Proliferation stimuliert/aktiviert werden (Ryan R. et al. 2011; Roh C. et al. 2004).

[0009] In der Anagenphase produziert die Hautpapille chemische Signale, welche die Wulststammzellen aktivieren und instruieren, die in der Basisregion des Follikels migrieren und die Bildung der Haarmatrix einleiten. Mit dieser «Migration» erzeugen die Wulstregion-Stammzellen einen «Zellpfad», aus dem sich die äussere Hülle der Wurzel oder ORS entwickeln wird.

[0010] Als Reaktion auf zusätzliche Signale von der Hautpapille vermehren sich die aus den Stammzellen erhaltenen Matrix-Zellen und beginnen den Prozess der Differenzierung, wobei sie sich nach oben bewegen und dabei den Stamm und die innere Scheide des Haarfollikels bilden.

[0011] Der Beginn der Katagenphase ist durch die Beendigung der Zellproliferation und durch die Apoptose der Zellmatrix gekennzeichnet. Während der Katagenphase wandert die Hautpapille in den untersten Teil der Wulstregion. Es wird angenommen, dass diese enge Nähe zwischen Papille und Wulstregion für die Einleitung eines weiteren Haarzyklus entscheidend ist. Dies ermöglicht die Interaktion/Aktivierung von ruhenden Zellen der Wulstregion und einen neuen Zyklus des Haarwachstums. Zum Zeitpunkt des Katagen/Telogen-Übergangs wandern einige Wulstzellen zur Papille, wobei der Haarkeim gebildet wird.

[0012] Das Telogenhaar besitzt an seiner Basis eine Zellpopulation, die eben als Haarkeimzellen benannt werden und sich in unmittelbarer Nähe der dermalen Papille befinden. Der Haarkeim wird gegen Ende der Telogenphase noch vor der Wulstregion zur Proliferation aktiviert, um rund um die Papille die Matrix der neuen Haarzwiebel zu bilden.

[0013] Die aus den Wulststammzellen hervorgegangenen Keimzellen wie auch die Wulstzellen besitzen eine intrinsische Fähigkeit zur Vermehrung und sind direkt an der initialen Anagenphase beteiligt, wobei sie zur Bildung der verschiedenen Kompartimente des Follikels beitragen; in der Telogenphase sind sie hingegen ruhend. In jüngster Zeit wurde ein Zusammenhang zwischen Haarausfall und einem Defekt der Funktion der Haarfollikelstammzellen festgestellt. Insbesondere sind nach einer im Januar 2011 im Journal of Clinical Investigation veröffentlichten US-amerikanischen Studie bei der androgenetischen Alopezie, welche die häufigste Form des Haarausfalls darstellt, die Stammzellen der Haarfollikel auf der Kopfhaut wie ausgeschaltet oder «schlafend», anstatt aktiv zu sein. Gemäss den Forschern um George Cotsarelis von der University of Pennsylvania können sich die Stammzellen der inaktiven Follikel nicht zu reiferen Zellen, den so genannten Vorläuferzellen, entwickeln.

[0014] Bei Personen mit androgenetischer Alopezie (AGA) nimmt die Grösse der Follikel, die zu Beginn einer neuen Anagenphase neu gebildet werden, im Verlauf der Zeit ab (Miniaturisierung), was nach und nach zur Bildung eines im Vergleich zum bisherigen Haar dünneren Haares führt. Im Ergebnis kommt es zur Bildung eines mikroskopischen Haares.

[0015] Garza A.L., Cotsarelis et al. (2011) haben festgestellt, dass die androgenetische Alopezie durch eine fehlende Umwandlung von Haarfollikelstammzellen zu Vorläuferzellen gekennzeichnet ist.

[0016] Um zu dieser Schlussfolgerung zu gelangen, haben George Cotsarelis und Kollegen bei 54 Männern im Alter zwischen 40 und 65 Jahren die Proben der Kopfhaut mit beziehungsweise ohne Haarausfall untersucht. Dabei zeigte sich, dass in den Follikeln von Probanden mit Haarausfall im Vergleich zu denjenigen ohne Haarausfall deutlich weniger Vorläuferzellen vorhanden waren. Die Forscher schlossen daraus, dass der Haarausfall eher auf ein Problem bei der Aktivierung der Stammzellen zurückzuführen ist als auf die Anzahl der in den Follikeln vorhandenen Stammzellen, wenn die Umwandlung der Vorläuferzellen in der kahlen Kopfhaut eingeleitet werden soll. Die Tatsache, dass sogar in der kahlen Kopfhaut eine normale Anzahl von Stammzellen vorhanden ist, ermöglich es jedoch, deren «Reaktivierung» und die Entwicklung neuer topischer Behandlungen gegen die androgenetische Alopezie in Betracht zu ziehen. Mit der Untersuchung der globalen Genexpression von Wulstzellen konnte gezeigt werden, wie diese Zellen das intermediäre filamentöse Protein Keratin-15 (KRT15) exprimieren, während die Expression von CD34 auf Zellen beschränkt ist, die sich direkt unter dem Wulstbereich befinden und den Phänotyp einer Vorläuferzelle besitzen, welche am Ende der Anagenphase der zellulären Apoptose unterliegt. Eine erhöhte Expression von KRT15 ist stark mit dem Phänotyp einer Stammzelle (Inaktivitäts-Eigenschaft und kleine Abmessungen) korreliert. KRT15 stellt somit einen Marker der Stammzellenaktivität dar.

[0017] In ihrer Studie isolierten Garza AL et al. monozelulläre Suspensionen von Epithelzellen aus kahlen und nicht kahlen Kopfhautregionen von Probanden mit AGA. Die KRT15-Bestimmung mittels Antikörpern zeigt, dass dieser Stammzellen-Marker sowohl in der kahlen wie auch in der nicht kahlen Kopfhaut in hohen Spiegeln vorhanden ist, was die These stützt, dass die Stammzellen des Follikels in der kahlen Kopfhaut erhalten bleiben.

[0018] Aus der Bestimmung von CD34 mittels Antikörpern ist ersichtlich, dass die Anzahl der CD34-positiven Zellen (Vorläuferzellen) des Follikels in Anagenphase, welche in der äusseren Wurzelscheide in der Nähe der Wulstregion angeordnet sind, in der kahlen Kopfhaut im Vergleich zur nicht kahlen Kopfhaut um ungefähr das Zehnfache verringert ist.

[0019] Der Verlust von aktivierten Zellen in der Wulstregion (Vorläuferzellen), nicht aber von ruhenden Zellen in der Wulstregion (Stammzellen), bei Individuen mit AGA bestätigt die Hypothese, dass die AGA auf eine geringere Umwandlung von Follikelstammzellen zu Vorläuferzellen zurückzuführen ist.

[0020] Die Follikel der Kopfhaut atrophieren, aber es verbleibt eine Reserve von Stammzellen, die in Vorläuferzellen umgewandelt werden, jedoch in geringerem Masse als in der nicht kahlen Kopfhaut.

[0021] Eine Abnahme dieser Zellpopulation, die sich möglicherweise infolge einer ungenügenden Versorgung durch die Wulstzellen ergibt, könnte möglicherweise zu einer verringerten Anzahl von Matrixzellen des Wulstes im neuen unteren Follikel führen. Eine kleinere Anzahl von Matrixzellen würde zu reduzierten Haarschäften führen, da diese Zellen unmittelbar für die Produktion des Haarschaftes verantwortlich sind.

[0022] Die Dermatologen unterscheiden bei der Alopezie die Kategorien der vernarbten und nicht vernarbten Alopezie. Gewisse Arten von Haarausfall (z.B. Lichen planopilaris, diskoider Lupus erythematodes und Graft-versus-Host-Erkrankung) sind mit der Zerstörung des Follikels in den Wulststammzellen und demnach mit permanentem Haarausfall verbunden. Bei den reversiblen Arten von Haarausfall (z.B. Alopecia areata) wirkt sich die Entzündung auf die Vorläuferzellen der Follikel aus, während die Stammzellen unbeschädigt bleiben. Bei diesen Erkrankungen kommt es nach der Beseitigung der Entzündung und der damit einhergehenden Regeneration der Haarfollikel, die aus unbeschädigten Stammzellen entstehen, zu einem erneuten Wachstum.

[0023] Der grösste Anteil der kommerziell erhältlichen trichologischen Präparate wirken gezielt auf die Haarzwiebel und wirken auf den Stoffwechsel, die Ernährung, die Sauerstoffzufuhr und die Mikrozirkulation der Kopfhaut mit dem Ziel, das Wachstum der Haare zu erhöhen und zu beschleunigen.

[0024] Im Gegensatz zu den oben erwähnten, herkömmlichen Forschungsprojekten hat die Anmelderin die Anwesenheit von Haarstammzellen in der Wulstregion und von undifferenzierten Stammzellen, die für die Entwicklung einer neuen Anagenphase im Follikel sowie für die Entwicklung und das Wachstum eines neuen Haares verantwortlich sind, untersucht.

[0025] Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine kosmetische Zusammensetzung zur Stimulation des physiologischen Haarwachstums von Patienten mit Haarausfall oder dünnem Haar bereitzustellen.

[0026] Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Zusammensetzung zur trichologischen Anwendung, welche zur Reaktivierung oder Erhaltung der Stammzellen der Kopfhaut von Subjekten mit Alopezie oder schütterem Haar.

Kurzbeschreibung der Erfindung

[0027] Die Anmelderin hat gefunden, dass diejenigen Follikelstammzellen der Kopfhaut, welche inaktiv sind oder sich im Ruhezustand befinden, durch die Anwendung einer trichologischen Formulierung, welche eine auf Stammzellen wirkende biologische Komponente in Kombination mit mindestens einer Komponente, welche die Proliferation der Zellen der Hautpapille stimuliert, enthält, reaktiviert werden können. Gemäss einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird demnach eine auf die Haarfollikelstammzellen wirkende Zusammensetzung zur Stimulation des Haarwachstums bereitgestellt, umfassend eine synergistische Kombination aus <tb>i)<sep>einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Expression von Proteinmarkern fördert, die mit dem Wachstum und der Proliferation von Follikelstammzellen assoziiert sind, und <tb>ii)<sep>einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Proliferation von mesenchymalen Zellen der Hautpapille stimuliert, und einem kosmetisch annehmbaren Träger,wobei die biologisch aktive Komponente i) ein Peptid-Extrakt aus Reis umfasst und die biologisch aktive Komponente ii) Corosolsäure umfasst.

[0028] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung wirkt auf die Vitalität der Follikelstammzellen, wobei der Lebenszyklus auch der in der Kopfhaut ruhenden Haarfollikel in den von Ausdünnung und/oder Kahlheit betroffenen Bereichen reaktiviert. Darüber hinaus begünstigt die erfindungsgemässe Zusammensetzung die Expression von Proteinmarkern der Stammzellen, insbesondere von Keratin-15, alfa-6-lntegrin, beta-Catenin, P63, welche mit dem Wachstum und der Proliferation von Follikelstammzellen assoziiert sind.

[0029] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung erhöht ausserdem die Vitalität der Follikelstammzellen sowohl in der Anagenphase wie auch im Verlauf der Miniaturisierung und schützt die Stammzellen vor endogenen und exogenen Schädigungen. Darüber hinaus reaktiviert die erfindungsgemässe Zusammensetzung die in der Kopfhaut ruhenden Stammzellen, wobei sie das Follikel regeneriert und das Wachstum von neuen Haaren stimuliert. Insbesondere erfordert die Follikelregeneration die Aktivierung der in der Wulstregion lokalisierten Stammzellen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff «Peptid-Extrakt aus Reis» auf ein Extrakt auf der Basis von Peptiden, Polypeptiden, biologisch aktiven Peptid-Fraktionen, das durch Hydrolyse von Proteinen von Körnern der Reispflanze gewonnen wird.

[0030] Pflanzen, aus denen das Peptid-Extrakt gewonnen wird, gehören zu den Familien der Poaceae oder Graminacee und der Gattung Oryza, insbesondere Oryza sativa L. Typischerweise umfasst das Peptid-Extrakt aus Reis eines oder mehrere der folgenden Proteine: in Wasser lösliches Albumin, typischerweise mit 0,3–9,9 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Proteinfraktion, in Wasser unlösliches, in Salzlösungen lösliches Globulin, typischerweise mit 1,6–14,0 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Proteinfraktion, in Wasser wie auch in Salzlösungen und Alkohol unlösliches, in alkalischen Lösungen lösliches Glutelin, typischerweise mit 73–94 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Proteinfraktion, in Wasser unlösliches, in Alkohol lösliches Prolamin, typischerweise mit 1,7–7,6 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Proteinfraktion.

[0031] Die Gluteine sind eine Gruppe von Proteinen, die für die erfindungsgemässe Anwendung besonders geeignet sind. Dabei ist Oryzenin eines der bevorzugtesten Proteine.

[0032] In gewissen Ausführungsformen ist der Wirkstoff i) der erfindungsgemässen Zusammensetzung ein hydrolysiertes Protein aus nicht-fermentiertem Reis, das durch Hydrolyse von Proteinen von Reiskörnern erhalten wird. Gemäss diesen Ausführungsformen erfolgt keine Fermentation, damit die Proteine durch die Proteasen der Fermentationshefen nicht abgebaut werden und das Extrakt in Form von nativen Peptiden erhalten bleibt.

[0033] Typischerweise handelt es sich bei dem zur Gewinnung der Proteinfraktion i) verwendeten Teil der Reispflanze um das durch einen Entschälungsvorgang von seiner Hülle befreite Reiskorn.

[0034] Die Proteinfraktion kann zu kleinen Peptidfraktionen, deren Molekulargewicht weniger als 5000 Da beträgt, hydrolysiert werden.

[0035] Die Komponente ii) der erfindungsgemässen Zusammensetzung ist die Corosolsäure, eine Substanz pflanzlichen Ursprungs, welche die Hautpapille zur Synthese von Wachstumsfaktoren anregt, die eine Verlängerung der Anagenphase des Haares bewirken und die Durchblutung des Follikels verbessern.

[0036] Corosolsäure ist beispielsweise in den Blättern der Loquat (Eriobotrya japonica) vorhanden, bei der es sich um eine Pflanze aus der Familie Rosacee handelt und die auch als japanische Mispel bezeichnet wird. Die Loquat-Blätter haben die Eigenschaft, das In-vitro-Wachstum von Hautpapillenzellen und Keratinozyten zu fördern. Da die Grösse der Hautpapille zudem die Haardicke beeinflusst, führt die durch Corosolsäure induzierte Proliferation der Papillenzellen zum Wachstum von dickem und starkem Haar.

[0037] Bei gewissen Ausführungsformen der Erfindung wird ein Extrakt der Loquat-Blätter als biologisch aktive Komponente ii) verwendet, da diese Corosolsäure enthalten. Die Extraktion erfolgt mittels bekannter Extraktionstechniken. Als Alternative zu den Loquat-Blättern kann die Corosolsäure aus einem Extrakt von Blättern der Banaba, die zur botanischen Art der Lagestroemia speciosa aus der Familie der Lythraceae gewonnen werden.

[0038] Bei gewissen Ausführungsformen umfasst die erfindungsgemässe Zusammensetzung überdies eine Komponente iii), welche die 5-alfa-Reduktase inhibiert. Die Zusammensetzung gemäss diesen Ausführungsformen entfaltet auf der Kopfhaut gleichzeitig die drei folgenden Wirkungen: Wirkung auf die Follikelstammzellen, um die Expression dieser Proteine/Marker der Follikelstammzellen, die mit der Regeneration des Haares assoziiert sind, zu fördern Wirkung auf die Hautpapille, um die Proliferation dieser Zellen und die entsprechende Bildung der Wachstumsfaktoren für das Haarfollikel zu stimulieren, Inhibitionswirkung auf die 5-alfa-Reduktase, um der Miniaturisierung des Follikels entgegenzuwirken.

[0039] Die Komponente iii) entfaltet eine trichologische Wirkung, da das Testosteron beim Eintritt in das Zytoplasma der Follikelzelle durch das zytoplasmatische Enzym 5-alfa-Reduktase in seine aktive Form, das Dihydrotestosteron (DHT), umgewandelt wird, welches an die Androgen-Rezeptoren der Haarfollikel bindet und dadurch den normalen Wachstumszyklus beeinträchtigt. Genauer gesagt, wird ein Rezeptor-DHT-Komplex gebildet, der in den Kern wandert, wo durch den Vorgang der Gentranskription die Synthese von Proteinen mit spezifischer biologischer Wirkung stattfindet. Im Haarfollikel befinden sich die Androgen-Rezeptoren in der Hautpapille, nicht in der Epithelzelle; dies bedeutet, dass die Hautpapille der wichtigste Angriffspunkt der Androgene im Haarfollikel ist.

[0040] In gewissen Ausführungsformen ist die besagte Komponente iii) ein Extrakt aus Rotklee oder Trifolium pratense aus der Familie der Leguminosae.

[0041] Der Rotklee ist ein Grasgewächs, das in gemässigten und subtropischen Regionen wild wächst und sowohl auf Wiesen wie auch in Berggebieten vorkommt. Die Blüten haben eine lila bis rote Farbe. Die Blüten werden im Sommer zu ihrer maximalen Blütenzeit geerntet.

[0042] Das Blütenköpfchen des Rotklees ist besonders reich an Biocyanin A und enthält Isoflavone wie das Genistein und Daidzein, die typisch für Soja und deren Derivate (Formononetin) sind.

[0043] Das Biocyanin A entfaltet eine inhibitorische Wirkung gegen die 5-alfa-Reduktasen Typ I und II. Dementsprechend wird die Aktivität des Enzyms 5-alfa-Reduktase verringert, welches das Hormon Testosteron in Dihydrotestosteron DHT umwandelt, das die Miniaturisierung des Follikels auslöst. Darüber hinaus reduziert es die für die Alopezie typische Entzündung des Follikels.

[0044] Insbesondere ist das Biocyanin A das häufigste im Rotklee enthaltene Isoflavon.

[0045] Bei gewissen Ausführungsformen wird als Alternative zum Extrakt des Rotklees das Biocyanin, insbesondere vom Typ A, verwendet. Geeignete alternative Quellen für Biocyanin A sind Baptisia tinctoria (wildes Indigo), Medicago sativa (Alfalfa), Sophora japonica (Japanischer Pagodenbaum) und Vigna radiata (Mungbohne).

[0046] Bei gewissen Ausführungsformen kann die erfindungsgemässe Zusammensetzung einen oder mehrere weitere Wirkstoffe wie beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, pflanzliche Glycoproteine aus der Familie der Lektine, hydrolysierte pflanzliche Proteine, Spurenelemente (Silizium, Zink, Kupfer etc.), hydrolysierte DNA, hydrolysierte RNA, Salizylsäure, Glycyrrhetinsäure, Allantoin, Extrakte aus Mikroalgen sowie Extrakte aus Algen enthalten.

[0047] Bei gewissen Ausführungsformen umfasst die erfindungsgemässe Zusammensetzung die folgenden Komponenten oder biologisch aktiven Substanzen: Peptid-Extrakt aus Reis, beispielsweise 0,0001 bis 10 Gew.-%, Corosolsäure oder Extrakt aus Trifolium pratense, beispielsweise 0,0001 bis 10 Gew.-%, gegebenenfalls Ester der Nikotinsäure, beispielsweise Benzylnicotinat, beispielsweise 0,001% bis 1 Gew.-%.

[0048] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung wird für die opische Anwendung eingesetzt und erweist sich als wirksam für die Prävention und/oder kosmetische Behandlung gewisser Formen des Haarausfalles oder der Ausdünnung der Haare, wie beispielsweise der androgenetischen Alopezie und des telogenen Defluvium.

[0049] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung für die topische Anwendung kann sowohl in flüssiger Form als Lotion, Lösung, Suspension als auch in fester oder halbfester Form als Gel, Creme, Salbe, Pomade, Maske, transdermales Pflaster mit verzögerter Wirkstofffreisetzung vorliegen.

[0050] Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann in einer geeigneten Form für die Verwendung in der Haarpflege und für die topische Anwendung z.B. als Lösung oder wässrige Suspension, Dispersion oder Gel formuliert werden.

[0051] In gewissen Ausführungsformen ist der Träger der wässrigen Zusammensetzung auf der Basis von Wasser und kann einen für die kosmetische Anwendung geeigneten Alkohol wie Ethylalkohol und/oder ein oder mehrere kosmetisch annehmbare Glykole wie Propylenglykol oder Mischungen davon enthalten.

[0052] In der Form einer Lösung oder einer wässrigen Suspension oder Dispersion kann die Zusammensetzung im Allgemeinen ungefähr 1 bis 99,9% Wasser enthalten. In gewissen Ausführungsformen ist das Wasser in einer Menge zwischen 5 bis 95% vorhanden. In anderen Ausführungsformen ist das Wasser in einer Menge zwischen 10 bis 90 Gew.-% vorhanden.

[0053] Im Falle von flüssigen Formulierungen kann die synergistisch aktive Wirksubstanz der Erfindung vorteilhafterweise in einem physiologisch verträglichen flüssigen Träger wie Wasser, Alkohol, Wasser-Alkohol-Lösung, Glycerin und anderen flüssigen für die topische Anwendung geeigneten Trägern gelöst sein.

[0054] Beispielsweise kann die flüssige Form der erfindungsgemässen Zusammensetzung durch Lösen der wasserlöslichen Komponenten in Wasser und der übrigen Komponenten in Alkohol und anschliessendem Zusammenführen der verschiedenen Fraktionen unter Rühren hergestellt werden. Das entstandene Gemisch kann anschliessend auf einen mit dem pH-Wert der Kopfhaut kompatiblen pH-Wert im Bereich zwischen 5 und 7 gepuffert und danach filtriert und in geeigneten Behältern wie Flaschen oder Ampullen abgefüllt werden.

[0055] In gewissen Ausführungsformen können die erfindungsgemässen trichologischen Zusammensetzungen zudem bei der Formulierung von kosmetischen Zubereitungen zur lokalen Anwendung häufig verwendete Hilfsstoffe wie beispielsweise Konservierungsmittel, Bakterizide, Stabilisatoren, Emulgatoren, Tenside, Puffer, Feuchthaltemittel, Farbstoffe und andere bei den Zubereitungsverfahren von Kosmetika und Pharmazeutika üblicherweise verwendete Hilfsstoffe umfassen. Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann in einer wirksamen Menge direkt auf die Kopfhaut angewendet werden.

[0056] Beispielsweise wird zur Behandlung der androgenetischen Alopezie eine kosmetisch wirksame Menge der erfindungsgemässen Lotion einmal oder mehrmals täglich direkt auf die Kopfhaut vorteilhafterweise während einer Dauer von 2 bis 3 Monaten mit anschliessenden Ruheintervallen aufgetragen.

[0057] Typischerweise sind die biologisch aktiven Komponenten in der erfindungsgemässen Zusammensetzung in unterschiedlichen Mengen, beispielsweise im Bereich von 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-%, typischerweise von 0,1 bis 5 Gew.-%, vorhanden. Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung bereitgestellt, welches die lokale Anwendung einer wirksamen Menge der oben beschriebenen Zusammensetzung umfasst.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

[0058] In gewissen Ausführungsformen ist die Komponente i) der Zusammensetzung ein hydrolysiertes Protein aus nicht-fermentiertem Reis, das durch Hydrolyse von Proteinen von Reiskörnern erhalten wird.

[0059] Das hydrolysierte Protein bestehend aus Aminosäuren, Peptiden und Proteinen kann durch alkalische, saure oder enzymatische Hydrolyse von Reis erhalten werden. In gewissen Ausführungsformen sieht die Gewinnung der Proteine aus Reis eine initiale Beseitigung der löslichen Anteile vor, welcher dann die Aufspaltung der Proteinextraktion unter Ausnutzung der unterschiedlichen Löslichkeiten der Proteine und durch Verwendung von geeigneten Lösungsmitteln folgt (Hamada J. S., 1997). Beispielsweise ist ein geeignetes Verfahren zur Gewinnung von Reisproteinen die alkalische Hydrolyse mit anschliessender saurer Ausfällung (Connor et al., 1977; Jiamyangyuen et al., 2005); das Verfahren sieht als optimale Bedingungen für die Extraktion einen alkalischen pH-Wert, beispielsweise von ungefähr 11, und eine Reaktionszeit von 10 Minuten bis 2 Stunden, beispielsweise 45 Minuten, vor.

[0060] Nach Entfernung der Lipidanteils wird die Reisprobe in destilliertem Wasser beispielsweise im Verhältnis 1:5 (1 g in 5 ml Wasser) suspendiert, und danach wird ein Anteil dieser Suspension, beispielsweise von 5 ml, auf einen basischen pH-Wert, beispielsweise von 11 (z.B. mittels einer 0,2 M NaOH-Lösung) eingestellt. Die Reaktion wird bei einer über der Umgebungstemperatur liegenden Temperatur durchgeführt, beispielsweise bei 30 °C mit einer Reaktionszeit von beispielsweise 45 Min.

[0061] Nach der Reaktion wird der pH-Wert der Suspension mit einer Säurelösung auf ca. 7 eingestellt, beispielsweise mit 0,2 M HCl, um die Reaktion zu stoppen. Der Rückstand wird mittels Filtration aus der Lösung abgetrennt.

[0062] Der lösliche Anteil wird dann schliesslich zur Bestimmung des Gehalts an Proteinen, Aminosäuren und des TOC (totaler organischer Kohlenstoff) untersucht. Als Alternative zur alkalischen Veresterung kann eine enzymatische Hydrolyse durchgeführt werden. Mit diesem Verfahren ist es möglich, einige Probleme, die unter stark alkalischen Bedingungen auftreten können, wie die Bildung von unerwünschten Reaktionsprodukten (z.B. Lisinoalanin), zu vermeiden.

[0063] Darüber hinaus können diese Bedingungen zu einer Denaturierung und Hydrolyse der Proteine, einer Verstärkung der Maillard-Reaktion, welche das Auftreten von dunkel gefärbten Produkten verursacht, einer Zunahme der Extraktion von Nicht-Protein-Derivaten, welche zusammen mit den Proteinen ausfallen und die Qualität des isolierten Produktes verringern, führen.

[0064] Beispiele der enzymatischen Hydrolyse sind in Mass Production Method for Rice Protein Isolate and Nutritional Evaluation, Morita T., Kiriyama S., Journal of food Science, November 1993, Vol. 58, Issue 6, 1393-96, beschrieben.

[0065] Bei einem typischen Beispiel einer Extraktion wird das Reismehl mit 0,6% einer Termamyl-Lösung (alfa-Amylase) bei Umgebungstemperatur (23 °C) vermischt. Das erhaltene Produkt wird während 2 Stunden bei 97 °C unter ständigem Schütteln erhitzt. Anschliessend folgt ein Prozess der gleichzeitigen Gelierung und Verflüssigung.

[0066] Das durch Filtration und Waschen mit siedendem Wasser erhaltene Produkt, welches als RP (Reis-Protein-Isolat) bezeichnet wird, enthält mehr als 90% reines Protein (Trockenmasse).

[0067] Ein alternativ anwendbares Extraktionsverfahren ist in Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis, Sereewatthanawut I., Prapintip S., Watchiraruji K., Goto M., Sasaki M., Shotipruk A., Bioresource Technology 99 (2008), 555-61, beschrieben.

[0068] Dieses Verfahren sieht die Durchführung einer Hydrolysereaktion in subkritischem Wasser in einem Temperaturbereich von 100 bis 220 °C während 0 bis 30 Min vor. Dieses Verfahren ermöglicht die Extraktion einer grösseren Menge an Proteinen als das herkömmliche Verfahren in basischer Umgebung, wobei die Ausbeute in der Regel mit zunehmender Temperatur und Reaktionszeit noch ansteigt.

[0069] Ein weiteres Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus Reis, das zur Gewinnung der Komponente i) verwendet werden kann, ist in Preparation and Functional Properties of Rice Bran Protein Isolate, Wang M., Hettiarachchy N. S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T., Journal of agricultural and food chemistry, 1999, 47, 411-16, beschrieben.

[0070] Nach diesem Verfahren wird eine Reisprobe, der die Lipid-Komponente entfernt wurde, in destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 5 suspendiert und mit Phytase und Xylanase während einer Inkubationsphase bei 55 °C während 2 h behandelt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

[0071] Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher beschrieben, wobei: <tb>Fig. 1<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die erhöhte Expression des Keratin-15-Markers in ORS-Paraffinschnitten (exvivo) hervorgeht; <tb>Fig. 2<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die erhöhte Expression des α6-lntegrin-Markers in gefrorenen ORS-Schnitten (exvivo) hervorgeht; <tb>Fig. 3<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die erhöhte Expression des beta-Catenin-Markers in gefrorenen ORS-Schnitten (exvivo) hervorgeht; <tb>Fig. 4<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die erhöhte Expression des P63-Markers in gefrorenen ORS-Schnitten (exvivo) hervorgeht; <tb>Fig. 5<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die trichologische Wirkung eines Peptid-Extraktes aus Reis in Haarbiopsien nach einer Behandlungsdauer von 20 Tagen hervorgeht; <tb>Fig. 6<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die Ergebnisse des In-vitro-Tests der Komponente i) auf humane Follikelstammzellen hervorgehen; <tb>Fig. 7<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die Wirkung der Corosolsäure auf Wachstumsfaktoren der Haarfollikel hervorgeht; und <tb>Fig. 8<sep>ein Diagramm zeigt, aus welchem die Ergebnisse der Inhibierung der 5-alfa-Reduktase durch Biocyanin A hervorgehen.

[0072] Die in den Fig. 1 bis 4 dargestellten Marker sind mit dem Wachstum und der Proliferation der Follikelstammzellen assoziiert und sind zuverlässige Indikatoren für den Zustand des Haares. Diese Marker umfassen die Proteine Keratin-K15, α6-lntegrin, β-Catenin und p63.

[0073] Insbesondere ist das Keratin-15 ein Marker für Follikelstammzellen des Haares von Erwachsenen, die in der Wulstregion und der äusseren Wurzelscheide lokalisiert sind (ORS). Die Expression von Keratin-15 in den Stammzellen führt zur Synthese von Proteinen, die als Keratine bezeichnet werden und typisch für reife Keratinozyten sind. Die Keratine bestehen aus einer Multigenfamilie von faserigen Proteinen, die das Zytoskelett der Zelle bilden. Sie können aufgrund ihres Molekulargewichtes und ihres isoelektrischen Punktes in Typ I (saures Zytokeratin oder mit niedrigem MG) und Typ II (alkalisches Zytokeratin oder mit hohem PM) eingeteilt werden. Insbesondere wurde in zahlreichen Studien nachgewiesen, dass das Keratin-15 ein spezifischer Marker für die Aktivität der Stammzellen in der Wulstregion des Haarfollikels ist.

[0074] Bei dem zur Bestimmung von Keratin-15 verwendeten Antikörper handelt es sich um den monoklonalen Antikörper C8/144B. In den Stammzellen der Wulstregion wird das mit Keratin-15 assoziierte Gen überexprimiert.

[0075] Das Keratin-15 wird von Stammzellen der Wulstregion in hohem Ausmass, von anderen Teilen der äusseren Haarwurzelscheide (ORS), dem Infundibulum in der Nähe des unteren Teils der ORS, nur in geringem Ausmass exprimiert.

[0076] Die Anwesenheit von Keratin-15 in diesen Regionen des Follikels ist auf die Anwesenheit von Zellen zurückzuführen, welche dieses Protein nur geringfügig exprimieren und in die Wulstregion einwandern.

[0077] Die Integrine sind integrale Membran-Glycoproteine, welche vor allem die Bindung der Keratinozyten in der Basalschicht an die Proteine der extrazellulären Matrix, die in der Basalmembran vorliegen, vermitteln, aber auch die intrazelluläre Adhäsion (Zelle zu Zelle) vermitteln. Die Integrine regulieren den Zellzyklus, die Differenzierung und die Apoptose. Insbesondere ist das α6-lntegrin ein Marker für die Stammzellen in der Basalmembran der äusseren Wurzelscheide des Follikels.

[0078] Die reifen Stammzellen sind in kleinen spezialisierten Kammern oder «Nischen» lokalisiert; eine Mikroumgebung, welche den Stammzellen eine Unterstützung und Schutz bietet sowie Signale abgibt, welche das Verhältnis zwischen Selbstreplikation und Zelldifferenzierung regulieren.

[0079] Die Integrine sind häufiger in den Stammzellen als in den Transit-Amplifikationszellen (AT), welche Vorläufer der zur Differenzierung führenden Stammzellen sind. Die Stammzellen benötigen eine starke Bindung untereinander und mit der Basalmembran, um sich in Stammzellenform zu halten oder um ihre Position in der «Nische» zu behalten, welche Haftung durch die Integrine gewährleistet wird. Die Integrine scheinen daher zum Erhalt der Identität einer Stammzelle beizutragen. Kloepper J.E. et al. (2008) haben in ihrer Studie gezeigt, dass die in der Wulstregion vorhandenen Stammzellen zusätzlich auch in anderen Regionen des humanen Follikels, wo die Basalmembran vorhanden ist, vorkommen und dass das α6-lntegrin in allen Teilen der äusseren Schicht der äusseren Wurzelscheide (ORS) der Basalmembran (BM) des gesamten Haarfollikels vorhanden ist.

[0080] Beim β-Catenin handelt es sich um ein multifunktionelles Protein, das im Zellkern als Transkriptionsfaktor und in der Plasmamembran als Modulator der zellulären Adhäsion wirkt. Das β-Catenin, das insbesondere in der äusseren Wurzelscheide des Follikels exprimiert wird, spielt eine wichtige Rolle beim Wachstum des Haarfollikels und der Zelldifferenzierung. Es ist Teil eines Proteinkomplexes, der die interzelluläre Kontaktstelle bildet. Die beta-Catenine werden für die Kontrolle des Zellwachstums, die Zellhaftung und die interzelluläre Zelldifferenzierung benötigt.

[0081] Bei Fehlen eines äusseren mitotischen Signals wird β-Catenin in einen Komplex eingebaut, der aus mehreren Untereinheiten von Proteinen, einschliesslich der APC-Proteine und der Tumor-Suppressor-Proteine gebildet ist und dessen Hauptaufgabe in der Reduktion der β-Cateninspiegel liegt.

[0082] Zu diesem Zweck werden β-Catenin-Moleküle phosphoryliert, welche abgebaut und an das Proteosom gesendet werden. Dieser Mechanismus, in Synergie mit der Bildung von β-Catenin an das E-Caderin, einem Transmembranprotein, das indirekt die Translokation von beta-Catenin in den Kern beschränkt, verursacht die Anwesenheit von geringen Mengen an freiem β-Catenin im Zytosol.

[0083] Wenn es im Zytoplasma zu einer Anreicherung von β-Catenin infolge eines unwirksamen Abbaus kommt, ergibt sich im Zellkern eine Translokation, wobei das Protein mit den Transkriptionsfaktoren Tcf/LEF interagiert und dabei die Expression verschiedener an der zellulären Migration und Proliferation beteiligter Gene aktiviert wird. Die Zellproliferation wird erhöht.

[0084] Demnach hat das β-Catenin eine bedeutende Rolle bei der Kontrolle der Zellproliferation und des Zelltodes.

[0085] Die Bildung des Haarfollikels findet während der Embryogenese durch spezifische Wechselwirkungen zwischen den Epithelzellen der Haut und der darunterliegenden Dermis statt. Die Epithelzellen bilden eine als Placode bezeichnete säulenartige Verdickung.

[0086] Anschliessend bildet sich unmittelbar unter der Placode ein mesenchymiales Kondensat. Weitere Interaktionen bewirken ein Absinken der Placode in die unterliegende Dermis, und die verlängerte Placode umgibt das dermische Kondensat, welches zur Hautpapille wird. Schliesslich vermehren sich die Epithelzellen und differenzieren zu den verschiedenen Schichten, welche das Haarfollikel bilden. Huelsken J. et al. (2001) haben gezeigt, dass das β-Catenin bei der Bildung des Haares eine zweifache Kontrollfunktion ausübt: <tb>a.<sep>es spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung der Placode des Haares während der Embryogenese, <tb>b.<sep>es ist für die Differenzierung der Stammzellen in der Haut von Erwachsenen unentbehrlich. Ohne β-Catenin sind die Stammzellen unfähig zur Bildung von Haar-Cheratinozyten und bilden Haut-Cheratinozyten.

[0087] Demnach erfordern die Stammzellen der Haut die Anwesenheit des beta-Catenins, um zu Haarfollikeln zu differenzieren. Durch Beobachtung der Stammzellen von Mäusen mit einer β-Catenin-Mutation haben Huelsken J. et al. (2001) deren anomale Differenzierung zu Hautzysten festgestellt, womit gezeigt wird, dass das β-Catenin ein spezifisches Signal für die Bildung des Haarfollikels darstellt.

[0088] P63 ist ein Marker, der von den Stammzellen der äusseren Wurzelscheide (ORS) und von den Stammzellen der Wulstregion im reifen Haar exprimiert wird. Er ist für die Zellproliferation und für die Morphogenese des Haarfollikels unerlässlich. Das Protein p63 ist während der Embryogenese essenziell, insbesondere für die Entwicklung der schichtförmigen Epithele und der Mesenchymialgewebe. Es ist insofern an der Morphogenese des Follikels beteiligt, als es für die Bildung der Placode des Haares benötigt wird, wie der Phänotyp von p63-/-Mäusen zeigt.

[0089] Die Isoformen DeltaNp63 scheinen die hauptsächlichen Isoformen zu sein, die an den ersten und entscheidenden Stadien der Haarbildung beteiligt sind. Durch ihre Wirkung als Transkriptionsaktivator regeln sie die Expression gewisser Gene wie beispielsweise das β-Catenin, welches wichtig für die Entwicklung des Haares ist und dessen Abwesenheit eine vorzeitige Blockade der Bildung der Haarplacode zur Folge hat. Das Protein p63 spielt eine wichtige Rolle für die Funktion der Stammzellen. Pellegrini et al. (2001) haben das Protein p63 als Marker der Epithelstammzellen identifiziert. In ihrer Arbeit wurden die Stammzellen der Haut und die zugehörigen Transitionszellen (TA) isoliert und anschliessend in vitro kultiviert, um Holoklone und Paraklone zu erhalten. Die Holoklone sind Epithelzellen in der Kultur mit erhöhter Proliferationsfähigkeit, welche zur nahezu ausschliesslichen Bildung von Klonen befähigt sind, wodurch die Eigenschaften der ursprünglichen Stammzellen nahezu unverändert bleiben. Die Paraklone sind Epithelzellen in der Kultur, welche zur nahezu ausschliesslichen Bildung von sekundären, durchwegs differenzierten Klonen befähigt sind.

[0090] Das Protein p63 kommt in den Holoklonen häufig vor, ist jedoch in den Paraklonen nicht vorhanden. Das p63 ist somit ein Stammzellenmarker.

[0091] In den reifen Follikeln ist zu beobachten, dass die Expression der Isoformen DeltaNp63 auf die Bulgeregion sowie auf die Matrixregionen beschränkt ist, wo sie eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Zellen in Stammzellenform, bei der Selbsterneuerung sowie bei der Einstellung der Proliferation und Differentiation der Matrixzellen spielt. Die biologisch aktive Komponente i) der erfindungsgemässen Zusammensetzung ist aktiv und fördert die Expression der Marker/Proteine, die mit dem Wachstum und der Proliferation der zuvor beschriebenen Follikelstammzellen einhergehen.

[0092] Die auf Corsolsäure basierende biologisch aktive Komponente ii) wirkt hingegen auf die Proliferation der Mesenchymialzellen der Hautpapille.

[0093] Insbesondere zeigt die zur Erforschung der am Haarzyklus beteiligten Zytokine durchgeführte RT-PCR-Analyse, dass Loquat-Blätter, und insbesondere Corosolsäure, die Expression der mRNA von FGF-7 (Fibroblast Growth Factor) und VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) positiv regeln, während sie diejenige von FGF-5 (Fibroblast Growth Factor-5) in den Zellen der Hautpapille negativ regeln. VEGF spielt im Haarwachstumszyklus eine wichtige Rolle aufgrund der Erhöhung der Vaskularisierung. FGF-5 blockt das Haarwachstum ab, indem der Anagenprozess inhibiert und der Übergang des Haares vom Anagen ins Katagen fördert. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Effekt des pflanzlichen Extrakts von Loquat auf das Haarwachstum durch eine Regulierung von Wachstumsfaktoren in den Zellen der Hautpapille vermittelt wird.

[0094] Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die anschliessenden Ausführungsbeispiele erläutert, welche jedoch lediglich zur Veranschaulichung dienen und nicht als Einschränkung des Erfindungsgegenstandes auszulegen sind.

Beispiel 1

[0095] Die Aktivität des Peptid-Extraktes (oder des hydrolysierten Peptids) aus Reis i) der erfindungsgemässen Zusammensetzung auf die Oberflächenmarker der Haarfollikelstammzellen wurde in Exvivo-Studien bei Biopsien von 6 mm, die mittels Stanzbiopsie aus der Kopfhaut erhalten wurden, gezeigt.

Material und Methoden

[0096] Die Kopfhautschnitte haben eine Dicke von 4 Mikrometern für in Paraffin eingebettete Biopsien und eine Dicke von 6 Mikrometern für gefrorene Biopsien. Es wurden jeweils durchschnittlich 5 Follikel pro Biopsie zweimalig untersucht.

[0097] Der Wirkstoff wurde einmal täglich während 2 Tagen topisch als 1%-ige Lösung angewendet.

[0098] Die Auswertung erfolgte durch Immunfluoreszenz, wobei die Marker ausgewertet wurden, die grün erscheinen, während die Zellkerne blau gefärbt sind. Die Quantifizierung der Immunreaktivität wurde gemäss den Veröffentlichungen von R. Paus durchgeführt und beruht auf dem Durchschnitt von 3 Messungen von drei einzelnen rechteckigen Querschnitten in den Bildern, die mit der Software Image Pro Version VI erhalten wurden. Die erzeugten Histogramme wurden integriert, um die Fläche unter der Kurve («Area under the Curve», AUC) zu erhalten. Die Messungen wurden je nach Experiment durch Bestimmung der Länge, Fläche oder der Anzahl der Zellen für jeden Abschnitt des Haarfollikels normiert.

[0099] Die prozentuale Erhöhung ergibt sich aus dem Verhältnis der gesamten Follikel gegenüber den Kontrollen.

Resultate

[0100] Die Expression des Keratins-15 ist in den Schnitten der äusseren Epithelscheide bei den in Paraffin eingebetetten Biopsien erhöht. Es zeigt sich ein Anstieg um 108,7% im Vergleich zu den Kontrollen, wie in Fig. 1gezeigt.

[0101] Die Expression des α6-lntegrins ist in den Schnitten der äusseren Epithelscheide bei den gefrorenen Biopsien erhöht. Es zeigt sich ein Anstieg um 102,0% im Vergleich zu den Kontrollen, wie in Fig. 2 gezeigt.

[0102] Die Expression des β-Catenin ist in den Schnitten der äusseren Epithelscheide bei den gefrorenen Biopsien erhöht. Es zeigt sich ein Anstieg um 87,9% im Vergleich zu den Kontrollen, wie in Fig. 3 gezeigt.

[0103] Die Expression des P63 ist in den Schnitten der äusseren Epithelscheide bei den gefrorenen Biopsien erhöht. Es zeigt sich ein Anstieg um 19,3% im Vergleich zu den Kontrollen, wie in Fig. 4 gezeigt.

[0104] Aus den durchgeführten Tests ergibt sich demnach, dass die biologisch aktive Komponente i), die durch die Anmelderin als hydrolysierte Proteine (oder hydrolysiertes Peptid) aus Reis identifiziert wurde, zu einer Verbesserung der Marker für die mit der Regeneration des Haares assoziierten Follikelstammzellen beitragen. Insbesondere trägt die Komponente i) der Zusammensetzung: <tb>1.<sep>zur Verbesserung der Expression von Keratin-15: Protein, die an der Anfangsphase der Differenzierung der Kerationzyten beteiligt sind und in der Lage sind, die weniger differenzierten Zellen im reifen Follikel in Bezug auf die Wulstregion zu markieren, <tb>2.<sep>zur Verstärkung der Expression von α6-lntegrin, einem der Marker der Haarfollikelstammzellen, welcher in der die Zellmatrix der Hautpapille und die Scheide des ORS umgebenden Basalschicht exprimiert wird, <tb>3.<sep>zur Verbesserung der Expression von β-Catenin, das eine wichtige Rolle beim Wachstum und der Differenzierung des Haarfollikels spielt, <tb>4.<sep>zur Verbesserung der Expression von P63, einem Protein, das mit Fähigkeit zur Bildung von Haarfollikeln korreliert ist, bei.

Beispiel 2

[0105] Die biologisch aktive Komponente i) wurde auch auf ihre Fähigkeit, das Haarwachstum positiv zu beeinflussen, untersucht. Die Studie wurde bei Biopsien von 6 mm, die mittels Stanzbiopsie aus der Kopfhaut erhalten wurden und 3 bis 6 Haare erhielten, jeweils zweimalig durchgeführt. Der Wirkstoff wurde täglich während 21 Tagen als wässrige 1%-ige Lösung angewendet.

[0106] Fotos derselben Biopsien wurden jeweils nach 10, 14 und 21 Tagen Wachstum mit Hilfe einer VivaCam aufgenommen.

[0107] Die Länge der einzelnen Haare wurde mit Hilfe der Software Image-Pro Analyzer bei jeweils 3 bis 6 Haaren zweimalig bestimmt.

[0108] Die Exvivo-Studie zum Haarwachstum ergab, dass der 1%-ig angewendete Wirkstoff das Haarwachstum im Vergleich zu den Kontrollen wie folgt erhöht: nach 10 Tagen +65%; – nach 14 Tagen + 148%; – nach 21 Tagen + 91%. Die erhaltenen Daten sind in Fig. 5 zusammengefasst.

[0109] Die Aktivität des Wirkstoffes auf die Haarfollikelstammzellen in der Anagenphase führt demnach zu einer Verlängerung der Haare.

Beispiel 3

[0110] Die Aktivität der aktiven Komponente i) auf die humanen Haarfollikelstammzellen wurde mit Hilfe des nachfolgend beschriebenen In-vitro-Tests untersucht. Die humanen Haarfollikel verarmen im Verlauf ihrer Lebensdauer an Stammzellen, und zwar sowohl infolge des chronologischen Alterns wie auch infolge verschiedener Arten von Stress, sodass sowohl die Zahl der Stammzellen wie auch ihre Vermehrungsaktivität abnimmt.

[0111] Um die Aktivität der Wirksubstanz auf das Leben der Stammzellen zu prüfen, wurden Kulturen von humanen Haarfollikelstammzellen angelegt und die Apoptose, d.h. der programmierte Zelltod, quantifiziert.

[0112] Beim Aktivieren des Apoptosenvorgangs bewirken die Zellenzyme eine Verdauung von Proteinen und Nukleinsäuren im Inneren der Zelle, welche in kleine Vesikel zerfällt. UV-Strahlung induziert in den Humanzellen die programmierte Aktivierung der Apoptose, damit eine Perpetuierung schädlicher Mutationen vermieden wird. Die untersuchten humanen Haarfollikelstammzellen wurden mit UV-Licht bestrahlt, um im Labor einen signifikanten Stress zu reproduzieren, und wurden mit der im Nährmedium (modifiziertes DMEM Nährmedium) solubilisierten Prüfsubstanz 2 h vor und 20 h nach der UV-Bestrahlung behandelt.

[0113] Der Bestrahler ist mit 2 monochromatischen UVB-Leuchtröhren (312 nm, 15 W) und mit einem Radiometer (HD2302 LightMeter, Delta OHM) ausgestattet.

[0114] Die humanen Stammzellen des Haarfollikels wurden mit 25 mJ/cm<2>UVB bestrahlt.

[0115] Anschliessend wurde die Apoptose, nach der Bestrahlung, durch Bestimmung spezifischer Enzyme (Caspasen), welche in der Apoptosephase aktiviert werden, insbesondere der Caspasen 3 und 7, quantifiziert. Die effektiven Caspasen 3 und 7 sind spezifische Proteasen, welche in der Phase der Apoptose aktiviert werden. Die apoptotischen Zellen werden im Mikroskop unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe identifiziert.

[0116] Wie der Test zeigte, findet bereits nach 24 Stunden auf dem Niveau von 0.05% des aktiven Wirkstoffs eine Reduktion der Zellapoptose um 10% gegenüber den nicht behandelten Kontrollen statt.

[0117] Mit anderen Worten beginnen humane Haarfollikelstammzellen bereits 24 Stunden nach UV-Belastung wieder ihre Wirksamkeit zurückzugewinnen. In Anbetracht dieser Ergebnisse kann angenommen werden, dass das geprüfte Wirkprinzip «hydrolyisierte Reisproteine» eine protektive Wirkung gegenüber DNA-Schädigungen in den Haarfollikelstammzellen entfaltet.

[0118] Die Ergebnisse sind besonders interessant, da die beschriebene Wirkung bereits 24 h nach der Inkubation auftritt.

[0119] Die Daten sind in der Fig. 6zusammengefasst.

[0120] Die besagte Figur zeigt, dass: <tb>1.<sep>die nicht durch UV belasteten Haarfollikelstammzellen ihre maximale Lebensdauer aufweisen, <tb>2.<sep>die Lebensdauer der durch UV belasteten Haarfollikelstammzellen im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollen um bis zu 3 Mal (303%) abnimmt, <tb>3.<sep>die durch UV belasteten und während 24 h mit hydrolysiertem Reisprotein behandelten Haarfollikelstammzellen eine um 10% verlängerte Lebensdauer haben.

[0121] Daraus folgt, dass die biologisch aktive Komponente i) im Test mit humanen Haarfollikelstammzellen eine Wiedergewinnung der zellulären Effizienz ermöglicht. Die Aufnahmen der Zellkulturen bestätigen die erhaltenen Resultate, indem sie eine prozentual geringere Anwesenheit von apoptotischen Stammzellen (grün-positiv) zeigen.

[0122] Aus der Analyse der gewonnenen Versuchsdaten ergibt sich, dass die biologisch aktive Komponente i) <tb>1.<sep>die Nische von Stammzellen erhält und dadurch eine erhöhte Wiederwachstumsaktivität des Follikels sicherstellt, <tb>2.<sep>bereits 24 Stunden nach Anwendung des Produkts eine höhere Effizienz der Follikelstammzellen garantiert, <tb>3.<sep>die Stammzellen auch in denjenigen Follikeln aktiviert, die ihre regenerative Fähigkeit verloren hatten, <tb>4.<sep>auch die inaktive Stammzellen in den ausgedünnten oder kahlen Zonen aktiviert.

Beispiel 4

[0123] Es wurde ein In-vitro-Test zur Bewertung der in einem Pflanzenextrakt von Blättern der Loquat (Eriobotrya japonica) enthaltenen Corosolsäure, insbesondere in Gegenwart eines Peptid-Extrakts aus Reis i), durchgeführt.

[0124] Zellen der Hautpapille des humanen Follikels wurden mit verschiedenen Konzentrationen des Extraktes von Blättern der Loquat/japanischen Mispel während 4 Tagen kultiviert, woraufhin mittels MTT-Test die Zunahme der Zellproliferation im Vergleich zu den Kontrollen bestimmt wurde. Resultate: +12% und +22% mit 2,5 µg/ml bzw. 10 µg/ml.

[0125] In einem weiteren Test wurden Zellen der Hautpapille des humanen Follikels mit verschiedenen Konzentrationen des Extraktes von Blättern der japanischen Mispel während 2 Stunden inkubiert, woraufhin die Gesamt-RNA isoliert und der Gehalt an mRNA mittels RT-PCR bestimmt wurde.

[0126] Für die mit 2,5 µg/ml Extrakt behandelten Zellen nahmen die Werte der Expression der mRNA von FGF-7, VEGF und BMP-2 gegenüber den Kontrollen signifikant zu: + 30%, + 38% bzw. + 47% (mit 10 µg/ml Extrakt). Demgegenüber nahmen die Werte der Expression der mRNA von FGF-5 gegenüber den Kontrollen ab: –20% mit 2,5 µg/ml Extrakt.

[0127] Hierbei handelt es sich um einen signifikanten Effekt, da die Wachstumsfaktoren FGF-7 und BMP-2 fähig sind, die Anagen durch die Proliferation der Follikelzellen zu verlängern.

[0128] Die experimentellen Ergebnisse belegen, dass der Extrakt von Blättern der Loquat/japanischen Mispel das Haarwachstum fördert, indem FGF-7 und BMP-2 (Verlängerung der Anagenphase) sowie VEGF (Erhöhung der Vaskularisation) überexprimiert und FGF-5 (Unterdrückung des Anagen-Katagen-Übergangs) unterexprimiert werden.

[0129] Die Ergebnisse der Verabreichung von Corosolsäure auf die Wachstumsfaktoren der Follikelzellen gehen aus der Fig. 7 hervor.

Beispiel 5

[0130] Die inhibitorische Wirkung der 5-alfa-Reduktase des Biocyanins, mit welcher dessen trichologische Aktivität korreliert wird, wurde in einem In-vitro-Test nachgewiesen. In diesem Test wurden Hautfibroblasten verwendet, d.h. Zellen, welche verschiedene Typen von Enzymen enthalten, die an der Biosynthese der Steroide beteiligt sind. Diese Zellen bieten ein gutes System zur Bewertung der kinetischen Parameter von Inhibitoren solcher Enzyme wie der 5-alfa-Reduktase, die zum Metabolismus der Steroide gehören.

[0131] Fibroblasten wurden teilweise mit 100 µM aktivem Biocyanin A während 1 h bei 37 °C inkubiert und teilweise nicht, wonach eine bekannte Menge an radioaktiv markiertem Testosteron mit einer Konzentration von 1.5 Mikromolar zugegeben wurde. Nach 3 h wurden die radioaktiven Steroiden extrahiert. Die Mengen an markiertem Testosteron und DHT wurden mittels TLC (Thin Layer Chromatography Dünnschichtchromatographie) bestimmt, um die Aktivität der 5-alfa-Reduktase zu quantifizieren.

[0132] Die als prozentuale Inhibition der Aktivität der 5-alfa-Reduktase ausgedrückten Resultate zeigen, dass das Enzym in der Gegenwart von Biocyanin A signifikant verringert ist: Aktivität der 5-alfa-Reduktase I: -64% gegenüber den negativen Kontrollen Aktivität der 5-alfa-Reduktase II: -93% gegenüber den negativen Kontrollen.

[0133] Die gewonnenen Ergebnisse sind in der Grafik der Fig. 8 veranschaulicht.

Beispiel 6

[0134] Kosmetische Zusammensetzung in Ampullen für die Haare mit der folgenden Formulierung in Gew.-%. <tb>Denaturierter Alkohol<sep>51,6 <tb>Wasser<sep>q.b. 100 <tb>Glycerin<sep>1,0 <tb>Benzylnicotinat<sep>0,12 <tb>pflanzliche Glycoproteine<sep>0.01 <tb>Lysin-Hydrochlorid<sep>0,1 <tb>Acetyl-Cystein<sep>0,08 <tb>Benzophenon-4<sep>0,08 <tb>Dinatrium-EDTA<sep>0,08 <tb>Glycyrrhetinsäure<sep>0,05 <tb>Menthol<sep>0,05 <tb>Silizium<sep>0,04 <tb>Glutamin<sep>0,04 <tb>Adenosin<sep>0,01 <tb>Allantoin<sep>0,01 <tb>Biotin<sep>0,01 <tb>Hämatit-Extrakt<sep>0,008 <tb>Zinkmethionat<sep>0,01 <tb>Hydrolysiertes Reisprotein<sep>0,1 <tb>Hydrolysiertes Sojaprotein<sep>0,005 <tb>Hydrolysierte DNA<sep>0,002 <tb>Hydrolysierte RNA<sep>0,002 <tb>Wurzel-Extrakt aus Pueraria Mirifica<sep>0,1 <tb>Extrakt aus den Blättern von Eriobotrya japonica<sep>0,1 <tb>pflanzliches Extrakt aus Trifolium pratense<sep>0,1 <tb>Salicylsäure<sep>0,001 <tb>Glykogen<sep>0,001

Beispiel 7

[0135] Kosmetische Zusammensetzung für eine Haarlotion mit der folgenden Formulierung in Gew.-%. <tb>Denaturierter Alkohol<sep>20,00 <tb>Wasser<sep>q.b. 100 <tb>Benzylnicotinat<sep>0,05 <tb>Lysin-Hydrochlorid<sep>0,01 <tb>pflanzliche Glycoproteine<sep>0,01 <tb>Acetyl-Cystein<sep>0,05 <tb>Menthol<sep>0,05 <tb>Silizium<sep>0,01 <tb>Zinkmethionat<sep>0,04 <tb>Biotin<sep>0,01 <tb>Adenosin<sep>0,01 <tb>Hämatit- Extrakt<sep>0,008 <tb>Hydrolysiertes Reisprotein*<sep>0,01 <tb>Extrakt aus den Blättern von Eriobotrya japonica**<sep>0,01 <tb>pflanzliches Extrakt aus Trifolium pratense<sep>0,01

Beispiel 8

[0136] Kosmetische Zusammensetzung in Form eines Haarshampoos mit der folgenden Formulierung in Gew.-% <tb>Wasser<sep>q.b 100 <tb>Natriumlaurylsulfat<sep>7,00 <tb>Dinatrium Cocoamphodiacetat<sep>4.00 <tb>Peg-18 Glyzeryloleat/cocoat<sep>1,4 <tb>Glyzerin<sep>1.00 <tb>Glycoldistearat<sep>0,5 <tb>Poliquaternium-10<sep>0,3 <tb>Propylenglykol<sep>0,3 <tb>Steareth-4<sep>0,3 <tb>Peg-200 hydriertes Glycerylpalmitat<sep>0,2 <tb>Quaternium-80<sep>0,13 <tb>Lysin HCl<sep>0,1 <tb>Cystein HCl<sep>0,1 <tb>Peg-7 Glyzerylcocoat<sep>0,08 <tb>Hydrolysiertes Keratin<sep>0,07 <tb>Arginin<sep>0,003 <tb>Hydrolysiertes Reisprotein<sep>0,001 <tb>Extrakt aus Blättern von Eriobotrya Japonica<sep>0,001 <tb>pflanzliches Extrakt aus Trifolium pratense<sep>0,001 <tb>Farbstoffe<sep> <tb>Parfum<sep> <tb>Konservierungsmittel<sep>

Claims (10)

1. Auf Haarfollikelstammzellen wirkende Zusammensetzung zur Stimulation des Haarwachstums, umfassend eine synergistische Kombination aus i) einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Expression von Proteinmarkern fördert, die mit dem Wachstum und der Proliferation von Follikelstammzellen assoziiert sind, und ii) einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Komponente, welche die Proliferation von mesenchymalen Zellen der Hautpapille stimuliert, und einen kosmetisch annehmbaren Träger, wobei die biologisch aktive Komponente i) ein Peptid-Extrakt aus Reis umfasst und die biologisch aktive Komponente ii) Corosolsäure umfasst.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Corosolsäure umfassende biologisch aktive Komponente ii) ein pflanzliches Extrakt von Eriobotrya japonica ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend eine biologisch aktive Komponente iii), welche das Enzym 5-alfa-Reduktase hemmt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die das Enzym 5-alfa-Reduktase hemmende Komponente iii) Biocyanin A umfasst.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Biocyanin A umfassende Komponente iii) ein Extrakt von Trifolium pratense ist.

6. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin umfassend einen Ester der Nicotinsäure.

7. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der besagte Träger Wasser oder eine Wasser-Alkohol-Lösung ist.

8. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die folgende Formulierung: 0,0001 bis 10 Gew.-% eines Peptid-Extraktes von Reis, 0,0001 bis 10 Gew.-% Corosolsäure oder pflanzliches Extrakt von Eriobotrya japonica, 0,0001 bis 10 Gew.-% Biocyanin A oder pflanzliches Extrakt von Trifolium pratense, Wasser oder eine Wasser-Alkohol-Lösung als Ergänzung auf 100 Gew.-%.

9. Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 in Form einer trichologischen Lotion zur topischen Anwendung oder eines Shampoos zur Behandlung der Kopfhaut.

10. Topische kosmetische Verwendung einer Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 zur Stimulierung der Stammzellenaktivität der Haarfollikel und des Haarwachstums.