CN104095883A - 珊瑚萃取物及其萃取方法以及其用途、珊瑚萃取物保养品 - Google Patents

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温志宏
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Abstract

本发明公开了一种用于皮肤美白、保湿、改善弹性、抗发炎以及伤口愈合的珊瑚萃取物及其萃取方法；该珊瑚萃取物为一种皮软珊瑚（Briareumexcavatum）的萃取物；该萃取方法包括：以有机溶剂萃取、以水和乙酸乙酯分配萃取，并以管柱层析法分离；该珊瑚萃取物可应用于皮肤美白、保湿、改善弹性、抗发炎以及伤口愈合等领域。

Description

珊瑚萃取物及其萃取方法以及其用途、珊瑚萃取物保养品
技术领域
本发明涉及一种珊瑚萃取物、萃取方法以及用途，尤其是指一种皮软珊瑚（Briareum excavatum），该萃取物具有提高皮肤保湿、弹性、抑制酪胺酸酶活性、减少黑色素形成，并减缓发炎细胞浸润与控制伤口面积等功效。
背景技术
由于海洋生态环境的特殊性使得海洋生物产生的次级代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地生物相比有显著的差异，导致海洋生物往往能够产生一些化学结构新颖、生物活性多样的具有与陆地生物完全不同结构特征的海洋次级代谢产物。
珊瑚属于腔肠动物门，有9000余种，是海洋中最常见的生物之一，约占海洋生物种类的22.4%，是可以大量利用的海洋生物资源。软珊瑚目(gorgonian)俗称海扇、海鞭、海柳，是珊瑚动物中的一大分支。在对珊瑚化学成分的研究中，自美国的Weinheiner等于1969年从软珊瑚目中发现丰富的具有独特结构和强烈生理活性的前列腺素前体以来，吸引了众多天然产物化学家把研究对象从陆地生物转向海洋生物，大量被发现的海洋天然产物具有广泛的生物活性，主要作用于神经系统、心血管系统、免疫系统等，且许多有显著的抗肿瘤活性。
近年来对软珊瑚的研究仍很活跃，例如，从Briareum属的软珊瑚目中发现众多有活性的briarane型二萜，但囿于野生珊瑚来源的限制，故有学者尝试对软珊瑚目中的皮软珊瑚（Briareumexcavatum）进行实验室人工养殖，然而迄今并无任何文献数据或专利前案曾经揭示，可以从皮软珊瑚得到具有抑制酪胺酸酶活性、加速伤口愈合并可抗发炎的萃取产物或经纯化的化合物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种珊瑚萃取物，其由皮软珊瑚（Briareum excavatum）萃取而得，具有提高皮肤保湿、弹性、抑制酪胺酸酶活性、减少黑色素形成，并减缓发炎细胞浸润与控制伤口面积等功效。
本发明的另一目的在于提供一种珊瑚萃取物的萃取方法，其方法简便易于量产。
本发明的再一目的在于提供一种珊瑚萃取物的用途，其将前述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤美白、保湿、改善皮肤弹性、抗发炎且可以促使伤口愈合。
为了达成上述目的，本发明的解决方案是：
一种用于皮肤美白、保湿、改善弹性、抗发炎以及伤口愈合的珊瑚萃取物，其借由下列步骤所制得：
a.以一有机混合液萃取干燥皮软珊瑚（Briareum excavatum）样品，获得有机层初萃取液，其中该有机混合液包含等比例的C1-C4醇类和C1-C4的含氯烷类；b.以水和低级酯类分配萃取该有机层初萃取液，获得一低级酯类粗萃物，该低级酯类粗萃物含有5～50％的一珊瑚活性成分。
上述b.步骤的该低级酯类粗萃物进一步以一管柱层析分析加以纯化，其以一冲提液冲提该低级酯类粗萃物，以得一冲提物，其中该冲提液的冲提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶剂与乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶剂所提供。
上述a.步骤的C1-C4醇类为甲醇。
上述a.步骤的C1-C4的含氯烷类为二氯甲烷。
上述b.步骤的低级酯类为乙酸乙酯。
上述第一混合溶剂中正己烷的溶剂梯度为0%-99%。
上述第二混合溶剂中乙酸乙酯的溶剂梯度比例为0%-90%。
上述珊瑚活性成分将该低级酯类粗萃物进一步由该第一混合溶剂加以冲提而得，其中该第一混合溶剂的冲提梯度为：正己烷:乙酸乙酯为90:10至70:30的划分（fraction）。
上述珊瑚活性成分经冲提后于该低级酯类粗萃物所占比例为5-30%。
上述珊瑚活性成分将该低级酯类粗萃物进一步由该第一混合溶剂加以冲提而得，其中该第一混合溶剂的冲提梯度为：正己烷:乙酸乙酯为60:40至50:50的划分（fraction）。
上述珊瑚活性成分经冲提后于该低级酯类粗萃物所占比例为20-50%。
一种所述的珊瑚萃取物的萃取方法，包含：
a.以一有机混合液萃取干燥皮软珊瑚（Briareum excavatum）样品，获得有机层初萃取液，其中该有机混合液包含等比例的C1-C4醇类和C1-C4的含氯烷类；b.以水和低级酯类分配萃取该有机层初萃取液，获得一低级酯类粗萃物，该低级酯类粗萃物含有5～50％的一珊瑚活性成分。
上述b.步骤的该低级酯类粗萃物进一步以一管柱层析分析加以纯化，其以一冲提液冲提该低级酯类粗萃物，以得一冲提物，其中该冲提液的冲提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶剂与乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶剂所提供。
一种珊瑚萃取物的用途，其所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤美白。
一种珊瑚萃取物的用途，其将所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤保湿。
一种珊瑚萃取物的用途，其将所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以改善皮肤弹性。
一种珊瑚萃取物的用途，其施用所述的珊瑚萃取物，以抗发炎。
一种珊瑚萃取物的用途，其施用所述的珊瑚萃取物，以促使伤口愈合。
一种保养品，其包含所述珊瑚萃取物，该珊瑚萃取物具0.00001～10%的重量比。
采用上述结构后，本发明为珊瑚萃取物及其萃取方法，该珊瑚萃取物借由下列步骤所制得：a.以一有机混合溶剂萃取干燥皮软珊瑚（Briareum excavatum）样品，获得有机层初萃取液，其中该有机混合液包含等比例的C1-C4醇类和C1-C4的含氯烷类；b.以水和低级酯类分配萃取该有机层初萃取液，获得一低级酯类粗萃物，该低级酯类粗萃物含有5～50％的一珊瑚活性成分；其由皮软珊瑚（Briareumexcavatum）萃取而得，具有提高皮肤保湿、弹性、抑制酪胺酸酶活性、减少黑色素形成，并减缓发炎细胞浸润与控制伤口面积等功效。
本发明珊瑚萃取物的用途，其将前述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤美白、皮肤保湿、改善皮肤弹性、抗发炎、且可以促使伤口愈合。
本发明保养品包含前述的珊瑚萃取物，其中珊瑚萃取物可具0.00001～10%的重量比。
附图说明
图1是养殖型皮软珊瑚(Briareum excavatum)有效成分的粗萃及分离步骤；
图2是BP1的1H-NMR图谱；
图3是BP2的1H-NMR图谱；
图4是BP3的1H-NMR图谱；
图5是BP4的1H-NMR图谱；
图6是BP5的1H-NMR图谱；
图7是BP6的1H-NMR图谱；
图8是BP7的1H-NMR图谱；
图9是皮软珊瑚各粗萃取进行动物皮肤过敏性测试结果；
图10是离体酪胺酸酶活性测试的实验结果；
图11是离体黑色素含量测试的实验结果；
图12是BP2活体美白活性分析的实验结果；
图13是BP3活体美白活性分析的实验结果；
图14是以老鼠的纤维母细胞：NIH/3T3进行离体伤口愈合测试实验的结果，图中A、B为控制组，不给予测试物；C、D为BP2低剂量组，浓度为10μg/ml；E、F为BP2高剂量组，浓度为20μg/ml；G、H为BP3低剂量组，浓度为10μg/ml；I、J为BP3高剂量组，浓度为20μg/ml；K为各组的统计数据；
图15是以人类脐静脉内皮细胞株:EA.hy926进行离体伤口愈合测试实验的结果，图中A、B为控制组，不给予测试物；C、D为BP2低剂量组，浓度为10μg/ml；E、F为BP2高剂量组，浓度为20μg/ml；G、H为BP3低剂量组，浓度为10μg/ml；I、J为BP3高剂量组，浓度为20μg/ml；K为各组的统计数据；
图16是以3mg/0.2ml的BP2、BP3、纯乳液治疗的伤口愈合试验的实验结果；
图17是以40μg/0.2ml的BP2、BP3、粗萃物、纯乳液治疗的伤口愈合试验的实验结果；
图18是利用HE染色(5X)的大白鼠烧烫伤皮肤组织病理切片，图中A为控制组、B为烧烫伤组、C为BP2组、D为BP3组，给予天然物浓度皆为3mg/0.2ml；
图19是利用HE染色(5X)的大白鼠烧烫伤皮肤组织病理切片，图中A为控制组、B为烧烫伤组、C为BP2组、D为BP3组、E为粗萃物组，给予天然物浓度皆为40μg/0.2ml；
图20是3种雏型保养品与空白组及乳霜基质在保湿比较；
图21是3种雏型保养品与空白组及乳霜基质在弹力的比较。
具体实施方式
为了进一步解释本发明的技术方案，下面通过具体实施例来对本发明进行详细阐述。
制备例1：以有机溶剂萃取皮软珊瑚
将大量养殖于0.6吨养殖水缸的生物样品Briareum excavatum皮软珊瑚(1021.49g,湿重)进行冷冻干燥，并将干燥的珊瑚组织磨碎(得干重417.75g)，接着以有机溶剂甲醇/二氯甲烷(1:1)混合比例在室温下萃取，经多次重复萃取至添加的有机溶剂呈现澄清后，得到有机层初萃取液。再将初萃取液过滤后进行减压浓缩，得到的粗萃物以水和乙酸乙酯进行分配萃取，经过分配萃取与减压浓缩后得到乙酸乙酯层的粗萃物(15.75g)。再进行下述分离流程后可取得BP2(2.44g，约占粗萃物的15.5%)及BP3(5.6g，约占粗萃物的35.6%)。
制备例2：粗萃物分离流程
参见图1，利用管柱层析法对乙酸乙酯层进行初步的分离，选用的填充剂为硅胶(Merck,230-400mesh)，以正己烷/乙酸乙酯与乙酸乙酯/甲醇的混合溶剂为冲提液作梯度冲提，共分为七个划分（fraction），各划分的冲提条件如下所示：
划分1(BP1)：Hexane:EtOAC(正己烷:乙酸乙酯)99:1～93:7。
划分2(BP2)：Hexane:EtOAC(正己烷:乙酸乙酯)90:10～70:30。
划分3(BP3)：Hexane:EtOAC(正己烷:乙酸乙酯)60:40～50:50。
划分4(BP4)：Hexane:EtOAC(正己烷:乙酸乙酯)40:60～20:80。
划分5(BP5)：Hexane:EtOAC(正己烷:乙酸乙酯)10:90～0：100。
划分6(BP6)：EtOAC:MeOH(乙酸乙酯:甲醇)90:10～50:50。
划分7(BP7)：EtOAC:MeOH(乙酸乙酯:甲醇)40:60～0：100。
之后每一个划分经过减压浓缩后以核磁共振仪作检测，得到1H-NMR图谱的讯号（请参见图2至图8）作为判断指标成分存在依据，以利进行更进一步的生物活性实验的依据。
测试例1：离体抗发炎活性测试
1.天然物筛选及细胞株使用
针对梯度冲提步骤后粗萃取物，使用酯多糖诱发小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株离体发炎模式进行筛选工作。控制6公分培养皿的小鼠巨噬细胞RAW264.7数目在3x106个，先给予粗萃取物，再给予酯多醣(LPS)16-18小时后收集细胞。
2.西方点墨法蛋白质表现量分析
使用4%磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)(137mM NaCl,2.68mM KCl,10mM Na2HPO4,1.76mM KH2PO4,pH=7.2)收集至1.5ml离心管中，待以3000rpm离心8分钟后去除上清液，再加入温度4℃的lysis buffer200μl(50mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,1%TritonX-100,0.1mM EDTA,0.1mM EGTA,100μg/mlphenylmethylsulfonyl fluoride,1μg/ml Aprotinin,20mM NaF,0.2mM Na3VO4)打破细胞膜后，在温度4℃之下，以14,000rpm离心30分钟，取出上清液并仿照Lowry等人的方法(Lowry et al.,1951)进行蛋白质定量。
使用Bio-Rad DC protein assay kit(Hercules，CA，USA)及酶测读仪(Thermo Electron Corporation,USA)分析上清液的吸光值，以测定各标本的蛋白质量。将经校正后取样本总体积的三分之一体积的标本缓冲液(sample buffer；2%SDS,10%glycerol,0.1%bromophenol bule,10%2-mercaptoethanol,50mM Tris,Bio-RadLaboratories,inc)。利用7%、10%的SDS-PAGE以80伏特电压分离蛋白质。将SDS-PAGE上的蛋白质以135毫安电流转置overnight到PVDF膜(0.45mm pore size,Immobilon-P,Millipore,Bedford,MA,USA)上。
转印后的PVDF膜以含5%脱酯奶粉TTBS溶液(Tris-Tween buffersaline)(Tris-HCl20mM,NaCl137mM，pH7.4，0.1%Tween20)在室温下覆盖40分钟，再与1:1000稀释比例的针对诱发型一氧化氮合成酶和第二型环氧化酶作用的一级抗体在室温下反应两小时。随后以TTBS溶液清洗三次，接着以HRP-conjugated的anti-rabbit IgG抗体(1：2000)在室温中反应一小时三十分钟，二级抗体结束后以TTBS溶液清洗三次，最后利用呈色液(Immobilon WesternChemiluminescent HRP Substrate,Millipore Corporation,Billerica,MA01821U.S.A.)与PVDF膜反应，并以影像分析处理设备(UVP Biospectrum AC System,UVP Inc,U.S.A.)侦测冷光反应，纪录蛋白质的表现量，以计算机分析软件(VisionWorks LSAcquisition and analysis software,copyright2007,LLC,U.S.A.)侦测并计算相对量。并以单独加入酯多醣组别为100%，最后以α-actin作为内控制组。
其结果比较不同划分层的粗萃取物在离体抗发炎的成果，进一步作为活体实验模式和其他离体实验模式做为参考。
3.使用的目标抗体
(1)诱发型一氧化氮合成酶(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA：catalog no.6103322：polyclonal antibody)，稀释比例1:1000。
(2)第二型环氧化酶(Cayman Chemical,USA;catalog no.160106;polyclonal antibody)，稀释比例1:1000。
(3)β-actin(sigma,St.Louis,MO,USA;catalog no.A5316-2ML;monoclonal antibody)，稀释比例1:2000。
4.试验结果
参见图9，其比较不同划分层的粗萃取物在离体抗发炎的效果，结果发现20μg/ml的BP2(划分2)及BP3(划分3)即具有非常明显的离体抗发炎效果。
测试例2：美白活性分析A.离体酪胺酸酶活性测试(in vitrotyrosinase activity assay)
1.试验步骤
试验步骤参照Wang(2010)的研究报告，其整体皆引作为本案的参考数据。将B16-F10种入24小格培养盘(24well plate)的孔洞中，每小格种入1*105个细胞，放置于37℃、5%CO2的培养箱24小时后，将原有的细胞培养液移除，并加入含有粗萃物的细胞培养液，再放入培养箱培养48小时。给药结束后移除原有细胞培养液，并加200μlPBS润洗一次，然后加入100μl trypsin作用1～2分钟使细胞脱离底面，然后加入200μl细胞培养液中和trypsin反应，并将含细胞的培养液装入微量离心管内以3000rpm离心5分钟后去除上清液，加入200μl PBS润洗一次，再以3000rpm离心5分钟，去除上清液，加入100μl1%triton X-100/PBS，混合均匀使细胞破碎。接着在4℃下以10000rpm离心10分钟，取上清液进行蛋白质定量。在同浓度下的蛋白质，取等体积上清液和L-dopa(2mg/ml)混合，反应一小时后利用酶测读仪测波长475nm的吸光值做统计整理。
2.试验结果
参见图10，其利用加入不同浓度BP2及BP3于黑色素瘤细胞，48小时后进行酪胺酸酶活性分析的实验结果，其中X轴为各浓度药物，Y轴为离体酪胺酸酶活性/黑色素含量，若产生的生成物愈多，则表示催化强度愈强量。由此结果发现在相同蛋白质浓度下，给予BP2及BP3的组别皆具有抑制酪胺酸酶的活性，且随着浓度提升呈现剂量依存(dose-dependent)的趋势。
B.离体黑色素含量测试(in vitro melanin content assay)
1.试验步骤
试验步骤参照Wang(2010)的研究报告，其整体皆引作为本案的参考数据。将B16-F10种入24小格培养盘的孔洞中，每小格种入1*105个细胞，放置于37℃、5%CO2的培养箱24小时后，将原有的细胞培养液移除，加入含有粗萃物的细胞培养液，再放入培养箱培养48小时后，以200μl PBS润洗一次，然后加入100μl trypsin作用1～2分钟使细胞脱离盘底，然后加入200μl细胞培养液中和trypsin反应，装入微量离心管内以3000rpm离心5分钟，去除上清液。再加入200μl PBS润洗一次，并以3000rpm离心5分钟，去除上清液后，加入100μl1N NaOH在80℃下反应一小时。利用酶测读仪测波长405nm的吸光值做统计整理。
2.试验结果
参见图11，其利用加入不同浓度BP2及BP3于黑色素瘤细胞48小时后进行黑色素(melanin)含量测定的实验结果。将细胞加入氢氧化钠并加热溶解后，利用分光光度计测定波长为490nm的吸收值时，吸收值愈高则说明黑色素含量也愈高。由数据显示结果与酪胺酸酶活性相吻合，随着药物浓度愈高，降低的酪胺酸酶活性愈显著，而黑色素的表现量亦随着下降。
C.蘑菇酪胺酸酶抑制能力分析
1.实验步骤
在96well plate中，于每个孔洞中加入70μl的PB、20μl各种不同浓度的检品溶液，混合均匀。接着加入10μl的12U酪胺酸酶，放入37℃培养箱中反应30分钟。再加入10μl的15mM L-dopa，继续放入培养箱中反应30分钟后，于波长492nm之下测其吸光值的变化量。以H2O或50%EtOH作为控制组。以下式的抑制酪氨酸酶百分率求得待测物的抗氧化率。抑制脂质过氧化率(%)愈高，表示抗氧化性愈强。
抑制酪氨酸酶百分率(Inhibition of Tyrosinase%,IT%)=[1－(样品于492nm的吸光值)/(未添加样品的控制组于492nm的吸光值)]×100。
2.实验结果
酪胺酸酶为黑色素形成的速率决定因子，如果待测物可抑制酪胺酸酶的活性，便可减少dopaquinone类化合物的产生，在492nm的波长下所测得的吸光值则相对减少，由吸光值的高低可推算出待测物抑制酪胺酸酶活性的能力，进而可抑制黑色素生成。实验结果发现，在500μg/ml及1000μg/ml的BP2及BP3具有显著抑制酪胺酸酶活性，其实验结果可参见下表1：
D.活体美白活性分析
1.实验步骤
a.种鱼饲养:
实验使用鱼龄四个月以上的斑马鱼(AB strain Danio rerio)为实验种鱼，饲养于具有过滤器以及循环系统的压克力水缸中，水温控制于28.5℃。光暗周期分别控制为14与10小时。
b.药品配制:
欲检测的药品须先溶于100%DMSO溶液中，最终浓度必须同时考虑到DMSO以及药品浓度。
c.药物给予:
取受精后9小时的胚胎，注入96小格培养盘中，每小格内有3个胚胎及100μl的Hank’s buffer，再将配好的药品取100μl注入孔洞中，充分混合均匀后盖上孔盘盖避免水分散失造成浓度改变。置入低温光照培养箱(Model RI-80,Firstek,Taiwan)，控制光暗周期分别为14与10小时(必须与种鱼的光周期相同)，且温度维持于28.5℃，持续浸泡给药48小时。
d.鱼体影像撷取
下药后48小时(即受精后57小时)，取出幼鱼以麻醉剂(MS-222,168ppm Tricaine)麻醉后个别依序放置于凹玻片(Micro ScientificLaboratories,Inc.,U.S.A.)的凹槽中，利用1%甲基纤维(MethylCellulose)(Sigma,U.S.A.)帮助固定鱼体再利用实体显微镜(Z16APO,Leica,Heerbrugg,Switzerland)观察，搭配影像撷取系统(ideaSPOT,Diagnostic instruments Inc.,U.S.A.)及其控制软件(SPOTsoftware VERSION4.6,Diagnostic instruments Inc.,U.S.A.)，来取得鱼体影像。本实验曝光时间设为3.372msec。
e.数据处理:
将取得的鱼体影像利用影像处理软件(Image J1.43g;NationalInstitute of Health,Bethesda,MD,USA)开启，在最低阈值设为0，最高阈值设为85的范围下，定量分析各组斑马鱼的黑色素值。
2.实验结果：
参见图12及图13，观察斑马鱼的黑色素值，熊果素在20mM(约等于5446μg/ml)时色素含量剩50%左右，而随着BP2及BP3的浓度愈高，色素含量逐渐下降至70%，本实验结果BP2及BP3美白程度虽然没有较正控制组优越，但其浓度为熊果素的五百分之一倍，因此这两种粗萃物具有极佳的美白潜力的有效成分。
测试例3：促伤口愈合活性分析
A.促伤口愈合活性分析
1.实验步骤
以纤维母细胞(fibroblast，NIH/3T3)及人类脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein cell line，EA.hy926)的移动作用(in vitrowound healing assay)做法参考Rodriguez(2005)10)的研究，其整体皆引用做本案的参考数据。将细胞种入12小格培养盘(12wellplate)的孔洞中，每小格种入5*105个细胞，放置于37℃、5%CO2的培养箱24小时后，将原有的细胞培养液移除，并利用200μl tip划出一道水平的伤痕。接着加入200μl PBS润洗一次，再加入含有粗萃物的细胞培养液后拍照，再放置于37℃、5%CO2的培养箱24小时后于同一区块拍照，利用影像分析软件(TScratch version1.0)分析照片取得数据后做统计整理。
2.实验结果
参见图14，其以老鼠的纤维母细胞：NIH/3T3进行离体伤口愈合测试实验结果，图中A、B为控制组，不给予测试物；C、D为BP2低剂量组，浓度为10μg/ml；E、F为BP2高剂量组，浓度为20μg/ml；G、H为BP3低剂量组，浓度为10μg/ml；I、J为BP3高剂量组，浓度为20μg/ml。并利用SPOT Advanced软件计算影像中刮痕部分的面积，求出第24小时细胞覆盖刮痕的面积后进行统计分析，如图中K。结果显示，给予BP2的低剂量组与高剂量组的细胞覆盖面积都比控制组明显提升。
参见图15，其以人类脐静脉内皮细胞株:EA.hy926进行离体伤口愈合测试实验结果，图中A、B为控制组，不给予测试物；C、D为BP2低剂量组，浓度为10μg/ml；E、F为BP2高剂量组，浓度为20μg/ml；G、H为BP3低剂量组，浓度为10μg/ml；I、J为BP3高剂量组，浓度为20μg/ml。并利用SPOT Advanced软件计算影像中刮痕部分的面积，求出第24小时细胞覆盖刮痕的面积后进行统计分析。结果显示，给予BP2、BP3低剂量组与控制组的细胞覆盖面积相比较之下均有显著增加。
B.活体促伤口愈合活性分析
1.伤口愈合试验:
a.实验动物准备：实验动物为400-450g的Wistar大白鼠公鼠，饲养在中山大学海洋资源馆动物室中。光周期维持12小时光照12小时黑暗，大白鼠可以自由取用饮水及食物。并以空调系统控制饲养环境的温度和湿度，使环境温度保持在23℃。
b.烧烫伤伤口制造：本活体促伤口愈合活性分析参照Huang(2008)11)，其整体皆引用做本案的参考数据。将大白鼠随机分组后，以2.5%isoflurane麻醉下(麻醉机：Isotec4,Ohmeda)使用动物剃毛机背部除毛，再使用刮胡刀剃除干净。利用酒精消毒后，使用手术刀片将大白鼠背部移除直径2公分的全层皮肤，治疗组依照实验设计立即给予药物，受伤组则不做任何治疗，手术完成后每只大白鼠独立饲养。
c.对伤口给予天然物：每日相同时间取天然物(该天然物是珊瑚粗萃物与申请人提供的空白基剂进行混合使用，其中该空白基剂详细成分参见下述)均匀敷于伤口上。每次治疗前先将伤口用灭菌生理盐水清洗把前日剩余的天然物清洁，同时除去异物，再用无菌棉棒将生理食盐水拭干后，于伤口上均匀敷药。
d.伤口观察与面积计算：依实验设计的日期于烧烫伤后，将大鼠麻醉后置于翻拍架上，以数字相机(Coolpix P6000,Nikon,Japan)在相同条件下(光圈7.2、快门1/60秒)拍摄一系列照片。使用数字影像撷取系统软件(Diagnostic Instruments,Inc.,SterlingHeights,MI,USA)，分析摄影所得伤口照片以计算伤口面积。各观察时间点伤口面积的数据呈现部分，则是分别以相对于第0天伤口面积的百分比方式表现。同时测量大白鼠体重，并观察大白鼠有无外观或行为上明显异样。
2.实验结果
参见图16其以175℃铜块置于大白鼠背上10秒，分别创造4个烫伤伤口，之后每天给予各伤口3mg/0.2ml的BP2、BP3、纯乳霜作治疗的结果。其结果证实烫伤后时间(day)与伤口恢复面积(%)的关系，在给药后8天内，BP3对抑制发炎与控制伤口面积的效果较好，而BP2则是在8天后有较佳的疗效。
如图17所示，另以不同浓度的40μg/0.2ml的BP2、BP3、粗萃、纯乳液对烫伤伤口治疗。图中证实烫伤后时间(day)与伤口恢复面积(%)的关系，从第2天开始到实验结束，BP3及BP2组，都有加速治疗伤口的能力。
C.组织切片试验:
1.试验步骤：
a.病理组织切片与HE染色：
依实验设计于受伤后特定天数将大白鼠予以人道牺牲后，以4℃含有肝素(0.2U/ml)的PBS由主动脉灌流，直到静脉流出不带血色的PBS。再以4℃的4%仲甲醛(paraformaldehyde)灌流固定。最后用手术刀将受伤区域仔细取下，浸泡于10%福尔马林固定液存放在4℃环境下固定数天。
接下来进行固定组织进行脱水与渗蜡处理，利用组织自动处理系统将皮肤组织进行脱水及渗蜡，接着以石蜡组织包埋机将组织包埋成石蜡块。然后以石蜡切片机进行组织切片后，使用苏木紫-伊红染色法进行组织切片染色。完成后以封片胶封片，再将完成的样品玻片置于光学显微镜观察，结合数字影像撷取系统拍摄和纪录切片结果。
病理组织切片分析的操作流程参考Bayat(2005)12)的方法，其整体皆引用做本案的参考数据。在400X视野下，从每个皮肤组织样本的真皮层内随机选取20个区块，并进一步针对嗜中性白血球、巨噬细胞以及淋巴球等白血球数目进行定量。另外为了评估受伤皮肤恢复状况，所以分别在每个皮肤组织样本的表皮、真皮和横纹肌等3个部位各随机选取20个点，进行量测这3层分别的厚度。关于以上这些病理组织切片分析，皆是由对动物分组不知情的试验者进行操作。
b.免疫组织化学染色法：
将皮肤组织以4%仲甲醛后固定两小时后，转置至4℃的30%蔗糖溶液中隔夜后。为减低免疫组织化学上的差异，本案采用修改自先前研究(Sung et al.,2003;Chen et al.,2008)13,14)的方法进行操作。故将各组皮肤组织包埋于同一个组织块中。包埋完毕的组织块则使用冷冻切片机在-30℃下进行组织切片，每切片厚度为5μm。将冷冻切片样本于室温下干燥1小时后，置于4%仲甲醛溶液中10分钟。再以PBS稀释的山羊血清(4％)于室温下反应1小时后，分别覆盖于含有抗体的PBS(含有0.01％Triton X-100与2％山羊血清)置于4℃下隔夜。而后，分别以带有绿色荧光的二级单株抗体(AlexaFluor488-conjugated secondary monoclonal antibody)或带有红色荧光的二级多株抗体(rhodamine-conjugated secondarypolyclonal antibody)覆盖切片在室温下反应1小时。二级多株抗体结束后利用Leica DM-6000B荧光显微镜(Leica,Wetzlar,Germany)观察，并使用SPOT Xplorer数字影像撷取系统(DiagnosticInstruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)撷取影像。在观察绿色荧光时，设定荧光显微镜的雷射波长于488nm；而进行观察红色荧光影像时，则是设定雷射波长为568nm。每次撷取荧光影像时都使用2.5倍物镜固定相同曝光时间，影像尺寸在每种实验条件下均保持相同。不知情的观察者在未被告知实验内容下使用Image J这套软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)针对各组免疫活性进行计算。
2.试验结果：
图18利用HE染色(5X)探讨粗萃物对于大白鼠烧烫伤皮肤组织病理切片的影响，图18中A为控制组、图18中B为烧烫伤组、图18中C为BP2组、图18中D为BP3组，给予天然物浓度皆为3mg/0.2ml。由HE拍照结果可以看到，相对于无受伤的控制组(A)，烧烫伤组(B)与治疗组(C、D)的上皮层均有增厚的现象，尤其烧烫伤组(B)比治疗组(C)厚上许多，相对于烧烫伤组，治疗组(C)的表皮层表面较为平滑。在烧烫伤组和治疗组中皆可发现肉芽组织，显示烧烫伤会引起真皮组织受损，与诱使发炎细胞浸润(inflammatory cell infitration)，而治疗组浸润的程度低于烧烫伤组。
图19利用HE染色(5X)探讨粗萃物对于大白鼠烧烫伤皮肤组织病理切片的影响，图19中A为控制组、图19中B为烧烫伤组、图19中C为BP2组、图19中D为BP3组、图19中E为粗萃物组，给予天然物浓度皆为40μg/0.2ml。由HE拍照结果可以看到，相对于无受伤的控制组(A)，烧烫伤组(B)与治疗组(E)的上皮层均有大量噬中性白血球产生，而治疗组(C、D)的上皮层中则噬中性白血球较少，且治疗组(C)已经有毛囊再生。
依据以上结果，显示BP2与BP3对于烫伤伤口都有加速复原的情形，并且在低浓度40μg/0.2m的时似乎比在3mg/0.2ml时有更好的疗效。
测试例4：皮软珊瑚有效成分雏型保养品功效性试验
1.肤质检测仪进行肤质改善监控：
以Aramo-TS多功能肤质检测仪进行肤质功效性评估，10位受测者的手臂内侧分区每日涂抹测试样品（空白基剂、珊瑚乳霜：BP2(200μg/ml)乳霜、BP3(200μg/ml)乳霜、珊瑚粗萃(200μg/ml)）乳霜）），并于每周进行测试，持续进行6周，结果以pairedStudent’sT-Test统计分析涂抹后与背景值的差异，空白基剂及皮软珊瑚有效成分雏型保养品的有效成分整理如下表2，其中空白基剂与珊瑚乳霜的差异仅在于为珊瑚萃取物的有无。
2.试验结果
结果如图20及图21所示，受试者使用添加皮软珊瑚有效成分的雏型保养品4周之后，有明显改善受测者于皮肤的保湿度及弹性，尤其以珊瑚的BP2乳霜功效最好。
上述实施例和附图并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (19)

1.一种用于皮肤美白、保湿、改善弹性、抗发炎以及伤口愈合的珊瑚萃取物，其特征在于，借由下列步骤所制得：
a.以一有机混合液萃取干燥皮软珊瑚（Briareum excavatum）样品，获得有机层初萃取液，其中该有机混合液包含等比例的C1-C4醇类和C1-C4的含氯烷类；
b.以水和低级酯类分配萃取该有机层初萃取液，获得一低级酯类粗萃物，该低级酯类粗萃物含有5～50％的一珊瑚活性成分。
2.如权利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：b.步骤的该低级酯类粗萃物进一步以一管柱层析分析加以纯化，其以一冲提液冲提该低级酯类粗萃物，以得一冲提物，其中该冲提液的冲提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶剂与乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶剂所提供。
3.如权利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：a.步骤的C1-C4醇类为甲醇。
4.如权利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：a.步骤的C1-C4的含氯烷类为二氯甲烷。
5.如权利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：b.步骤的低级酯类为乙酸乙酯。
6.如权利要求2所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该第一混合溶剂中正己烷的溶剂梯度为0%-99%。
7.如权利要求2所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该第二混合溶剂中乙酸乙酯的溶剂梯度比例为0%-90%。
8.如权利要求6所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该珊瑚活性成分将该低级酯类粗萃物进一步由该第一混合溶剂加以冲提而得，其中该第一混合溶剂的冲提梯度为：正己烷:乙酸乙酯为90:10至70:30的划分（fraction）。
9.如权利要求8所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该珊瑚活性成分经冲提后于该低级酯类粗萃物所占比例为5-30%。
10.如权利要求1所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该珊瑚活性成分将该低级酯类粗萃物进一步由该第一混合溶剂加以冲提而得，其中该第一混合溶剂的冲提梯度为：正己烷:乙酸乙酯为60:40至50:50的划分（fraction）。
11.如权利要求10所述的珊瑚萃取物，其特征在于：该珊瑚活性成分经冲提后于该低级酯类粗萃物所占比例为20-50%。
12.一种如权利要求1所述的珊瑚萃取物的萃取方法，包含：
a.以一有机混合液萃取干燥皮软珊瑚（Briareum excavatum）样品，获得有机层初萃取液，其中该有机混合液包含等比例的C1-C4醇类和C1-C4的含氯烷类；
b.以水和低级酯类分配萃取该有机层初萃取液，获得一低级酯类粗萃物，该低级酯类粗萃物含有5～50％的一珊瑚活性成分。
13.如权利要求12所述的萃取方法，其特征在于：b.步骤的该低级酯类粗萃物进一步以一管柱层析分析加以纯化，其以一冲提液冲提该低级酯类粗萃物，以得一冲提物，其中该冲提液的冲提梯度由正己烷/乙酸乙酯的一第一混合溶剂与乙酸乙酯/甲醇的一第二混合溶剂所提供。
14.一种珊瑚萃取物的用途，其将如权利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤美白。
15.一种珊瑚萃取物的用途，其将如权利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以使皮肤保湿。
16.一种珊瑚萃取物的用途，其将如权利要求1所述的珊瑚萃取物施用于一活体的皮肤，以改善皮肤弹性。
17.一种珊瑚萃取物的用途，其施用如权利要求1所述的珊瑚萃取物，以抗发炎。
18.一种珊瑚萃取物的用途，其施用如权利要求1所述的珊瑚萃取物，以促使伤口愈合。
19.一种保养品，其包含如权利要求1～11任一项所述珊瑚萃取物，其特征在于：该珊瑚萃取物具0.00001～10%的重量比。
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