CN115058459B - 草本与珍珠粉结合的抗炎美白亮肤祛斑组合制备方法及其应用 - Google Patents

草本与珍珠粉结合的抗炎美白亮肤祛斑组合制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了草本与珍珠粉结合的抗炎美白亮肤祛斑组合制备方法及其应用。利用该草本植物和珍珠粉进行发酵，得了一种含有脂溶性成分和卟啉类化合物的活性粉，并依次制得护肤乳。该护肤乳物皮肤毒性和过敏反应性，具有对抗光老化细胞炎症反应趋势和降低黄褐斑模型豚鼠黑色素含量，进而使得该活性粉具有作为修复黄褐斑、美白亮肤的化妆品的应用前景。

Description

草本与珍珠粉结合的抗炎美白亮肤祛斑组合制备方法及其 应用
技术领域
本申请涉及珍珠粉技术领域，尤其涉及草本与珍珠粉结合的抗炎美白亮肤祛斑组合制备方法及其应用。
背景技术
珍珠是由珍珠贝科动物马氏珍珠贝、蚌科动物二焦帆蚌或褶纹冠蚌等双壳类动物软体部受刺激而形成的一种霰石型结晶体。
珍珠的主要是成分为碳酸钙、蛋白质、水分和多种微量元素包括铁、铝、镁、锌、俐、锰、锗、钾等，此外还含有卟啉类化合物。中医学认为，珍珠具有镇心安神、养阴熄风、清热堕痰、解毒生肌、护肤、养颜和抗衰老等功效。然而，珍珠粉其质地坚硬，难溶于水，若不经加工处理，人体对其吸收率低。现有珍珠粉的炮制方法有，有研制、煅制、炒制、焙制、水飞、水解和酶解等十几种方法，然而这些方法多少对珍珠粉的有效成分产生破坏，不能实现对其有效利用。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种对珍珠粉有效加工方法，已充分发挥其在美容亮肤领域的应用价值。
第一方面，本申请实施例公开了以草本植物和珍珠粉为原料的发酵方法，包括以下步骤：
制备种子液，所述种子液为包含有嗜热栖热菌的菌悬液；以及
制备发酵液，所述发酵液是由所述种子接无菌菌种至发酵培养基中进行培养得到；
其中，所述发酵培养基包含320～500mg/L珍珠粉和50～250mg/L栉叶蒿粉。
在本申请实施例中，所述发酵方法还包括制备活性粉的步骤，所述活性粉由所述发酵液经由离心，得上清液，经过干燥得到。
在本申请实施例中，所述发酵培养基包含1.5g/L蛋白胨，0.55g/L酵母粉，320～500mg/L珍珠粉，50～250mg/L栉叶蒿粉、100mg/L氨三乙酸，55mg/L CaSO4·2H2O，100mg/LMgSO4·7H2O，0.47mg/L FeCL3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/LH3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32μg/L Na2MoO4·2H2O，23μg/L CoCL2·6H2O，165mg/L KNO3，178mg/L(NH4)2SO4，70～106mg/L Na2HPO4，50～75mg/LNaH2PO4，pH值为7.8。
在本申请实施例中，所述种子液由经过平板活性的嗜热栖热菌菌落接种至种子培养基培养得到，所述种子培养基包含50～200mg/L珍珠粉，15～35mg/L栉叶蒿粉。
在本申请实施例中，所述种子培养基包含1g/L色氨酸，0.8g/L酵母粉，50～200mg/L珍珠粉，15～35mg/L栉叶蒿粉、120mg/L氨三乙酸，45mg/L CaSO4·2H2O，85mg/L MgSO4·7H2O，0.47mg/L FeCL3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/L H3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32μg/L Na2MoO4·2H2O，178mg/L(NH4)2SO4，2mg/L NaCL，70～106mg/LNa2HPO4，50～75mg/L NaH2PO4，pH值为7.8。
第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的发酵方法制得的活性粉，所述活性粉包含脂溶性成分和卟啉类化合物。
在本申请实施例中，所述脂溶性成分包括反-侧柏酮、樟脑、石竹烯、大香叶烯、α-花柏烯、匙叶桉油烯醇、丁香烯环氧物和α-桉叶醇。
第三方面，本申请实施例公开了一种护肤乳，包含第二方面所述的活性粉。
第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的发酵方法指导的活性粉、或第二方面所述的活性粉在制备美容亮肤化妆品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请利用含有栉叶蒿粉和珍珠粉的种子培养基制备嗜热栖热菌的种子液，并进一步利用含有栉叶蒿粉和珍珠粉的发酵培养基发酵培养，得到一种含有脂溶性成分和卟啉类化合物的活性粉，其中脂溶性成分和卟啉类化合物含量均分布高于栉叶蒿粉和珍珠粉自身中相关成分含量。
本申请进一步利用该活性粉制得了一种护肤乳，先经过皮肤过敏试验验证无毒性和过敏反应后，再经过光老化试验和紫外光照至黄褐斑试验验证了本申请实施例提供的护肤乳能够显著降低光老化所致的豚鼠皮肤组织相关细胞验证因子的分泌，由于混入了该活性粉，其能够帮助该护肤乳产生对抗豚鼠皮肤光老化趋势。
本申请还通过分析光老化豚鼠皮肤组织中基质金属蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G含量，验证了本申请实施例提供的护肤乳对光老化所致皮肤组织的炎症反应的影响作用。
另外，本申请还通过分析了黄褐斑豚鼠皮肤组织中黑色素合成趋势，表明本申请实施例提供的护肤乳能够干预紫外光致黑色素合成，减少黑色素沉积，进而修复黄褐斑和皮肤组织正常化产生作用，进而使得其具有作为修复黄褐斑、美白亮肤的化妆品的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例提供的护肤乳样本图，左图为初始样本，右图为放置1周后样本。
图2为本申请实施例提供的光老化试验正常组豚鼠皮肤组织HE染色图。
图3为本申请实施例提供的光老化试验模型组豚鼠皮肤组织HE染色图。
图4为本申请实施例提供的光老化试验实验组(实施例1)豚鼠皮肤组织HE染色图。
图5为本申请实施例提供的黄褐斑试验正常组豚鼠皮肤组织HE染色图。
图6为本申请实施例提供的黄褐斑试验模型组豚鼠皮肤组织HE染色图。
图7为本申请实施例提供的黄褐斑试验实验组(实施例1)豚鼠皮肤组织HE染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
栉叶蒿Neopallasia pectinata(Pall.)Poljak.，为菊科栉叶蒿属植物，产于黑龙江、吉林、辽宁、陕西、甘肃等地区。以其地上全草人药，清肝利胆，消炎止痛，主治急性黄疽型肝炎，头痛，头晕。为了充分开发利用该草本植物资源，本申请发明人发现，利用栉叶蒿作为草本植物原料，搭配珍珠粉，利用嗜热栖热菌对其进行高温发酵，得到的发酵物能够与其他常规配方匹配，得到一种抵抗光老化，并且具有修复褐斑的美白护肤类制品，具有非常广泛的应用前景。为此，本申请发明通过以下实施例得以实现。
栉叶蒿和珍珠粉的发酵
1、材料与方法
1.1、菌株
嗜热栖热菌，购自上海帛科生物技术有限公司，货号BK-J63380。
1.2、制备种子液
(1)菌株活化
平板培养基：按照5g/L蛋白胨、1g/L酵母提取物、0.7g/L硝酸钠、0.1g/LNa2HPO3、0.2g/L MgSO4·7H2O、0.1g/L CaCL2以及15g/L的琼脂配置培养基，调节pH7.5，溶解后，高压灭菌，冷凝形成平板，
将上述提供的嗜热栖热菌的冻干粉，用PBS配置成1mg/mL菌粉的菌悬液，划线于该平板培养基上，于60℃恒温培养箱中培养1-2天，富集和活化菌株。
(2)种子液
栉叶蒿，从内蒙古锡林郭勒草原采摘，阴干，粉碎，过40目筛。
种子培养基：含有1g/L色氨酸，0.8g/L酵母粉，50～200mg/L珍珠粉，15～35mg/L栉叶蒿粉、120mg/L氨三乙酸，45mg/L CaSO4·2H2O，85mg/L MgSO4·7H2O，0.47mg/L FeCL3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/L H3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32μg/L Na2MoO4·2H2O，178mg/L(NH4)2SO4，2mg/L NaCL，70～106mg/L Na2HPO4，50～75mg/LNaH2PO4，利用Na2HPO4和NaH2PO4的比例调节整个培养基pH为7.8。
挑取活化的单菌落，接种至种子培养基，于60℃恒温水浴摇床上，120rpm震摇频率培养，待生长至菌悬液OD600值0.8～1.0之间，即可得到种子液。
1.3、制备发酵液
发酵培养基：1.5g/L蛋白胨，0.55g/L酵母粉，320～500mg/L珍珠粉，50～250mg/L栉叶蒿粉、100mg/L氨三乙酸，55mg/L CaSO4·2H2O，100mg/L MgSO4·7H2O，0.47mg/LFeCL3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/L H3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32μg/L Na2MoO4·2H2O，23μg/L CoCL2·6H2O，165mg/L KNO3，178mg/L(NH4)2SO4，70～106mg/L Na2HPO4，50～75mg/LNaH2PO4，利用Na2HPO4和NaH2PO4的比例NaOH调pH至pH7.8。将上述得到的种子液以5v/v％比例接种至发酵培养基，于150rpm搅拌转速，75℃下培养余液48h，即可得到发酵液。纳米珍珠粉，购于浙江长生鸟健康科技股份有限公司。
1.4、制备活性粉
收集发酵液，于2500rpm离心10min，得其上清液，上清液45℃减压浓缩冷冻干燥，即可得到活性粉。
本申请以上述提供的嗜热栖热菌菌株，经过活化、制备种子液和发酵液，实施了实施例1，进而得到对应的活性粉。其中，种子培养基包含50mg/L珍珠粉、15mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述种子培养基内容相同。发酵培养基包含320mg/L珍珠粉、250mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述发酵培养基内容相同。
本申请还实施了实施例2，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基包含174mg/L珍珠粉、30mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述种子培养基内容相同。发酵培养基包含475mg/L珍珠粉、220mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述发酵培养基内容相同。
本申请还实施了实施例3，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基包含200mg/L珍珠粉、35mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述种子培养基成分相同。发酵培养基包含320mg/L珍珠粉、250mg/L栉叶蒿粉，其他成分与上述发酵培养基成分相同。
本申请还实施了对比例1，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基不包含栉叶蒿粉，其他成分与实施例1的种子培养基成分相同。发酵培养基与实施例1相同。
本申请还实施了对比例2，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基不包含珍珠粉，其他成分与实施例1的种子培养基成分相同。发酵培养基与实施例1相同。
本申请还实施了对比例3，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基不包含珍珠粉和栉叶蒿粉，其他成分与实施例1的种子培养基成分相同。发酵培养基与实施例1相同。
本申请还实施了对比例4，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基与实施例1相同。发酵培养基不包含栉叶蒿粉，其他成分与实施例1的发酵培养基成分相同。
本申请还实施了对比例5，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基与实施例1相同。发酵培养基不包含珍珠粉，其他成分与实施例1的发酵培养基成分相同。
本申请还实施了对比例6，采用与实施例1相同的步骤得到对应的活性粉。其中，种子培养基与实施例1相同。发酵培养基不包含珍珠粉和栉叶蒿粉，其他成分与实施例1的发酵培养基成分相同。
本申请还将栉叶蒿粉作为对照。
1.5、活性粉的脂溶性成分检测
活性粉的脂溶性成分采用GC-MS分析和检测。
供试品：将活性粉超声分散10倍mL/mg的无水乙醇中，进行减压加热回流提取，共提取3次，每次1.5h，过滤合并提取液，减压浓缩成浸膏后，加入5v/v％体积比例的纯水，再加入加入2倍体积混合溶剂进行萃取，混合溶剂包含65v/v％乙酸乙酯、25v/v％正丁醇和10v/v％的石油醚，得到萃取浸膏。准确称取1mg萃取浸膏溶于10mL上述的混合溶剂中，得到供试品。
GC分析条件：10毛细管GC色谱柱(0.25mm×30m，0.25μm，默克公司)；进样口温度为250℃；升温程序：从50℃开始，以15℃/min升至90℃，再以5℃/min升至140℃，然后以1℃/min升至163℃；最后以22℃/min升至280℃，保留1min。
载气为高纯度氦气；柱内载气流量1.26mL/min；分流比为20:1；进样量2μL；汽化室温度为250℃。MS条件：EI离子源，电子能量70eV；离子源温度200℃；接口温度250℃；溶剂延时4min；倍增器电压0.9KV；扫描范围40-600amu。
定性定量方法：各色谱峰相应的质谱图经人工解析、NIST27和NIST147谱库检索，并以一系列正构烷烃为内标，通过计算保留指数(KI)对其化学成分进行准确定性。各组分的相对百分含量是根据总离子流图由计算机采用峰面积归一化法计算而得。
1.6、活性粉卟啉类化合物含量检测
供试品：称取50g活性粉，混入800mL超纯水中，80℃下水浴加热(用磁力搅拌器搅拌)提取2h后，采用双层滤纸过滤2次，弃去滤渣，将滤液置于高速冷冻离心机中，在转速6000rpm离心15min，取上清液冷冻干燥，以作为供试品。
标准品：硫酸奎宁，购自北京百灵威科技有限公司，含量99.9％，其荧光光谱的最大吸收波长为Ex350nm/Em420nm。
标准曲线的绘制：精密称取硫酸奎宁，用0.1N硫酸溶液溶解，配制成10μg/mL母液，并用0.1N硫酸溶液将其稀释成0.1、1.0、1.5、2.5和5.0μg/mL，分别取5mL于荧光光度计上(货号F95S，上海精密仪器仪表有限公司)，在Ex340nm/Em420nm波长处分别测定荧光强度，根据不同浓度标准品对应的荧光值，绘制标准曲线。
供试品溶液浓度测定：取样品溶液5mL，同样于于荧光分光光度计相同条件下测定荧光值，根据标准曲线计算出供试品中卟啉类化合物浓度，进而即可计算出活性粉中卟啉类化合物含量。
1.7、数据处理
实验数据采用Excel 2013和SPSS22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
表1活性粉脂溶性成分百分含量(％)
实施方式 反-侧柏酮 樟脑 石竹烯 大香叶烯
实施例1 4.14±2.42ab 5.07±2.42ab 7.58±1.83b 16.09±3.74b
实施例2 4.21±1.76a 5.41±4.09a 8.05±2.42a 17.16±2.38a
实施例3 4.53±3.12a 5.34±3.94a 8.14±1.38a 16.34±4.15ab
对比例1 3.13±2.47c 4.02±2.86c 6.93±1.26c 8.05±2.12de
对比例2 3.26±2.63c 4.03±3.84c 5.49±2.01d 15.62±3.84c
对比例3 3.28±3.04c 4.38±2.91bc 4.47±2.13e 7.89±0.13e
对比例4 － － － 0.13±0.09f
对比例5 3.82±3.42b 4.73±3.04b 4.61±1.43e 9.76±4.08d
对比例6 － － － －
栉叶蒿粉 3.31±0.12c 4.07±0.32c 3.39±0.55f 7.26±0.72e
表2活性粉脂溶性成分百分含量(％)
实施方式 α-花柏烯 匙叶桉油烯醇 丁香烯环氧物 α-桉叶醇
实施例1 5.13±3.04b 14.06±1.72c 7.18±1.86a 16.82±6.24b
实施例2 5.48±2.06a 15.28±2.29b 7.43±5.09a 18.17±4.12a
实施例3 5.04±4.27b 16.87±3.02a 7.29±2.46a 17.27±3.82ab
对比例1 4.06±2.32d 8.39±3.12e 5.16±4.13c 8.65±0.16d
对比例2 4.02±2.46d 12.46±2.35d 5.71±3.54c 11.08±2.11c
对比例3 4.78±3.32c 8.23±2.17e 6.07±2.82b 8.43±1.05d
对比例4 － 0.72±0.13g － 0.06±0.01f
对比例5 4.23±2.74cd 9.13±1.74de 5.87±3.12c 12.13±3.03c
对比例6 － － － －
栉叶蒿粉 3.86±0.18e 3.24±0.43f 5.27±0.28c 5.73±0.16e
表1、2列出了各实施例和对比例制得的活性粉以及栉叶蒿粉中各脂溶性成分含量，其中，“－”表示未检出。由表1、2可知，相对于栉叶蒿粉，各实施例和对比例制得的活性粉中脂溶性成分含量均有不同程度的升高，说明经过本申请实施例提供的发酵方法能够提升栉叶蒿粉中脂溶性成分含量，尤其是大香叶烯、匙叶桉油烯醇和α-桉叶醇的含量。
表3活性粉卟啉类化合物(μg/g)
实施方式 卟啉类化合物
实施例1 37.82±4.17a
实施例2 38.42±6.82a
实施例3 39.17±3.24a
对比例1 26.81±5.04b
对比例2 21.43±3.12c
对比例3 21.13±4.07c
对比例4 16.28±2.37d
对比例5 －
对比例6 －
珍珠粉 9.43±1.26e
表3列出了活性粉中卟啉类化合物含量，其中，“－”表示未检出。由表3可知，实施例1-3和对比例1-4提供的活性粉卟啉类化合物含量均显著高于珍珠粉，并且实施例1-3的活性粉卟啉类化合物含量最高。由此说明，本申请实施例通过将珍珠粉添加中嗜热栖热菌的培养基中，通过发酵能够获得卟啉类化合物含量高于珍珠粉自身的活性成分。
结合上述对活性粉中脂溶性成分和卟啉类化合物含量的结果发现：
(1)由于对比例1-3在嗜热栖热菌的种子液制备过程中，使用的种子培养基不含栉叶蒿粉、或珍珠粉，使得其制备得到种子液中嗜热栖热菌没有提前适应同时含有栉叶蒿粉和珍珠粉营养环境，进而不能快速适应含有栉叶蒿粉和珍珠粉的发酵培养基，使得其获得的活性粉中脂溶性成分和卟啉类化合物含量有所下降，但是仍然显著高于栉叶蒿粉和珍珠粉自身中相关成分含量。
(2)而对比例4-6尽管使用了与实施例1相同的种子培养基，但是其对应使用的发酵培养基中并未同时含有栉叶蒿粉和珍珠粉，使得制得的活性粉中脂溶性成分和卟啉类化合物含量与栉叶蒿粉和珍珠粉本身相差无几。由此说明，在对嗜热栖热菌的发酵过程中，同时添加栉叶蒿粉和珍珠粉至关重要。
护肤乳
本申请发明人利用上述制得的活性粉，将其制成护肤乳，该护肤乳包含以十八醇、肉豆范酸异丙酯、荷荷巴油、十二烷基硫酸钠、丙二醇、水和活性粉，其中活性粉的质量比例为1～3％。
一个具体的护肤乳的制备过程如下：
油相：十八醇7500g，肉豆范酸异丙酯1250g，荷荷巴油300g，加热溶解，活性粉855g，用500r/min磁力搅拌2min，进行40kHZ超声处理2min，继续充分搅拌10min却至室温。其中，所用活性粉为实施例1制得。
水相：十二烷基硫酸钠250g，丙二醇1500g，水12500g，500r/min磁力搅拌5min，充分溶解作为水相。
向油相中缓慢加入水相溶液，500r/min磁力搅拌，直至5～10min，直至形成稳定的白色乳液。
参照上述护肤乳的配方和配制过程，将其中的活性粉替换为其他实施例和对比例提供，或者将其替换为本申请所述的珍珠粉和/或栉叶蒿粉，制备得到不同的护肤乳，如表4所示其配方。如图1所示，对其中实施例1制备得到的白色乳液密封放置一周后，其并未明显分层现象产生，说明其稳定性较佳。
表4
皮肤过敏试验
1、试验动物和供试品
Hartley豚鼠，购自上海甲干生物科技有限公司，体重50g作为，雌雄参半。供试品为上述实施例1-3和对比例1-9提供的护肤乳。
1、皮肤急毒性试验
取上述豚鼠8只，随机分成低剂量组和高剂量组，每组4只，2雌2雄。于给药前24小时，将顿时背部两侧毛剪短后，用20％Na2S脱毛约20cm2左右。皮肤实验区分为低剂量区和高剂量区，低剂量区的一半面积涂抹供试品0.2g，并一半面积设置为对照区。同样地，在高剂量区的一半面积涂抹供试品0.05g，并一半面积设置为对照区。并且间隔2天再次涂抹，共涂抹3次。涂药后盖上一层纱布，用无刺激性胶布固定。
每只豚鼠分笼饲养。皮肤给药24小时后，用温水或无刺激溶剂除去残留的乳膏药物与基质，去除乳膏后第1～7日，每日观察并记录动物的体重、皮肤毛发、眼和粘膜的变化、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等及其他中毒表现，若有死亡动物，应及时进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，应进行病理组织学检查。
结果所有实施例和对比例提供的护肤乳无论剂量还是高剂量涂抹豚鼠后，其无异常活动行为、对刺激反应灵敏、神经反射正常、肌张力正常、瞳孔无变化、分泌物正常和呼吸频率正常，表明这些护肤乳对豚鼠均无明显急毒性作用，具有临床用药前景。
2、皮肤刺激性试验
采用上述相同的实验涂抹方法，根据表5的皮肤刺激性和过敏反应评分标准准对各实施例和对比例提供的护肤乳涂抹后的豚鼠皮肤进行评分，结果如表5所示。
表5皮肤刺激性反应评分标准
刺激反应情况 分值 刺激反应情况 分值
无红斑 0 无水肿 0
红斑勉强可见 1 水肿勉强可见 1
红斑明显可见 2 水肿可见，边缘略高出周围皮肤 2
中度至严重红斑 3 皮肤隆起约lcm，轮廓清楚 3
紫红班并有焦痂形成 4 紫红色红斑并有焦痴形成 4
红斑反应最高分 8 水肿反应最高总分 8
每组试验的得分为红斑和水肿评分总分与受试动物的平均分值。平均分值处于0～0.49则为无刺激性，处于0.5～2.99之间，则为轻度刺激性，处于3.0～5.99之间，则为中度刺激性，处于6.0～8.0之间，则为强度刺激性。由表6可知，各组实验动物无论低剂量还是高剂量涂抹本申请提供的护肤乳均对豚鼠皮肤无刺激性。
表6
4、皮肤过敏性实验
取供试品0.2g涂于动物左侧脱毛区，涂药后纱布固定，持续6h，第7天和第14天以同样方法各重复1次，共计3次。
于末次给受试物致敏后14d，将0.1g供试品和0.1mL 0.1％2,4-二硝基氯苯(阳性对照)分别涂抹于相应动物的脱毛区，6h后去掉受试物，即刻观察，然后于24、48、72h再次观察皮肤变态反应情况，参考上述表4的皮肤变态反应程度的评分标准给予评分，评分标准为：0～10分表示无致敏性，11～30分表示轻度致敏性，31～60分表示中度致敏性，61～80分表示高度致敏性。同时注意观察动物是否有哮喘、站立不稳等全身性变态反应；按公式计算致敏反应发生率：致敏反应发生率(％)＝有变态反应动物数(不论轻重)/动物总数×100％，按致敏发生率推断致敏性。
结果如表6所示，实施例1～3和对比例1～9提供的护肤乳分别作为供试品，进行致敏实验，致敏率均为0％。而阳性对照组中，2,4-二硝基氯苯涂抹豚鼠后6h及产生变态反应，72h累积致敏率达到16.8％。
动物实验
1、材料与方法
1.1、实验动物和供试品
Hartley豚鼠，购自上海甲干生物科技有限公司，体重50g作为，雌雄参半。供试品为上述实施例1-3和对比例1-9提供的护肤乳。
1.2、光老化模型豚鼠的建立以及分组实验
在豚鼠适应期过后，采用上述相同的方法对其背部进行脱毛，形成无毛区稳定后件豚鼠固定在紫外灯下约20cm距离(320nm，平均辐照能量为1.5mW/cm2)照射豚鼠脱毛区，每两天UV照射10min，共照射3次，以构建光老化模型豚鼠。
将光老化模型豚鼠分为实验组和模型组，另设正常豚鼠作为正常组。其中，实验组豚鼠于紫外照射前和照射后均涂抹一次供试品，涂抹剂量为0.1g，统一用仪器测量无毛豚鼠皮肤的相关参数。最后把豚鼠全部处死，分别取下各组皮肤组织，并将组织分为三份，其中一份清洗后放入4％的多聚甲醛中，室温保存，用于石蜡切片做HE染色。剩下的两份保存在-80℃冰箱中。
取豚鼠脱毛区的皮肤组织，匀浆制成匀浆液，添加1/10体积的裂解液(索莱宝)，2000rpm离心10min，取上清，使用ELISA检测试剂盒(上海朗顿生物科技有限公司)检测上清中IL-1、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-2、NE、Cath-G含量。
1.3、黄褐斑模型豚鼠的建立以及分组实验
采用上述相同得到方法对豚鼠进行脱毛，形成无毛区稳定后，以黄体酮注射液于豚鼠后腿肌肉注射，两腿交替，连续45d，剂量为0.4％，5mL/kg体重，相当于人临床等效剂量的8倍。采用上述相同的方法，以波长为320nm的中波紫外线(UVB)照射豚鼠裸露皮肤，每日1次，每次60min，连续照射45d，连续观察其脱毛部位皮肤变化情况，制作豚鼠黄褐斑动物模型。
同样将黄褐斑模型豚鼠随机分为模型组和实验组，实验组豚鼠在造模后每天于豚鼠脱毛区涂抹供试品0.2g，每日2次，连续涂抹1个月。模型组豚鼠不做处理，另设正常豚鼠(具有脱毛区，并未进行紫外辐照)作为对照。
1.4、黄褐斑模型豚鼠组织切片以及免疫组化实验
分别于治疗前、治疗后1月取其背部皮肤，常规石蜡包埋，制作切片，后行HE染色观察其光镜下大体变化。HMB45免疫组化染色黑色素病理切片完成后，每张切片观察5个不同视野，找到阳性目标后，用病理图像分析仪对目标图像进行定量分析，得出每张切片5个视野的平均灰度值等。
1.5、黄褐斑模型豚鼠皮肤组织黑色素水平检测
取黄褐斑模型豚鼠皮肤组织，加入Tris-HCL进行匀浆，10000rpm离心30min，收集沉淀，加入1M NaOH溶液至完全溶解后，参照“酉州鸟羊皮肤黑色素含量和结构分析[J]，黑龙江畜牧兽医言，2019(20):35-38”公开的放养测量黑色素含量。
1.6、酪氨酸酶阳性产物的表达
取黄褐斑模型豚鼠皮肤组织，加入Tris-HCL进行匀浆，10000rpm离心30min，取上清，用酪氨酸酶试剂盒(北京索莱宝，SOT/48S)检测其中酪氨酸酶酶活。
2、结果
2.1、光老化试验
光老化试验各组豚鼠脱毛区的HE染色图如图2～4所示，正常组无明显变化；模型组豚鼠脱毛区皮肤表皮层明显增厚，真皮层变薄，炎症细胞浸润，光老化病理特征明显；实验组(实施例1)与模型组相比，其表皮层变薄至与正常组相近，密度增加，炎症细胞浸润不明显。
表7光老化实验各组豚鼠皮肤细胞因子的分泌水平
结果如表7所示，模型组IL-1、IL-6和TNF-α豚鼠皮肤组织分泌水平均显著高于正常组。与模型组比较，实验组的三种因子的量明显下降，差异有统计学意义。
表8光老化实验各组豚鼠皮肤相关酶的表达水平
如表8所示，模型组豚鼠皮肤NE、MMP-1、MMP-2和Cath-G的表达水平均显著高于正常组，表明光老化豚鼠模型建立成功。实验组中实施例1～3组别的豚鼠皮肤组织这四种酶表达水平均显著低于模型组，表明采用本申请实施例1～3提供的护肤乳干预治疗，能够缓解光老化造成的相关酶表达水平异常。
2.2、黄褐斑试验
如图5～7所示，免疫组化显示黑色素颗粒在正常豚鼠表皮基底层偶可见黑色素颗粒阳性反应的黑色素细胞，黑色素颗粒染色黄色或棕色。模型组的黑色素颗粒较多，着色深，导致其平均灰度值显著低于正常组，表明建模成功。
经联系涂抹1个月供试品进行干预治疗后，实验组各实施例1～3提供的供试品进行干预治疗后，其平均灰度值有显著提升，表明本申请实施1～3提供的护肤乳对于中波紫外线形成的黄褐斑豚鼠皮肤具有修复作用。而对比例1～9提供的供试品进行干预治疗后，其灰度值变化程度均不及实施例1～3.
表9黄褐斑实验各组豚鼠皮肤实验结果
同样地，如表9所示，模型组豚鼠皮肤组织中黑色素含量亦显著高于正常组，表明造模成功。而实验组中实施例1～3组别的豚鼠皮肤组织黑色素含量与正常组相当，表明经过实施例1～3提供的护肤乳的干预治疗，对于豚鼠脱毛区的皮肤黑色素合成进行干预，阻止了其合成，对于中波紫外光造成黄褐斑具有一定修复作用。表8中含对各组豚鼠皮肤组织中酪氨酸酶酶活进行了检测，其结果与黑色素含量变化趋势一致。酪氨酸酶对于黑色素合成起到关键作用，其实施例1～3组别的酶活相对于模型组显著降低，进一步表明本申请实施例1～3提供的护肤乳干预了黑色素合成。而对比例1～9提供的护肤乳，对于紫外光辐照引起的豚鼠皮肤组织黑色素合成干预作用有限。
本申请利用实施例和对比例制得的护肤乳，经过皮肤过敏试验验证无毒性和过敏反应后，经过光老化试验和紫外光照至黄褐斑试验验证了，本申请实施例提供的护肤乳能够显著降低光老化所致的豚鼠皮肤组织相关细胞验证因子的分泌，而这些细胞炎症因子与局部皮肤甚至全身免疫系统的有关，长期紫外线照射不仅能够导致皮肤老化和病变，还能导致相关免疫应答能力下降等疾病；而对比例1～9，尤其是对比例7～9提供的护肤乳对光老化所致的豚鼠皮肤组织相关细胞验证因子的分泌下调作用有限。由此说明，通过本申请实施例提供的护肤乳正由于混入了实施例制得的活性粉，其能够帮助该护肤乳产生对抗豚鼠皮肤光老化趋势。
本申请还通过分析光老化豚鼠皮肤组织中基质金属蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G含量，验证了本申请实施例提供的护肤乳对光老化所致皮肤组织的炎症反应的影响作用。
另外，本申请还通过分析了黄褐斑豚鼠皮肤组织中黑色素合成趋势，表明本申请实施例提供的护肤乳能够干预紫外光致黑色素合成，减少黑色素沉积，进而修复黄褐斑和皮肤组织正常化产生作用，进而使得其具有作为修复黄褐斑、美白亮肤的化妆品的应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.以草本植物和珍珠粉为原料的发酵方法，包括以下步骤：
制备种子液，所述种子液为经过平板活化的嗜热栖热菌菌落接种至种子培养基培养得到的包含有嗜热栖热菌的菌悬液；以及
制备发酵液，所述发酵液是将种子液接种至发酵培养基中进行培养得到；
其中，所述种子培养基包含1g/L色氨酸，0.8g/L酵母粉，50~200 mg/L珍珠粉，15~35mg/L栉叶蒿粉、120 mg/L氨三乙酸，45mg/L CaSO4·2H2O，85 mg/L MgSO4·7H2O，0.47mg/LFeCl3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/L H3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32 μg/L Na2MoO4·2H2O，178 mg/L (NH4)2SO4，2 mg/L NaCl，70~106mg/L Na2HPO4，50~75 mg/L NaH2PO4，pH值为7.8；
所述发酵培养基包含1.5 g/L蛋白胨，0.55g/L酵母粉，320~500 mg/L珍珠粉，50~250mg/L栉叶蒿粉、100mg/L氨三乙酸，55mg/L CaSO4·2H2O，100mg/L MgSO4·7H2O，0.47mg/LFeCl3·6H2O，2.2mg/L MnSO4·H2O，0.5mg/L ZnSO4·7H2O，0.5mg/L H3BO3，25μg/L CuSO4·5H2O，32 μg/L Na2MoO4·2H2O，23 μg/L CoCl2·6H2O，165 mg/L KNO3，178 mg/L (NH4)2SO4，70~106mg/L Na2HPO4，50~75 mg/LNaH2PO4，pH值为7.8；
其中，所述栉叶蒿（Neopallasia pectinata (Pall.)Poljak.）为菊科栉叶蒿属植物。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，还包括制备活性粉的步骤，所述活性粉由所述发酵液经由离心，得上清液，经过干燥得到。
3.一种权利要求1~2任一项所述的发酵方法制得的活性粉，所述活性粉包含脂溶性成分和卟啉类化合物，所述脂溶性成分包括反-侧柏酮、樟脑、石竹烯、大香叶烯、α-花柏烯、匙叶桉油烯醇、丁香烯环氧物和α-桉叶醇。
4.一种护肤乳，包含权利要求3所述的活性粉。
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