CN105998118B - 竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老表现在随着年龄的增长，降低IL‑1β、TNF‑α蛋白和IL‑1β、IL‑6、1L‑12、IL‑17α、TNF‑α、IFN‑γmRNA的表达。所述的竹节参总皂苷包括人参皂苷Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷2。本发明的竹节参总皂苷对自然衰老大鼠肝脏有保护作用，可能与其对抗肝脏炎症有关。

Description

竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用

技术领域

本发明提供一种竹节参总皂苷在制药中的应用，具体为制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。

背景技术

衰老是生物体普遍的生理现象，是一个及其复杂和多因子的过程，以许多器官渐进的退行性变化为其主要特征。研究显示随着衰老的进行体内稳态并不能良好维持，而肝脏是最容易受到影响的器官之一。在人和实验动物肝脏中，与衰老相关的形态学和功能学的变化包括肝血流量，脂质积累，储存脂肪和产生细胞外基质的肝星状细胞的减少、肿胀以及炎性因子的增加。慢性炎症已经被提议作为潜在的衰老以及与衰老相关的疾病的主要分子机制，炎症细胞因子在肝脏疾病中的作用受到密切关注。其中包括Th1类炎症因子：IL-1β、IL-12、IL-6、TNF-α、IFN-γ和Th17类炎症因子：IL-17α，这些炎症因子直接反映了肝脏内的炎症状态。

竹节参为五加科人参属植物竹节参Panaxjaponicas C.A.Mey的干燥呈竹鞭状根茎，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血祛痰的功效。竹节参总皂苷是从竹节参块根中提取分离而得，是竹节参的主要活性成分之一。竹节参总皂苷(total saponins ofPanaxjaponicas，TSPJ)包括人参皂苷Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷2等，多以齐墩果烷型五环三萜为主，达玛烷型四环三萜(原人参二醇、原人参三醇型)相对较少。现代药理学研究显示，竹节参总皂苷具有抗炎、抗肿瘤、降血脂等多种药理活性。前期研究显示，竹节参总皂苷可以保护异烟肼、利福平、酒精以及四氯化碳所致的小鼠肝损伤，竹节参对D-半乳糖所致的衰老具有保护效应。基于此，本研究建立大鼠自然衰老模型，初步探讨竹节参总皂苷对自然衰老大鼠肝脏炎症的干预作用。

发明内容

本发明提供一种探讨竹节参总皂苷干预自然衰老大鼠肝脏炎症作用的实验研究。以自然衰老大鼠为对象，将SPF级SD大鼠按月龄分为3月龄组(3M组)、9月龄组(9M组)、15月龄组(15M组)、24月龄组(24M组)、及24月龄的竹节参总皂苷(TSPJ)低、中、高剂量组，每组12只大鼠。TSPJ低、中、高剂量组的大鼠从18M开始，分别给予竹节参总皂苷10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg灌胃至24个月，每周停药一天，连续6个月。采用HE染色观察病理形态学变化，肝脏生化指标检测，Western Blotting检测肝脏白介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的蛋白表达，RT-PCR检测肝脏IL-1β、白介素-6(IL-6)、白介素-12(1L-12)、白介素17α(IL-17α)、TNF-α、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA的表达。随着大鼠年龄的逐渐增长，HE染色观察发现肝组织中肝索及肝血窦的排列紊乱加重，脂肪空泡和炎症细胞增多，血清ALT、胆固醇、甘油三酯明显增高，TSPJ(10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)各剂量组均能在一定程度上改善其病变情况，恢复肝功能，降低血糖血脂；IL-1β、TNF-α蛋白和IL-1β、IL-6、1L-12、IL-17α、TNF-α、IFN-γmRNA的表达随着年龄的增长逐渐升高，TSPJ各剂量组均在一定程度上的降低其表达。竹节参总皂苷对自然衰老大鼠肝脏有保护作用，与其对抗肝脏炎症有关。

因此本发明提供一种竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用。所述的竹节参总皂苷包括人参皂苷Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷2。

附图说明

图1为不同年龄段及不同处理的大鼠肝脏图。

图2为不同年龄段及不同处理的大鼠肝脏重量图。

图3为TSPJ对自然衰老大鼠肝脏HE染色的影响。

图4为TSPJ对自然衰老大鼠肝脏IL-1β、TNF-α蛋白表达的影响。

图5为TSPJ对自然衰老大鼠炎症因子基因的影响。

具体实施方式

实施例1

实验动物

SPF级雄性SD大鼠，购自三峡大学实验动物中心，动物分笼饲养于空调室内，室温(22±2)℃，湿度(60±5)％，喂标准颗粒饲料，自由饮水和摄食。

实验药物和试剂

竹节参的块根购于湖北省恩施椿木营竹节参种植基地，经湖北省天然产物研究与开发重点实验室邹坤教授鉴定其为五加科人参属植物竹节参Panaxjaponicas C.A.Mey。竹节参总皂苷(total saponins ofP.japonicas，TSPJ)是由本研究团队提取分离，其提取分离方法参照前期研究方法(袁丁,张长城,何毓敏,王洪武,胡远浪,孙志伟,赵海霞,李玉洲.一种竹节参皂苷和多糖的提取分离方法[P].湖北：CN101838338A,2010-09-22.)；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒，大连宝生物科技有限公司；PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；羊抗β-actin、白介素-1β(IL-1β),兔抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体，美国Santa Cruz公司，批号依次为：sc-4778，sc-13968，sc-1351。羊抗兔及兔抗羊IgG-HRP，武汉科瑞有限公司；化学发光剂ECL，碧云天生物技术研究所。

仪器

AL104型电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司)；TP1020脱水机(Leica公司)；ZB-J0020样品旋转浸透器(北京中兴百瑞技术有限公司)；ULTRACUTR型超薄切片机(奥地利莱卡公司)；CS-V1型摊片烤片机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；DMIRB荧光倒置生物显微镜(德国Leica公司)；CT15RT高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；HH.S21-6-S恒温水浴锅(上海新苗医疗器械制造有限公司)；WD-9405D脱色摇床(北京市六一仪器厂)；DYY-6C电泳仪(北京市六一仪器厂)；902PCR扩增仪(新加坡AB AppliedBiosystems)；Gene Genius凝胶分析系统(美国SYNGNE公司)。

方法 分组和给药

不同时间点购买3M大鼠，在三峡大学实验动物中心常规喂养至不同月龄进行实验。其中3M大鼠12只、9M大鼠12只、15M大鼠12只、18M大鼠48只，将18M大鼠分为4组，每组12只，分别是衰老对照组，竹节参总皂苷(TSPJ)低、中、高剂量组。18M衰老对照组每天灌胃生理盐水，每周灌六天停一天至24个月；TSPJ低、中、高剂量组分别给与竹节参总皂苷10mg/kg、30mg/kg、60mg/kg灌胃至24个月，每周灌六天停一天。实验前12小时禁食，饮水不限制。实验过程、实验研究均遵循中国实验动物学会动物伦理委员会制定的指导原则和要求。

血清生化指标测定：全自动生化仪测定

肝脏HE染色

大鼠处死后，完整取出肝脏组织，称重后用0.9％氯化钠注射液冲洗，予滤纸尽量沾干，快速切取肝中叶标本，置入4％多聚甲醛中固定，统一进行脱水，石蜡包埋、切片，按标准操作进行HE染色，光镜下观察结果。

肝脏电镜观察

取新鲜大鼠肝组织，放入装有预冷的生理盐水的玻璃培养皿中，经漂洗，除去肝脏表面血液，用手术刀片迅速在肝右页距边缘1cm处，切取两块肝组织，大小为1×1×1mm，迅速放入装有3％戊二醛固定液的玻璃小瓶中，4℃固定，于12h内送至三峡大学医学院电镜室做进一步处理，制作成电镜观察标本，在H-7500型投射电镜(日立公司)下观察并拍照。

Western Blotting检测蛋白的表达

取50-100mg肝组织于1.5ml EP管中，每管加入1ml PBS，冰上快速剪碎肝组织，1000r离心10s，倒去上清液，如此反复至上清液接近无色，倒去上清液，然后每管加入适量蛋白裂解液和PMSF(100:1)，轻轻混匀，加至玻璃匀浆器中，迅速碾磨呈乳白色无碎块即可，4℃12000r离心10min，取上清，加入1/5上清体积的5×上样缓冲液，煮沸10min，进行Western Blotting，检测肝组织IL-1β、TNF-α蛋白的表达，Image J软件进行分析。

RT-PCR检测基因的表达

将提取RNA所需的用物均进行高压处理，泡酸后洗净的培养皿提前于150℃烘箱中放置6h，用前取出放在超净台内。取30-70mg肝组织于1.5ml EP管中，加入适量Trizol，在培养皿中进行组织匀浆，4℃12000rpm离心10min，取上清，将其转至1.5ml EP管中，加入1/5上清体积的氯仿，震荡30s，室温静置5min，4℃12000r离心15min，将其转至新的EP管中，加入同等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置5min，4℃12000r离心10min，弃去上清，加入1ml75％乙醇于管中，洗涤沉淀，4℃12000rpm离心10min，弃去上清，即得到RNA，按照反转录试剂盒操作，得到DNA。按照PCR扩增试剂盒说明书进行扩增，扩增条件为：94℃5min，94℃30s、53℃30s、72℃30s循环34次，72℃5min。产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的表达。

表1 PCR引物序列

统计学分析

采用SPASS 18.0统计学软件进行分析。计量资料用x±s表示，多组样本间采用方差分析，WesternBlotting和RT-PCR数据采用Image J软件分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

活体动物观察

试验期间，3M大鼠精神状态好，活动正常，毛发光泽，肤色红润，大小便正常；随着年龄的增长9M、15M和24M大鼠精神萎靡，喜静，活动明显减少，饲料消耗量比3M少，体重增长较慢；TSPJ低、中、高剂量组大鼠比24M大鼠活跃，进食有所增加。

肝脏大体观察如图1、2所示

3M大鼠肝脏外观颜色呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑；随着年龄的增长9M、15M和24M大鼠的肝脏体积逐渐增大，边缘变钝，与周围组织黏连增加，切面呈油腻状；TSPJ低、中、高剂量组大鼠肝脏体积略有减轻，外观色泽有所改善。

TSPJ对自然衰老大鼠血清生化指标的影响

注vs 3M,*P<0.05,**P<0.01；vs 24M,^#P<0.05

血清TG和TC的含量是高血脂症的重要指标。ALT能一定程度反映肝损伤。通过试剂盒测定，由公式计算获得结果如表1知，与3月龄对照组(3M)比较，随着年龄的增长TG、TC、ALT的水平也不断增高，到老年(24M)升高最明显(P<0.05)，说明老年肝脏的衰老及功能的衰退；相对于老年组而言，给药组的TG、TC、ALT均有不同程度地降低，而且药物高剂量组降低较为明显。

TSPJ对自然衰老大鼠肝脏HE染色的影响

3M大鼠肝细胞排列紧密，镜下肝小叶结构完整，随着年龄的增长9M、15M、24M大鼠肝脏汇管区炎性细胞、坏死细胞明显增多，细胞索排列紊乱，脂滴和假小叶显著增加。TSPJ低、中、高剂量组在镜下观察发现TSPJ中剂量组的肝细胞和肝索的排列最为整齐，脂滴明显减少，炎性细胞和坏死细胞数量显著下降。如图3所示。

TSPJ对自然衰老大鼠肝脏IL-1β、TNF-α蛋白表达的影响

如图4显示，随着大鼠年龄的逐渐增长，肝脏组织IL-1β、TNF-α蛋白的表达逐渐增加，TSPJ低、中、高剂量组能够明显的降低其表达。

TSPJ对自然衰老大鼠炎症因子基因的影响

如图5所示，与3M大鼠肝脏相比，随着年龄的增长，IL-1β、IL-6、1L-12、IL-17α、TNF-α和IFN-γmRNA表达明显增加，与24M相比，TSPJ低、中、高剂量组均能够降低其表达。

Claims (1)

1. 一种竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用，所述的竹节参总皂苷包括人参皂苷 Re、竹节参皂苷V、竹节参皂苷 IV、竹节参皂苷 IVa、竹节参皂苷 2；竹节参总皂苷使用剂量为60mg/kg；竹节参总皂苷在制备预防及治疗肝脏衰老的药物上的应用，具体表现在TG、 TC、 ALT的降低；肝细胞和肝索的排列最为整齐，脂滴明显减少，炎性细胞和坏死细胞数量显著下降；以及降低 IL-1β、TNF-α蛋白和 IL-1β、IL-6、1L-12、IL-17α、TNF-α、IFN-γ mRNA的表达。