CN108888713A - 金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用，属于生物医药技术领域。金钗石斛生物总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用，所述金钗石斛为二年生金钗石斛，所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天20‑180mg/kg。本发明为进一步明确金钗石斛生物总碱DNLA的降脂作用及其可能的作用机制，本发明采用实验性大鼠动脉动脉粥样硬化模型，以及ApoE‑/‑小鼠转基因模型，观察DNLA对高血脂以及血管动脉粥样硬化的影响，并分析其作用机制，发现DNLA对大鼠动脉粥样硬化模型具有防治作用，作用机制部分与其下调MCP‑1/CCR2、MCPIP、CRP基因的表达有关，为DENLA用于临床治疗HLP、AS的治疗提供基础药理学依据。

Description

金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用
技术领域
本发明涉及，具体为一种金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术
随着人们日益增长的生活水平，饮食的不断改善，且人口老龄化的发展，心脑血管疾病已经成为危害人类健康的首要原因，其中高脂血症hyperlipidaemia，HLP)更是导致动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)及心脑血管疾病的主要和易患因素，并越来越引起人们广泛关注。
十几年来大量研究资料表明，中国高脂血症的发病率呈逐年增高趋势，对人体健康的损害主要表现在心血管系统的损伤,尤其以心、脑、肾血管的危害较大。高脂血症(hyperlipidaemia，HLP)是指血清中总胆固醇(cholesterol，TC)、甘油三脂(triglycer-ides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)过高或血清高密度脂蛋白(high-density lipo-protein，HDL)过低的一种全身代谢异常综合征。HLP是由于外源性脂质摄入过多，或体内脂质代谢紊乱等各种原因导致的血浆中TC、TG和(或)LDL过高和(或)HDL过低的一种全身脂代谢异常。
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)系指在动脉及其分支的脉管壁内和内膜下有脂质(主要是胆固醇及胆固醇脂)沉着，同时伴有中层平滑肌细胞向内膜移行、增殖，使内膜增厚而形成粥样病灶或纤维脂质斑块病灶的一种疾病。动脉粥样硬化的病理过程复杂，学术界曾有多种理论，如氧化应激和脂质浸润理论等，从不同角度对其发生和发展机制进行了阐释，遗憾的是没有一种理论能够全面地阐明动脉粥样硬化的发病机制。近年来随着基础医学的不断发展，国内外学者分别从感染、炎性反应及免疫学等多方面入手，提出了动脉粥样硬化发病机制的新学说:AS是一种由多种炎性因子参与并伴有细胞增生的血管慢性炎症反应过程。
大部分研究表明脂肪代谢或运转异常是引起高脂血症的重要原因，同时也是诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要危险因子。高脂高胆固醇的摄入主要侵袭动脉血管细胞，诱导其分泌细胞因子、炎性因子等介质。相关医学研究也表明，炎症在HLP与AS发生、发展及其并发症中起着重要的作用，是导致一系列恶性结果的重要因素。
HLP引起炎症的作用相关研究证明LDL、VLDL、IDL及其氧化物，进一步可用氧化磷脂、溶血磷脂酰胆碱、脂肪酸、脂蛋白酯酶、乳糜微粒等，其中HDL能有效的抑制AS的炎症反应。有研究以及文献报道，ox-LDL可以刺激炎性细胞因子释放，并进入血管内膜下；还可刺激组织因子表达并活化激活蛋白－1和NF-kB，参与AS的炎症过程。游离脂肪酸也是AS的危险因素之一，其中软脂酸能刺激单核细胞黏附和激活炎症反应，进一步刺激脂肪细胞、巨噬细胞炎性细胞因子的释放，并刺激巨噬细胞释放产生IL-6、TNF-α等炎症因子。
近年来，相关研究者们开始越来越重视由多种因素引起的慢性炎症反应因素及脂代谢紊乱在AS中的作用，学界普遍认为其是AS发生、发展的中心环节。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)及诱导型前列腺素合-1(membraneassociatedprostaglandinE-1，mPGES-1)与AS相关疾病的发生、发展之间存在密切关系。另一方面炎症因子IL-6、TNF-α刺激巨噬细胞使得表面LDL受体的合成及巨噬细胞对LDL摄取，从而加速脂质的沉积，促进粥样斑块的形成。同时作为强烈的促炎性细胞因子，其在动脉粥样硬化斑块形成和破裂中起着至关重要的影响。
金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl，DNL)为多年生附生草本植物的，属兰科石斛。作为我国传统名贵中药，金钗石斛常以新鲜或干燥茎入药，历朝历代以来屡被道家尊为中华九大仙草之首，并在2015年版《中国药典》将其收载为常用中药。我国以广西、贵州、四川和云南等等省区的大部分多见。大量研究表明，金钗石斛富含多糖、生物碱及菲类联苄类等化学成分，具有提高机体免疫能力，进一步抗肿瘤的作用。传统医学研究认为，中药石斛的有效成分主要是生物碱，并将其作为评价石斛质量的重要指标。
发明内容
本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用。
金钗石斛生物总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用。
所述金钗石斛为二年生金钗石斛。
所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天20-180mg/kg。
进一步，所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天40-90mg/kg。
随着医疗的发展，在我国，中医药在改善和治疗高血脂和预防AS等方面有肯定的疗效，且同时具有不良反应少的优势，因此在未来的医学研究工作中有必要积极研制中药以治疗高脂高胆固醇等疾病。为进一步明确金钗石斛生物总碱DNLA的降脂作用及其可能的作用机制，本发明采用实验性大鼠动脉动脉粥样硬化模型，以及ApoE-/-小鼠转基因模型，观察DNLA对高血脂以及血管动脉粥样硬化的影响，并分析其作用机制，发现DNLA对大鼠动脉粥样硬化模型具有防治作用，作用机制部分与其下调MCP-1/CCR2、MCPIP、CRP基因的表达有关，为DENLA用于临床治疗HLP、AS的治疗提供基础药理学依据。
附图说明
图1为本发明实施例中DNLA对对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响；
图2为本发明实施例DNLA对ApoE-/-小鼠血清TG、CHOL、HDL-C和LDL-C的影响；
图3为本发明实施例DNLA对ApoE-/-小鼠血管组织形态学变化的影响；
图4为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中COX-2蛋白表达的影响；
图5为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中IL-1β蛋白表达的影响；
图6为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中IL-6蛋白表达的影响；
图7为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中TNF-α蛋白表达的影响；
图8为本发明实施例大鼠胸主动脉动脉粥样硬化病变病理学变化图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步介绍本发明，但本发明不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。
实施例一、金钗石斛生物总碱的制备
1、实验材料和仪器
1.1、药材与试剂
金钗石斛药材购自赤水信天中药有限公司，经鉴定为金钗石斛Dendrobiumnobile Lindl.的干燥茎。冰醋酸(分析纯，上海申博化工有限公司，批号1202101)，甲基红(C15H15N3O2:上海三爱思试剂有限公司)，溴甲酚绿(C21H14Br4O5S：上海三爱思试剂有限公司)，二氯甲烷(重庆川江化学试剂厂，批号:20030106)，其他生物碱通用显色剂(碘化铋钾、稀碘化铋钾、改良碘化铋钾)均为分析纯，石油醚(30-60℃)等。
1.2、主要仪器
Q-Exactive高性能台式四级杆-轨道阱UPLC-MS/MS(HESI离子源)系统(美国Thermo公司)；Genius 1022液氮发生器(英国PEAK公司)；MILLI-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；精密天平(上海良平仪表有限公司)等。
2方法与结果
金钗石斛总生物碱的提取
取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量10倍量的90％乙醇浸泡12-16小时，煮沸提取3次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩成浸膏，用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤。滤液过阳离子交换树脂(钠型)，先用蒸馏水冲洗至无色，在用60％-85％的乙醇冲洗至无色，无色后用25％氨水加在80％的乙醇里面冲洗柱子，用10％硅钨酸检测，浓缩冲洗液，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物(78.3％)。
实施例二、金钗石斛总生物碱对ApoE-/-小鼠高血脂和血管动脉粥样硬化的防治作用研究
目的：观察金钗石斛总生物碱(Dendrobium nobileLindl.Alkaloids,DNLA)对ApoE-/-小鼠高血脂、动脉粥样硬化的影响以及作用机制。方法：以雄性C57BL/KsJ小鼠作正常对照，雄性ApoE-/-小鼠随机分为模型对照组、DNLA低、中、高剂量治疗组(20、30mg、80mg/kg)、辛伐他汀阳性对照组(50mg/kg/d)。连续灌胃给药16周后，收集各组小鼠血清、血管标本，全自动生化仪测甘油三酯(TG)、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白；B超观察小鼠血管内膜斑块情况，HE染色法观察血管组织形态学变化；Western blot检测血管炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平。结果：DNLA各治疗组血脂水平较模型组下降，B超下血管斑块稳定。模型组小鼠血管炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于空白组，给予不同剂量DNLA后，其表达均明显降低。结论：DNLA可降低ApoE-/-小鼠血脂水平，具有一定的血管保护作用，其机制可能与抑制炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α的产生，降低p-NF-κB-p65水平有关。
1 实验材料
1.1 实验动物
50只ApoE-/-小鼠及10只C57BL/KsJ小鼠，雄性，SPF级，4周龄，体重分别为22～26g，14～18g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供(许可证号：SCXK(京)2014-0004)。
1.2 主要药品和试剂
金钗总石斛生物碱(Dendrobium nobile Lindl.Alkaloids,DNLA)：以贵州遵义赤水产2年生金钗石斛为研究原药，原药材粉碎后以溶剂法分离提取总生物碱，由遵义医学院提纯，经测定其纯度为75.2％。
1.3 主要仪器设备
普通饲料和高脂饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责公司。
2 实验方法
2.1 分组及给药
所有小鼠均适应性饲养至8周龄，10只C57BL/KsJ小鼠作为正常对照组，50只ApoE-/-小鼠随机分为模型组(10只)、阳性药辛伐他汀组(10只)、DNLA低剂量组(10只)、DNLA中剂量组(10只)、DNLA高剂量组(10只)，实验连续进行16周。
具体分组及给药方法如下：
所有药物均以含1％吐温-80的双蒸水作为溶媒配制而成，给药体积为0.1ml/10g。
1)正常对照组(Control)：以溶媒灌胃，每天2次。
2)模型对照组(Model)：以溶媒灌胃，每天2次。
3)辛伐他汀阳性对照组(IUPAC)：以辛伐他汀(25mg/kg)灌胃，每天2次。
4)金钗石斛总生物碱低剂量组(DNLA-L)：以DNLA(20mg/kg)灌胃，每天2次。
5)金钗石斛总生物碱中剂量组(DNLA-M)：以DNLA(30mg/kg)灌胃，每天2次。
6)金钗石斛总生物碱高剂量组(DNLA-H)：以DNLA(90mg/kg)灌胃，每天2次。
试验期间，所有小鼠饲养于SPF级动物房内，条件：室温控制在20～24℃，湿度40～60％，光线12h明暗交替(光照时间：8:00～20:00)，以高压灭菌干燥的普通颗粒饲料喂养，自由饮水、进食。
2.2 小动物超声观察小鼠主动脉内膜以及粥样硬化斑块
各组小鼠连续灌胃给药16周后，称重、水合氯醛麻醉，予小动物超声下行动脉血管超声检查，Vevo70小动物超声机检查ApoE-/-小鼠胸主动脉斑块的形成。ApoE-/-小鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后脱毛，在小鼠板上的心电图金属电极上涂导电膏，并将小鼠仰卧式置于小鼠板中央，用3M透明胶将小鼠的四肢紧贴于四个电极金属片，于颈部涂上耦合剂，选用MS-700探头及B超模式，探头方向为90°，切迹是朝向小鼠下颚，缓慢移动探头到小鼠胸骨右侧切面，直到获得清晰图像.
2.3 谷草转氨酶/谷丙转氨酶(AST/ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)的测定
各组小鼠连续灌胃给药16周后，称重、麻醉、眼眶取血约1ml，室温静置，待血液充分凝固后，3000r/min离心10min分离血清，吸取适量上清采用全自动生化分析仪进行测定。
2.3主动脉H&E染色
麻醉后使用眼眶取血，处死小鼠取相同部位的主动脉组织标本，用4％中性甲醛(甲醛溶液与0.01M pH＝7.4的PBS缓冲溶液按体积1:9配制)固定48h后，常规石蜡包埋制备组织切片。按如下步骤操作
(1)3.5μm厚的石蜡切片，60℃烘烤1h后，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，过程如下：二甲苯(Ⅰ)10min→二甲苯(Ⅱ)10min→无水乙醇5min→95％乙醇5min→90％乙醇5min→80％乙醇5min→70％乙醇5min，自来水冲洗10min
(2)染色用苏木素染5-7min后，用流水冲洗数分钟；
(3)盐酸乙醇分化数秒(提插数次)观察到细胞核染色看着清楚后，再用水冲洗，至核变蓝
(4)伊红染色2min，水洗2min；
(5)常规脱水、透明、封片：80％乙醇1min→95％乙醇1min→无水乙醇(Ⅰ)1min→无水乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)2min→中性树胶封固。
(6)显微镜观察、拍照。
2.4 Western blot检测
2.5.1 试剂配制
(1)10％AP溶液
称取1g AP溶于10mL双蒸水中，混匀后分装为500μL一支，于—20℃保存，保质期为一个月左右。
(2)5％浓缩胶
双蒸水 5.5mL
30％Acr-Bis(29:1) 1.3mL
1M Tris(pH 6.8) 1.0mL
10％SDS 80μL
10％AP 80μL
TEMED 8μL
(3)8％分离胶
双蒸水 9.3mL
30％Acr-Bis(29:1) 5.3mL
1.5M Tris(pH 8.8) 5.0mL
10％SDS 200μL
10％AP 200μL
TEMED 12μL
(4)10％分离胶
双蒸水 7.9mL
30％Acr-Bis(29:1) 6.7mL
1.5M Tris(pH 8.8) 5.0mL
10％SDS 200μL
10％AP 200μL
TEMED 8μL
(5)12％分离胶
双蒸水 6.6mL
30％Acr-Bis(29:1) 8.0mL
1.5M Tris(pH 8.8) 5.0mL
10％SDS 200μL
10％AP 200μL
TEMED 8μL
(6)20％Tween20
20mLTween20加ddH2O至100mL，混匀后4℃保存。
(7)10×电泳缓冲液
Tris 30.2g
Glycine 188g
SDS 10g
加ddH2O至1000mL，混匀后室温保存。
用时量取100mL 10×电泳缓冲液+900mL ddH2O，稀释为1×电泳缓冲液。
(8)10×电转缓冲液(分子量＜70KD)
Tris 30.2g
Glycine 150.2g
加ddH2O至1000mL，混匀后4℃保存。
用时量取200mL甲醇+100mL 10×电转液+700mL ddH2O稀释为1×电转缓冲液。
(9)10×TBS缓冲液
Tris 24.23g
NaCl 80.06g
加ddH2O至1000mL，混匀后加浓HCl将pH调值至7.6，4℃保存。
用时量取100mL 10×TBS缓冲液+900mL ddH2O，稀释为1×TBS缓冲液。
(10)TBST缓冲液
1×TBS 1000mL
20％Tween 20 2.4mL
混匀后使用，现用现配。
(11)抗体洗脱液(Mild stripping buffer)：
Glycine 15g
SDS 1g
Tween-20 10mL
加ddH2O至1000mL，加浓HCl将pH调至2.2，常温保存。
2.5.2 主要操作步骤：
(1)组织中总蛋白的提取：分别称取血管30mg，置于含500μL裂解液(RIPA裂解液:PMSF:NaF＝1000:10:1)的1.5mlEP管中，用干净剪刀将组织块尽量剪碎。在冰上反复研磨组织直至浆状。静置于冰上，每10min混匀一次，30min后12000rpm，4℃离心20min。取上清液转移至新的EP管中，即为全蛋白提取物。置于-80℃保存。
用BCA法测定蛋白浓度：
1)将蛋白标准品(BSA)由5mg/mL稀释至终浓度为0.5mg/mL(稀释液为0.9％NaCl)；
2)按照说明书，将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板中，每孔加入20μL，不足体积的用0.9％NaCl补足；
3)将样本稀释50倍，做2个复孔，每孔20μL。即：2μL样本+98μL 0.9％NaCl，按照顺序分别加入到96孔板中；
4)配制BCA工作液，配制比为A:B＝50:1，充分混匀，现配现用；
5)各孔依次加入BCA工作液200μL，于37℃烘箱中孵育30min；
6)酶标仪测定：波长设定为562nm，检测各孔的吸光度值。绘制出标准曲线后计算出样本的蛋白浓度。
(2)变性：取已提取组织总蛋白加入5×上样缓冲液(体积比4:1)混匀、离心、于95℃加热5min。
(3)制胶：聚丙烯酰胺凝胶，上层为5％浓缩胶，下层分别为8％，10％及12％分离胶。
(4)上样：将变性后的样本按顺序依次加样，上样量为8μL/孔。
(5)电泳：回收电泳液与新鲜电泳液加入至电泳槽内外各半，调节电压70V，待Marker跑开(约40min)后，加大电压至110V，直至Marker到达分离胶底线时停止电泳。
(6)电转：电泳结束后，取出玻璃板，按Marker切出相应分子量的目的蛋白。由下至上顺序依次加入电转槽内：滤纸--大小相同的聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)--凝胶--滤纸(上下各3层)，电压25V，电流1A，根据分子量大小调整电转时间。
(7)洗涤：电转结束后，将PVDF膜取出，贴胶面即为正面，作好标记，用TBST液在25℃摇床上洗5min×6次。
(8)封闭：将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的TBST液中，25℃摇床上轻摇90min。
(9)洗涤：TBST液清洗5min×6次。
(10)与一抗反应：用1％BSA稀释一抗原液：β-actin(1:2000)、COX-2(1:1000)、TNF-α(1:1000)、IL-1β(1:1000)、IL-6(1:1000)p-NF-κB-p65(1:500)、NF-κB-p65(1:1000)各10mL，PVDF膜正面朝上放入50mL离心管中，4℃过夜。
(11)洗涤：回收一抗，条带取出，在25℃摇床上TBST液清洗10min×3次。
(12)与二抗反应：根据一抗来源选择相对应的HRP标记二抗(羊抗兔IgG或羊抗小鼠IgG)进行孵育，以TBST液稀释，条带正面朝上放入50mL离心管中，25℃摇床上轻摇1h。
(13)洗涤：条带取出，在25℃摇床上TBST液清洗5min×6次。
(14)增强化学发光法显色：
1)ECL显色液按A:B＝1:1比例混合配制，暗室操作；
2)将显色剂均匀覆盖于膜表面，放入BIO-RAD凝胶成像仪中，开始曝光；
3)将免疫印迹结果进行扫描，采用Quantity One定量分析软件系统对图像进行灰度值测定。
2.6 统计学处理
实验结果均采用SPSS17.0软件进行统计处理，所有数据以均数±标准差表示。所有数据有重复检测两个时间点，采用重复测量数据的方差分析，进行时间点和分组的交互作用。对每个时间点的组间比较采用单因素方差分析，方差齐用LSD检验，方差不齐采用Dunnett，T3检验，P<0.05有统计学意义。
3 结果
3.1 小动物超声下观察DNLA对对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响
结果显示，模型组可观察到斑块的影像，斑块面积为0.24±0.19mm 2，而DNLA给药组对照组只观察到DNLA-L组有斑块的影像，斑块面积仅为0.07±0.05mm 2，其余各组未见斑块，结果见图1。
如图1为本发明实施例中DNLA对对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的影响。Fig.1Effects of DNLAon the atherosclerotic plaque in ApoE-/-mice.
3.2 DNLA对ApoE-/-小鼠血清TG、CHOL、HDL-C和LDL-C的影响
模型组与正常组小鼠血清TG、CHOL、HDL-C和LDL-C明显升高(P＜0.05)；与模型组比较IUPAC组小鼠血清TG、LDL-C极明显降低(P＜0.01)，CHOL、HDL-C明显降低(P＜0.05)，与模型组比较，DNLA低剂量组小鼠血清TG、LDL-C极明显降低(P＜0.01)，CHOL明显降低(P＜0.05)，DNLA中剂量组小鼠血清TG、CHOL、LDL-C极明显降低(P＜0.01)，DNLA高剂量组小鼠血清TG、CHOL极明显降低(P＜0.01)，HDL-C、LDL-C明显降低(P＜0.05)其他给药组有下降趋势但无统计学差异，结果见表1和图2。
表1 DNLA对ApoE-/-小鼠血清TG、CHOL、HDL-C和LDL-C的影响Tab.1 Effectsof DNLA on serum TG，CHOL，HDL-C and LDL-C in ApoE-/-mice
#p＜0.05vs Control；＊P＜0.05vsModel；##p＜0.01vs Model
如图2为本发明实施例中DNLA对ApoE-/-小鼠血清TG、CHOL、HDL-C和LDL-C的影响(n＝8-10)，Fig.2 Effects of DNLA on serum TG，CHOL，HDL-C and LDL-C inApoE-/-mice(#P＜0.05vs Model；*P＜0.05vs Control；**P＜0.01vs Model).
3.3 DNLA对ApoE-/-小鼠血管组织形态学变化的影响
病理图片为100倍、200倍、400倍光镜下拍摄。正常对照组：内、中、外膜分界清楚，管腔面由单层内皮细胞覆盖，细胞完整，中膜平滑肌细胞排列整齐，外膜较薄，为疏松结缔组织；模型组：大量泡沫细胞聚积，动脉内皮细胞脱落，出现大量硬化斑块，细胞排列紊乱，血管壁结构层次不清晰。给药组：DNLA-L组小鼠血管无明显改善；DNLA-M以及阳性给药组，血管内仍可见大量泡沫细胞，细胞排列紊乱，血管壁结构层次不清晰；DNLA-H组血管可见少量泡沫细胞，未见斑块形成。
如图3为本发明实施例DNLA对ApoE-/-小鼠血管组织形态学变化的影响。Fig.3Effects of DNLA on the blood vessels of pancreas in ApoE-/-mice.
3.4 DNLA对主动脉COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达的影响
与正常对照组比较，模型组COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高，其各均值增加至对照组的2.6倍、1.5倍、1.4倍、1.7倍、1.7倍、1.6倍左右，有统计学差异；与模型组比较，各给药组都能显著降低COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白含量，有统计学意义，结果如下见图4-图7。
如图4为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中COX-2蛋白表达的影响(n＝4).Fig.4 Effects of different doess of on the COX-2protein expressionin ApoE-/-mice blood vessels.(#P<0.05vs Control；*P<0.05vs Model；**P<0.01vsModel).
如图5为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中IL-1β蛋白表达的影响(n＝4).Fig.5 Effects of different doess of on the IL-1βprotein expressionin ApoE-/-mice blood vessels.(#P<0.05vs Control；*P<0.05vs Model；**P<0.01vsModel).
如图6为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中IL-6蛋白表达的影响(n＝4).Fig.6 Effects of different doess of on the IL-6protein expressionin ApoE-/-mice blood vessels
如图7为本发明实施例DNLA不同剂量对ApoE-/-小鼠血管中TNF-α蛋白表达的影响(n＝4).Fig.7 Effects of different doess of on the TNF-αprotein expressionin ApoE-/-mice blood vessels.(#P<0.05vs Control；*P<0.05vs Model；**P<0.01vsModel).
4结论
(1)DNLA可以显著降低ApoE-/-小鼠血清TG、CHOL水平；
(2)DNLA可通过抗炎作用发挥稳定与控制动脉粥样硬化斑块形成。
实施例三、金杈石斛总生物碱大鼠动脉粥样硬化动物模型的影响
材料和方法
1.实验材料
1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体重220～300g，由第三军医大学大坪医院动物中心提供，合格证号SCXK(渝)2007-0005。
1.2 主要药物及试剂
1.2.1 受试药：金钗石斛生物总碱由遵义医学院基础药理教育部重点实验室提供，含量：78.9％，批号：20150926)；维生素D3(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：V8070)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司；批号：20071226)；规格：250g)。
1.2.2 主要试剂 兔抗MCP-1、MCPIP、NF-κB多克隆抗体(北京博奥森公司产品)，免疫组化检测试剂盒(基因科技上海有限公司，批号：GK500705)，逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)，TRIzol(宝生物工程大连有限公司)，DEPC(焦碳酸二乙酯)，SYBR PermixEx TaqTMⅡ(宝生物工程大连有限公司),引物(均由宝生物工程大连有限公司合成)。
1.3 主要仪器 实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，逆转录仪(德国Eppendorf公司)，Centrifuge 5415D离心机(德国Eppendorf公司)，TU1810紫外分光光度计(北京普析仪器有限责任公司)，Leica光学显微镜及照相系统(德国Leica MicrosystemsLtd)。
2.实验方法
2.1 制模制作及给药方法
大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白对照组、模型组、金杈石斛总碱低剂量组、金杈石斛总碱高剂量组，阳性药组(辛伐他盯),空白对照组给予普通饲料，不给维生素D3，其余各组给预以高脂饲料(82.5％普通饲料，10％猪油，2％胆固醇，5％蔗糖，0.5％胆盐，0.2％丙硫氧嘧啶)，并以60万IU/kg维生素D3溶液灌胃给药(4000万IU/g维生素D3粉末0.15g溶于100ml食用植物油，按大鼠体重1ml/100g给药)，间隔30天后重复给维生素D3溶液30万IU/kg复制大鼠动脉粥样硬化模型，从制模8周后开始，灌胃给予金杈石斛总碱(40mg/kg、20mg/kg)，,辛伐他盯(50mg/kg),模型组每天用等量蒸馏水灌胃，大鼠体重1ml/100g给药，连续给药4周。于12周末,腹主动脉取血,
2.2 血脂测定
于12周末，将大鼠腹主动脉取血，置于离心管中，以3000转/min离心10分钟，分离血清,采用酶法，用全自动血生化分析仪测定血清TC、TG、LDLC和HDLC。
2.3 胸主动脉组织病理标本制备
实验第12周后，大鼠禁食12h，称重，用7％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5ml/100g)，取下大鼠胸主动脉，10％中性甲醛溶液固定24h后，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，连续切片(厚度4μm)，HE染色，光镜下观察其病理改变，用图像分析系统采集图像并在显微镜下拍照。
2.4 Real Time PCR测血管中MCPIP、MCP-1/CCR2、CRP mRNA的表达量
2.4.1 RNA提取 将血管组织50-100mg,加入1ml Trizol，匀浆后加200μl氯仿，剧烈震荡10s，以4℃12000转/分离心10min；取上清液装入无酶EP管，加入等体积的异丙醇，以4℃12000转/分离心10min，小心弃去上清液；加入75％酒精500μl，4℃7500转/分离心10min，小心弃去酒精，重复2次；待干燥后，加入40μl DEPC水溶解。
2.4.2 测定样品中RNA的纯度及浓度 在495μl DEPC水中加入5μlRNA母液(即RNA稀释100倍)，采用TU1810紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，A260/A280比值在1.6-2.0范围内即可根据A260的值计算出RNA样品母液的浓度(RNA浓度＝A260×40μg/ml×稀释倍数)，配置50ng/μl的RNA样品液体。
2.4.3 逆转录 合成cDNA，反应总体积10μl，包括5×PrimeScript TM Buffer 2μl，PrimeScript TMRT Enzyme Mix 1 0.5μl，Oligod T Primer(50μM)0.5μl，Random 6mers(100μM)0.5μl，50ng/μl RNA 6.5μl。反应条件：37℃15min(逆转录反应)，95℃5sec，4℃保存。
2.4.4 Real time PCR反应体系的组成：SYBR superMix荧光混合物7.5μl，模板混合液(上游、下游引物)0.5μl，DEPC水4μl，稀释4倍cDNA 3μl。
MCP-1引物序列:上游5'-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3',
下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'，扩增产物片段长度146bp；
MCPIP引物序列:上游5'-TCGGCCAGATGTGCCTATCA-3',
下游5'-CTTGGAGGTCCCGGTATGTGTC-3'；扩增产物片段长度191bp；
CCR2引物序列：上游5'-TGTGAGGCTCATCTTTGCCATC-3',
下游5'-CAACCTGCATGGCCTGGTCTA-3'，扩增产物片段长度145bp；
CRP引物序列：上游5'-TTGACGCGAATCAGTCTTTG-3'，
下游5'-CATTGGGGCTGAATACCCTA-3'，扩增产物片段长度114bp；
β-actin引物序列：上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，
下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGTCTTT-3'，扩增产物片段长度150bp。
2.4.5 反应条件：Stage 1：预变性(1Cycle)95℃10min；Stage 2：PCR反应(40Cycles)95℃10s ec，60℃45sec；Stage 3：融解曲线分析95℃1min；55℃1min；(80Cycles)55℃10sec.
2.4.6 统计处理 采用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间差异比较采用单因素方差分析，PCR数据用均数±标准误表示，免疫组化IOD值采用均数±标准差表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1 金钗石斛生物总碱对高脂血症所致动脉粥样硬化模型大鼠血清TC、TG、LDLC和HDLC含量的影响(n＝8，)
结果显示,模型组与正常组小鼠血清TG、CHOL、HDL-C明显升高(P<0.05)；与模型组比较，DNLA低剂量组小鼠血清TG、LDL-C明显降低(P<0.05)，DNLA高剂量组,IUPAC小鼠血清TC、TG、LDLC、HDLC显著降低(P<0.01)，结果见表2。
model vs control #P＜0.05；vs model *P＜0.05；vs sv◆P＜0.05
表2 DNLA对高脂血症所致动脉粥样硬化模型大鼠血清TC、TG、LDLC和HDLC含量的影响。
3.2 对大鼠动脉粥样硬化病变的影响
3.2.1 胸主动脉病理学变化
HE染色，光镜下观察，正常对照组胸主动脉(A组)：动脉壁薄厚均匀，内膜光滑，无增厚，中膜平滑肌细胞排列整齐，外膜结缔组织无明显变化；模型组(B组)：动脉内皮细胞脱落，大部分血管严重萎缩、钙化，出现大量硬化斑块，血管壁结构层次不清晰；低剂量组(C组)：部分血管肌层萎缩、钙化，有硬化斑块，血管壁结构层次不清晰；高剂量组(D组)：动脉壁薄厚均匀，内膜光滑，无增厚；辛伐他盯组(E)，结果见图8(200X)。其中，正常组：动脉壁薄厚均匀，内膜光滑，无增厚，中膜平滑肌细胞排列基本整齐，外膜结缔组织无明显变化。模型组：动脉内皮细胞脱落，大部分血管严重萎缩、钙化，出现大量硬化斑块，血管壁结构层次不清晰；治疗组：部分血管肌层萎缩、钙化，有硬化斑块，血管壁结构层次不清晰。
3.2.3 对胸主动脉MCP-1/CCR2、MCPIP、CRP mRNA表达量的影响
Real-time PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组各基因表达均显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，给药组的各基因表达均见明显降低(P＜0.05)(表3)。
表3：DNLA对大鼠动脉粥样模型胸主动脉MCP-1/CCR2、MCPIP、CRP mRNA表达量的影响(n＝6)
与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，ΔP＜0.05.
4.结论：DNLA对大鼠动脉粥样硬化模型具有防治作用，作用机制部分与其下调MCP-1/CCR2、MCPIP、CRP基因的表达有关。

Claims (4)

1.金钗石斛生物总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用。
2.根据权利要求1所述金钗石斛生物总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛为二年生金钗石斛。
3.根据权利要求1所述金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天20-180mg/kg。
4.根据权利要求1所述金钗石斛总碱在制备动脉粥样硬化药物中的应用，其特征是：所述金钗石斛生物总碱的剂量为每天40-90mg/kg。
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