KR101813871B1

KR101813871B1 - 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101813871B1
Application number: KR1020150123983A
Authority: KR
Inventors: 이승재; 안택원; 이진영
Original assignee: (주)아로마뉴텍
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2018-01-03
Also published as: KR20170027421A

Abstract

본 발명은 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합한 후 증류수와 에탄올을 가해 추출한 추출액에 대하여 여과, 감압 농축 및 동결 건조로 처리하여 수득한 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유하는 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물과, 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합하는 혼합 단계; 혼합된 상기 한약재들에 증류수와 에탄올을 가해 침지시켜 상등액과 침전물로 분리하여 한약재 추출액을 추출하는 추출 단계; 상기 한약재 추출액을 여과수단으로 여과하는 여과 단계; 여과된 상기 한약재 추출액에서 농축기로 용매를 제거하여 한약재 추출물로 감압 농축시키는 농축 단계; 및 농축된 상기 한약재 추출물을 동결 건조기로 건조시키는 동결 건조 단계;를 포함하는 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 각종 기능성 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유함으로써 시너지 효과로 인하여 주름 개선, 항염증 및 피부 자극 완화 효능을 가지며, 천연물질에서 추출되어 피부에 부작용이 없어 안전하므로, 피부 미용과 건강에 유익한 효과가 있다.

Description

피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물 및 그 제조 방법{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING COMPLEX MEDICINAL HERBS EXTRACT FOR SKIN WHITENING AND ANTI-WRINKLE EFFECT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 기능성 화장료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연의 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유하여 피부의 주름을 개선시키고, 피부 자극 및 염증을 감소시킬 수 있는 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 과도한 자외선이나 오염물질 등에 노출되면 홍반, 부종, 가려움 등의 피부 자극 및 염즌 반응이 유발된다. 이러한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응 과정에서 생성되는 독성물질들이 부수적으로 피부의 색소침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름을 증가시키는 문제가 있다.

또한, 현대 사회에서는 남녀 노소를 불문하고 화장품을 사용하고 있는데, 일부 민감성 피부의 경우 화장품의 사용으로 인하여 오히려 피부 자극 및 염증이 유발될 수 있다.

피부의 주름은 피부의 노화에 의해 형성된다. 피부의 노화는 크게 내인적 노화와 광노화로 대별된다. 내인적 노화는 피부의 두께가 얇아지고, 피부의 탄력이 떨어지며, 혈관이 감소하고, 얕은 주름이 생기는 특징이 있다. 광노화는 피부의 탄력이 감소하고, 피부결이 거칠어지며, 깊은 주름이 생기고, 색소가 침착되는 특징이 있다. 이러한 피부의 주름은 진피층에 존재하는 콜라겐 교원섬유에 의해 결정되는데 콜라겐 분자는 섬유아세포에서 생성되어 진피층으로 분비된 후 자동회합에 의하여 콜라겐 섬유로 형성된다. 이러한 콜라겐 섬유는 피부 진피층에서 피부의 기계적 견고성, 조직의 결합력, 세포와의 부착, 세포분화 등에 관여한다. 콜라겐은 내·외인적 요인에 의해 생성이 감소하거나 변형이 축적되어 주름 생성의 원인이 된다. 또한, 피부의 노화는 자외선에 의한 영향이 가장 큰데, 자외선을 차단하기 위하여 자외선 차단제를 사용하는 방법이 일반적으로 사용되고 있다.

또한, 감영, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동은 감염에 대한 신속한 해결 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기시킨다. 이러한 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류되고, 특히 알러지나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화, 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 예컨대 여드름은 피부 속에서 분비된 피지가 밖으로 빠져나가지 못하고 피부 속에 쌓이면서 발생하게 되고, 이러한 피지에 여드름균이 영향을 주면서 여드름으로 진행되며, 여드름균이 증식하는 과정에서 피부에 자극을 주는 독성물질들이 분비되면서 염증을 일으켜 피지선이 터지고 고름 또는 붉은 발진 등이 생겨서 2차적으로 피부 건강을 해치게 된다.

또한, 피부는 신체에서 가장 큰 장기로 외부에 노출되어 있어 각종 외부 자극에 민감하게 반응하는 면역기관이다. 이러한 이유로 피부에는 가려움증을 동반하는 각종 질환이 빈번히 발생한다. 이러한 가려움증을 동반하는 대표적인 피부 질환은 아토피 피부염 및 피부 소양증, 염증성 피부염, 살갗의 거칠어짐 등으로 인한 피부염, 땀띠, 짓무름, 동상, 접촉성 피부염, 건선 또는 유건선 등으로 유발되는 가려움증을 포함한다. 이들 가려움증을 동반하는 질환들은 자주 긁다 보면 상처가 나게 되고 이로 인하여 세균 감염 및 외부 알러젠(allergen)에 의한 2차 감염에 따른 피부 염증이 동반된다. 이로 인하여 T-세포 및 대식세포와 같은 면역세포들이 활성화되어 여러 싸이토카인이나 뉴로펩타이드 등이 분비되어 가려움증을 일으킨다. 이를 다시 긁게 되면 피부염 증상이 증폭되는 현상이 반복되어 더욱 심각한 상태로 발전하게 되는 것이다.

주름 개선과 관련된 종래기술로, 특허문헌 1에는 의약분야에서 항산화 및 항노화물질로 사용되는 이데베논 물질을 주름 개선 용도로 사용하여 콜라겐 생성 능력을 향상시키고, 진피층의 밀도를 증가시켜 주름을 개선해 주는 주름개선용 이데베논 및 이데베논을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물이 개시되어 있다.

또한, 염증 개선과 관련된 특허문헌 2에는 합성 또는 반합성을 통해 얻어진 스테로이드계 락톤을 유효성분으로 포함하는 항염 화장료 조성물 또는 항염 피부 외용제가 개시되어 있다.

또한, 소양증 등 피부 자극 개선과 관련된 종래기술로 특허문헌 3에는 소금과 대나무를 중량비로 1:6 내지 1:9로 혼합하여 대나무에 충진한 후 대나무를 밀봉하는 과정과, 밀봉한 소금을 600 내지 900℃에서 3시간 내지 8시간 동안 가열하는 과정 및 가열한 소금을 분쇄하는 과정을 포함하는 제1소성단계 및 제1소성단계를 수행한 소금을 대나무에 충진하고 밀봉한 후 1,000 내지 1,300℃에서 2시간 내지 5시간 동안 가열하는 제2소성단계를 포함하는 피부 소양증 개선 또는 예방 효과를 갖는 죽염을 유효성분으로 포함하는 피부 소양증 개선 또는 예방용 조성물 및 그 제조 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상술한 종래기술들은 제형의 안정화가 까다롭고, 대부분 인공적인 합성물이어서 부작용 등 피부 안전성에 문제가 있어 사용에 제한이 있으며, 효과 또한 구체적인 실험에 의해 입증된 바가 없다.

따라서 주름을 개선시키고, 각종 피부 자극 및 염증을 감소시키며, 화장품 사용으로 인한 부작용을 줄이기 위한 주름 개선, 항염증 및 피부 자극 완화 효능을 갖는 기능성 조성물을 개발하는 것이 절실히 요구되고 있다.

대한민국 공개특허공보 제10-2009-0001265호(2009.01.08. 공개) 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0050981호(2015.05.11. 공개) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0032801호(2012.04.06. 공개)

본 발명은 각종 기능성 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유함으로써 시너지 효과로 인하여 주름 개선, 항염증 및 피부 자극 완화 효능을 가지며, 천연물질에서 추출되어 피부에 부작용이 없어 안전한 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물 및 그 제조 방법의 제공에 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합한 후 증류수와 에탄올을 가해 추출한 추출액에 대하여 여과, 감압 농축 및 동결 건조로 처리하여 수득한 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 한약재들은 각각 동일한 중량비로 혼합되는 것에도 그 특징이 있다.

또한, 본 발명은 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합하는 혼합 단계; 혼합된 상기 한약재들에 증류수와 에탄올을 가해 침지시켜 상등액과 침전물로 분리하여 한약재 추출액을 추출하는 추출 단계; 상기 한약재 추출액을 여과수단으로 여과하는 여과 단계; 여과된 상기 한약재 추출액에서 농축기로 용매를 제거하여 한약재 추출물로 감압 농축시키는 농축 단계; 및 농축된 상기 한약재 추출물을 동결 건조기로 건조시키는 동결 건조 단계;를 포함하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

여기서, 상기 한약재들은 각각 동일한 중량비로 혼합되는 것에도 그 특징이 있다.

게다가, 상기 추출 단계는 70% 에탄올을 한약재들의 10 내지 20배의 양을 가하여 실온에서 12 내지 48 시간 동안 침지시켜 한약재 추출액으로 추출하는 것에도 그 특징이 있다.

아울러, 상기 여과 단계는 상기 한약재 추출액을 감압여과기로 감압 여과시키는 1차 여과와, 마이크로 여과막으로 정밀 여과시키는 2차 여과를 포함하는 것에도 그 특징이 있다.

본 발명에 의하면, 각종 기능성 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유함으로써 시너지 효과로 인하여 주름 개선, 항염증 및 피부 자극 완화 효능을 가지며, 천연물질에서 추출되어 피부에 부작용이 없어 안전하므로, 피부 미용과 건강에 유익한 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물의 제조 방법의 플로우차트이다.
도 2는 HaCaT 세포주에서 세포의 생존능력에 대한 한약재 추출물의 효능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 인체의 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물의 Rantes 발현에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 인체의 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물의 MDC 발현에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5는 인체의 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물의 IP-10 발현에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 HR-1 생쥐의 등 부분을 촬영한 사진들이다.
도 7은 HR-1 생쥐의 등 피부 조직을 촬영한 디지털 현미경 분석 사진들로, 주름 개선 효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 피부 조직에서 UVB 조사로 유도된 hyperpirnentation과 histopathological(H&E) 변화에 대한 SunBlock과 한약재 추출물의 영향을 나타낸 사진들이다.
도 9는 피부 조직에서 UVB 조사로 유도된 hyperpirnentation과 histopathological(M-T) 변화에 대한 SunBlock과 한약재 추출물의 영향을 나타낸 사진들이다.
도 10은 피부 조직에서 UVB 조사로 유도된 hyperpirnentation과 histopathological(Toluidine blue) 변화에 대한 SunBlock과 한약재 추출물의 영향을 나타낸 사진들이다.
도 11은 피부 조직에서 UVB 조사에 의해 등 피부 조직에서 mRNA 유전자 발현에 대한 SunBlock과 한약재 추출물의 영향을 나타낸 그래프이다.

이하에서, 도면을 참고하여 본 발명에 따른 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물 및 그 제조 방법을 실시하기 위한 구체적인 내용에 대하여 실시예를 중심으로 상세히 설명한다.

팥(Phaseolus radiatus L.)은 콩과의 일년초 식물로서 탄수화물, 단백질뿐만 아니라 엽산, 니아신, 티아민 등 각종 비타민과 무기질이 풍부한 곡물이고, 각기병, 소갈 등을 다스리는 약제로도 잘 알려져 있다. 또한, 팥에 함유된 사포닌은 섬유질과 함께 변통을 돕고 독을 풀며 배변을 촉진하여 장을 깨끗하게 해주고, 신장병과 숙취 등에도 이용된다. 그리고 팥은 예로부터 다양한 음식의 재료로 이용되어 왔다.

팥껍질에는 아린 맛을 내는 시아니딘 배당체(cyanidine glycoside)와 사포닌 성분 등 생리활성물질이 다량 함유되어 있고, 트립신 저해제(trypsin inhibitor)와 같은 생육억제인자를 다량 포함하고 있기 때문에, 체내의 노폐물을 잘 배설시키고 해독작용을 하여 붓기를 없애 주며, 피부 진정과 기미, 주근깨 등의 멜라닌 색소를 감소시키고 피부를 환하게 해 준다.

연잎은 넬룸보사이드(Nelumboside), 누키페린(Nuciferine), 코크라유린(Coclaurine) 등의 알칼로이드, 갈산, 메틸 갈레이트 등의 아로마틱산, 퀘세틴(Quercetin), 이소퀘르시트린(Isoquercitrin) 등의 플라보노이드 등을 포함하여, 항산화 작용으로 활성산소로 인해 발생하는 성인병 예방과 노화 억제 기능을 나타내고, 항균 및 해독 작용이 우수하며, 여드름 등 피부 자극을 감소시키는 효능이 있고, 특히 둥글고 큰 잎을 부용이라고 하는데 부용은 피부 미용에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

율피는 밤의 떪은 맛이 나는 속껍질을 말하는 것으로 흔히 밤보니라고 한다. 율피의 떫은 탄틴 성분은 피부에 탄력을 주어 주름을 없애주고, 여드름이나 잡티를 제거하여 피부를 깨끗하게 해 주며, 피부 노화를 방지하는 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

포공영은 국화과 식물인 민들레와 흰민들레의 전초를 말린 것이다. 타락사스테롤(Taraxasterol), 타락세롤(Taraxerol), 루테인(Lutein), 플라스토퀴논(Plastoquinone) 등의 성분을 포함하고 있고, 열을 내리고, 염증을 진정시켜 소염 작용을 하며, 여드름 등 피부 트러블을 완화시키고, 모세혈관 강화, 면역 부활 작용, 항균 작용 등을 하는 것으로 알려져 있다.

비파엽은 장미과의 비파나무의 잎을 말려서 만든 약재이다. 털페노이드, 플라보노이드를 다량 함유하고 있어 항산화 및 항염증 효능을 갖고, 피부 자극을 감소시키며, 땀띠, 피부염을 비롯한 피부 질병에 효능이 있고, 각종 알러지 반응을 진정시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

황기는 콩과에 속하는 다년생 식물이다. 뿌리를 약재로 이용하고, 폴리산, 콜린, 사포닌 등의 약효성분을 갖고, 항산화 효능이 있어 피부 노화를 방지하고, 각종 미네랄과 비타민이 풍부하여 피부 염증에 대한 저항력을 높여 주며, 여드름이나 잡티 제거에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

산약은 마과에 속한 덩굴성 참마 또는 마의 덩이 뿌리이다. 산약에는 사포닌, 콜린 등의 성분과 함께 글루코프로테인과 아미노산이 풍부하고, 폴리페놀과 비타민이 포함되어 있어 피부를 윤택하게 하고, 건성피부에 좋으며, 미백, 피부 세포에 대한 자외선 손상의 방어 효과뿐만 아니라 산약에서 분리 추출한 저장성 단백질 디오스코린(Dioscorine), 점액성 다당류 및 폴리페놀성 화합물 등에 의하여 중금속 흡착 제거능과 항산화 효능이 우수하다고 알려져 있다.

당귀는 산형과 참당귀의 건조시킨 뿌리를 말하고, 미나리과 다년생초목의 뿌리를 꽃이 피기 전에 채취하여 건조한 것이다. 당귀에는 쿠마린계의 데커시놀 엔젤레이트와, 노다케닌, 움벨리페론, 베타-시토스테롤가 들어 있어 항산화 작용은 물론 활성산소 제거 효능이 있고, 항균 및 미백 기능이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 이러한 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합한 후 증류수와 에탄올을 가해 추출한 추출액에 대하여 여과, 감압 농축 및 동결 건조로 처리한 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유하는 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물과 그 제조 방법에 관한 것이다.

먼저, 도 1의 플로우차트를 참고하면, 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합하는 혼합 단계(S1 단계)를 수행한다. 이때, 팥은 물에 불린 후 알맹이와 껍질을 분리한 후 채반을 이용하여 껍질만 모아서 수득하며 분리된 팥껍질을 모아 건조기에서 건조시킨 후 사용한다.

상기 혼합 단계(S1 단계)의 수행 후 혼합된 상기 한약재들에 증류수와 에탄올을 가해 침지시켜 상등액과 침전물로 분리하여 한약재 추출액을 추출하는 추출 단계(S2 단계)를 수행한다.

상기 추출 단계(S4 단계)는 70% 에탄올을 팥껍질 중량의 10 내지 20배의 양을 가하여 실온에서 12 내지 48 시간 동안 침지시켜 한약재 추출액으로 추출하는 것이 바람직하다.

상기 추출 단계(S2 단계)의 수행 후, 상기 한약재 추출액을 여과수단으로 여과하는 여과 단계(S3 단계)를 수행한다. 상기 여과 단계(S3 단계)는 상기 한약재 추출액을 감압여과기로 감압 여과시키는 1차 여과와, 마이크로 여과지나 여과막으로 정밀 여과시키는 2차 여과를 포함할 수 있다. 이때, 상기 1차 여과는 흡입 여과라고도 하는데 감압에 의하여 여과기 중의 액면에 대기압이 가해져 여과를 촉진시키는 것이고, 여과속도가 증가되고 다량의 액을 단시간 내에 여과시킬 수 있다. 더불어, 상기 2차 여과는 마이크로 단위 예컨대 0.45㎛ 여과막으로 정밀 여과하여 불순물 및 침전물을 제거할 수 있다. 이와 같은 여과 단계를 거침으로써 상기 한약재 추출액은 넓은 pH 영역에서도 침전물이 발생되지 않고 안정하여 저장성이 향상되게 된다.

상기 여과 단계(S3 단계)의 수행 후, 여과된 상기 한약재 추출액에서 농축기로 용매를 제거하여 한약재 추출물로 감압 농축시키는 농축 단계(S4 단계)를 수행한다. 상기 농축 단계(S4 단계)는 증발 농축기를 이용하여 열을 가하여 소정의 고형분의 함량에 도달할 때까지 용매를 증발시켜 감압 증류시킨다. 이렇게 되면 한약재에 함유된 유효성분들이 최대한 유지되어 그 고유한 특성을 발현하게 된다.

상기 농축 단계(S4 단계)의 수행 후, 농축된 상기 한약재 추출물을 동결 건조기로 건조시키는 동결 건조 단계(S5 단계)를 수행한다. 상기 동결 건조 단계(S5 단계)는 동결 건조기를 이용하여 상기 한약재 추출물을 완전히 건조시켜 -20℃ 이하의 조건하에 보관하게 된다.

< 실시예 >

1. 시료 추출

건조된 팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀를 각각 12.5g씩 계량하여 혼합하고, 상술한 한약재들에 증류수 및 70% 에탄올을 한약재들 중량의 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 동안 침지시켜 상등액과 침전물로 분리하여 한약재 추출액을 추출하였다. 그리고, 한약재 추출액을 감압여과기로 여과한 후, 증발 농축기로 감압 농축시켜 용매를 제거한 다음. 농축된 한약재 추출물을 동결 건조기로 완전히 건조시켜 -20℃ 이하에서 냉동보관하는 방식으로 화장료 조성물의 시료를 제조한다.

2. 실험 기기

본 실험에 사용한 기기는 열탕추출기(DWT-1800T, 대웅, Korea), 증발 농축기(Rotary vaccum evaporator, BUCHI B-480, Switzerland), 동결 건조기(Freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan), CO2 배양기(Forma scientific Co., USA), 원심분리기(한일과학, Korea), Plate shaker(Lab-Line, USA), Spectrophotometer(Shimazue, Japan), Bio-freezer(Sanyo, Japan), Quantitative Real-Time PCR(Applied Biosystems, USA), ELISA reader(Molecular Devices, USA), HPLC(High performance liquid chromatography; Waters Co. USA)를 사용하였다.

3. 실험 방법

가. 각질형성세포( Hacat )에서 TNF -a+ IFN -r로 유도된 염증반응에 대한 피부 주름 개선 및 항염증에 미치는 효과

(1) 세포주 및 세포배양

Human keratinocyte(HaCaT cells)는 한국 세포주은행 (Seoul National University, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. Human keratinocyte(HaCaT cells)를 10% FBS과 1% 항생제가 첨가된 MEM 배지에서 37℃의 온도와 5% CO₂ 조건이 유지되는 CO₂배양기(Forma Sci, USA)에서 배양하였다.

(2) 세포 독성(cell cytotoxicity )

한약재 추출물이 생쥐 Human keratinocyte(HaCaT cells)에 세포독성을 나타내는지 확인하고자 "Chung YC, Chiang BH, Wei JH, Wang CK, Chen PC, Hsu CK. Effects of blanching, drying and extraction processes on the antioxidant activity of yam (Dioscorea alata). Int J Food Sci Technol. 2008 ; 43 : 859-864"에서 Chung 등이 사용한 MTT assay를 시행하였으며 그 내용은 다음과 같다. 각각 Human keratinocyte(HaCaT cells)를 96-well plates에 1×10⁶ cells/mL 농도로 100μL씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 한약재 추출물을 각 농도별(12.5, 25, 50, 100, 200, 400㎍/mL)로 제조한 후 세포에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그리고, 24시간 후 DMEM의 10분의 1에 해당하는 MTT 용액(0.5 mg/mL)을 가하고 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시킨 후 상층액을 제거하였다. 그런 다음 암 조건에서 30 분간 건조한 후 DMSO를 100μL 분주하여 1시간 동안 혼합한 후 ELISA reader(Molecular device, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포생존률(%)은 다음 식에 의해 산출하였다.

(3) 한약재 추출물의 항염증 / 주름 개선 효과

HaCat 세포주에서 TNF-α+IFN-γ(10 ng/mL)의 처리에 의해 유도된 IP-10, Rantes, 그리고 MDC 단백질을 증가시킨 후 한약재 추출물이 어느 정도 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인하고자, HaCat 세포에서 각 효소에 대한 단백질 양을 측정하기 위해 ELISA를 시행하였으며 그 내용은 다음과 같다. 사람 피부각질 HaCaT 세포 배양은 24-well culture plate에 넣고 standard incubator conditions(37℃, humidified, 5% CO2 / 95% air environment)에서 24시간 배양한 다음, 상층액을 제거했고, 여기에 10㎍/㎖의 농도로 TNF-α+IFN-γ를 처리한 cyclosporin A(10 ㎍/ml), 한약재 추출물(10, 50, 100 ug/ml)을 2㎖씩 넣고, 다시 24시간 배양한 후 상층액을 분리하여 냉동실에 보관하여 사용하였다. 이때, ELISA 측정은 사람 IP-10, Rantes, 그리고 MDC(eBioscience, USA) ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 코팅 antibody를 microwell에 100 ㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었으며 각 well을 wash buffer로 세척하고 assay diluent를 200㎕씩 넣어서 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. 표준품을 희석하고 상청액을 20배 희석한 후 microplate를 세척하고 각 표준품과 상청액을 100㎕ 씩 넣었으며 2시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. Microplate를 세척하고 working detector를 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였으며, microplate를 세척하고 suvstrate solution을 만들어서 각 well에 100 ㎕씩 넣고 30분 동안 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. Stop solution을 각 well에 50 ㎕씩 넣고 microplate spectrophotometer에서 흡광도 450㎚로 항주름 효과를 측정하였다.

나. 온천수와 한약재의 조합물의 소양증 / 피부 염증에 관한 동물 효능 시험

(1) HRM -2 실험동물

온천수와 한약재의 조합물의 멜라닌화 억제를 마우스에서 확인해 보고자 20~22g의 HRM-2 melanin-possessing hairless mice를 Hoshino Laboratory Animals Co. Ltd.(Saitama, Japan)로부터 분양받아 항생제를 첨가하지 않은 고형사료(삼양사료 Co.,)와 물을 충분히 공급하였고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%의 환경에서 12시간의 light-dark cycle이 유지되는 동물사육실 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물실험의 윤리적, 과학적 타당성 검토 및 효율적인 관리를 위하여 대전대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받았다.

(2) 온천수를 포함한 크림 제형 제조

온천수와 한약재의 조합물의 크림 제형은 수상, 유상, 안정제에 2% 5입욕제, 2% 5입욕제+팥껍질+율피+연잎, 2% 5입욕제+팥껍질+율피+연입+도고온천수 2% 또는 0.5% SPF 47/PA⁺⁺의 첨가물을 혼합하여 만들었고 이는 하기 표 1과 같다. 여기서 5입욕제는 앞서 서술한 8가지 한약재들 중에 팥껍질, 율피, 연잎을 제외한 나머지 5가지 한약재들을 원료로 추출 제조한 화장료 조성물의 시료를 포함하는 입욕제이고, 2% 5입욕제는 이러한 5가지 한약재들로 추출 제조한 화장료 조성물의 시료가 입욕제에 2% 포함된 것을 의미한다.

[표 1]

(3) HRM -2 생쥐에서 피부 주름에 미치는 효과

1) HRM -2 생쥐의 실험군 분류

HRM-2 melanin-possessing hairless mice에 melanogenesis를 유발하였을 때 온천수와 한약재의 조합물이 미치는 효과를 확인하고자 실험군을 다음의 표 2와 같이 분류하였다.

[표 2]

2) UVB 조사 및 과색소침착 유발

7주령의 HRM-2 생쥐에 UVB 램프(15W type, UV maximum wave length 312nm; UV intensity 100μW cm^-2, Ieda Boeki Co., Tokyo, Japan)로 등 피부에 조사하여 피부두께, 탄력, 그리고 색소침착 변화에 대하여 온천수와 한약재의 조합물의 효과를 검증하고자 하였다. 하기 표3과 같이 HRM-2 생쥐의 등피부에 크림 제형으로 제작한, 양성대조군, 온천수와 한약재의 조합물의 2% 및 0.5%의 크림을 도포하고 후 마취한 후 UVB를 30㎝ 거리에서 5분간 조사하였으며 1주에 3회로 4주간 조사하였다.

[표 3]

3) 색소침착의 육안적 관찰

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부를 육안적으로 관찰하기 위하여 실험 시작 후 1주, 3주 및 5주차에 총 3회 실험동물 피부의 착색상태를 용매대조군 도포부위와 시료군 도포 부위를 비교하여 상대적인 주름 효과를 관찰하였고, 마우스를 에테르로 마취한 후 피부표면 상태를 디지털 카메라(D 70 model, Nikon, Tokyo, Japan)로 촬영하였다.

4) 색소침착에 대한 Image Analysis Software 분석

실험 시작 후 1주, 3주 및 5주에 디지털 카메라로 촬영된 사진을 분석하기 위하여 Image Analysis Software(Bio-Rad, USA)를 이용하였다. 전체 등 부위 중 멜라닌 침착을 비교하기 위하여 왼쪽 등과 오른쪽 등을 구분하였으며 왼쪽 등의 색소침착 면적(area)과 오른쪽 등의 색소침착 면적(area)의 차이로부터 멜라닌 침착 정도를 계산하였다.

5) 피부 조직에서 IL-31의 mRNA 전사량

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부에 온천수와 한약재의 조합물을 도포하여 IL-31(Interleukin-31)이 피부 염증과 소양증을 유발하는 대표적인 사이토카인(Cytokine)으로 알려져 있으며, IL-31 수용체의 유전자 돌연변이가 가려움증을 유발하는 기전으로 알려진 IL-31 mRNA의 전사량에 어느 정도 영향을 미치는 지 확인하고자 UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부에서 각 효소에 대한 mRNA의 양을 측정하기 위하여 RT-PCR을 시행하였으며 그 내용은 다음과 같다.

① RNA 추출

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부를 적출하여 RNAzol^B 500㎕를 넣고 homogenizer로 세포들을 분쇄하였으며 여기에 chloroform(CHCl₃) 50㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분 동안 방치한 후 13,000rpm에서 원심 분리하였고 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분 동안 방치하였다. 이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후 80% EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

② 역전사 (Reverse Transcription)

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부에서 추출된 total RNA 3㎍을 75℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 이에 2.5㎕의 10mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides(25 pmole/25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor (20U/㎕), 1㎕ 100 mM DTT, 4.5㎕ 5×RT buffer (250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl₂)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT (200U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.

③ Real-time RT- PCR

Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 실험에 사용한 primer sequence는 하기 표 4와 같다.

[표 4]

IL-31 mRNA 유전자 발현은 SYBR법으로, internal standard를 생쥐 GAPDH probe set; Endogenous Control(VIC® / MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems(4352339E)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation은 50℃에서 2분간, 94℃에서 10분간, 그리고 40cycles을 95℃에서 0.15분간 및 60℃에서 1분간 수행하였다. 실험군과 대조군은 internal standard로 GAPDH를 사용하였다. Target group의 RQ(relative quantitative)는 Quantitative PCR로 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

y = x(1+e)n

y: yield, x: starting quantity, n: number of cycles, e: efficiency

6) 피부의 조직학적 관찰

피부조직의 광학현미경적 변화를 관찰하기 위해 적출된 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 12시간 고정하고 흐르는 물에 수세한 후, 70%, 80%, 95% 및 100% 에탄올로 탈수시킨 다음 xylene으로 투명하였고 침투과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 제작된 파라핀 블록을 microtome을 이용하여 4㎛ 두께의 박절편을 제작하였으며 4㎛ 두께의 박절편을 xylene에 탈 paraffin, 함수, 수돗물에 수세하여 목적에 맞는 염색을 실시하였다. 전반적인 피부 조직의 변화를 관찰하기 위하여 Harris hematoxylin 용액에 옮겨 5분간 핵을 염색한 후 흐르는 물에 수세하고 1% HCl-alcohol 용액으로 3회 침적 후 충분히 수세하여 1% ammonium 용액으로 청색화 하고 eosin 용액에 3분간 세포질을 염색한 후 80% 알코올로 이동하였으며 95% 및 100% 알코올을 사용하여 탈수시켰다. 청명 과정을 거친 후 canada balsam 으로 봉입 후 현미경으로 검경하였다.

7) 피부의 주름개선 관찰

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부의 주름개선을 관찰하기 위하여 잠시 ethyl ether로 마취한 후 생쥐의 등피부를 USB Disital Microscope (x400, CE FOROHS, china)로 피부조직을 400배 촬영하여 주름의 변화를 검경하였다. 전체 등 부위 중 주름 침착을 비교하기 위하여 왼쪽 등과 오른쪽 등을 구분하였으며 왼쪽 등의 색소 침착이 나타난 부위에 대하여 주름 형성 및 개선 정도를 관찰하였다.

8) 통계 처리

각 실험군 결과값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001).

4. 실험 결과

가. 각질 형성 세포(Hacat)에서 TNF-a+IFN-r로 유도된 염증반응에 대한 HaCat세포주에서 피부 주름 개선 및 항염에 미치는 효과 측정 결과.

(1) 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)에 의한 RAW264 .7 세포주와 HaCaT 세포주의 세포생존 능력확인

한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 피부 항염증 측정을 위한 HaCaT 세포주의 세포독성을 확인한 결과, 도 2와 같이 "5가지 혼합 입욕제+팥껍질/율피/연잎"은 200㎍/㎖ 이상에서 세포독성이 나타난 것을 확인할 수 있었다.

(2) 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)에 의한 인체 각질 세포 HaCaT 세포주에서 피부 항염증 작용 검증 결과

HaCaT세포에서 tomor necrosis factor alpha(TNF-a)와 IFN-γ에 의해 유도되는 inducible protein 10(IP-10), RANTES(regulated on activation), MDC(macrophage-derived chemokine) 발현 분비에 대한 한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)이 TNF-a와 IFN-γ로부터 유도되는 inducible protein 10(IP-10), RANTES(regulated on activation), MDC(macrophage-derived chemokine)의 발현을 저해함으로써 피부 주름을 개선할 수 있는 주름 개선제로서의 활용가능성을 확인하였다.

1) 인체 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물 ( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)의 Rantes 발현에 대한 영향

한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 피부 항염증 측정을 위한 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자로 대식세포염증성 단백질인 RANTES 생산량은, 도 3에 도시된 바와 같이 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자인 RANTES 생산량은 정상군(Normal)에 비하여 TNF-α+IFN-γ(TI)를 처리한 대조군(TI)이 현저하게 증가되었고, 양성대조군인 CsA는 RANTES 생산량이 대조군(TI)에 비해 통계학적으로 유의성있게 감소되었으며, "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물"을 처리한 실험군의 RANTES 생산량은 50㎍/㎖ 이상에서 대조군(TI)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소되었다.

2) 인체 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)의 MDC 발현에 대한 영향

한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 피부 항염증 측정을 위한 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자로 대식세포염증성 단백질인 MDC 생산량은, 도 4에 도시된 바와 같이 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자인 MDC 생산량은 정상군(normal)에 비하여 TNF-α+IFN-γ(TI)를 처리한 대조군(TI)이 현저하게 증가되었고, 양성대조군인 CsA는 MDC 생산량이 대조군(TI)에 비해 통계학적으로 유의성 있게 감소되었으며, "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물"을 처리한 실험군의 MDC 생산량은 50㎍/㎖이상에서 대조군(TI)에 비하여 통계학적으로 유의성있게 감소되었다.

3) 인체 HaCaT 각질세포주에서 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)의 IP-10 발현에 대한 영향

한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 피부 항염증 측정을 위한 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자로 대식세포염증성 단백질인 IP-10 생산량은, 도 5에 도시된 바와 같이 HaCaT 각질세포주에서 염증케모카인 인자인 IP-10 생산량은 정상군(normal)에 비하여 TNF-α+IFN-γ(TI)를 처리한 대조군(TI)이 현저하게 증가되었고, 양성대조군인 CsA는 IP-10 생산량이 대조군(TI)에 비해 통계학적으로 유의성 있게 감소되었으며, 5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물을 처리한 실험군의 IP-10 생산량은 50㎍/㎖ 이상에서 대조군(TI)에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소되었음을 확인하였다.

(3) In vivo : 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)의 소양증/주름개선 효과

1) HR-1 생쥐의 등 피부 조직에서 주름개선 효과

도 6 및 도 7을 참고하면, 한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 UVB만을 조사한 마우스는 대조군(UVB_control)에 비하여 주름의 생성이 매우 증가한 것으로 관찰되었다. 그리고 UVB와 동시에 피부에 2%SunBlock을 처리한 HR-1생쥐에서는 증가된 주름이 유의적으로 감소하는 효과가 있었으며, "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물"을 처리한 그룹에서는 약간의 개선은 있었으나 "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물+도고온천수"를 처리한 그룹에 비하여 적은 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물+도고온천수"가 UVB에 의해서 유발된 주름을 유의적으로 감소시켜 주는 효과가 있음을 제시하고 있다.

2) HR-1 생쥐의 등 피부 조직의 조직학적 분석

도 8 및 도 9를 참고하면, 한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 UVB만을 조사한 마우스는 대조군(UVB_control)에 비하여 정상군(HR-1-Nr)의 피부조직에 비해 대조군(UVB-control)이 epidermis의 두께가 과형성, 확장되어 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증의 침윤 등이 정상군(HR-1_Nr)에 비하여 현저하게 증가하여 UVB조사에 의한 피부 조직손상이 증가한다는 것을 관찰하였다. 그리고 SunBlock 도포군와 "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물+도고온천수" 추출물에서는 대조군 (UVB-control)에 비하여 정상군(HR-1_Nr)에 가깝게 epidermis의 두께가 줄어들었으며 그 주변에 세포변형과 각화증상의 침윤 등이 감소되었다. 그러나 "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물" 처리군은 대조군(UVB-control)에 비하여 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 콜라겐의 침윤 등이 약간 감소되었지만 epidermis의 두께는 대조군과 차이가 없었다.

(4) In vivo : 한약재 추출물( 5입욕제 + 팥껍질 / 율피 /연잎의 추출물)의 소양증 개선 효과

1) HR-1 생쥐의 등 피부 조직에서 소양증 개선 효과

도 10을 참고하면, 한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물)에 대한 UVB만을 조사한 마우스는 대조군(UVB_control)에 비하여 정상군(HR-1-Nr)의 피부조직에 비해 대조군(UVB-control)이 epidermis의 두께가 과형성, 확장되어 그 주변에 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증 및 비만세포의 침윤 등이 정상군(HR-1_Nr)에 비하여 현저하게 증가하여 UVB조사에 의한 피부 조직손상이 증가한다는 것을 관찰하였다. 그리고, SunBlock 도포군와 "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물+도고온천수" 추출물에서는 대조군(UVB-control)에 비하여 정상군(HR-1_Nr)에 가깝게 epidermis의 두께가 줄어들었으며 그 주변에 세포변형과 각화증상 및 비만세포의 침윤 등이 감소되었다. 그러나, "5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물" 처리군은 대조군(UVB-control)에 비하여 과각화, 색소침착, 과립증가, 부전각화증, 비만세포의 침윤 등이 약간 감소되었지만 epidermis의 두께는 대조군과 차이가 없었다.

2) HR-1 생쥐의 등 피부 조직에서 소양증 바이오마커 IL-31 유전자 발현분석

도 11을 참고하면, HR-1 hairless mouse의 등 피부를 적출하여 피부광노화에 의한 소양증 바이오마커인 IL-31 mRNA 유전자 발현을 real-time PCR로 분석하였다. 온천수와 한약재의 조합물이 UVB를 조사한 HR-1 hairless mouse의 등 피부에서 소양증에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 IL-31 mRNA 유전자 발현은 양성대조군인 SunBlock 도포군이 대조군(UVB-control)에 비하여 9.9% 유전자 발현이 억제되었다. 그리고 2% 한약재 추출물(5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물) 도포군은 대조군(UVB-control)에 비하여 19.39% 유전자 발현이 통계학적으로 유의성 있게 억제되었다(p<0.01). 그리고, 5입욕제+팥껍질/율피/연잎의 추출물+온천수의 실험군은 대조군(UVB-control)에 비하여 48.2% 유전자 발현이 통계학적으로 유의성 있게 억제되었다(p<0.05).

결국, 본 발명에 따른 복합 한약재 추출물 함유 기능성 화장료 조성물 및 그 제조 방법은 각종 기능성 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유함으로써 시너지 효과로 인하여 주름 개선, 항염증 및 피부 자극 완화 효능을 가지며, 천연물질에서 추출되어 피부에 부작용이 없어 안전하므로, 피부 미용과 건강에 유익한 것이다.

본 발명에서 상기 실시 형태는 하나의 예시로서 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

Claims

팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합한 후 증류수와 에탄올을 가해 추출한 추출액에 대하여 여과, 감압 농축 및 동결 건조로 처리하여 수득한 한약재 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 한약재들은 각각 동일한 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물.
팥껍질, 연잎, 율피, 포공영, 비파엽, 황기, 산약 및 당귀의 한약재들을 혼합하는 혼합 단계;
혼합된 상기 한약재들에 증류수와 에탄올을 가해 침지시켜 상등액과 침전물로 분리하여 한약재 추출액을 추출하는 추출 단계;
상기 한약재 추출액을 여과수단으로 여과하는 여과 단계;
여과된 상기 한약재 추출액에서 농축기로 용매를 제거하여 한약재 추출물로 감압 농축시키는 농축 단계; 및
농축된 상기 한약재 추출물을 동결 건조기로 건조시키는 동결 건조 단계를 포함하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물의 제조 방법.
제 3항에 있어서,
상기 한약재들은 각각 동일한 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물의 제조 방법.
제 3항에 있어서,
상기 추출 단계는 70% 에탄올을 한약재들의 10 내지 20배의 양을 가하여 실온에서 12 내지 48 시간 동안 침지시켜 한약재 추출액으로 추출하는 것을 특징으로 하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물의 제조 방법.
제 3항에 있어서,
상기 여과 단계는 상기 한약재 추출액을 감압여과기로 감압 여과시키는 1차 여과와, 마이크로 여과막으로 정밀 여과시키는 2차 여과를 포함하는 피부에 대한 주름개선 및 항염증 기능을 갖는 복합 한약재 추출물 함유 화장료 조성물의 제조 방법.