KR101894175B1 - 프로폴리스, 모링가 및 상엽 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로폴리스, 모링가, 상엽 추출물로부터 얻는 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 각각 함유할 때보다 3종의 추출물을 혼합시킬 때 피부주름 개선 및 항염증 효과가 더 증가되었는바, 식물 유래의 피부보호 제품 개발에 유용한 원료로 사용될 수 있다.

Description

프로폴리스, 모링가 및 상엽 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 {Composition for Cosmetics Containing Mixed Extracts of Propolis, Moringa and Morus alba L}

본 발명은 프로폴리스, 모링가 및 상엽 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 여러 가지 생리기능을 가진 보호막이면서 동시에 타인으로부터 미용적 호감을 얻는데 중요한 기관이기도 하며, 노화된 피부는 외견상 보이는 변화와 함께 여러 가지 피부의 기능적 장애를 동반하고 있다. 한편 나이보다 젊어 보이는 피부를 가지고 있는 노인은 삶에 더 만족감을 보이는 것으로 알려져 있다. 이것은 피부가 가진 생리적 기능에 버금가는 중요한 의미가 있는데, 심한 노화의 흔적은 삶의 활력에 지대한 영향을 주어 심한 경우 우울증에 빠지기도 한다. 따라서 피부노화를 예방하거나 최소화하기 위한 보다 적극적인 노력이 필요하다.

피부 노화는 크게 두 가지 과정으로 일어나는데, 특별한 환경적 요인 없이 누구에게나 세월과 함께 일어나는 변화를 내인성 노화(intrinsic aging)라 하며, 여기에 햇볕과 같은 환경요인에 장기간 노출되어 얼굴, 목, 손등에 나타나는 변화를 광노화(photoaging)라고 한다.

내인성 노화의 주 원인은 우리 몸의 대사과정에서 만들어진 반응성 활성산소라디칼에 의하여 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상이 누적되기 때문이며, 외인성 노화는 유해한 활성산소가 자외선에 의하여 만들어진다는 점에서 차이가 있다. 일단 활성산소가 만들어진 후 몸속에 있는 여러 가지 보호 장치에 의하여 효과적으로 제거되지 못하게 되면 일련의 염증반응이 일어나 피부 손상이 초래된다.

또한 광노화는 피부노화의 주된 요인으로 피부에 생기는 대부분의 미용 및 의학적 문제의 원인이 되고 있는데, 광노화를 일으키는 햇빛의 파장대(action spectrum)는 자외선 영역이다. 일광화상은 주로 자외선B(UVB, 290~320nm)에 의하여 발생되지만, 피부노화와 암을 유발하는 것은 자외선B 뿐만 아니라와 자외선A(UVA, 320~400nm)도 원인이다. 따라서 광노화를 막기 위해서는 반드시 자외선A와 B를 모두 차단해야만 한다.

나아가 피부노화를 유발하는 가장 대표적인 외적 요인은 햇빛이지만, 이 외에도 적외선, 흡연, 약물복용, 폐경 등 기타 많은 요인이 연관되어 있다. 특히 흡연은 피부에 악영향을 주는데, 각질층의 수분 함량을 떨어뜨려 건조하게 만들고, 에스트로겐을 감소시켜 피부를 위축시키며, 여성 피부의 노화를 촉진시킨다.

피부노화의 예방과 치료로서, 내인성 노화는 모든 이에게 피할 수 없는 현상이지만, 광노화는 적극적인 노력에 의하여 피할 수 있다. 자외선 노출을 줄이기 위해서는 아침 10시부터 오후 3시까지의 시간대에는 야외활동을 피하고 외출 전에 자외선 차단제를 피부에 바르도록 하고, 긴소매 옷과 창이 넓은 모자나 우산을 쓰는 것이 좋다.

또한 체내로부터 배출되는 피지 및 땀, 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 성분 등이 피부상에 존재하는 피부 상재균에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 이들에 의해 피부 염증이 유발될 수도 있으며, 태양으로부터 나오는 자외선에 의해서도 피부 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다. 이러한 외부 환경에 의해 노출된 피부는 활성산소종에 쉽게 노출되고, 발생된 활성산소종은 정상적인 세포 조직이나 세포막 뿐만 아니라 인접해 있는 조직 세포와 비세포 성분들까지 공격하게 되어 피부는 결국 염증을 일으키게 된다.

이를 해소하기 위해서는 항산화제의 섭취나 화장품 등의 도포도 피부노화 및 염증에 효과가 있는데, 이들 중 대부분은 피부에 발랐을 경우에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이들의 효능과 부작용이 아직 명확히 규명되지 않은 상태이므로 과용해서는 안 된다.

한편, 피부 개선과 관련한 종래기술로서 하기 특허문헌 0001에는 "산초, 백두옹, 이끼, 팔각회향, 에키나시아 및 프로폴리스의 혼합 추출물을 유효 성분으로 하는 피부 개선용 화장료 조성물"이 개시되어 있으나, 이는 항균 및 항염 효과가 있을 뿐이고, 광(光)방어 및 피부 항노화와는 다른 것이다. 또한 하기 특허문헌 0002에는 “모링가 추출물을 함유하는 나노에멀젼 천연 미용 조성물의 제조방법”이 개시되어 있으나, 이는 방부제가 사용되지 않아 피부자극을 방지하는 등의 효과가 있을 뿐이고, 광(光)방어 및 피부 항노화와는 다른 것이다. 또한 하기 특허문헌 0003에는 “상엽 추출물 등이 함유된 피부노화방지 및 주름억제 기능을 갖는 생약재 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 엘라스타제 저해활성, SOD활성, 항산화활성이 뛰어나 피부노화방지 및 주름억제 기능을 가질 뿐이다.

본 연구자들은 오랜 연구를 통하여 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 혼합 추출물이 피부주름 개선 및 항염증의 가능성을 발견하였고, 동물모델과 생화학적, 분자생물학적 프로파일에서 상기 효과를 얻어내어 본 발명을 완성하게 되었다.

등록특허공보 제10-1176521호(2012. 8. 17.) 등록특허공보 제10-1572155호(2015. 11. 20.) 등록특허공보 제10-0722955호(2007. 5. 22.)

본 발명은 프로폴리스, 모링가 및 상엽 추출물로부터 얻는 혼합 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 피부주름 개선 및 항염증 효과를 가지면서도 부작용을 감소시키는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 프로폴리스, 모링가, 상엽 추출물로부터 얻는 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 프로폴리스, 모링가 및 상엽 추출물을 각각 함유할 때보다 3종의 추출물을 균등하게 혼합시킬 때 피부주름 개선 및 항염증 효과가 더 증가되었는바, 혼합 추출물은 식물 유래의 피부보호 제품 개발에 유용한 원료로 사용될 수 있다.

도 1은 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 체중 변화를 나타내는 도면이다.
도 2는 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 식이효율을 나타내는 도면이다.
도 3은 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 생쥐 상피조직 두께를 나타내는 도면이다.
도 4는 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 콜라겐 섬유를 나타내는 사진이다.
도 5, 6은 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 생쥐 등주름 형태를 나타내는 사진이다.
도 7은 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 생쥐 pro-inflammatory cytokine 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 생쥐 IL-31R, MMP-2 및 유전자 발현 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본원 발명에 의한 화장료 조성물의 MMP-2 단백질 발현 결과를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예 및 적용예에 의해 보다 상세하게 설명한다.

먼저, 본 발명의 구성성분인 약제를 설명하면, 프로폴리스(propolis)란 꿀벌이 전나무, 버드나무 등 각종 나무로부터 모은 다양한 수액(식물에 따라 성분의 차이가 있음)과 꽃에서 모은 꽃가루에 꿀벌 자신의 밀랍(beeswax) 등 분비물을 이용하여 만든 물질이다. 그 효능으로서, 항균 및 항산화 작용 등이다. 프로폴리스에 들어 있는 항산화 작용의 플라보노이드는 비타민 C가 파괴되지 않도록 도와주며, 여러 가지 비타민과 무기질, 아미노산 등이 풍부하게 들어 있어 건강 증진에 도움이 된다고 알려졌다.

모링가(Moringa)는 필수 아미노산 9가지를 모두 함유하고 있는 극히 드문 식물 자원 중 하나로서, 우리 몸을 늙게 하는 활성산소들이 우리 몸의 세포들을 공격하여 노화를 촉진 시키는데, 이러한 활성산소의 생성을 억제시키는 항산화작용을 하는 물질이 46가지나 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

상엽(桑葉)은 뽕나무의 잎을 말린 것으로서, 가을에 서리가 내린 다음에 잎을 따거나 낙엽들을 모아 햇볕에 말린다. 맛은 쓰고 달며 성질은 서늘하며, 폐경(肺經), 간경(肝經)에 작용한다. 풍열사(風熱邪)를 없애고, 혈열(血熱)을 제거하며, 출혈을 멎게 하고, 눈병을 낫게 한다. 약리실험에서 혈당 및 혈압 강하 작용, 이뇨 작용, 항균 작용이 밝혀졌다.

본 발명에 의한 화장료 조성물의 유효성분인 프로폴리스, 모링가 및 상엽 추출물로부터 얻는 혼합 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.

예건대, 본 발명의 프로폴리스, 모랑가 및 상엽의 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 에탄올로서, 70% 에탄올, 1,3-부틸렌 글리콜이다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 건조 중량의 2~10배이며, 보다 바람직하게는 5~7배이다. 상기 혼합 추출물은 천연물 각각의 추출물을 혼합하는 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 추출시 조건으로서, 30-60℃의 온도에서 1시간 내지 5시간 추출된다.

추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증류기로 용매를 제거하여 농축하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있으며, 이렇게 하여 상기 추출물은 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 화장료 조성물에 포함되는 성분은 본 발명의 유효성분으로 사용되는 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 혼합 추출물 이외에 생체성분의 활성을 유지시켜주는 다양한 성분들, 예컨대 보존제, 삼투제, pH 조절제, 완충제, 안정제, 수산화알루미늄, 인산 알루미늄, 계면활성제, 리포솜, 증점제 등 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 유연화장수, 영양화장수, 팩 또는 유화형 화운데이션 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 크림인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 혼합 추출물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.75~4.5중량%이며, 바람직하게는 3.0중량%이다. 상기 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 혼합 추출물의 함량이 0.75중량% 미만인 경우에는 피부주름 개선 및 항염증 효과를 나타내는데 문제점이 있고, 4.5중량%를 초과하는 경우에는 시너지 효과를 기대하지 못할뿐더러 조성물의 제형의 안정성에 문제점이 있다. 또한 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 각 추출물은 1.0 : 1.0 : 1.0의 동량의 질량비로 혼합되어 혼합 추출물이 된다.

이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<참고예>

1. 실험동물

숫컷 6주령의 20~22g 생쥐 HR-1 albino를 공급받아 실험 당일까지 고형사료와 물을 충분히 공급하고 온도 22℃, 습도 55%, 12시간의 광-암주기 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

2. 통계처리

각 실험군 결과 값은 unpaired student's T-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

(* : p<0.05, ** : p<0.01, *** : p<0.001)

<실험예> UVB로 유도된 피부주름 생쥐모델에서의 효능평가

1. UVB 조사 및 피부주름 유발

7주령의 HR-1 생쥐에 UVB 램프 (15W type, UV 최대파장 312㎚; UV 강도 100μWcm^-2, Ieda Boeki Co., Tokyo, Japan)로 등피부에 조사하여 피부두께, 탄력, 그리고 주름생성 변화에 대하여 한약의 효과를 검증하고자 한다. HR-1 생쥐는 첫 번째 1 주일은 매일 100mJ/cm² UVB광선(1 최소치사량=100 mJ/cm²)을 조사하였고, 그런 다음 2주째부터 9주째까지는 200mJ/cm²으로 UVB 광선을 주에 3번(월, 수, 금) 조사한다. HR-1 생쥐의 등피부에 vehicle(30% 에탄올, 70% 폴리에틸렌글리콜)로 제작한 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물, 그리고 프로폴리스, 모링가 및 상엽 추출물이 균등 혼합된 4.5% 혼합물, 3% 혼합물, 1.5% 혼합물, 0.75% 혼합물 및 시중에서 판매되고 있는 선블록 크림을 대조군으로 하여 각각의 시료를 도포한 후에 UVB를 15㎝ 거리에서 5~10분간 조사한다(표 1).

UVB 조사 및 약물 투여 일정

	1 주 (회수)	2주 (회수)	3주 (회수)	4주 (회수)	5주 (회수)	6주 (회수)	7주 (회수)	8주 (회수)	9주 (회수)	10주
UVB 조사회수	7	3	3	3	3	3	3	3
약물 투여회수	7	7	7	7	7	7	7	7
주름 촬영						측정			측정 불가

2. HR-1 생쥐의 체중 및 식이섭취량

HR-1 생쥐의 식이섭취량 및 체중은 매주 일정한 시간에 측정하여 기록한다.

(1) 체중(body weight)

① 체중변화 : 매주 목요일 10시에 측정/기록

② 총 체중 증가량 : 최종 체중 - 초기 체중

③ 1일 평균 체중 증가량 = 총체중증가량/일수

(2) 식이섭취량(food intake)

1일 평균 식이 섭취량 - 총식이섭취량/일수

(3) 식이효율 (food efficiency ratio, FER)

식이효율(FER) = [총체중증가량/총식이섭취량] x 100

3. 피부주름 측정

UVB에 의해서 유도된 피부노화의 정도는 주름형성 상태를 관찰하여 측정한다. 주름의 형성을 평가하기 위해, 각각의 HR-1 생쥐는 6주째와 9주째에 chloral hydrate (체중 0.1ml/7% CH/25g mouse)의 복강 내 주사하여 마취한 후, UVB 조사된 등피부의 주름 사이트를 촬영하였다. 피부주름은 UVB를 조사한 후 DETAX System II (MIXPAC)과 Double-Stick Disc(3M, Germany)을 사용하여 측정한다. 실험 후 마우스 피부에 Double-Stick Disc를 붙이고, DETAX System II를 이용하여 상기 혼합물을 분사하여 2-3분 정도 후에 완전히 굳어진 Disc를 떼어내어 주름의 정도를 관찰한다. Disc에 생긴 주름은 Bissett 등(1990)에 의해서 제시된 평가방법에 따라 평가한다. 이러한 평가에서 grade 0은 주름이 없는 경우, grade 1은 몇 개의 얕은 주름이 있는 경우, grade 2는 일부 주름이 있는 경우, grade 3은 몇 개의 깊은 주름이 생긴 경우로 정의하여 수행한다(Tsukahara et al., 2001).

4. 피부의 주름개선 관찰

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부의 주름개선을 관찰하기 위하여 잠시 에틸에테르로 마취한 후 생쥐의 등피부를 USB 디지털 현미경(x400, CE FOROHS, China)로 피부조직을 400배 촬영하여 주름의 변화를 검경하였다. 전체 등 부위 중 주름 침착을 비교하기 위하여 왼쪽 등과 오른쪽 등을 구분하였으며, 왼쪽 등의 색소침착이 나타난 부위를 주름형성 및 개선정도를 관찰하였다.

5. 등피부조직에서 주름 관련 유전자 발현 분석

UVB가 조사되어 주름관련 유전자인 금속단백분해효소 MMP-2, MMP-9 mRNA, 그리고 피부손상 관련 유전자인 IL-1β, IL-6, TNF-α, NOS-II, COX-2 mRNA를 합성하기 위하여 전사되는 mRNA의 전사량에 어느 정도 영향을 미치는지 확인하고자 UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부에서 실시간 PCR을 시행하였으며 그 내용은 다음과 같다.

(1) RNA 추출

UVB가 조사되어 색소침착이 유발된 마우스 피부를 적출하여 트리졸 500㎕를 넣고 균질기로 세포들을 분쇄하였으며 여기에 클로로폼(CHCl₃) 100㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000rpm에서 원심 분리하였고 약 200㎕의 상층액을 회수하여 2-프로판올 200㎕와 동량 혼합한 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다. 이를 다시 13,000rpm에서 원심 분리한 후 80% 에탄올로 수세하고, 3분간 진공펌프에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 DEPC를 처리한 20㎕의 증류수에 녹여 가열 블록 75℃에서 불활성화시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

(2) 역전사(reverse transcription)

UVB가 조사되어 주름 유발된 마우스 피부에서 추출된 총RNA 3㎍을 75℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 이에 2.5㎕의 10mM dNTPs mix, 1㎕ random sequence hexanucleotides(25pmole/25㎕), RNA inhibitor로서 1㎕ RNase inhibitor(20 U/㎕), 1㎕ 100mM DTT, 4.5㎕ 5×buffer(250mM Tris-HCl, pH 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl₂)를 가한 후, 1㎕의 M-MLV RT(200U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 이 20㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ 가열 블록에서 60분동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 PCR에 사용하였다.

(3) 실시간 PCR

실시간 정량 PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였고 실험에 사용한 프라이머 서열은 [표 2], [표 3]과 같다.

실시간 PCR 분석용 프라이머 서열(wrinkle related gene)

Target gene	Primer/probe	Sequences
MMP-2	Forward	5'-CAG GGA ATG AGT ACT GGG TCT ATT-3
	Reverse	5'-ACT CCA GTT AAA GGC AGC ATC TAC-3'
MMP-9	Forward	5'-AAT CTC TTC TAG AGA CTG GGA AGG AG-3
	Reverse	5'-AGC TGA TTG ACT AAA GTA GCT GGA-3'
COX-2	Forward	5'-ATG GAT CGA AGA CTA CGT GCA A-3'
	Reverse	5'-GGG ATT TCC CAT AAG TCC TTT C-3'

실시간 분석용 프라이머 서열 및 태그만 분석(pro-inflammatory gene)

Target gene	Primer/probe	Sequences
IL-1β	FAM	5'-CTGTGTAATGAAAGACGGCACACCCACC-3'
IL-6	Forward	5'-TCCAGTTGCCTTCTTGGGAC-3'
	Reverse	5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3'
TNF-α	FAM	5'-CACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGA-3'
NOS-II	Forward	5'-CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3'
	Reverse	5'-ATG TGA TGT TTG CTT CGG ACA-3'

[표 2], [표 3]의 mRNA 유전자 발현은 태크만 분석(FAM dye-labeled, ABi, USA)을 내부 표준으로 생쥐 GAPDH probe set; Endogenous Control (VIC®/ MGB Probe, Probe limited) from Applied Biosystems (4352339E)를 사용하였고, SYBR용 primer의 최종 농도는 200nM이 되게 반응시켰다. 실시간 정량 PCR의 조건은 pre-denaturation은 50℃에서 2분간, 94℃에서 10분간, 그리고 40cycles을 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간 수행하였다. 실험군과 대조군은 내부표준으로 GAPDH를 사용하였다. 타겟 그룹의 RQ(relative quantitative)는 Quantitative PCR로 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

x = starting quantity

y = yield

n = number of cycles

e = efficiency

로 계산하여 RQ(relative quantitative)을 측정한다.

6) MMP-2 ELISA 측정

실험 종료 후 각 HR-1 쥐로부터 적출한 등피부조직(dorsal skin tissue)에서의 MMP-2 단백질의 발현량을 ELISA법으로 측정하였다. 생쥐용 MMP-2 ELISA Kit(R&D System, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 MMP-2 코팅 항체를 microwell에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었으며 각 well을 wash buffer로 세척하고 assay diluent를 200㎕씩 넣어서 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. 표준품을 희석하고 상청액을 20배 희석한 후 microplate를 세척하고 각 표준품과 상청액을 100㎕씩 넣었으며 2시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. Microplate를 세척하고 working detector를 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였으며, microplate를 세척하고 substrate solution을 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 30분 동안 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. Stop solution을 각 well에 50㎕씩 넣고 microplate 분광광도기에서 흡광도 450㎚로 측정하였다.

7) 피부의 조직학적 관찰

각 실험군에서 적출한 등피부조직은 10% 포르말린용액에 48시간 정도 고정한 뒤, 카세트에 들어갈 만한 적당한 크기로 절단하여 카세트에 넣고 라벨링을 했다. 그리고 이들 조직은 조직처리기(Thermo Shandon Ltd./Thermo Fisher Scientific, England)를 이용하여 알코올 70, 80, 90, 95, 100%에 각각 1~2시간정도 처리한 후 크실렌으로 4시간 처리하고, 파라핀에서 4시간 처리하였다. 고정된 조직은 Paraffin Embedding Station(LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 포매(embedding)한 후 냉동실에서 하루정도 보관하고, Rotary Microtome(LEICA MICROSYSTEMS NUSSLOCH GMBH, Germany)을 사용하여 block을 박절하였다. 박절된 조직은 H&E staining을 실시하기 위하여 크실렌에 3분씩 3번, 알콜 100%에 각각 2분, 1분, 알콜 95, 80, 70%에 각 1분 30초 담근 후에 물로 1분 세척하고, hematoxylin에 1분, 10% scott’tap water에 1분, eosin에 3분 동안 처리과정을 거쳐 염색을 실시하였다. 염색된 조직은 다시 알콜 70, 80, 95, 100, 100%에 순서대로 처리하여 탈수한 후 크실렌에 3분씩 3번 처리하였다. 슬라이드를 건조 후 카나다발삼과 크실렌을 이용하여 permounting을 실시한 후 현미경을 이용하여 표피/내피의 두께, lipid pore 등을 관찰하였다. 전반적인 피부 조직의 변화를 관찰하기 위하여 Harris hematoxylin 용액에 옮겨 5분간 핵을 염색한 후 흐르는 물에 수세하고, 1% 염산-알콜 용액으로 3회 침적 후 충분히 수세하여 1% 암모늄용액으로 청색화하고, eosin 용액에 3분간 세포질을 염색한 후 80% 알코올로 이동하였으며, 95% 및 100% 알코올을 사용하여 탈수시켰다. 다른 조직 슬라이드는 피부 진피층에서 콜라겐 침착을 관찰하기 위하여 Masson’trichrome염색을 실시하였다. 청명 과정을 거친 후 카나다발삼으로 봉입 후 현미경으로 검경하였다.

<실험 결과> UVB 조사를 통한 피부손상 효과

1. 체중변화 및 식이효율

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 18주 후 시험물질에 따른 체중변화 수준을 나타내는 그래프이다. 최종 18주에서 개체 간의 체중 변화는 나타나지 않았다(도 1).

사료를 섭취하는 양이 많음에도 불구하고 체중의 증가가 적다는 것은 약물에 의하여 체중조절효과가 있는 것으로 생각할 수 있다. 따라서 식이효율은 체중감소에 대한 하나의 척도로 사용할 수 있고, 식이효율의 수치가 적을수록 약물에 의한 체중조절 효과가 있다고 할 수 있다. [도 2]에서 보듯이 식이효율의 측면에서 볼 때, 그룹 간의 큰 차이가 없었고, 약물에 의한 식이효율이 차이가 없음은 약물에 의한 부작용이 없다는 것을 의미한다.

2. HR-1 생쥐의 상피조직 두께에 미치는 영향

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 H&E 염색을 하여 현미경 상에서 상피조직 두께를 측정한 결과다. 그 결과 [도 3]에서처럼 정상군에 비하여 UVB_대조군이 4배 이상 상피조직 두께가 두꺼워 졌다. 그러나 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물 등의 도포로 상피조직 두께가 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 감소하였고, 특히 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%) 중에서는 3% 도포군이 대조군에 비하여 44.3% 이상 통계학적으로 유의성 있게 감소를 나타내었다(도 3).

3. HR-1 생쥐의 피부 콜라겐 섬유의 변화에 미치는 영향

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 Masson’trichrome 염색을 하여 현미경 상에서 콜라겐 섬유의 변화를 측정한 결과다. 그 결과 [도 4]에서처럼 정상대조군에 비하여 UVB대조군이 M-T 염색의 강도가 현저하게 감소된 것으로 보아 콜라겐 섬유의 분해가 크게 진행되어 주름형성이 가속된 것으로 보인다. 그러나 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽추출물의 도포로 콜라겐 섬유의 양이 대조군에 비하여 증가된 것을 알 수 있었고, 특히 3% 혼합물(도 4)의 도포로 콜라겐 섬유의 양이 대조군에 비하여 현저하게 증가된 것을 알 수 있었고, 이러한 결과로 주름개선이 되었다.

4. HR-1 생쥐의 등피부 주름형성의 변화에 미치는 영향

각 실험군에 대한 등피부 주름형성(wrinkle formation)의 개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 광노화를 유도한 다음 8주 후 등피부를 디지털카메라로 등주름 형태를 관찰하였고(도 5), 디지털 현미경으로 등피부 주름을 400x 관찰한 결과이다(도 6). 그 결과 [도 5], [도 6]에서처럼 정상대조군에 비하여 UVB_대조군이 등피부 사진 및 현미경 사진으로 UVB 광노화로 주름형성이 현저하게 증가된 결과이다. 그러나 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물의 도포로 등피부 주름형성이 대조군에 비하여 감소된 것을 알 수 있었고, 특히, 3% 혼합물 도포군은 등피부 주름형성이 대조군에 비하여 현저하게 감소된 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 광노화로 유발되는 주름형성이 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(3%)에 의하여 개선 효과가 있었다.

5. UVB조사를 통한 피부손상 유발 병태모델에서의 피부염증 및 주름관련 유전자 발현 분석

(1) HR-1 생쥐의 pro-inflammatory cytokine 분석

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 분리하여 염증관련 mRNA유전자(IL-1β (A), IL-6 (B), TNF-α (C), 그리고 NOS-II (D) 발현을 측정한 결과로 UVB_대조군 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 NOS-II mRNA유전자 발현의 RQ 값을 1로 했을 때 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%)의 상대정향 값을 분석하였다. 그 결과 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 NOS-II mRNA유전자 발현(도 7의 A~D)에서처럼 정상대조군에 비하여 UVB_대조군이 모두 2배 이상 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 NOS-II mRNA유전자 발현이 증가되었다.

각 실험군의 도포로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 NOS-II mRNA유전자 발현이 감소하였다(p<0.01, p<0.001). 그러나 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 0.75% 혼합물의 도포로 대조군에 비하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, 그리고 NOS-II mRNA유전자 발현이 감소하였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.

(2) HR-1 생쥐의 IL-31R 와 MMP-2 및 관련 유전자 발현 분석

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 분리하여 UVB 광노화에 의한 피부 소양증을 관찰하기 위하여 IL-31R (A) 발현을 측정한 결과로 UVB_대조군 IL-31R mRNA유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%) 처리실험군의 상대정향값을 분석하였다. 그 결과 [도 8A]에서 보는 것처럼 정상대조군에 비하여 UVB_대조군이 모두 5배 이상 IL-31R mRNA유전자 발현이 증가되었다. 실험군에서는 UVB_1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물의 도포로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 IL-31R mRNA유전자 발현이 감소하였다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).

그렇지만 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%)의 도포로 대조군에 비하여 IL-31R mRNA유전자 발현이 약간 감소하였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다. 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%)에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 분리하여 UVB광노화에 의한 피부 콜라겐 분해로 형성되는 주름생성을 관찰하기 위하여 MMP-2 (B) 발현을 측정한 결과로 UVB_대조군 MMP-2 mRNA유전자 발현의 RQ값을 1로 했을 때 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%) 처리실험군의 상대정향 값을 분석하였다. 그 결과 MMP-2 mRNA유전자 발현[도 8B]에서처럼 정상대조군에 비하여 UVB_대조군이 모두 2배~4배 이상 MMP-2 mRNA유전자 발현이 증가되었다. 실험군에서는 1% 프로폴리스, 1% 상엽 추출물의 도포로 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 MMP-2 mRNA유전자 발현이 감소하였다 (p<0.05). 그러나 1% 모링가 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%)의 도포로 대조군에 비하여 MMP-2 mRNA유전자 발현이 약간 감소하였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.

6. UVB조사를 통한 피부손상 유발 병태모델에서의 MMP-2 단백질 발현 분석

각 실험군에 대한 피부 주름개선 효과를 측정하기 위해 HR-1 생쥐에 UVB를 조사하여 주름을 유도한 다음 8주 후 등피부조직을 분리하여 UVB광노화에 의한 피부 콜라겐 분해로 형성되는 주름생성 변화를 관찰하기 위하여 MMP-2 단백질량발현을 측정한 결과로, 대조군 MMP-2 단백질 발현을 등피부조직에서 1% 프로폴리스, 1% 모링가, 1% 상엽 추출물과 그 혼합물(4.5%, 3%, 1.5%, 0.75%) 처리실험군의 생산량 차이를 분석하였다. 그 결과 [도 9]에서 보는 것처럼 MMP-2 단백질량은 정상대조군에 비하여 대조군이 50배 이상 MMP-2 단백질 발현이 증가되었다. 실험군에서는 1% 상엽 추출물과 3% 혼합물(p<0.001), 1% 프로폴리스 추출물과 1% 모링가 (p<0.05)의 도포로 대조군 에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 MMP-2 단백질 발현이 감소하였다. 그러나 혼합물(0.75%)의 도포로 대조군에 비하여 MMP-2 단백질 발현이 약간 감소하였으나 통계학적 유의성은 나타나지 않았다.

<제조예>

하기 [표 4]의 조성에 따라 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 혼합 추출물을 함유하는 영양크림을 제조하였다. 영양크림에 사용한 혼합 추출물은 프로폴리스, 모링가 및 상엽의 추출물을 1 : 1 : 1:의 비율로 균등 혼합하여 만든 0.75%, 1.5%, 3.0%, 4,5%의 것을 사용하였다.

영양크림의 성분 및 비율

	성분명	제조예 1(중량%)	제조예 2(중량%)
수상	글리세린	10.0	10.0
	실리콘 유도체	0.2	0.2
	Microcide-C	0.2	0.2
	EDTA-2Na	0.01	0.01
	KeltrolF(1%)	5.0	5.0
	Sepiplus 400	0.3	0.3
유상	Lanette O	2.0	2.0
	Olive M 1000	1.0	1.0
	Tego care 450	2.0	2.0
	Puresyn 4	2.0	2.0
	TCG-M	3.0	8.0
	DC 200/6cs	2.5	2.5
	Lipex Shea	1.0	1.0
	Vitamin E	0.5	0.5
	BHT	0.02	0.02
안정제	TEA	0.1	0.1
	Di Water	2.0	2.0
첨가제	프로폴리스, 모링가, 상엽	4.5	-
	상동	3.0	-
	상동	1.5	-
	상동	0.75	-
증류수		잔량	잔량

이상 본 발명을 보다 상세하게 설명하였다. 그러나 이는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니며, 여기에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

Claims (6)

1. 프로폴리스, 모링가, 상엽 추출물을 각각 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합하여 얻은 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하되, 조성물 총량에 대하여 상기 혼합추출물을 3중량%로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선 및 항염증 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 프로폴리스, 모링가, 상엽 추출물은 각각 10배의 70Vol% 에탄올을 가하여 45℃에서 2시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선 및 항염증 화장료 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 영양크림, 마사지크림, 에센스, 유연화장수, 영양화장수, 팩 또는 유화형 파운데이션으로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 피부주름 개선 및 항염증 화장료 조성물.

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