KR20170088274A - 식물 추출물로부터 엽록소 또는 색소를 제거하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 포함하는 식물 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 엽록소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물은 유의적인 항노화 및 피부 주름 개선 효과를 나타냄과 동시에 고농도로 화장료 조성물 내 함유하더라도 세포독성 없고, 화장품의 안정성(stability)이 유지되므로, 본 발명의 제조방법은 주름 개선용 기능성 화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 포함하는 식물 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
노화는 생명의 필수불가결한 부분이다. 모든 생명체는 동물이든 식물이든 태어나면서부터 노화의 길로 들어선다. 위생과 보건 의료 덕택에 인간 수명은 지난 세기 동안 상당히 연장되었다. 그 결과로서 노인 비율이 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 노화의 과정은 신체의 전 기관에서 일어나는데 노화와 더불어 고혈압, 만성 관상 동맥 질환이나 당뇨와 같은 질병 등과 같이 장기들의 생리적 기능이 변화되어 간다. 피부 역시 나이가 들어감에 따라 노화가 진행된다.
피부 노화는 크게 생물학적인 과정에 의해 시간이 지나면서 누구에게나 나타나는 내인성 노화와 햇볕과 같은 환경요인에 지속적으로 노출되어 얼굴, 목, 손등 등에 나타나는 광노화로 분류할 수 있다. 내인성 노화와 광노화 모두 유해한 활성 산소에 의해 우리 몸의 구성 성분에 생기는 손상 누적이 원인이라는 점에서 동일하나 광노화는 이 활성산소가 자외선에 의해 만들어진다는 점에서 차이가 있다.
자외선은 피부 노화의 주요 원인으로 파장의 길이에 따라 UVA(320~400 nm), UVB(280~320 nm), UVC(200~280 nm)로 나뉘는데, 지구 대기의 오존층이 UVC를 흡수하게 되어 피부에 직접 닿는 파장은 UVA와 UVB가 된다. 이 중, UVA는 진피층까지 깊숙이 침투하여 피부 탄력을 유지하는 콜라겐을 생성하는 섬유아세포를 손상시키는 가장 큰 원인이 되며, 피부 내에 프리라디칼을 활성화시켜 생체 내 항산화 방어망을 파괴하고 세포와 조직을 손상시키는데 이때 피부의 주요 구성물질인 지질과 단백질, 다당류 등이 산화되게 된다. 그 중 단백질의 산화는 콜라겐과 같은 피부 결합조직을 분해하며, 심할 경우 암을 유발하거나 면역기능 저하를 촉발한다. 생체 내 프리라디칼의 활성화는 활성 산소에 의해 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질분해효소(MMP; matrix metalloprotease)를 증가시켜 세포외기질의 분해를 가속화하게 되어 결과적으로 피부 탄력이 감소하여 주름이 형성된다.
그러므로 주름 형성 억제를 위한 광범위한 노력이 행해지고 있으며 대표적인 콜라겐 분해 억제제로 EGCG(Epigallocatechin gallate), 레티노이드 및 그 유도체 등이 있으나 제형상 안정성의 문제점 등으로 인해 이를 대체할 새로운 천연 물질에 대한 연구가 진행되고 있다. 따라서 옛날에는 화학 성분의 화장품이 대세였지만 최근에는 웰빙 시대의 도래로 피부에 대한 관심이 증폭되어 자극이 심한 화학 성분의 화장품보다 저자극성이면서 화장료로서의 효능을 기대할 수 있는 다양한 식물 추출물을 사용한 기능성 화장품(Cosmeceuticals)들이 제조되고 있다.
상기와 같이 피부에 자극이 있는 화학 성분을 대체하기 위하여 저자극성이면서 주름 개선 효능을 나타낼 수 있는 식물 추출물을 이용한 화장품 조성물에 관련된 종래 특허로는 한국등록특허공보 제 10-0429590 호「감태 추출물을 함유하는 주름개선 화장료 조성물」, 한국등록특허공보 제 10-0670238 호 「생약재 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 및 그 제조방법」, 한국공개특허공보 제 10-2007-0111025 호 「녹두 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부 주름 개선용화장료 조성물」, 한국등록특허공보 제 10-1009766 호「하고초 추출물 및 개사철쑥 추출물을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물」등이 다수 존재한다. 그러나 아직까지 주름 개선 효과가 있는 천연 추출물을 고농도로 함유하며, 화장료 조성물의 안정성이 확보된 화장료 조성물 제조방법은 존재하지 않는 실정이다.
이에, 본 발명자는 항노화 및 피부 주름 효과를 나타냄과 동시에 고농도로 화장료 조성물 내 함유되더라도 세포독성 없고, 화장품의 안정성(stability)이 유지되는 천연물 유래 화장료 조성물 제조방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 엽록소 및 색소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물은 유의적인 주름 개선 효과를 나타냄과 동시에 고농도로 화장료 조성물 내 함유되더라도, 화장품의 안정성이 유지됨을 확인함으로써, 본 발명의 제조방법은 주름 개선용 기능성 화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 목적은 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 포함하는 식물 추출물을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 제조하는 단계; 및
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 주정과 혼합한 후, 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하거나, 상기 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하는 단계를 포함하는, 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명은 엽록소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 엽록소가 제거된 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 색소가 제거된 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 및 주름 개선용 화장료 조성물 제조방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 유의적인 항노화 및 피부 주름 개선 효과를 나타냄과 동시에 고농도로 화장료 조성물 내 함유되더라도 세포독성 없고, 화장품의 안정성(stability)이 유지되므로, 본 발명의 제조방법은 주름 개선용 기능성 화장품 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 식물추출물에서 엽록소를 제거하는 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 나타낸 도이다:
A: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 엽록소를 나타냄;
B: 침전된 엽록소를 여과 또는 원심분리한 사진;
C: 본 발명의 엽록소 제거 조건(농도, 시간, 온도)가 상이한 조건에서 엽록소 제거시 엽록소가 침전되지 않고 퍼져버린 사진; 및
D: 본 발명의 엽록소 제거 조건을 통해 엽록소가 침전되고, 유효성분으로 포함하는 상층부가 분리된 사진.
도 3은 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 나타낸 도이다:
A: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 엽록소를 나타냄;
B: 침전된 엽록소를 여과 또는 원심분리한 사진;
C: 본 발명의 엽록소 제거 조건(농도, 시간, 온도)가 상이한 조건에서 엽록소 제거시 엽록소가 침전되지 않고 퍼져버린 사진; 및
D: 본 발명의 엽록소 제거 조건을 통해 엽록소가 침전되고, 유효성분을 포함하는 상층부가 분리된 사진.
도 4는 식물추출물에서 색소를 제거하는 방법을 나타낸 도이다.
도 5는 색소가 제거된 호장근 추출물을 나타낸 도이다:
A 및 B: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 색소를 나타냄;
C: 색소와 유효성분이 분리된 사진; 및
D: 색소가 제거된 호장근 추출물을 나타낸 사진.
도 6은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 콜라게나제 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 자외선에 노출된 케라틴 세포(Hacat cells)에서 IL-6 및 TNF-α억제 효과를 확인한 도이다.
도 7b는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 IL-6의 발현을 억제하는 효과를 fold change 값으로 나타낸 도이다.
도 7c는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 TNF-α 발현을 억제하는 효과를 fold change 값으로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 엘라스타제 활성 저해 효과를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 활성 산소종 생성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 10a는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 3시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 12시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 이용하여 화장품을 제조하는 방법을 나타낸 도이다.
도 13은 화장품의 안정도를 확인한 도이다.
도 14는 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물로 제조된 화장품 원료를 동결건조한 것과 엽록소가 제거되지 않은 녹차 잎 추출물을 동결건조한 것을 비교한 도이다:
A: 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물; 및
B: 엽록소가 제거되지 않은 녹차 잎 추출물.
도 15는 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물로 제조된 화장품 원료를 동결건조한 것과 엽록소가 제거되지 않은 동백나무 잎 추출물을 동결건조한 것을 비교한 도이다:
A: 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물; 및
B: 엽록소가 제거되지 않은 동백나무 잎 추출물.
도 16은 색소가 제거된 호장근 추출물에서 추출한 화장품 원료와 색소가 제거되지 않은 호장근 추출물을 동결 건조한 것을 비교한 도이다:
A: 색소가 제거된 호장근 추출물; 및
B: 색소가 제거되지 않은 호장근 추출물.
도 2는 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 나타낸 도이다:
A: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 엽록소를 나타냄;
B: 침전된 엽록소를 여과 또는 원심분리한 사진;
C: 본 발명의 엽록소 제거 조건(농도, 시간, 온도)가 상이한 조건에서 엽록소 제거시 엽록소가 침전되지 않고 퍼져버린 사진; 및
D: 본 발명의 엽록소 제거 조건을 통해 엽록소가 침전되고, 유효성분으로 포함하는 상층부가 분리된 사진.
도 3은 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 나타낸 도이다:
A: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 엽록소를 나타냄;
B: 침전된 엽록소를 여과 또는 원심분리한 사진;
C: 본 발명의 엽록소 제거 조건(농도, 시간, 온도)가 상이한 조건에서 엽록소 제거시 엽록소가 침전되지 않고 퍼져버린 사진; 및
D: 본 발명의 엽록소 제거 조건을 통해 엽록소가 침전되고, 유효성분을 포함하는 상층부가 분리된 사진.
도 4는 식물추출물에서 색소를 제거하는 방법을 나타낸 도이다.
도 5는 색소가 제거된 호장근 추출물을 나타낸 도이다:
A 및 B: 식물에서 추출한 액상 추출물인 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터와 반응하여 침전된 색소를 나타냄;
C: 색소와 유효성분이 분리된 사진; 및
D: 색소가 제거된 호장근 추출물을 나타낸 사진.
도 6은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 콜라게나제 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7a는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 자외선에 노출된 케라틴 세포(Hacat cells)에서 IL-6 및 TNF-α억제 효과를 확인한 도이다.
도 7b는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 IL-6의 발현을 억제하는 효과를 fold change 값으로 나타낸 도이다.
도 7c는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 TNF-α 발현을 억제하는 효과를 fold change 값으로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 엘라스타제 활성 저해 효과를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 활성 산소종 생성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 10a는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 3시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 12시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물의 HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물추출물을 이용하여 화장품을 제조하는 방법을 나타낸 도이다.
도 13은 화장품의 안정도를 확인한 도이다.
도 14는 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물로 제조된 화장품 원료를 동결건조한 것과 엽록소가 제거되지 않은 녹차 잎 추출물을 동결건조한 것을 비교한 도이다:
A: 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물; 및
B: 엽록소가 제거되지 않은 녹차 잎 추출물.
도 15는 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물로 제조된 화장품 원료를 동결건조한 것과 엽록소가 제거되지 않은 동백나무 잎 추출물을 동결건조한 것을 비교한 도이다:
A: 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물; 및
B: 엽록소가 제거되지 않은 동백나무 잎 추출물.
도 16은 색소가 제거된 호장근 추출물에서 추출한 화장품 원료와 색소가 제거되지 않은 호장근 추출물을 동결 건조한 것을 비교한 도이다:
A: 색소가 제거된 호장근 추출물; 및
B: 색소가 제거되지 않은 호장근 추출물.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은,
1) 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물을 제조하는 단계;
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 주정과 혼합한 후, 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하거나, 상기 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하여, 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 3) 상기 단계 2)에서 제조된 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는 노화 및 주름 개선용 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물은 하기와 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 녹차 잎, 동백나무 잎 또는 호장근에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하는 단계
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 녹차 잎, 동백나무 잎 또는 호장근은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2의 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 추출방법으로는 진탕 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출 용매를 녹차 잎, 동백나무 잎 또는 호장근 분량에 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출온도는 상온 내지 100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 내지 5일인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 3회인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터는 맹종죽 잎, 신의대 잎, 녹차 잎, 동백나무 잎 또는 개똥 쑥을 에센셜오일추출기로 8시간 이상 각각 추출하여, 엽록소 제거용 식물 액상 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)의 본 발명의 녹차 잎 추출물은 녹차 잎 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 제조하는 것이 바람직하고, 동백나무 잎 추출물은 동백나무 잎 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 제조하는 것이 바람직하며, 호장근 추출물은 호장근 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 색소가 제거된 호장근 추출물을 제조하는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)의 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 개똥에서 추출한 후로랄 워터를 에탄올과 9:1 내지 6:4 비율로 혼합한 후, 상기 단계 1)의 농축된 추출물에 20 배 내지 25배 첨가하여, 상기 단계 1)의 농축된 추출물을 희석한 후, -40 내지 -60℃의 동결 조건에서 30분 내지 14시간 또는 30분 내지 12시간 정치시켜 침전된 엽록소 또는 색소를 분리하는 것이 바람직하다. 또한 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터만을 추출용매로 활용하여, 상기 단계 1)의 농축된 추출물에 20 배 내지 25배 첨가하여, 상기 단계 1)의 농축된 추출물을 희석한 후, -40 내지 -60℃의 동결 조건에서 10 내지 14시간 정도 정치시켜 침전된 엽록소 또는 색소를 분리하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3)의 전체 화장료 조성물에 녹차 잎 추출물은 50 내지 400 ㎍/mL, 동백나무 잎 추출물은 30 내지 12O ㎍/mL 및 호장근 추출물은 20 내지 12O ㎍/mL로 첨가되는 것이 바람직하고, 상기 녹차 잎 추출물이 400 ㎍/mL 이상 화장료 조성물 내 포함될 경우, 세포독성을 나타내고, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물이 12O ㎍/mL 이상 함유될 경우, 화장품의 안정성(stability)이 문제가 발생하므로, 유효성분으로 고농도로 함유하면서, 화장품 안정성이 유지되는 녹차 잎 추출물 200 내지 400 ㎍/mL, 동백나무 잎 추출물 50 내지 12O ㎍/mL 및 호장근 추출물 20 내지 12O ㎍/mL로 화장료 조성물 내 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자는 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물을 각각 제조한 후(도 1 내지 도 5 참조 및 도 11 참조), 최적 엽록소 또는 색소 제거용 식물 액상 추출물을 확인한 결과, 녹차 잎 추출물은 녹차 잎 추출물을 깨똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터와 혼합하여 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 제조하는 것이 바람직하고, 동백나무 잎 추출물은 동백나무 잎 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터과 혼합하여 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 제조하는 것이 바람직하며, 호장근 추출물은 호장근 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 또는 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터와 혼합하여 색소가 제거된 호장근 추출물을 제조하는 것이 바람직함을 확인하였다(표 1 내지 3 참조).
또한, 본 발명자는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 콜라게나제 활성 억제 효과를 확인한 결과, 엽록소를 제거한 식물추출물이 케라틴 세포(Hacat cells)의 콜라게나제 (MMP-1) 활성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 염증성 사이토카인 생성억제 효과를 확인한 결과, 케라틴 세포(Hacat cells)에서 엽록소를 제거한 식물추출물이 염증성 사이토카인 발현을 현저히 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명자는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 엘라스타제 활성 저해 효과를 확인한 결과, 본 발명의 엽록소 또는 색소를 제거한 식물추출물은 케라틴 세포(Hacat cells)에서 유의적인 엘라스타제 활성억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 본 발명자는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 활성 산소종 생성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 색소들이 제거된 호장근 추출물은 케라틴 세포(Hacat cells)에서 활성산소종의 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 본 발명자는 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 세포독성 실험을 수행한 결과, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물은 모두 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 10 참조).
아울러, 본 발명자들은 화장품 제조시, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 최적 함유량을 확인한 결과, 녹차 잎 추출물 100 내지 400 ㎍/mL, 동백나무 잎 추출물 50 내지 12O ㎍/mL 및 호장근 추출물 20 내지 12O ㎍/mL로 화장료 조성물 내 포함될 경우, 고농도로 화장료 조성물 내 함유되더라도 세포독성 없고, 화장품의 안정성(stability)이 유지됨을 확인하였다(녹차 추출물 400㎍/mL 이상 세포 독성 가짐, 한국식품영양과학회지 제40 권 제5호, 2011.5, 619-624)(도 13 참조).
따라서, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차(Green tea) 잎 추출물, 동백나무(Camellia japonica) 잎 추출물 및 호장근(Polygonum cuspidatum) 추출물은 유의적인 항노화 및 피부 주름 개선 효과를 나타냄과 동시에 고농도로 화장료 조성물 내 함유되더라도 세포독성 없고, 화장품의 안정성(stability)이 유지되므로, 본 발명의 제조방법은 항노화 및 주름 개선용 기능성 화장품 제조방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 천연 추출물의 제조
<1-1> 녹차 잎 추출물의 제조
식물에서 주정[발효주정, 대한주정라이프(주)]을 용매로 추출하는 일반적 절차로 녹차 잎 추출물을 제조하였다.
구체적으로, (재)하동녹차연구소로부터 공급받은 세척 건조된 녹차 잎(200g)에 10배 주정을 함유시킨 후 침지시키고, 상온에서 72시간 정치시킨 후 국물 팩[중 팩, 25 cm X 35 cm, 8P, 티앤씨일레트로닉스(주)]으로 100 ㎛이하 입자들이 통과되게 여과시켰다. 주정을 휘발시키기 위해 일정시간 동안 50℃ 조건에서 감압농축기(CCA-1111, EYELA4)를 이용하여 증류시킨 후 농축시켜, 녹차 잎 추출물을 제조하였다.
<1-2> 동백나무 잎 추출물의 제조
(주)웰파이토로부터 구입한 동백나무 잎의 경우 이물질을 제거한 후 천연추출물을 추출하는 일반적 절차에 따라 진행하였다.
구체적으로, 이물질 및 미세 먼지를 제거하기 위해 잘 건조된 동백나무 잎을 국물 팩에 500g의 건조된 동백나무 잎을 혼합시키고 주정이 포함된 정제수(가야산 천년 수, (주)하이얏트샘물)로 세척한 후 건조시켰다. 그런 다음, 오염물질이 제거된 건조된 동백나무 잎을 분쇄기로 분쇄한 후 상기 실시예 <1-1>의 녹차 잎 추출방법과 동일한 방법으로 추출 및 농축하여, 동백나무 잎 추출물을 제조하였다.
<1-3>
호장근
추출물의 제조
천일약업사로부터 구입한 호장근을 실시예 <1-1>의 녹차 잎 추출방법과 동일한 방법으로 추출 및 농축하여, 호장근 추출물을 제조하였다.
<
실시예
2> 엽록소 제거용 식물 액상 추출물의 제조
엽록소 및 색소 제거용 식물 액상 추출물을 제조하기 위해, 맹종죽 잎(6.5 kg), 신의대 잎(6.5 kg), 녹차 잎(7.0 Kg), 동백나무 잎(7.0 Kg) 및 개똥 쑥(7 kg)을 현지에서 바로 구입한 후, 조선대학교 치과용 정밀장비 및 부품 지역혁신센터에서 에센셜오일추출기로 8시간 이상 각각 추출하여, 엽록소 제거용 식물 액상 추출물(후로랄 워터)을 제조하였다.
<
실시예
3> 엽록소 및 색소가 제거된 식물 추출물의 제조
<3-1> 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물의 제조
상기 <실시예 2>에서 제조한 엽록소 제거용 식물 액상 추출물을 이용하여 녹차 잎 추출물의 엽록소를 제거하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 2>에서 제조한 엽록소 제거용 식물 액상 추출물(개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터)을 에탄올과 9:1 비율로 혼합한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 녹차 잎 추출물에 20배로 첨가하여 희석한 후 -50℃의 동결 조건에서 12시간 정도 충분히 정치시켰다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 엽록소 층은 침전되고 유효성분은 상층부위로 분리되므로, 상층부위만 수확하여, 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 제조하였다(도 1 및 도 2). 한편, 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물은 냉동고에서 완전히 동결한 후, 동결건조기(FDU-1200(EYEL4)로 동결 건조하였다(도 14).
<3-2> 엽록소가 제거된 동백나무 잎의 제조
상기 <3-1>과 동일한 방법으로 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 제조하였다(도 3 및 도 15).
<3-3> 색소가 제거된
호장근
추출물이 제조
상기 <3-1>과 동일한 방법으로 색소가 제거된 호장근 추출물을 제조하였다(도 4, 도 5 및 도 15).
< 실험예 1> 식물 추출물의 최적 엽록소 또는 색소 제거용 식물 후로랄 워터 확인
<1-1> 녹차 잎 추출물의 최적 엽록소 제거용 식물 후로랄
워터
확인
상기 <실시예 2>에서 제조한 다양한 엽록소 제거용 식물 후로랄 워터 중 최적 엽록소 제거용 식물 후로랄 워터를 확인하였다.
구체적으로, 엽록소 제거는 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터은 녹차 잎 추출물의 엽록소를 유의적으로 분리시키나, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 정제수는 엽록소를 분리하지 못하는 것을 확인하였다(표 1).
| 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터 | 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 정제수 | |
| 엽록소 분리/침전 여부 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 | 분리가 어려움 | 분리/침전 가능 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 |
<1-2> 동백나무 잎 추출물의 최적 엽록소 제거용 식물 후로랄
워터
확인
상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 동백나무 잎 추출물의 최적 엽록소 제거용 식물 후로랄 워터를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터는 동백나무 잎 추출물의 엽록소를 유의적으로 분리시키나, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 정제수는 엽록소를 분리하지 못하는 것을 확인하였다(표 2).
| 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터 | 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 정제수 | |
| 엽록소 분리/침전 여부 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 | 분리/침전 가능 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 | 분리가 어려움 |
<1-3>
호장근
추출물의 최적 색소 제거용 식물 후로랄
워터
확인
상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 호장근 추출물의 최적 엽록소 제거용 식물 후로랄 워터를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터는 호장근 추출물의 색소를 유의적으로 분리시키나, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 정제수는 색소를 분리하지 못하는 것을 확인하였다(표 3).
| 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터 | 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 동백나무 잎 액상 추출물 | 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터 | 정제수 | |
| 엽록소 분리/침전 여부 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 | 분리가 어려움 | 분리/침전 가능 | 분리/침전 가능 | 분리가 어려움 |
< 실험예 2> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 콜라게나제 활성 억제 효과 확인
주름 개선물질인 레티놀과 아데노신이 콜라겐 형성증가와 콜라겐 분해효소인 콜라게나아제 활성을 억제하는 특성으로 많이 사용되고 있으나 고농도가 함유될 경우 피부에 부작용을 일으킨다. 본 발명에서는 엽록소와 색소가 제거된 고농도의 추출물(함유농도, 100 ㎍/mL이상)에서 콜라겐 분해효소인 메트릭스 메틸로프로티나아제(Matric metalloprotinase, MMP-1)의 발현을 억제하고 탄력적인 피부의 유지에 도움을 줄 수 있는 물질을 발굴하고 콜라게나제 발현억제를 목적으로 한 엽록소 및 색소가 제거된 천연물 유래 원료를 선택하는 것을 목적으로 하였다.
구체적으로, 세포배양은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 분양받은 케라틴 세포(Hacat cells)를 15% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 DMEM을 배양액으로 하여 CO2 incubator(5% CO2, 37℃)에서 배양하였고 2~3일 간격으로 계대배양하였다. 계대 배양된 세포를 60 mm 배양접시에 1 X 106개 세포를 접종하고 18시간 배양 후 실험에 사용하였다. 또한, 세포감작은 배양한 세포의 배지를 제거한 후 PBS buffer 2 mL에 여러 종류의 엽록소 또는 색소가 제거된 추출물(호장근 추출물, 동백나무 잎 추출물, 녹차 잎 추출물)을 각 군으로 하며, Control은 0.05% 비타민 C+PGA(poly-gamma-glutamic acid)로 하였다. 이 실험 군을 배양접시에 넣고 1시간 동안 CO2 incubator(5% CO2, 37℃)에서 배양하였다. 1시간 후 자외선 A(UVA:360 mm)를 배양접시에 5 J/cm2로 조사한 후 혈청이 없는 DMEM배지에 교체하고 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 배지는 모아서 active MMP-1 ELISA 실험에 사용하며 세포는 모아서 mRNA을 추출하여 RT-PCR실험에 사용하였다. 상기 RT-PCR은 추출된 total RNA 1 ug을 Superscript first strand synthesis system(Invitrogen, CA, USA)를 이용하여 RT-PCR을 수행한다. Total RNA에 0.5 ug random hexamer 6(invitrogen, CA, USA)와 72℃에서 5분간 반응 후, Reaction buffer Mix(3 mM MgCl₂, 각 0.5 mM dNTP, 5x reaction buffer, 20U Ribonuclase inhibitor, 1ul Revers Transcriptase)를 첨가 한 후, 25℃에서 5분, 42℃에서 1시간, 72℃에서 5분으로 반응하였다. 이렇게 생산된 template를 PCR 반응에 사용하였다. PCR 반응은 하기 표 4에 개시된 primer를 사용하였으며 95℃에서 5분, 95℃에서 40초, 55℃에서 40초 72℃에서 80초로 30 cycles을 수행하며, 마지막으로 72℃에서 5 분간 반응하여 PCR 반응을 수행하였다. 이렇게 얻어진 생산물은 2% agarose gel에서 전기영동하여, ethidium bromide으로 염색한 후 UV-system에서 확인 결과를 얻었다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 엽록소를 제거한 식물추출물이 케라틴 세포(Hacat cells)의 콜라게나제(MMP-1) 활성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 케라틴 세포에 UVB를 조사하여 콜라게나제의 발현이 나타나게 하고 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물, 기존의 방법으로 주정을 용매로 추출한 후 농축한 백출추출물 및 색소들이 제거된 호장근 추출물을 10, 30, 100 ㎍/mL의 농도로 처치하였다. UVB 자극으로 인하여 콜라게나제의 발현이 증가됨을 확인할 수 있고, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물에서 콜라게나제(MMP-1) 발현 억제효과가 100 ㎍/mL의 농도에서 70% 이상 억제되는 것이 확인하였다(도 6).
| 프라이머 | 염기서열 |
| MMP-1 Forward primer | 5'-TGACTTTTAAAACATAGTCTATGTTCA-3'(서열번호 1) |
| MMP-1 Reverse primer | 5'-TCTTGGATTGATTTGAGATAAGTCATAGC-3'(서열번호 2) |
| Beta actin Forward primer | 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'(서열번호 3) |
| Beta actin Reverse primer | 5'-TAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'(서열번호 4) |
< 실험예 3> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 염증성 사이토카인 생성억제 효과 확인
진피세포에서 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 염증성 사이토카인(TNF-α및 IL-6)의 발현억제를 확인하기 위해 RNA isolation kit와 agarose gel 전기영동을 수행하였다.
구체적으로, 6-well plate에 배양되고 있는 케라틴 세포(immortal keratinocyte cell line, Hacat cells)에 UVB를 100 mJ로 조사하였다. 그런 다음, 본 발명의 엽록소가 제거된 녹차 잎 및 동백나무 잎 추출물과 색소가 제거된 호장근 추출물 및 기존의 방법으로 주정을 용매로 추출한 후 농축한 백출 추출물을 10, 30, 100 ㎍/mL농도로 넣고 37℃ 세포 배양기에서 12시간 반응하였다. 반응이 완료되면 RNA isolation kit를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 cDNA로 합성 후 사람 IL-6와 TNF-α primer를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR은 하기 표 5에 개시된 primer를 사용하는 것을 제외하고는 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 케라틴 세포(Hacat cells)에서 엽록소를 제거한 식물추출물이 염증성 사이토카인 발현을 현저히 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로, 케라틴 세포에 UVB를 조사하여 염증성 사이토카인의 발현이 나타나게 하고 엽록소를 제거한 후 동결 건조한 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물과 색소들이 제거된 호장근 추출물 및 주정을 용매로 추출한 후 동결 건조한 백출 추출물들을 10, 30, 100 ㎍/mL의 농도별로 처리하였다. IL-6 발현억제의 경우, 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물을 가장 낮은 농도인 10㎍/mL로 처치할 때부터 발현이 억제되는 것을 확인되었으나, 기존의 기술로 제조된 백출 추출물은 IL-6의 발현이 억제되지 않는 것을 확인하였다. TNF-α발현억제의 경우, 녹차 잎 추출물과 호장근 추출물에 의해 발현이 억제되는 것을 확인하였고 동백나무 잎 추출물은 미미하게 발현 억제 효과를 확인하였다. 백출 추출물은 TNF-α도 UVB 조사로 인한 발현 억제 효과를 확인할 수 없었다(도 7).
| 프라이머 | 염기서열 |
| TNF-α Forward primer | 5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'(서열번호 5) |
| TNF-α Reverse primer | 5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'(서열번호 6) |
| IL-6 Forward primer | 5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'(서열번호 7) |
| IL-6 Reverse primer | 5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'(서열번호 8) |
| Beta actin Forward primer | 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'(서열번호 9) |
| Beta actin Reverse primer | 5'-TAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'(서열번호 10) |
< 실험예 4> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 엘라스타제 활성 저해 효과 확인
엘라스타제(elastase)는 엘라스틴을 분해할 수 있는 지금까지 알려진 유일한 효소이다. 엘라스틴분해효소의 유전자의 발현은 프리라디칼에 의해 유발된다고 알려져 있다. 또한, 광노화의 대표적인 조직학적 변화는 엘라스틴 섬유의 주성분인 엘라스틴축적이다. 정상적인 교원섬유와는 달리 광탄력소물질(solar elastotic material)은 거대분자로 구성되고 광에 의해 기능이 심각하게 손상된다. 자외선에 노출된 피부세포에서 엘라스틴 분해효소의 유전자의 발현이 두드러지게 활성이 촉진된다. 이 효소의 활성억제는 피부노화를 근본적으로 줄일 수 있다. 본 발명에서는 엘라스틴의 분해효소의 활성을 억제하고 탄력적인 피부의 유지 및 생성에 도움을 줄 수 있는 물질의 발굴을 목표로 한다.
구체적으로, 엘라스타제 활성화 정도를 측정하기 위해 Elastase Assay Kit를 이용하였다. sample이 넣어져 있는 각각의 96-well plate에 효소로 엘라스타제와 기질로 N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid(SANA)를 이용하였다. 1.015 mM 기질액 1300 ㎕와 실험군 샘플 100 ㎕를 넣어주었다. 액으로 돼지 췌장 엘라스타제를 50 ㎕ 넣어주었다(30초 동안 잘 섞어줌). 상온에서 10분간 반응시킨 후 0.0375 unit/ml 농도의 엘라스타제 효소액 100 ㎕을 넣어주고 10~30분간 반응시켰다(차광된 상온에서 반응). 30분간의 반응 후, ELISA reader 장비를 이용하여 410 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 케라틴 세포(Hacat cells)에서 엽록소 또는 색소를 제거한 식물추출물의 유의적인 엘라스타제 활성억제 효과를 확인하였다. 구체적으로, 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 색소들이 제거된 호장근 추출물, 기존의 방법으로 주정을 용매로 추출한 후 농축한 백출 추출물에 의해 엘라스타제 활성이 억제되는지 확인하고자 실험을 진행하여 다음과 같은 결과를 도출하였다. 상기 엽록소 또는 색소가 제거된 각 추출물을 10, 30, 100, 300 ㎍/mL의 농도까지 처리할 때, 녹차와 백출 추출물은 효과를 보이지 않았으나, 동백나무 잎 추출물과 호장근 추출물이 엘라스타제의 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 동백나무 잎 추출물은 30 ㎍/mL의 농도에서부터 엘라스타제의 활성을 농도 의존적으로 억제시키며 300 ㎍/mL의 농도에서 30% 정도의 엘라스타제 활성억제가 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 호장근 추출물은 10 ㎍/mL의 농도에서부터 100 ㎍/mL의 농도까지 농도 의존적인 억제 효과를 보였고, 300 ㎍/mL의 농도에서는 60% 이상의 엘라스타제 활성억제효과가 100 ㎍/mL의 농도와 유사함을 확인하였다(도 8).
< 실험예 5> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 활성 산소종 생성 억제 효과 확인
인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 활용하여 에너지 대사를 진행시키며 생존하고 있다. 이 산소들은 에너지 대사 후 부산물로 활성산소로 발생 된다. 세포가 정상인 상태일 경우, 활성 산소종에 대한 활성억제 시스템으로 효소적 방어 시스템인 Superoxide Dismutase등의 항산화효소와 비효소적 방어 시스템인 Ascorbic Acid등의 항산화물질을 생산으로 산화환원상태의 균형을 유지하기 때문에 활성산소종에 의한 영향은 미비하다. 세포가 비정상인 상태일 경우, 활성산소종의 증가와 이들의 계속적 활성은 방어시스템을 무력화시키고 불균형을 야기해 단백질의 산화 및 변성 등을 초래하며 생체 내 세포장벽의 기능의 손상과 악화를 야기한다. 이에 본 발명은 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 활성 산소종 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 세포내에서 생성된 활성 산소종을 측정하기 위해 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 이용하였다. 96-well plate에 케라틴세포를 배양하고 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 녹차, 동백, 백출, 호장근 추출물을 10, 30, 100 μl/ml 농도로 넣어주었다. 15분간 37℃ 세포 배양기에서 반응한 후 DCFH-DA를 100 μM 농도로 넣고 37℃ 세포 배양기에서 15분간 반응시켜주었다. 반응 후 배양액을 HBSS로 변경해준 뒤 UVB를 100 mJ로 조사하고 다시 37℃ 세포 배양기에 15분간 반응하였다. 반응이 끝나면 0.5% Triton X-100으로 세포막을 천공시키고 fluorescence intensity를 측정하였다(Ex/Em=480 nm/530 nm).
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 색소들이 제거된 호장근 추출물은 케라틴 세포(Hacat cells)에서 활성산소종의 생성을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 사람 유래의 케라틴 세포에 UVB 조사를 한 후, 각 추출물에 의한 활성 산소종 생성 억제효과를 확인하였다. UVB 조사를 통해 활성산소종의 생성이 증가됨을 우선적으로 확인할 수 있었고, 모든 추출물이 농도 의존적으로 활성산소종 생성의 억제 효과를 보이고, 특히 100㎍/mL의 농도에서 유의적인 생성억제효과를 보임을 확인하였다. 호장근 추출물의 경우에는 다른 추출물들에 비해 미미한 효과를 보이지만 통계적 유의성 있게 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 9).
< 실험예 6> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 세포독성 실험
엽록소가 제거된 추출물 및 색소가 제거된 식물 추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 투여한 후, 세포독성을 확인하였다.
구체적으로, 세포독성 실험은 Trypan blue dye exclusion법을 활용하였다. 먼저, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 추출물을 세포에 3시간 또는 12시간 처리하였다. 이때 살아 있는 세포에 색소가 침투되지 않아 염색이 되지 않으며 죽은 세포만 색소가 침투되어 푸른색으로 염색된다. 살아있는 세포의 %로 산정하였다.
그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 3시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과, 세포독성이 나타내지 않는 것을 확인하였다.
또한, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물을 케라틴 세포(Hacat cells)에 12시간 처리한 후 세포의 생존도를 확인한 결과, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물은 12시간 후에도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 10).
< 실험예 7> 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 chorophyll a 및 chorophyll b 제거 확인
본 발명의 엽록소가 제거된 호장근 추출물과 대조군으로 기존의 기술인 주정으로 추출한 호장근 추출물, 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물과 대조군으로 기존의 기술인 주정으로 추출한 녹차 잎 추출물 및 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물과 대조군으로 기존의 기술로 추출한 동백나무 잎 추출물을 HPLC(high performance liquid chromatography)를 통해 엽록소 제거를 확인하였다. 지표물질로 chorophyll a 및 chorophyll b를 이용하였다.
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 호장근 추출물 및 녹차 잎 추출물에서 chlorophyll a 및 chlorophyll b 모두가 완전히 제거된 것을 확인하였다. 반면 동백나무 잎 추출물에서 chlorophyll a는 95.5%가 제거되고 4.5%가 아직 남아 있는 것이 확인되었고, chlorophyll b는 완전히 제거되었다. 호장근 추출물에서 엽록소도 다량 포함되어 있는 것이 확인되며 엽록소 및 색소 제거실험으로 효과적으로 제거된 것도 확인되었다(표 6).
또한, 도 11의 A 및 B에 대한 크로마토그램은 호장근 추출물, 녹차 잎 추출물 및 동백나무 잎 추출물에서 chlorophyll a 및 chlorophyll b가 이 실험을 통해 효과적으로 제거되었는지 확인하기 위한 방법으로 활용된 지표물질 chlorophyll a 및 chlorophyll b에 대한 HPLC 자료이다. Run Time을 15분으로 반응시켰을 때, 지표물질 chlorophyll a 및 chlorophyll b는 9.5분의 위치와 9분의 위치에서 Peak가 형성된 것이 확인되었다. C 및 D는 호장근 추출물에서 다량 함유된 색소 및 엽록소에 존재를 확인할 수 있는 크로마토그램이다. C의 경우 단지 에탄올을 용매로 추출했을 때, 9분의 위치에서 Peak가 형성된 것이 확인되었다. 호장근 추출물에서는 분자량이 무거운 검은 색소 층이 2분에서 4분 사이에 광범위하게 Peak가 형성된 것이 확인되었다. 이전 공지문헌을 통해(주관기관이 2012년도 창업성장-첫걸음기술개발사업(과제번호:S2069583)이 부분은 화장품원료로 사용하기 어려운 물질들이 많이 존재한 것이 확인되었다. E는 녹차 잎 추출물에서 다량 함유된 엽록소의 존재를 확인할 수 있는 크로마토그램이며, F는 본 발명의 방법을 통해 녹차 잎 추출물에서 엽록소가 제거된 것이 확인되었다. G 및 H는 기존의 방법으로 추출한 동백나무 잎 추출물과 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물의 크로마토그램이다. G에서는 엽록소뿐만 아니라 많은 성분들이 확인된다. 호장근 추출물과 동백 추출물과는 달리 대부분 성분들이 제거되지 않고 그대로 존재한 것이 확인되나 chlorophyll b는 제거되지만 chlorophyll a가 4.5%가 남아 있음을 확인하였다.
< 실험예 8> 화장품 제조시, 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 최적 함유량 확인
엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 색소가 제거된 호장근 추출물을 원료로 하기 표 6의 농도로 스킨에는 0.5%, 로션 및 크림은 1%가 되게 제조되었다. 한편, 화장품 베이스는 코스멕스(주)의 화장품 베이스를 이용하였다(도 12).
| 화장품 1 | 화장품 2 | 화장품 3 | |
| 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물 | 300 ㎍/mL | 200 ㎍/mL | 300 ㎍/mL |
| 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물 | 300 ㎍/mL | 100 ㎍/mL | 100 ㎍/mL |
| 색소가 제거된 호장근 추출물 | 300 ㎍/mL | 100 ㎍/mL | 100 ㎍/mL |
그런 다음, 상기 제작한 화장품 1, 2 및 3의 안정도(stability)를 평가하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 화장품 1의 경우, 안정도 일주일 관찰시 4℃를 제외하고 온도가 높아질수록 색이 진하게 변색되는 현상이 나타남을 확인하였다(도 13). 화장품의 안정도에서 변색이 일어나는 이유는 기존 원료에서 사용하지 못한 고농도(녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물의 원료의 농도가 모두 300㎍/mL)로 발생한 현상으로 동일한 방법으로, 화장품 2 및 화장품 3에 대한 안정도를 확인한 결과, 화장품 1에서 발생한 변색 문제점이 사라지는 것을 확인하였다. 일반적으로, 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물은 기존의 엽록소가 다량 함유된 원료의 유효농도는 50㎍/mL을 넘지 못하는 것으로 알려져 있다. 또한, 호장근 추출물도 검붉은 색소로 인해 원료로 사용하지 못한다.
따라서, 본 발명은 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 및 호장근 추출물을 다량 함유하고 있으면서도 화장품 안정도에 영향을 미치지 않는 최적 함유량을 확인하였다.
< 제조예 1> 본 발명의 본 발명의 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물을 포함하는 화장품 조성
<110> BAE, YONG TAE
<120> Method for removing chlorophyll and pigments from plant extracts
<130> P2016-314
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-1 Forward primer
<400> 1
tgacttttaa aacatagtct atgttca 27
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP-1 Reverse primer
<400> 2
tcttggattg atttgagata agtcatagc 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta actin Forward primer
<400> 3
tggaatcctg tggcatccat gaaac 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta actin Reverse primer
<400> 4
taaacgcagc tcagtaacag tccg 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha Forward primer
<400> 5
cagagggaag agttccccag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha Reverse primer
<400> 6
ccttggtctg gtaggagacg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 Forward primer
<400> 7
ccttggtctg gtaggagacg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6 Reverse primer
<400> 8
ccttggtctg gtaggagacg 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta actin Forward primer
<400> 9
tggaatcctg tggcatccat gaaac 25
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Beta actin Reverse primer
<400> 10
taaacgcagc tcagtaacag tccg 24
Claims (9)
1) 녹차(Green tea) 잎, 동백나무(Camellia japonica) 잎 및 호장근(Polygonum cuspidatum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계; 및
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 주정과 혼합한 후, 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하는 단계를 포함하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 주정과 혼합한 후, 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하는 단계를 포함하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 녹차 잎 추출물, 동백나무 잎 추출물 또는 호장근 추출물은 C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 녹차 잎 추출물은 녹차 잎 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 엽록소가 제거된 녹차 잎 추출물을 제조하는 것을 특징으로 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 동백나무 잎 추출물은 동백나무 잎 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 엽록소가 제거된 동백나무 잎 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 호장근 추출물은 호장근 추출물을 개똥쑥에서 추출한 후로랄 워터, 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 후로랄 워터와 혼합하여 색소가 제거된 호장근 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 맹종죽 잎, 신의대 잎, 녹차 잎, 동백나무 잎 또는 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터를 에탄올과 6:4 내지 9:1의 비율로 혼합한 후, 상기 단계 1)의 추출물에 15 배 내지 25배 첨가한 다음, -40 내지 -60℃의 동결 조건에서 30분 내지 12시간 정치시키는 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서, 단계 2)의 후로랄 워터를 주정과 혼합한 후, 식물 추출물에 첨가한 후, 침전된 엽록소 또는 색소를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
1) 녹차(Green tea) 잎, 동백나무(Camellia japonica) 잎 및 호장근(Polygonum cuspidatum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물로부터 식물 추출물을 제조하는 단계; 및
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하는 단계를 포함하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
2) 맹종죽 잎에서 추출한 후로랄 워터, 신의대 잎에서 추출한 후로랄 워터, 녹차 잎에서 추출한 후로랄 워터, 동백나무 잎에서 추출한 후로랄 워터 및 개똥 쑥에서 추출한 후로랄 워터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 후로랄 워터를 상기 단계 1)의 추출물에 각각 첨가하는 단계를 포함하는 엽록소 또는 색소가 제거된 식물 추출물의 제조방법.
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Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170818 Patent event code: PE09021S01D |
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Patent event date: 20180227 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20170818 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |