JP6554181B2 - 漢方薬抽出物、その製造方法及び使用方法 - Google Patents
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Description
以下、本発明を実施例と結びつけてより詳細に説明する。
30gの青蒿と50gのプロポリスとを20倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し、低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
30gの青蒿と50gのプロポリスとを25倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
50gの青蒿と30gのプロポリスとを30倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
50gの青蒿と30gのプロポリスとを30倍質量のメタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
40gの青蒿と40gのプロポリスとを10倍質量のクロロフォルムに添加し、連続還流抽出(ソックスレー抽出)を室温で24時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
35gの青蒿と45gのプロポリスとを10倍質量の酢酸エチルに添加し、還流抽出を室温で36時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
50gの青蒿と30gのプロポリスとを同質量のブタンジオールに添加し、超音波抽出を室温で2時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
50gの青蒿と30gのプロポリスとを同質量のプロパンジオールに添加し、超音波抽出を50℃で2時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
50gの青蒿と30gのプロポリスとを30倍質量の石油エーテルに添加し、浸漬抽出を室温で48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
45gの青蒿と35gのプロポリスとを30倍質量の水に添加し、煎じ出し抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
30gの青蒿と50gのプロポリスとに対して下記条件下で超臨界流体抽出を行い、圧力が33MPa〜35MPa、温度が50℃、時間が3.5時間、CO2が流速15L/h〜25L/h、エタノール共溶媒中のエタノール含有率が15%(体積百分率)であった。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
80gの青蒿を25倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
80gのプロポリスを25倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
60gの青蒿と20gのプロポリスとを25倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
20gの青蒿と60gのプロポリスとを25倍質量の95%エタノールに添加し、パーコレーション抽出を48時間行った。濾液を収集し低温減圧下で80gまで濃縮することによって抽出物を得た。
テストサンプル:
すべての抽出物を70%エタノール中に溶解し、脱イオン水中で0.2mg/mlの使用液を調製した。測定時に、10μlのサンプルを試験管に添加し、測定される抽出物の最終濃度が0.2mg/mlである。
エンゾライフサイエンス社(Enzo Life Science)のCaN活性テストキット使用し、テストキットの説明書に従ってテストを行った。小径の遠心分離管に、25μlのCaM使用液、5μlのCaN使用液、10μlの50μMのテストサンプル使用液とを添加すると共に、対照管において、10μlの0.5%DMSO水溶液を添加し、均一に混合させ、30℃で10分間インキュベートした。その後、10μlの基質希釈標準溶液を各管に添加し、よく混合した。30℃で50〜60分間のインキュベーション後、100μlの顕色剤を添加しよく混合した。20分間〜30分間の放置後、各管から135μlの溶液を96ウェルプレートに移し、620nmでの吸光度測定を行った。
CaN−NF−AT経路を活性化するPMAとA23187の最適濃度を決定するために、PMAを、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml及び40ng/mlの濃度で調製し、A23187を、0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM及び2μMの濃度で調製した。各濃度は4つの反復ウェルを有するようにした。18時間の活性化後、すべての実験グループの蛍光強度を1μmで測定した。
NFATレポータ遺伝子が常時発現されるNFAT K562レポータ安定細胞株をアフィメトリクス社(Affimatrix)(米国)から購入した。K562細胞をPMA(プロテインキナーゼC(PKC)活性化剤)及びA23187(カルシウムチャンネル活性化剤)で処理した後、転写因子NFATによって調節されるルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを測定した。ルシフェラーゼレポータ遺伝子の発現レベルは、カルシニューリン(CaN)経路の活性レベルを反映する。結果を表1に示す。
抑制率(%)W=[1−(X−A)/(B−A)]x100
ここで、Aは1μmのブランクの平均値、Bは1μmの対照の平均値、Xは1μmでの抽出物の平均値である。その結果を表2に示す。
以下の工程を含む通常のCCK8アッセイによって、実施例1〜3と比較例1〜5との抽出物の細胞毒性を測定した
(1)100μLのK562細胞懸濁液(1x105/ウェル)を96ウェルプレートに入れ、インキュベータ内で24時間(37℃,5%CO2)インキュベートした。
(2)実施例1〜3及び比較例1〜5からの10μLの抽出物をウェルにそれぞれ添加し、そのほかに、6つのウェルを対照群とした。
(3)96ウェルプレートをインキュベータ内で24時間インキュベートした。
(4)10μLのCCK8溶液を各ウェルに添加した。
(5)96ウェルプレートをインキュベータ内で4時間インキュベートした。
(6)ELISAプレートリーダで吸光度(波長450nm)を測定した。
相対毒性(%) W=[(A−X)/A]x100
ここで、AはブランクOD450の平均値、Xは抽出物OD450の平均値である。
Claims (9)
- 青蒿とプロポリスとからなる原材料から作られる漢方薬抽出物であって、前記青蒿と前記プロポリスとの質量比は3:5〜5:3である漢方薬抽出物。
- 請求項1に記載の漢方薬抽出物を製造する方法であって、青蒿とプロポリスとを抽出する工程を有する、製造方法。
- 前記抽出する工程における抽出用溶媒は、アルコール類、アルカン、クロロフォルム、アセトン、水及び酢酸エチルからなる群から選択される一種又は複数種の混合物である、請求項2に記載の製造方法。
- 前記抽出の方法は、パーコレーション法、浸漬法、煎出法、還流抽出法、連続還流抽出法、超臨界流体抽出法又は超音波抽出法である、請求項2に記載の製造方法。
- CaN−NF−AT経路阻害剤の製造における、請求項1に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
- 皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療用の薬剤の製造における、請求項1又は2に記載の漢方薬抽出物の使用方法、又は、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
- 請求項1に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物を含む、皮膚炎症又は自己免疫性疾患の治療用の薬剤。
- アレルギー緩和用又は抗アレルギー用化粧品の製造における、請求項1に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物の使用方法。
- 請求項1に記載の漢方薬抽出物、又は、請求項2から4のいずれか一項に記載の製造方法によって作られる漢方薬抽出物を含む、アレルギー緩和用又は抗アレルギー用の化粧品。
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