KR101790624B1

KR101790624B1 - 항염증 효능을 가지는 국수나무 추출물을 함유하는 조성물 및 그를 유효성분으로 함유한 용도

Info

Publication number: KR101790624B1
Application number: KR1020150103904A
Authority: KR
Inventors: 정현정; 박성하; 김유아; 박병준; 정태화
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2017-10-27
Also published as: WO2017014340A1; KR20170011373A

Abstract

본 발명은 항노화 효능을 가지는 국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 추출물을 함유하는 조성물 및 그를 유효성분으로 함유한 용도에 관한 것이다.
본 발명은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 NO 생성저해, 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 국수나무 추출물을 제공하고, 나아가 상기 면역활성에 의한 항노화 효과뿐만 아니라, 피부에 독성 및 자극이 없어 그 안정성이 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물 및 피부외용제 조성물을 제공할 수 있다.

Description

항염증 효능을 가지는 국수나무 추출물을 함유하는 조성물 및 그를 유효성분으로 함유한 용도{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING EXTRACT FROM STEPHANAFRA INCISA (THUNB.) ZABEL HAVING ANTI-INFLAMMATION EFFECTS AND USE CONTAINING OF COSMETIC COMPOSITION AS EFFECTIVE INGREDIENTS}

본 발명은 항노화 효능을 가지는 국수나무 추출물을 함유하는 조성물 및 그를 유효성분으로 함유한 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 NO 생성저해, 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 조성물을 제공하고, 나아가 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성이 우수하므로, 상기 국수나무 추출물을 함유하는 조성물 및 그를 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물 및 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

노화 과정은 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 나눌 수 있다. 연령증가에 따라 활성 산소종이 활성화될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 세포와 조직의 기능이 손상되어 결국 노화로 이어진다. 이때, 염증의 발생 원인으로 활성산소종은 과도한 스트레스 등에 의한 체내에서 다양한 생화학적 자극에 의하여 생성이 되며, 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적 현상이 관여한다.

염증은 조직에 해롭거나 해로울 가능성이 있는 요인들로부터 생체를 보호하는 국소적인 생리적 반응이다. 엘라스타제(Elastase), 히알루로니다아제(hyaluronidase) 및 리폭시게나아제(lipoxygenase)와 같은 효소들은 염증 시 생성되는 단백질 및 지질 분해 효소들로 잘 알려져 있다. 이들의 작용은 때로는 인접해 있는 조직 세포와 비세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키기도 한다.

따라서 적절한 조건하에서는 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나 계속해서 만들어지면 결과적으로 만성염증이 일어나게 되어서 더욱더 심각한 조직손상을 가져온다.

이처럼 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부탄력을 감소시켜 주름 원인이 될 뿐 아니라 나아가 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 그러므로 과다 염증에 의해 생성되는 하기의 단백질 및 지질분해효소들을 억제함으로써 그로 인해 손상되는 세포들을 보호하여 피부 노화를 억제할 수 있다.

염증은 ROS(Reactive oxygen species), NO(nitric oxide), Cox-2(cyclooxygenase-2)와 같은 인자에 의해 유발된다. 상기 ROS는 세포내의 신호전달로에서 활성화가 이루어진다.

또한, 상기 NO(nitric oxide)는 NOS(nitric oxide synthas)에 의해 생산이 되며, NOS(nitric oxide synthas)에 관여하는 효소는 두 가지로 분류된다. 세포 내에 항상 존재하는 nNOS(neuronal nitric oxide synthase)와 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)와 LPS(lipopolysaccharide) 염증유도 사이토카인에 노출되는 경우에만 발현이 가능한 유도성 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 있다. 염증 매개체의 중심축을 이루는 COX-2는 PGs(Prostaglandin) 생산에 관여하며, COX-2가 활성화되면 PGE₂(Prostaglandin E₂)가 많이 생산된다. NF-κB가 활성화되어 핵으로 이동하여 염증반응을 유도하여 iNOS 및 COX-2 등의 다양한 유전자 발현에 관여한다.

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel)는 장미과의 낙엽활엽관목이며 한국이 원산지이고, 한국, 중국 동북부, 대만(타이완), 일본에 분포한다. 침엽수와 활엽수가 섞여 있는 숲 또는 가장자리, 빛이 잘 드는 경사 지대, 길가에 서식한다. 양지 쪽을 좋아하나 음지에서도 잘 자라며 추위에 강하다. 높이가 1∼2m이며, 가지가 많이 나오며 긴 덩굴처럼 땅 위로 축축 늘어져서 전체가 둥그스름한 덤불처럼 된다. 잔가지는 둥글고 잔털 또는 선모가 있다. 잎의 길이는 2∼5cm로 어긋나고 세모진 넓은 달걀 모양이며 끝이 뾰족하며 가장자리에 날카롭고 깊은 톱니가 있으며 몇 갈래로 깊이 갈라지기도 한다. 붉은빛이 도는 잎자루는 잔털이 있으며, 꽃은5∼6월에 지름 4∼5mm의 노란색 빛이 도는 흰색 꽃이 햇가지 끝에 원추꽃차례로 달린다. 꽃받침 잎은 끝이 날카로우며, 꽃잎은 5개이고 수술은 10개로 꽃잎보다 짧다. 열매는 둥글거나 달걀 모양이고 잔털이 많으며 8∼9월에 익는다.

대한민국특허 제523443호에는 자생식물군으로부터 오리나무, 고로쇠나무, 국수나무로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 추출물을 주성분으로 하여 비만 예방 및/또는 치료용 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2011-0068923호에는 항히스타민제 조성물의 유효성분으로서 국수나무 잎 추출물을 보고하고 있다.

또한, 미국공개특허 제2009-68291호에는 체외 단백질 분해 효소 억제제를 포함하는 식물 추출물로서 국수나무 추출물을 개시하고 그 활성을 보고하고 있다.

이에, 본 발명자들은 국내 자생식물에 대한 생리활성 연구를 통해 국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 추출물이 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 NO 생성저해, 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효능과 피부에 독성 자극이 없는 안정성을 확인하고, 이를 유효성분으로 함유하는 피부유용성 용도를 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 국내 자생식물군 중에서 염증 발병 인자에 대한 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 국수나무 추출물을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 국수나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 국수나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 염증 발병 인자에 대한 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 추출물을 함유하는 조성물을 제공한다.

더욱 구체적으로 국수나무 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)처리 후, NO 생성저해 및 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성을 가지므로, 항노화 또는 피부유용성 효과를 제공한다.

이상의 국수나무 추출물은 국수나무 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 2종이상의 혼합부위로부터 추출되며, 바람직하게는 물, 헥산, 메탄올, 에탄올 및 부틸렌글리콜으로 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그들의 혼합형태의 추출용매에 의해 추출된다.

이에, 본 발명은 이상의 국수나무 추출물 0.001중량% 이상을 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 이상의 국수나무 추출물 0.001중량% 이상을 유효성분으로 함유한 피부외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 국수나무 추출물은 노화진행에 따라 생성이 증가되는 염증 발병 인자에 대한 생성억제 활성을 가지며, 구체적으로 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, 면역 반응에 의한 NO 생성저해, 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현에 대한 억제활성을 보이는 항노화 효과와 더불어 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성이 우수함을 확인함으로써, 항염증 및 항노화 용도에 유효한 국수나무 추출물을 함유하는 조성물을 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 국수나무 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부 항노화 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 국수나무 메탄올 추출물에 따른 세포생존능 측정 결과이고,
도 2는 본 발명의 국수나무 추출물에 따른 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw264.7)에서 NO(Nitrite Oxide) 생성 억제효과를 나타낸 결과이고,
도 3은 본 발명의 국수나무 추출물에 따른 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw264.7)에서 COX-2와 iNOS 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

즉, 본 발명의 실시예에서는 국수나무 추출물에 의해 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성을 구현한다.

본 발명의 국수나무 추출물에 있어서, 국수나무 부위를 모두 포함할 수 있으며, 그 일례로는 국수나무 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 2종이상의 혼합부위로부터 추출될 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 국수나무의 잎과 줄기의 혼합형태로부터 추출된 추출물의 경우 염증 발명 인자에 대한 더욱 우수한 면역활성을 구현하나, 이에 한정되지 아니할 것이다.

상기 국수나무 부위별 추출물에 있어서, 각 추출물은 물, 헥산, 메탄올, 에탄올 및 부틸렌글리콜으로 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그들의 혼합형태의 추출용매를 이용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 추출물의 경우 우수한 활성을 보인다. 이때, 메탄올 및 알코올을 포함하는 알코올류의 추출용매는 그 순도에 특별한 제한없이 사용될 수 있으나 바람직하게는 80∼95% 메탄올 및 70∼80%의 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 국수나무 추출물은 상기의 추출용매를 이용하여 45∼120℃에서 30분∼24시간 동안 가열하여 열수 추출되거나, 5∼40℃에서 30분∼15일간 침지하여 진탕 추출하는 방법에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법에 의해 제조될 수 있으며, 추출용매 및 추출방법에 따라 추출물의 수율을 향상시킬 수 있다.

이때, 추출용매의 사용량은 각별히 한정되는 것은 아니나, 식물소재 대비 과량 사용되면 추출물이 충분히 추출될 수 없고, 추출 후 추출용매를 제거하고 건조 추출물을 얻는 데 시간과 비용이 많이 들게 된다. 따라서, 열수 추출할 경우 식물 소재를 충분히 포함하고, 추출 효율을 높이기 위해서 가온된 상태로 추출하는 것이 바람직하며, 온도가 너무 낮으면 가온의 이점을 충분히 살리기 어렵고 긴 시간동안 추출해야 하며, 온도가 너무 높으면 유용물질의 분해가 생길 수 있다.

또한, 진탕 추출할 경우 상온에서 추출할 수 있으며, 분말 상태의 시료를 충분한 시간 동안, 바람직하게는 3일 정도의 시간 동안 충분한 추출용매에 침지하여 유효성분이 충분히 추출되도록 하며, 추출이 충분하지 못한 경우 반복 공정을 통하거나 추출 시간을 증가시켜 추출량을 늘릴 수 있을 것이다.

이상의 각 추출용매로부터 추출된 국수나무 추출물은 100㎍/㎖ 이하 농도조건에서 세포독성이 관찰되지 않음으로써[도 1], 피부 적용에 유용하다.

또한, 본 발명의 각 추출용매로부터 추출된 국수나무 추출물에 대하여 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 NO 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, LPS를 처리한 대조군에 비해, 각 국수나무 추출물 100㎍/㎖ 농도에서 30∼40% 수준으로 NO 생성 억제효과를 확인할 수 있다[도 2].

또한, 본 발명의 국수나무 추출물이 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 COX-2와 iNOS 발현에 미치는 저해효과를 측정한 결과, 국수나무 추출물은 농도 의존적으로 COX-2와 iNOS 저해 효과를 나타낸다. 특히, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 100㎍/㎖ 농도에서 iNOS 발현이 억제된 결과를 확인할 수 있다.

이에, 본 발명의 국수나무 추출물은 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 COX-2, iNOS 발현을 탁월하게 억제하는 효과를 가지며, 100㎍/㎖ 이하 농도조건에서 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성 면에서도 우수하므로, 이를 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부외용제 조성물의 유효성분으로 함유할 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 국수나무 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 국수나무 추출물을 유효성분으로 함유한 항염증 및 항노화 효능을 가지는 피부외용제 조성물을 제공한다.

이때, 본 발명의 피부 항노화 화장료 조성물의 경우는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지 또는 팩 제형에 적용될 수 있고, 피부외용제 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트(liniments)제, 파스타(pasta)제 또는 카타플라스마(cataplasma)제 제형에 적용될 수 있다.

또한, 상기 조성물의 총 중량에 대하여, 국수나무 추출물은 0.001중량% 이상을 유효성분으로 함유하는 것이 바람직하며, 상기 함량은 염증 발병 인자에 대한 생성억제 활성을 구현하는 최소함량으로 선정된다. 다만, 국수나무 추출물의 안정성과 면역활성을 고려하여 유효함량을 높여 함유할 수 있을 것이나, 피부적용시 변색, 변취 등을 고려하여 바람직하게는 30 중량% 이내 범위로 함유된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 제한되지 않는다는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 국수나무 열수 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 잎, 줄기 추출성분과 물을 1:20 중량비로 혼합하여 열수 추출한 후, 380 메쉬로 여과한 후, 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과하였다. 이후 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압증발하여 국수나무 잎, 줄기 추출물 5.8g을 제조하였다.

< 실시예 2> 국수나무 헥산 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 잎, 줄기 추출성분과 헥산을 1:20 중량비로 혼합하여 3일 동안 상온 침지하였고, 상기 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하여 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과하였다. 이후 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압증발하여, 국수나무 헥산 추출물6.4g을 제조하였다.

< 실시예 3> 국수나무 메탄올 추출물의 제조

국수나무( Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 잎, 줄기 추출성분과 메탄올을 1:20 중량비로 혼합하여 3일 동안 상온 침지하였고, 상기 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하여 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과하였다. 이후 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압증발하여, 국수나무 메탄올 추출물6.8g을 제조하였다.

< 실시예 4> 국수나무 에탄올 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 잎, 줄기 추출성분과 에탄올을 1:20 중량비로 혼합하여 3일 동안 상온 침지하였고, 상기 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하여 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor®-450, 60173, PALL Life Sciences)로 재여과하였다. 이후 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압증발하여, 국수나무 에탄올 추출물5.1g을 제조하였다.

< 실시예 5> 국수나무 부틸렌글리콜 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 잎, 줄기 추출성분과 부틸렌글리콜을 1:20 중량비로 혼합하여 3일 동안 상온 침지하였고, 상기 과정을 3회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하여 0.45㎛ 멤브레인 필터로 재여과하여, 국수나무 부틸렌글리콜 추출물을 제조하였다.

< 실시예 6> 국수나무 열매 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 열매 성분을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일하게 수행하여, 국수나무 열매 메탄올 추출물 5.7g을 제조하였다.

< 실시예 7> 국수나무 뿌리 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 뿌리 성분을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일하게 수행하여, 국수나무 뿌리 메탄올 추출물 4.2g을 제조하였다.

< 실시예 8> 국수나무 전초 추출물의 제조

국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 전초 성분을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 3과 동일하게 수행하여, 국수나무 전초 메탄올 추출물 6.3g을 제조하였다.

< 실험예 1> MTT 세포생존능 측정

상기 실시예 1∼5에서 제조된 국수나무 추출물들에 대한 세포독성을 확인하기 위하여, 마우스 대식세포주인 Raw264.7 셀을 5×10⁴cells/㎖ 농도로 하여 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 6시간 동안 배양하였다. 이때 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)를 이용하였다.

상기 중에서 실시예 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 농도 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1, 0.5, 0.1㎍/㎖로 96-웰 플레이트에 시료 처리하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.

24시간 후 MTT 용액을 웰 당 10㎕씩 처리하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에 배양 3시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 웰당 100㎕씩 주입하여 20분 흔들어(Shaking) 570nm/ 655nm 흡광도를 측정하였다.

상기 실험결과를 도 1에 도시하였으며, 상기 실시예 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물 100㎍/㎖이하의 농도조건에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

< 실험예 2> NO 생성평가 측정

상기 실시예 1∼8에서 제조된 국수나무 추출물들에 대한 세포독성을 확인하기 위하여, 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 5×10 cells/㎖ 농도로 96-웰 플레이트에100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)를 이용하였다.

상기에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 100, 50, 25㎍/㎖ 농도로 96-웰 플레이트에 시료 처리하여 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 90㎕, 시료 10㎕) 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 반응시킨 후, LPS (Lipopolysaccharide) 1㎍/㎖씩 처리하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.

생성된 NO(Nitrite Oxide) 양은 그리스(Griess) 시약(NED solution, sulfanilamide solution)을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO₂형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 50㎕와 그리스 시약 (NED solution, sulfanilamide solution) 각각 50㎕씩 처리하여 10분간 실온에서 빛을 차단하여 반응시킨 후, 540nm/655nm 흡광도를 측정하고, 그 실험결과를 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.

상기 표 1 및 표 2에서 가장 우수한 NO(Nitrite Oxide)의 생성 억제효과를 보인 실시예 3의 국수나무 추출물에 대하여, 도 2는 본 발명의 실시예 3에 국수나무 추출물에 따른 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw264.7)에서 NO(Nitrite Oxide) 생성 억제효과를 나타낸 도시하였다.

그 결과, 100㎍/㎖ 이하의 조건에서 염증 유발물질인 LPS에 의하여 유도된 NO(Nitrite Oxide)의 생성 억제효과를 확인하였으며, 특히, 100㎍/㎖ 농도에서 가장 높은 NO(Nitrite Oxide)의 생성 억제효과를 확인하였다.

< 실험예 3> iNOS 및 COX-2 발현 측정

RAW 264.7 세포 (5×10⁵cells/㎖)를 18시간 동안 전 배양하고, 시험물질(실시예 3의 국수나무 메탄올 추출물 100, 50, 25㎍/㎖)과 LPS(1㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다.

24시간 배양 후 세포를 수거하고 PBS로 두 번 세척하였다. 이후 세포를 버퍼용액[Pro-PREP^TM solution]에 용해하고 원심분리시킨 후 상등액을 수거하여 사용 전까지 70℃에서 보관하였다. 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량하였다. 세포 용해 상등액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고 PVDF 막(BIO-RAD, HC, USA)에 전이시킨 후 블락킹(blocking) 용액(5% nonfat dried milk)으로 블락킹하였다.

anti-iNOS 항체 및 anti-COX-2 항체를 이용하여 밤새(overnight) 방치한 후 2차 항체를 넣고 반응시켰다. 그 다음 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 키트로 검출하고 액틴(actin)과 비교하여 장비(chemi-Doc)를 이용하여 단백질의 발현 정도를 측정하였다.

그 실험결과를 도 3에 도시하였으며, 100㎍/㎖ 농도에서 iNOS 발현이 억제된 결과를 확인하였다.

< 처방예 1> 유연화장수 제조

상기 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 중 유연화장수에 대한 제형예는 하기 표 3과 같다.

더욱 구체적으로는, 소듐히아루로네이트는 정제수에 프로펠러믹서 3000rpm으로 분산하여 1% 용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼8을 프로펠러믹서 500rpm으로 균일화하고 75℃에서 가온하여 완전 용해시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 별도 용해조에 원료 9∼11을 완전 용해시켜 상기 수상 용해조에, 투입한 후 교반 혼합하였다. 여기에, 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.

<처방예 2> 영양화장수 제조

상기 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 중 영양화장수에 대한 제형예는 하기 표 4와 같다.

카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% 용액으로 준비하였다. 수상용해조에 원료 1∼6을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7∼13을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에, 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.

< 처방예 3> 에센스 제조

상기 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 중 에센스에 대한 제형예는 하기 표 5와 같다.

소듐히아루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서 2000rpm으로 분산하여 1% 용액으로 준비하였다. 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% 용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼12를 투입하여, 호모 2000rpm으로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 상기 가온된 수상을 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13∼15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다.

여기에, 여기에, 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 에센스를 제조하였다.

< 처방예 4> 영양크림 제조

상기 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 유효성분으로 함유한 화장료 중 영양크림에 대한 제형예는 하기 표 6과 같다.

수상용해조에 원료 1∼8을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 9∼16을 투입하여 80℃까지 가온 용해시켰다. 수상용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에, 실시예의 3에서 제조된 국수나무 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 국내 자생식물의 생리활성에 대한 연구를 통해 국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 추출물이 염증 발병 인자에 대한 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 확인함으로써, 항염증 및 항노화 용도에 유효한 국수나무 추출물을 함유하는 조성물을 제공하였다.

이에, 본 발명은 국수나무 추출물이 피부에 독성 및 자극이 없어 그 안정성을 확인함으로써, 이를 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물 및 피부외용제 조성물을 제공하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

염증 발병 인자에 대한 생성억제의 면역활성을 가지는 국수나무(Stephanandra incisa (Thunb.) Zabel) 추출물을 함유하는 항염용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 국수나무 추출물이 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)처리 후, NO 생성저해 및 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 생성억제의 면역활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항염용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 국수나무 추출물이 국수나무 식물의 꽃, 잎, 줄기, 열매, 종자, 뿌리 및 전초 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 2종이상의 혼합부위로부터 추출된 것을 특징으로 하는 항염용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 국수나무 추출물이 물, 헥산, 메탄올, 에탄올 및 부틸렌글리콜으로 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그들의 혼합형태의 추출용매에 의해 추출된 것을 특징으로 하는 항염용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 국수나무 추출물 0.001중량% 내지 30중량%를 유효성분으로 함유하는 항염증 효능을 가지는 화장료 조성물.
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