KR101551750B1

KR101551750B1 - 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물 및 그를 유효성분으로 함유하는 피부유용 조성물

Info

Publication number: KR101551750B1
Application number: KR1020140178222A
Authority: KR
Inventors: 박성하; 김보윤; 박병준; 김진준
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2014-12-11
Filing date: 2014-12-11
Publication date: 2015-09-10

Abstract

본 발명은 본 발명은 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물 및 그를 유효성분으로 함유하는 피부유용(皮膚有用) 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.) 추출물은 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS)의 발현에 대한 억제활성이 우수하므로, 상기의 면역활성에 의한 항노화 효과와 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성 면에서 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부외용제 조성물의 유용한 원료로 활용될 수 있다.

Description

항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물 및 그를 유효성분으로 함유하는 피부유용 조성물{AN EXTRACT OF FALLOPIA SACHALINENSIS HAVING ANTI-AGING EFFECT AND SKIN USEFUL COMPOSITION CONTAINING THE EXTRACT AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 항노화 효과를 가지는 왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.) 추출물 및 그를 유효성분으로 함유하는 피부유용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 바람직하게는 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)를 처리한 후 NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지고, 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성이 우수한 왕호장 추출물 및 그를 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히알루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유 라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 따라서 피부의 탄력성이 떨어지고 주름이 증가하게 된다.

노화의 원인은 내인성 노화와 외인성 노화로 나눌 수 있다. 내인성 노화는 나이가 들면서 타고난 유전적 체질에 의해 나타나는 자연적이며 불가항력적인 노화현상으로 보통 20대 초반부터 시작된다. 외인성 노화는 환경 외부 인자들 특히, 장기간의 태양 광선에 노출됨으로써 오는 자외선 자극으로 인한 광노화 및 기타 바람, 열, 공해, 피부 건조, 스트레스, 염증 등에 의한 노화가 있다.

또한 노화가 진행되거나 자외선에 의해서, 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시제나제-2(COX-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다.

즉 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있다.

구체적으로, 염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상분위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 여러 반응 물질들이 발생하게 된다. 이들의 작용은 때로는 인접해 있는 조직 세포와 비세포 성분들에게도 해로운 손상을 일으키게 된다. 따라서 적절한 조건하에서는 염증은 초기 상태가 지난 후에는 정상기능을 되찾게 되지만 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나 계속해서 만들어지면 결과적으로 만성염증이 일어나게 되어 더욱더 심각한 조직의 손상을 가져온다. 이처럼 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될뿐 아니라 나아가 빠른 피부 노화를 초래하게 된다. 그러므로 과다 염증에 의해 생성되는 단백질 및 효소들을 억제함으로써, 그로 인해 손상되는 세포들을 보호하여 피부노화를 억제할 수 있다.

내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccaride)는 그람-음성세균의 세포외막에 존재하며, 대식세포(macrophage) 또는 단핵세포(monocyte)로부터 다양한 염증 발병 인자로 알려진 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 염증매개 물질의 형성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)을 PGs(prostaglandins)으로 바뀌는 과정 및 NO (nitric oxide) 형성 과정으로 이어지게 된다.

이때, 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX)는 아라키돈산을 PGs으로 전환시키는 효소로서, COX-1과 COX-2로 분류된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적인 생체기능에 작용하지만, COX-2는 염증매개물질인 PGE₂ (Prostaglandin E₂)를 형성시킨다. PGE₂와 같은 물질은 염증반응, 면역반응 및 신생혈관 생성(angiogenesis)을 촉진 등 암 발생에도 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다.

체내 염증과정에서는 과량의 NO 및 PGE₂ 등의 염증인자가 NO 합성효소(NOS)라는 유도성 또는 상존성 효소에 의하여 생성되는 반응성 라디칼로서 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다.

NF-κB는 염증반응, 면역 반응 등 다양한 유전자의 발현에 관여하는 전사인자로서, 조양형성, 자가면역질환, 염증질환에 주용한 역할을 담당하는 것으로 알려져있다. 세포질 속에서 p65와 p50의 헤테로다이머(heterodimer)와 억제 단백질인 I-Κb(inhibitory-κB)와 함께 비활성 상태로 존재하다가 외부로부터 LPS 또는 사이토카인과 같은 염증성 자극이 주어지면 I-κB kinase가 활성화되어 분해되고 헤테로다이머는 활성화되어 핵안으로 이동하여 염증반응을 유도하는 사이토카인, iNOS, COX-2등의 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다.

왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.)은 경상북도 울릉군에 서식하고 있는 쌍떡잎식물 이판화군 마디풀목 마디풀과의 여러해살이풀로 줄기 높이는 2∼3m이고 곧게 자란다. 줄기는 원주형으로 속이 비어 있으며 녹색이지만 햇빛이 닿은 부분은 붉어지며, 어린순은 죽순처럼 생겼다. 어린 줄기에 호피 모양으로 자주색 반점이 퍼져 있다. 잎은 어긋나고 삼각형의 달걀 모양이며, 덩이줄기는 굵고 널리 퍼지는데 겉은 갈색, 안쪽은 누런색이다. 꽃은 8∼9월에 흰색으로 피며 단성화이다. 총상꽃차례로 달리며 털이 빽빽하게 나 있으며, 열매는 수과(瘦果)이고 세모진 달걀 모양이다. 비슷한 종류로 감절대, 왕호장, 붉은호장근 등이 있다. 우리나라에서는 울릉군에만 분포하는 식물이며, 산지의 계곡에서 자생하고, 우리나라가 원산지이다. 변비·이뇨·생리통·치루 출혈·타박상·화상 등의 치료에 쓴다. 용법은 9∼30g을 달이거나 술로 담가 마시고, 환이나 가루로 복용한다.

종래, 왕호장에 대한 연구로서, 일본 공개특허공보 제2013-28580호에는 왕호장 수꽃의 추출액을 이용한 화장품에 대하여 보고하고 있으며, 이를 사용함으로써, 두발 또는 피부를 유연하고 탄력있고 건강하게 유지할 수 있는 효능을 보고하고 있다.

이에, 본 발명자들은 국내 자생식물군 중에서 왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.)에 대한 유효활성을 연구한 결과, 왕호장 추출물에 대해 대식세포(RAW 264.7 세포)에 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현에 대한 억제활성을 확인함으로써, 왕호장 추출물의 면역활성에 의한 항노화 효과를 확인하고, 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성이 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 피부유용 조성물을 제공하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 국내 자생식물군 중에서 염증 발병 인자에 대한 생성억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.)으로부터 으로부터 추출되어 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물을 제공한다.

더욱 구체적으로 왕호장 추출물은 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현에 대한 억제활성을 보이고, 이러한 면역활성에 의한 항노화 효과를 가진다.

더욱 바람직하게는 본 발명의 왕호장 추출물은 왕호장의 열매, 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 부위 또는 2종이상의 혼합부위로부터 추출된 추출물인 것이다.

또한, 본 발명의 왕호장 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물, 및 부틸렌글라이콜으로 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그들의 혼합형태의 추출용매로 추출된 추출물이다.

이에, 본 발명은 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유한 피부유용 조성물로서, 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이때, 상기의 피부유용 조성물에서, 왕호장 추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 0.01 중량% 이상을 함유한다.

본 발명의 왕호장 추출물은 노화진행에 따라 생성이 증가되는 염증 발병 인자에 대한 생성억제 활성을 가지며, 구체적으로 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, 면역 반응에 의한 NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현에 대한 억제활성을 통해 이러한 면역활성에 의한 항노화 효과를 확인하고, 피부에 독성 및 자극이 없으며 안정성 면에서도 우수하다.

이에, 본 발명의 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부유용 조성물에 적용할 수 있으며, 바람직한 일례로서 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 왕호장 추출물에 따른 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw264.7)에서 COX-2와 iNOS 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과이고,
도 2는 본 발명의 왕호장 추출물이 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6의 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.)으로부터 추출되어 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물을 제공한다.

즉, 본 발명은 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물을 제공한다.

본 발명의 왕호장 추출물에 있어서, 왕호장 부위를 모두 포함할 수 있으며, 그 일례로는 열매, 줄기, 꽃, 잎, 종자, 뿌리, 전초부위 등을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 왕호장의 열매, 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 부위로부터 추출된 추출물에 한정하여 설명하고 있으나, 이에 한정되지 아니할 것이다. 이에, 실시예에서 기재되지 않았으나, 상기 2종이상의 혼합부위로부터 추출된 추출물 또는 상기 부위를 제외한 추출물도 적용할 수 있을 것이며, 가장 바람직하게는 상기 부위별 추출물 중에서 왕호장 열매 추출물이 염증 발병 인자에 대한 가장 우수한 활성을 보인다.

상기 왕호장 추출물에서, 각 추출물은 메탄올, 에탄올, 헥산, 물, 및 부틸렌글라이콜으로 이루어진 군에서 선택되는 단독 또는 그들의 혼합형태의 추출용매을 이용하여 추출될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 추출물의 경우 우수한 활성을 보인다. 이때, 메탄올 및 알코올을 포함하는 알코올류의 추출용매는 그 순도에 특별한 제한없이 사용될 수 있으나 바람직하게는 80∼95% 메탄올 및 70∼80%의 에탄올을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 왕호장 추출물은 상기의 추출용매를 이용하여 45∼120℃에서 30분∼24시간동안 가열하여 열수 추출되거나, 5∼40℃에서 30분∼15일간 침지하여 진탕 추출하는 방법에서 선택된 적어도 하나의 추출 방법에 의해 제조될 수 있으며, 추출용매 및 추출방법에 따라 추출물의 수율을 향상시킬 수 있다.

이때, 추출용매의 사용량은 각별히 한정되는 것은 아니나, 식물소재 대비 과량 사용되면 추출물이 충분히 추출될 수 없고, 추출 후 추출용매를 제거하고 건조 추출물을 얻는 데 시간과 비용이 많이 들게 된다. 따라서, 열수 추출할 경우 식물 소재를 충분히 포함하고, 추출 효율을 높이기 위해서 가온된 상태로 추출하는 것이 바람직하며, 온도가 너무 낮으면 가온의 이점을 충분히 살리기 어렵고 긴 시간동안 추출해야 하며, 온도가 너무 높으면 유용물질의 분해가 생길 수 있다.

또한, 진탕 추출할 경우 상온에서 추출할 수 있으며, 분말 상태의 시료를 충분한 시간동안, 바람직하게는 3일 정도의 시간 동안 충분한 추출용매에 침지하여 유효성분이 충분히 추출되도록 하며, 추출이 충분하지 못한 경우 반복 공정을 통하거나 추출 시간을 증가시켜 추출량을 늘릴 수 있을 것이다.

이상의 각 추출용매로부터 추출된 왕호장 추출물은 100㎍/㎖ 이하 농도조건에서 독성이 관찰되지 않음으로써[표 1 내지 표 5], 피부 적용에 유용하다.

또한, 본 발명의 각 추출용매로부터 추출된 왕호장 추출물에 대하여 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 NO 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과, LPS를 처리한 대조군에 비해, 각 왕호장 추출물 100㎍/㎖ 농도에서 86.6%의 NO 생성 억제효과를 확인할 수 있다[표 6].

도 1은 본 발명의 왕호장 추출물이 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 COX-2와 iNOS 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과로서, 왕호장 추출물은 농도 의존적으로 COX-2와 iNOS 저해 효과를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 왕호장 추출물이 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6의 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과로서, 왕호장 추출물의 농도 의존적으로 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6의 발현을 억제함을 확인할 수 있다.

상기의 왕호장 추출물은 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6 발현을 탁월하게 억제하는 효과를 가지며, 100㎍/㎖ 이하 농도조건에서 피부에 독성 및 자극이 없어 안정성 면에서도 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 피부 항노화 화장료 조성물 또는 피부외용제 조성물의 원료로서 유용할 것이다.

이에, 본 발명은 상기의 조성물 중에서 더욱 바람직한 용도로서, 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 항노화 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유한 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이때, 본 발명의 피부 항노화 화장료 조성물의 경우는 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림, 마사지 또는 팩 제형에 적용될 수 있고, 피부외용제 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트(liniments)제, 파스타(pasta)제 또는 카타플라스마(cataplasma)제 제형에 적용될 수 있다.

또한, 상기 조성물의 총 중량에 대하여, 왕호장 추출물은 적어도 0.01 중량% 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 상기 함량이 0.01 중량% 미만으로 함유되면, 염증 발병 인자에 대한 생성억제 활성이 미흡하므로 최소함량으로 선정된다. 다만, 왕호장 추출물의 안정성과 면역활성을 고려하여 유효함량을 높여 함유할 수 있을 것이나, 피부적용시 변색, 변취등을 고려하여 바람직하게는 30 중량% 이내 범위로 함유된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 왕호장 열매의 메탄올 추출물 제조

왕호장 열매와 95% MeOH을 1:20 중량비율로 넣고 3일 간 상온 침지하였다. 이 과정을 3 회 반복하여 추출한 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor

-450, 60173, PALL Life Sciences)여과하였다. 상기 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 왕호장 잎의 메탄올 추출물 제조

왕호장 잎을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 잎의 메탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 3> 왕호장 줄기의 메탄올 추출물 제조

왕호장 줄기를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 줄기의 메탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 4> 왕호장 뿌리의 메탄올 추출물 제조

왕호장 뿌리를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 뿌리의 메탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 5> 왕호장 열매의 에탄올 추출물 제조

왕호장 열매와 70% EtOH을 1:20 중량비율로 넣고 3일 간 상온 침지하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 열매의 에탄올 추출물을 제조하였다.

<실시예 6> 왕호장 열매의 헥산 추출물 제조

왕호장 열매와 헥산을 1:20 중량비율로 넣고 3일 간 상온 침지하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 열매의 헥산 추출물을 제조하였다.

<실시예 7> 왕호장 열매의 열수 추출물 제조

왕호장 열매와 물을 1:20 중량비율로 넣고 100℃에서 3시간 동안 추출하였다. 상기 추출 후, 380 메쉬로 여과하고 0.45㎛ 멤브레인 필터(Supor

-450, 60173, PALL Life Sciences)로 여과하였다. 상기 여과액을 냉각 콘덴서가 달린 증류장치에서 40℃로 감압 농축한 후 감압 증발하여 왕호장 열매의 열수 추출물을 제조하였다.

<실시예 8> 왕호장 열매의 부틸렌글라이콜 추출물 제조

왕호장 열매와 1,3-부틸렌글라이콜을 1:3 중량비율로 넣고 3일 간 상온 상온 침지하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방식으로 수행하여, 왕호장 열매의 부틸렌글라이콜 추출물을 제조하였다.

<실험예 1> 그리스 분석방법을 이용한 NO 생성평가 측정

1. 부위별

마우스 대식세포(Raw 264.7 cell)를 5×10⁵ cells/ml 농도로 96 웰플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 이때, 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 상기 실시예 1 내지 4에서 왕호장 부위별로 추출된 각각의 왕호장 메탄올 추출물을 농도별로 첨가하고 동일한 배양조건에서 30분 배양한 후 1㎍/㎖LPS를 1㎕씩 넣고 24시간 배양하였다. 이때, 각각의 왕호장 추출물의 농도는 100㎍/㎖이였다. 상기 배양이 끝난 후 그리스 시약(Griess reagent) Ⅰ과 Ⅱ를 동량 섞은 후 배양한 배지와 50㎕씩 96 웰플레이트에 넣은 후 37℃, 인큐베이터에서 10분 반응시킨 후, 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 540nm에서 결과값을 측정하였다.

상기 표 1의 결과로부터, 왕호장의 각 부위별 메탄올 추출물의 경우, 모든 부위에서 NO 생성을 억제하는 효과를 나타내었으나, 왕호장 열매 추출물에서 가장 낮은 NO 생성량(uM)을 보임으로써, 가장 우수한 NO 생성 억제 효과를 확인하였다.

2. 추출용매별

상기 실시예 1, 실시예 5 내지 8에서 각각의 추출용매별로 추출된 각각의 왕호장 추출물을 시료로 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실험방법과 동일하게 수행하여 NO 생성량을 측정하였다.

상기 결과에서, 추출용매별 제조된 왕호장 추출물의 경우, 모두 NO 생성을 억제하는 효과를 나타내었으나, 메탄올을 이용한 실시예 1의 추출물에서 가장 낮은 NO 생성량(μM)을 보임으로써, 가장 우수한 NO 생성 억제 효과를 확인하였다.

<실험예 2> MTT 분석 방법을 이용한 세포 생존능 측정

마우스 대식세포(Raw 264.7 cell)를 5×10⁴ cells/ml 농도로 96 웰플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 16시간 배양하였다. 이때, 배지는 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 배양 후 소혈청과 항생제가 배제된 DMEM 배지로 교체한 후, 시료를 농도별로 첨가하고 동일 배양조건에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 5㎎/㎖ MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 시약을 첨가하여 동일 조건에서 3시간 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 DMSO(Dimetyl sulfoxide)을 100㎕씩 넣은 후 20분 동안 쉐이킹한 후 마이크로플레이트계수기(Micro plate reader) 570nm에서 결과값을 측정하였다.

이때, 시료는 왕호장 부위별 추출물의 NO 생성량 결과에서 가장 우수한 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 사용하였다.

상기 실험결과, 실시예 1에서 제조된 왕호장 열매의 메탄올 추출물은 100㎍/㎖이하 농도에서 독성을 나타내지 않았음을 확인하였다.

<실험예 3> COX-2와 iNOS 발현 억제 효과

마우스 대식세포(Raw 264.7 cell)를 10% FBS-DMEM에 배양한 후, 이를 취하여 세포농도를 5×10⁵cell/㎖로 조정한 세포액을 조제한 후, 이를 60mm 디쉬에 4㎖씩 분주하고, 이를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지를 제거한 후 배지 3.6 ㎖과 농도별 시료 400㎕, 1㎍/㎖ LPS 4㎕을 혼합한 후 다시 동일 조건에서 16시간 배양시켰다. 이때, 불랭크(Blank)의 경우 배지만을 넣고, 실시예 1의 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 시료로 이용하였다. 16시간 배양한 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하여 이를 마이크로튜브(microtube)에 획득한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 1회 세척한 후 이를 원심분리하고, 펠렛에 용액(PRO-PREP^TMProtein Extract Solution, Intron, Inc.)을 400㎕씩 처리하여 -20℃에서 15분 반응시켰다. 이때, 원심분리(13,000rpm, 10분) 후, 상등액을 1.5㎖ 튜브로 옮긴 후 -20℃에 보관하였다. 정제한 단백질을 10% SDS-PAGE을 이용해 전기영동하고 이를 PVDF 멤브레인(GEhealthcare)으로 이전시켰다. 5% 스팀밀크가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블록킹(blocking) 과정을 거친 후, 1차 항체와 반응시켰다. HRP(Horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 가하고, 장비(Chemi-Doc)를 이용하여 현상하였다.

그 결과를 도 1에 기재하였고, 실시예 1의 왕호장 열매의 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 COX-2와 iNOS 저해효과를 나타냄을 확인하였다.

<실험예 4> COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6 사이토카인의 발현 억제 효과

마우스 대식세포(Raw 264.7 cell)를 10% FBS-DMEM에 배양한 후, 이를 취하여 세포농도를 5×10⁵cell/㎖로 조정한 세포액을 조제한 후, 이를 60mm 디쉬에 4㎖씩 분주하고, 이를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다. 24시간 배양 후, 배지를 제거한 후 배지 3.6 ㎖과 농도별 시료 400㎕, 1㎍/㎖ LPS 4㎕을 혼합한 뒤 다시 동일 조건에서 16시간 배양시켰다. 이때, 블랭크(Blank)의 경우, 배지만을 넣고, 실시예 1의 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 시료로 이용하였다. 16시간 배양한 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하여 이를 microtube에 획득한 뒤 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 1회 세척한 후 이를 원심분리하고, 키트(Rneasy Mini kit (Qiagen)와 RT-PCR kit(Takara, Japan))를 사용하여 RNA를 추출한 후, RT-PCR 키트로 cDNA를 합성하였으며, 각 유전자에 맞는 프라이머를 이용하여 PCR를 진행한 후 아가로스 전기영동을 진행하여 결과를 확인하였다.

도 2는 본 발명의 왕호장 열매의 메탄올 추출물이 LPS-활성화 마우스 대식세포(Raw 264.7)에서 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6의 발현에 미치는 저해효과를 나타낸 결과로서, 왕호장 추출물이 농도 의존적으로 COX-2, iNOS, IL-1β, TNF-α, IL-6의 발현을 억제함을 확인하였다.

<처방예 1> 유연화장수 제조

소듐히아루로네이트는 정제수에 프로펠러믹서 3000rpm으로 분산하여 1% 용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼8을 프로펠러믹서 500rpm으로 균일화하고 75℃에서 가온하여 완전 용해시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 별도 용해조에 원료 9∼11을 완전 용해시켜 상기 수상 용해조에, 투입 한 후 교반 혼합하였다. 여기에, 실시예 1에서 제조된 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 유연화장수를 제조하였다.

<처방예 2> 영양화장수 제조

카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% 용액으로 준비하였다. 수상용해조에 원료 1∼6을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7∼13을 투입하여 75℃까지 가온 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/5분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에, 실시예 1에서 제조된 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 영양화장수를 제조하였다.

< 처방예 3> 에센스 제조

소듐히아루로네이트, 히드록시에틸셀룰로이즈는 각각 정제수에 프로펠러믹서 2000rpm으로 분산하여 1% 용액으로 준비하였다. 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2% 용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1∼12를 투입하여, 호모 2000rpm으로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 상기 가온된 수상을 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13∼15를 완전 용해시킨 후, 상기 수상 용해조에 투입하여 교반 혼합하였다.

여기에, 여기에, 실시예 1에서 제조된 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 에센스를 제조하였다.

<처방예 4> 영양크림 제조

수상용해조에 원료 1∼8을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 9∼16을 투입하여 80℃까지 가온 용해시켰다. 수상용해조에 용해된 유상을 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에, 여기에, 실시예 1에서 제조된 왕호장 열매의 메탄올 추출물을 투입하고 충분히 교반 혼합하여, 영양크림을 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 국내 자생식물군 중에서 왕호장 추출물에 대한 유효활성으로서, 노화진행에 따라 생성이 증가되는 염증 발병 인자에 대한 생성억제 효과가 우수함을 확인하였다. 더욱 구체적으로는 염증반응을 유도하는 LPS 처리 후, NO 생성저해 및 면역 반응에 의한 인터루킨((interleukin)-1β, IL-6), 종양괴사인자((tumor necrosis factor)-α, TNF-α), COX-2 및 iNOS 발현에 우수한 억제활성을 보였으며, 100㎍/㎖ 이하 농도조건에서 독성이 관찰되지 않음으로써 피부에 독성 및 자극이 없어 우수한 안정성을 확인하였다.

이에, 본 발명은 상기의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 왕호장 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부에 유용한 조성물로서 적용가능하며, 더욱 구체적으로는 피부 항노화 화장료 조성물의 원료로서 활용하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

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왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.) 열매 추출물 0.01 중량% 이상을 유효성분으로 함유하되,
상기 왕호장 열매 추출물이 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부 항노화 화장료 조성물.
왕호장(Fallopia sachalinensis (F.Schmidt) RonseDecr.) 열매 추출물 0.01 중량% 이상을 유효성분으로 함유하되,
상기 왕호장 열매 추출물이 염증반응을 유도하는 리포폴리싸카라이드(LPS)처리 후, NO 생성저해 및 인터루킨(IL)-1β, IL-6, 종양괴사인자-α(TNF-α), 사이클로옥시제나제-2(COX-2) 및 일산화질소합성효소(iNOS) 발현억제의 면역활성에 의한 항노화 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.