KR102374884B1 - 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 출원은 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 출원의 화장료 조성물은 피부 진정 효과가 우수하고, 항산화 활성효과 또는 항염 활성 효과가 우수하다는 장점이 있다.

Description

황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING THE EXTRACT OF DENDROPANAX MORBIFERA AND WILD GINSENG AS ACTIVE INGREDIENT}

본 출원은 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 남녀노소 누구나 스킨이나 로션 혹은 크림이나 에센스 등을 이용하여 피부를 진정시키는 것은 물론 피부 노화를 방지하고자 다양한 화장료를 사용한다.

그 중에서도 산삼은 진세노사이드 Rg5, Rk1, Rh2, Rg3 등 인삼에는 거의 들어있지 않은 사포닌을 비롯하여 Rb1, Rb2, Rh1, Rg1, Rg2 등 미량으로 존재하는 사포닌과 폴리페놀 화합물, 폴리아세틸렌, 알칼로이드, 미네랄(Ge, Se, Mn, V, Ti 등) 등 다양한 영양성분들을 함유하고 있어 피부 진정, 항노화 방지, 항산화 활성, 항염증에 우수한 효과를 가지고 있다.

삼(蔘)은 재배환경에 따른 인위적인 성장과 자연적인 성장의 차이, 육안적 관찰을 통한 형태학적 차이 등에 따라 인삼(人蔘), 산양산삼(山羊山蔘) 및 산삼(山蔘)으로 구분된다. 인삼은 인위적으로 밭이나 논에서 재배한 삼을 말하고, 산양산삼(산양삼)은 인삼이나 산삼의 삼씨나 묘삼(苗蔘)을 인위적으로 산에서 재배한 삼을 뜻한다. 특히, 산삼은 야생에서 자연발생적으로 발아하여 성장한 삼으로 그 종자를 뿌려도 싹이 잘 나오지 않으며 땅 속에서 없어지는 경우가 많고, 자란다고 해도 몇 년을 채 넘기지 못하고 썩어 없어지기 쉽기 때문에 매우 귀하고 고가인 문제점이 있다. 그러므로 산양산삼에 대한 효능 연구가 필요하다.

한편, 천연식물인 황칠나무(Dendropanaxmorbifera Lev.)는 쌍떡잎식물 산형화목 두릅나무과의 난대 상록활엽성 교목인 황칠나무속(Dendaropanax)이다. 황칠나무속(Dendropanax)은 동아시아, 말레이 반도, 중앙 및 남아메리카에 약 30 여종이 분포하고 있으며, 그 중 우리나라에는 전라남도 완도, 보길도, 대흑산도, 어청도 제주도 등지에 자생하고 있다. 본초강목에서 황칠나무가 번열제거, 안질 및 화상치료, 나병에 효과가 있으며 무해하다고 기록되어 있고, 황칠나무의 뿌리와 잎의 줄기는 거풍습, 황멸맥, 풍습 비통, 편두통 월경불순에 효능이 있다고 알려져 있으며, 멜라닌 생합성 저해 효능이 있다고 알려져 있다. 또한, 최근 관심을 받고있는 잎, 줄기 등에 함유된 성분의 약리 효능 또는 기능성과의 관련성 혹은 유효성분의 측면에서 연구가 미비하다.

따라서, 모양이나 약효면에서 자연산 산삼과 거의 비슷한 효과를 지니는 산양삼과 황칠나무에 대한 연구가 필요하다.

한국등록특허 제10-0538078호 (2005.12.21. 공고)

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 하는 항산화용 또는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는, 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물의 중량비는 10:90 내지 90:10일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물은, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 수액 및 내수피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상에서 추출된 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은, 상기 황칠나무 추출물의 제조과정에서 생성된 부산물을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은, 물 또는 유기 용매를 이용하여 추출되는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 유기 용매는, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 메틸렌클로라이드 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은, 80℃ 내지 120℃에서 30분 내지 6시간 동안 추출되는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은, 조성물 총 중량을 기준으로 0.005중량% 내지 30중량%의 농도로 포함되는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 피부 진정용인 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 항산화용 또는 항염증용인 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물은 피부 진정 효과가 우수하다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물은 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거 활성이 높아 항산화 효과 또는 항염 활성 효과가 우수하다는 장점이 있다.

도 1a은 산양삼과 황칠나무의 용매별 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이고, 도 1b는 산양삼과 황칠나무의 용매별 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 2a는 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 배합비별 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이고, 도 2b는 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 2의 배합비별 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 4 내지 7 및 비교예 4 내지 7의 RAW264.7 세포 독성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 4 내지 7 및 비교예 3의 RAW264.7 세포를 이용한 NO 저해활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 4 내지 7 및 비교예 3의 RAW264.7 세포를 이용한 PGE2 저해활성 측정 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원의 하나의 실시예는, 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에 있어서 용어 '유효성분'이라 함은 손상된 피부의 재생을 촉진하거나, 주름을 개선하거나, 탄력을 증진시키거나, 항산화 효과, 항염증 효과, 피부 진정 효과, 미백 효과 또는 피부 재생 효과를 나타낼 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 출원의 조성물에 포함되는 상기 추출물의 함량은 조성물이 제품화되는 형태, 상기 조성물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물의 중량비는 10:90 내지 90:10, 더 구체적으로 20:80 내지 80:20, 더욱 더 구체적으로 25:75 내지 75:25 인 것일 수 있다. 상기 황칠나무 추출물에 대한 산양삼 추출물의 중량비가 1/9배 내지 9배인 것이 피부 진정 활성, 항산화활성 또는 항염증 활성이 커지는 장점이 있다.

또한, 상기 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물을 혼합한 경우가 각각을 단독으로 포함하는 경우보다 피부 진정 활성, 항산화활성 또는 항염증 활성이 더 커지는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물은, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 수액 및 내수피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것에서 추출되는 것일 수 있다.

상기 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 수액 및 내수피를 분쇄하여 용매와 혼합한 후 여액을 얻고, 상기 얻어진 여액을 여과한 후 여과물을 원심분리하여 상등액을 수득하며, 수득된 상기 상등액을 다시 여과하여 분리된 세포 외 베지클 또는 추출물을 수득할 수 있다.

구체적으로, 상기 추출물이 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 수액 및 내수피로 이루어진 군에서 둘 이상이 선택될 때, 하나는 수액일 수 있고, 나머지는 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자 및 내수피와 같은 고체 추출물일 수 있다.

더 구체적으로, 황칠나무 추출물로 수액과 잎 또는 수액과 줄기가 선택되어지면 잎과 줄기가 수액과 혼합되어 용매로 추출되므로 산양삼 추출물과의 혼합시 유효성분이 뭉치지 않고, 균일하게 혼합될 수 있다는 장점이 있다.

한편, 산양삼 추출물은 산양삼 또는 산양삼으로부터 추출될 수 있는 진세노사이드 Rg5, Rk1, Rh2, Rg3, 사포닌을 비롯하여 Rb1, Rb2, Rh1, Rg1, Rg2 등 미량으로 존재하는 사포닌과 폴리페놀 화합물, 폴리아세틸렌, 알칼로이드, 미네랄 등의 성분일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은, 상기 황칠나무 추출물의 제조과정에서 생성된 부산물을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 부산물은 분말이거나 진액의 형태일 수 있고, 예를 들어, 목질(줄기나 가지) 및 잎의 분말, 진액 형태의 수액 또는 분말과 진액의 혼합물일 수 있다. 상기 황칠나무 추출물의 추출시 진액 형태의 수액이 포함되면 점도가 높은 액상형 추출물이 추출 될 수 있다. 상기 부산물은, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물이 일정한 배합비로 혼합된 이후에 첨가 될 수 있으며, 부산물을 더 포함함으로써, 균일한 화장료 조성물을 제조할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은, 물 또는 유기 용매를 이용하여 추출되는 것일 수 있다.

상기 물은 증류수일 수 있고, 초음파 또는 열수 추출법을 이용하여 추출할 수 있다. 열수 추출법을 이용하면 고온에서도 유효성분이 불활성화되지 않도록 추출할 수 있다는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 유기용매는, 에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 메틸렌클로라이드 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 유기 용매는 에탄올일 수 있으며, 초음파 또는 환류 추출법을 이용하여 추출할 수 있다. 환류 추출법을 이용하면 빠른 건조로 제조속도가 단축되는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 및 산양삼 추출물은, 80℃ 내지 120℃에서 30분 이상, 더 구체적으로 2시간 이상, 6시간 이하, 더 구체적으로 3시간 이하의 시간 동안 추출되는 것일 수 있다.

상기 추출물의 추출 온도가 80℃ 미만이면 추출물이 완전히 추출되지 않을 수 있고, 120℃를 초과하면 상기 황칠나무 및 산양삼의 유효성분들이 불활성화되어 피부 진정, 항산화 또는 항염증 효과가 감소할 수 있다.

또한, 상기 추출물의 추출 시간이 30분 미만이면 추출물의 양이 소량일 수 있고, 6시간을 초과하면 추출물이 변성될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은, 조성물 총 중량을 기준으로 0.005중량% 이상, 구체적으로 0.5 중량% 이상, 더 구체적으로 5중량% 이상, 30중량% 이하, 구체적으로 15 중량% 이하로 포함되는 것일 수 있다.

상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물의 농도가 0.005중량% 미만이면 피부 진정 활성, 항산화 활성 또는 항염증 활성이 작을 수 있고, 30중량%를 초과하면 함량의 증가에 비해 활성에 차이가 없을 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 피부 진정용인 것일 수 있다.

본 출원에 있어서 용어 ‘피부 진정’이라 함은 자극받은 피부의 열감이나 통증 따위를 가라앉히고 안정되게 하는 것으로, 자외선으로부터 유발되는 피부세포 자극으로 인한 스트레스에 대하여 진정효과를 가지며, 피부노화 원인을 억제하여 피부를 보호할 수 있고, 피부노화의 근본적인 원인을 억제하여 피부를 개선시킬 수 있는 것을 말한다. 따라서, 본 출원의 화장료 조성물은 피부에 대한 독성이 전혀 없어 안정성이 매우 우수하고, 세포의 손상이 감소하는 장점이 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은 항산화용 또는 항염증용인 것일 수 있다.

본 출원에 있어서 용어 ‘항산화’라 함은 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성 산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 출원에 있어서 용어 ‘항염증’이라 함은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 아토피성 피부염, 건선, 알러지성 피부염, 접촉성 피부염 및 습진을 포함한다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 상기 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 출원의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데 이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤지방족에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검 등이 이용될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족알코올설페이트, 지방족알코올에테르설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드에테르설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예, 비교예, 실험예들을 통해서 본 출원을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 하기 예들은 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위를 제한하는 것은 아니다.

< 제조예 1> 추출물의 용매 조건 확립

(1) 용매별 추출물의 제조

산양삼과 황칠나무의 잎 건조물을 각각 에탄올과 증류수의 비율을 달리하여 동일한 조건으로 추출하였다. 열수 추출은 각 건조 원료 50g을 증류수 500ml에 첨가하여 100℃에서 3시간 동안 추출 후 1um 종이 필터로 여과하였다. 50% 에탄올 추출은 각 건조 원료 50g을 50% 에탄올 500ml에 첨가하여 85℃에서 3시간 동안 환류 추출 후 1um 종이 필터로 여과하였다. 100% 에탄올 추출은 각 건조 원료 50g을 100% 에탄올 500ml에 첨가하여 75℃에서 3시간 동안 환류 1um 종이 필터로 여과하였다.

(2) 용매별로 제조된 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH assay를 Yoshida et al. (1989)이 사용한 방법에 따라 측정하였다.

96well plate에 control에는 추출물을 추출한 용매를 100㎕, 시험군에는 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물을 100㎕ 씩 각각 넣는다. 모든 well에 50㎕의 DPPH (0.5 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)/ethanol) 용액을 가하여 혼합한다. 25℃의 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정한다.

용매별로 제조된 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성도를 알아보기 위해 수학식 1에 따라 용매만을 첨가한 대조군에 대한 추출물의 백분율로 계산하여 표 1와 도 1a에 나타내었다.

[수학식 1]

시료명 (원액)		DPPH 라디칼 소거능(%)
시료명	추출용매
산양삼	열수추출	59.4 ± 1.0
	50% 에탄올 추출	61.4 ± 1.0
	100% 에탄올 추출	61.1 ± 1.9
황칠	열수추출	58.6 ± 3.3
	50% 에탄올 추출	63.5 ± 3.0
	100% 에탄올 추출	65.1 ± 2.0

산양삼 추출물 및 황칠나무 추출물에 대해 각각 열수추출, 50% 에탄올 추출 및 100% 에탄올 추출의 용매혼합비에 따른 DPPH 라디칼 소거 활성능을 비교한 결과, 상기 표 1에서 산양삼 추출물과 황칠나무 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성능은 모든 추출 용매에서 유사한 활성을 나타냈다.

(3) 용매별로 제조된 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS radical 소거 활성은 Reet al. (1999)의 방법을 변형하여 측정하였다.

즉, 7mM ABTS 5mL와 140mM potassium persulfate 88㎕를 섞은 후 상온에서 16 시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 상기 용액을 414nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 PBS로 희석하였다. 조제된 희석용액 190㎕와 시료 10㎕를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다.

용매별로 제조된 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성도를 알아보기 위해 수학식 2에 따라 용매만을 첨가한 대조군에 대한 추출물의 백분율로 계산하여 표 2와 도 1b에 나타내었다.

[수학식 2]

시료명 (10배 희석액)		ABTS 라디칼 소거능(%)
시료명	추출용매
산양삼	열수추출	59.4 ± 1.0
	50% 에탄올 추출	47.8 ± 2.1
	100% 에탄올 추출	41.2 ± 1.7
황칠	열수추출	45.5 ± 1.3
	50% 에탄올 추출	47.9 ± 1.1
	100% 에탄올 추출	46.2 ± 2.0

산양삼 추출물 및 황칠나무 추출물에 대해 각각 열수추출, 50% 에탄올 추출 및 100% 에탄올 추출의 용매혼합비에 따른 ABTS 라디칼 소거능을 비교한 결과, 상기 표 2에서 황칠나무 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성은 모든 추출 용매에서 유사한 활성을 나타냈으나, 산양삼의 ABTS radical 소거 활성은 열수추출물이 50% 에탄올 추출물과 100% 에탄올 추출물에 비해 약 1.2배 우수한 활성을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.

(4) 추출물의 용매 조건 확립

용매별 추출물의 제조 결과, DPPH 라디칼 소거 활성에서 산양삼 및 황칠나무 추출물의 모든 추출 용매는 유사한 소거 활성을 나타내었다. ABTS 라디칼 소거 활성에서 황칠나무 추출물의 모든 추출 용매는 유사한 활성을 나타내었으나, 산양삼의 경우 증류수(열수추출물)에서 가장 높은 소거 활성을 나타내었다.

따라서, 최종 추출 용매는 ABTS radical 소거 활성이 우수한 증류수(열수 추출물)로 진행하였다.

< 제조예 2> 추출물의 배합 조건별 복합 추출물의 제조

(1) 배합 조건별 복합 추출물 제조

산양삼 열수 추출물과 황칠 열수 추출물을 각각 표 3의 비율로 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.

	배합비	산양삼 열수 추출물(%)	황칠 열수 추출물(%)
비교예 1	100:0	100	0
실시예 1	75:25	75	25
실시예 2	50:50	50	50
실시예 3	25:75	25	75
비교예 2	0:100	0	100

(2) 배합 조건별로 제조된 복합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거 활성 측정 방법은 <제조예 1>의 (2)인 DPPH radical scavenging 측정법과 동일한 방법으로 진행하여 배합 조건별로 제조된 복합 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 하기 표 4 및 도 2a에 나타내었다.

시료설명		DPPH 라디칼 소거능(%)
시료명	농도 (%)
비교예 1	10	19.4 ± 4.2
	20	29.6 ± 1.7
	50	37.8 ± 2.0
	100	44.8 ± 2.4
실시예 1	10	24.4 ± 4.5
	20	39.3 ± 4.6
	50	51.1 ± 2.4
	100	68 ± 3.2
실시예 2	10	27.7 ± 4.3
	20	39.5 ± 0.3
	50	50.7 ± 1.3
	100	68.3 ± 1.3
실시예 3	10	27.7 ± 4.6
	20	39.4 ± 1.4
	50	53.1 ± 1.3
	100	71.9 ± 5.0
비교예 2	10	18.9 ± 1.7
	20	33.7 ± 4.5
	50	43.7 ± 0.7
	100	58 ± 2.3

상기 표 4에서 산양삼 열수 추출물과 황칠 열수 추출물의 복합 추출물이 산양삼 및 황칠 열수 추출물 각각의 활성과 비교하여 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였다.

(3) 배합 조건별로 제조된 복합 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거 활성 측정 방법은 제조예 1의 (3)인 ABTS radical scavenging 측정법과 동일한 방법으로 진행하여 배합 조건별로 제조된 복합 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 하기 표 5 및 도 2b에 나타내었다.

시료설명		ABTS 라디칼 소거능(%)
시료명	농도 (%)
비교예 1	2	15.8 ± 2.1
	5	21.4 ± 2.6
	10	62.3 ± 2.3
실시예 1	2	19.9 ± 1.2
	5	27.1 ± 1.6
	10	74.6 ± 2.2
실시예 2	2	18.1 ± 1.5
	5	27.2 ± 1.2
	10	76.4 ± 1.2
실시예 3	2	16.3 ± 1.3
	5	25.8 ± 0.2
	10	76 ± 1.7
비교예 2	2	14.3 ± 0.5
	5	18.7 ± 1.7
	10	38.5 ± 2.1

상기 표 5에서 산양삼 열수 추출물과 황칠 열수 추출물을 포함하는 복합 추출물이 산양삼 및 황칠 열수 추출물 각각의 활성과 비교하여 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하는 것을 확인하였다.

(4) 복합 추출물 제조의 배합비 조건 확립

제조예 2에 따른 배합비별 복합 추출물의 제조 결과, 산양삼 열수 추출물과 황칠 열수 추출물은 단일 추출물보다 혼합하였을 때 증가하는 효과를 확인하였다.

산양삼 추출물 및 황칠나무 열수 추출물의 배합비 25:75, 50:50 및 75:25는 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성에서 유의적인 차이가 없었다.

< 실험예 1> RAW264 .7 세포주에서의 세포 독성 측정

산양삼 및 황칠나무 추출물의 각 건조 원료 50g을 증류수 500ml에 첨가하여 100℃에서 3시간 동안 열수 추출하였다. 추출 이후에 1um 종이 필터로 여과하였다. 산양삼 및 황칠나무 열수 추출물을 25:75의 배합비로 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다. 상기 복합 추출물의 시료를 0.005%(실시예 4), 0.01%(실시예 5), 0.02%(실시예 6), 0.05%(실시예 7)로 포함하여 조성물을 제조하였다.

양성대조군으로, 항염 활성이 우수하다고 알려져 있는 감초 추출물도 같은 농도의 비교예 4 내지 비교예 7로 제조하였다.

상기 실시예 4 내지 7과 비교예 4 내지 7에 대하여 세포주 RAW264.7의 생존율을 측정하였다. 세포주 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA) 시약을 이용하였다. 시약 1 ml에 배지(DMEM high glucose, free FBS) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 표 6 및 도 3에 나타내었다.

시료명	시료 농도 (%)	세포독성 (%)
Control	-	100.0± 7.6
실시예 4	0.005	102.2 ± 10.9
실시예 5	0.01	96.9 ± 6.1
실시예 6	0.02	99.0 ± 10.8
실시예 7	0.05	87.8 ± 9.2
비교예 4	0.005	96.2 ± 9.9
비교예 5	0.01	104.2 ± 3.4
비교예 6	0.02	99.5 ± 8.1
비교예 7	0.05	103.2 ± 7.6

<실험예 2> RAW264.7 세포주에서의 NO 저해 활성 측정

실시예 4 내지 7과 비교예 3의 항산화 활성 또는 항염 활성도를 평가하기 위해 RAW264.7 세포주에서의 NO 저해 활성 측정을 실험하였다.

실험에 사용한 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA(PBS-EDTA)로 세척한 후, 배지 1~2ml을 dish에 분주하고, scrapper를 이용하여 dish 바닥에 부착되어있는 세포를 긁어 세포를 떼어내 계대 배양하였으며, 배지는 48 시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

배양한 대식세포(RAW264.7)에 염증을 유발하기 위하여 1㎍/ml Lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 함께 처리하였다.

항염증 효능의 측정은 대식세포주에 LPS를 처리하여 LPS 만을 처리한 군의 NO 생성량에 대한 LPS 와 함께 시료를 처리한 군의 NO 생성량을 측정하여 실시예 4 내지 7과 비교예 3이 NO 생성 저해 효능을 가지는 지를 측정하였다.

NO 생성량은 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. Griess 시약은 2.5%의 phosphate 용액에 1% sulfanilamide와 0.1% naphthylethylene-diamine-di-hydrochloride를 혼합하여 만들었다. 상기 배양한 세포의 상등액 50㎕를 96 well plate에 취하고 여기에 Griess 시약 50㎕를 가해 15분 동안 실온에서 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하여 RAW264.7 세포주에서의 NO 저해 활성을 표 7 및 도 4에 나타내었다.

시료명	시료 농도 (%)	LPS 처리 (1 ㎍/ml)	NO 함량 (μM)	NO 함량 (%)
Control	-	-	7.65 ± 0.10*	42.43 ± 0.57*
Control	-	+	18.03 ± 0.31	100.00 ± 1.70
실시예 4	0.005	+	16.82 ± 0.10*	93.32 ± 0.54*
실시예 5	0.01	+	14.77 ± 0.12*	81.95 ± 0.65*
실시예 6	0.02	+	12.71 ± 0.10*	70.51 ± 0.54*
실시예 7	0.05	+	9.29 ± 0.54*	51.53 ± 2.98*
비교예 3	1	+	12.30 ± 0.36*	70.47 ± 2.07*

상기 <표 7>에 나타난 바와 같이, 실시예 7은 1 ㎍/ml로 LPS 처리한 control군 대비 NO 함량이 51.53%로 나타나 우수한 NO 저해활성을 보였다.

반면에, 시료 농도가 1%의 농도인 비교예 3은 LPS 처리한 control군 대비 NO 함량이 70.47%로 시료 농도가 0.02%인 실시예 6의 활성과 비슷한 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 출원의 일 실시예는 비교예와 비교했을 때, 높은 NO 저해활성을 가지고, 우수한 항산화 활성 또는 항염 활성도를 나타내는 것을 알 수 있다.

<실험예 3> RAW264.7 세포주에서의 PGE2 저해 활성 측정

실시예 4 내지 7과 비교예 3의 항산화 활성 또는 항염 활성도를 평가하기 위해 RAW264.7 세포주에서의 PGE2(Prostaglandin E2) 저해 활성 측정을 실험하였다.

실험에 사용한 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Lonza, Valais, Switzerland) medium을 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 습도 95%, 5% CO2, 37℃로 조절된 배양기에서 배양하였으며, 이때 미생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA(PBS-EDTA)로 세척한 후 배지 1~2ml을 dish에 분주한 후 scrapper를 이용하여 dish 바닥에 부착되어있는 세포를 긁어 세포를 떼어내 계대 배양하였으며, 배지는 48 시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

대식세포(RAW264.7)에 염증을 유발하기 위하여 1㎍/ml Lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich, MO, USA)와 함께 시료를 처리하였다.

PGE2(Prostaglandin E2)의 측정은 Prostaglandin E2 EIA Kit를 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, Michigan, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 측정 방법은 제조회사의 분석방법에 따라 정량하였다. 즉, RAW264.7 세포에 농도별 시료 및 LPS(1㎍/㎖)를 24시간 전 처리 후 세포 배양 상층액을 PGE2 측정에 사용하였다. 배양액을 goat anti-mouse로 coating 된 96 well plate에 각각 배양액을 50㎕씩 loading 하였다. 이후 primary antibody solution 50㎕와 PGE2 conjugate 50㎕씩 첨가하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, Washing buffer로 5회 세척 한 후 Ellman's reagent을 200㎕씩 처리하여 60-90분간 교반하면서 반응 시킨 후, 420nm에서 흡광도를 측정하여 표 8 및 도 5에 나타내었다.

시료명	시료농도 (%)	LPS 처리 (1 ㎍/ml)	PGE2 (pg/g of protein)	PGE2 (%)
Control	-	-	69.96 ± 2.48*	30.94 ± 1.09*
Control	-	+	226.14 ± 3.92	100.00 ± 1.73
실시예 4	0.005	+	197.37 ± 5.42*	87.28 ± 2.39*
실시예 5	0.01	+	158.22 ± 2.17*	69.97 ± 0.96*
실시예 6	0.02	+	132.16 ± 4.65*	58.44 ± 2.06*
실시예 7	0.05	+	96.83 ± 1.08*	42.82 ± 0.48*
비교예 3	1	+	132.97 ± 6.43*	58.80 ± 2.84*

상기 <표 8>에 나타난 바와 같이, 실시예 7은 1 ㎍/ml로 LPS 처리한 control군 대비 PGE2 함량이 42.82%로 나타나 우수한 PGE2 저해 활성을 보였다.

반면에, 시료 농도가 1%의 농도인 비교예 3은 LPS 처리한 control군 대비 PGE2 함량이 58.80%로 시료 농도가 0.02%인 실시예 6의 활성과 비슷한 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 실시예들은 비교예와 비교했을 때, 높은 PGE2 저해활성을 가지고, 우수한 항산화 활성 또는 항염 활성도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

하기에 본 발명에 따른 화장료 조성물의 제형예를 설명하나, 하기 예시 이외에도 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제형예 1> 유연 화장수( 스킨 로션 )

하기 표 9에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3	10
글리세린	3.5
올레일알코올	1.5
에탄올	5.5
폴리솔베이트 80	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

< 제형예 2> 영양 화장수( 밀크 로션)

하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3	10
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

< 제형예 3> 영양 크림

하기 표 11에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 3	10
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

이상으로 본 출원의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 출원의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 출원의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

1. 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은,
   조성물 총 중량을 기준으로 0.005중량% 내지 30중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 황칠나무 추출물과 산양삼 추출물의 중량비는 10:90 내지 90:10인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은,
   잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 수액 및 내수피로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상에서 추출된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 조성물은,
   상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물의 제조과정에서 생성된 부산물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은,
   물 또는 유기 용매를 이용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 유기 용매는,
   에탄올, 메탄올, 부탄올, 헥산, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 메틸렌클로라이드 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 청구항 5에 있어서,
   상기 황칠나무 추출물 및 산양삼 추출물은,
   80℃ 내지 120℃에서 30분 내지 6시간 동안 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 피부 진정용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
10. 청구항 1에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 항산화용 또는 항염증용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
    

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