KR101829209B1 - 산수유 추출물을 함유하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산수유 또는 그 추출물을 함유하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 피부홍조 또는 안면홍조의 개선에 탁월한 효과를 발휘한다.

Description

산수유 추출물을 함유하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition with the extract of Cornus officinalis for the improvement of skin redness or face redness}

본 발명은 산수유 또는 그 추출물을 함유하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부홍조(skin redness) 또는 안면홍조(face redness)로 불리는 피부 붉음증은, 주로 갱년기 증후군의 일종으로 알려져 있으나, 이외에도 햇빛, 열, 스트레스 등에 민감하게 반응하여 피부색이 붉어지는 증상을 통칭하여 말한다.

피부홍조(또는, 안면홍조)는 온도 변화가 심하고 건조해지는 초겨울에 증상이 가장 심해지며, 최근에는 10~20대 여성뿐만 아니라 남성 피부홍조도 늘어나고 있는 추세이다. 계절 변화 때문에 잠깐 나타났다가 없어지는 피부 트러블이라면 크게 걱정할 필요가 없지만, 잘못된 관리로 방치할 경우, 주사(rosacea), 모세혈관확장증(telangiectasis)과 같은 심각한 피부 질환으로 발전할 수 있다.

피부가 붉어지는 것은 혈관신생인자(angiogenic factor)에 의해 유발되는 것으로 보고되어 있다. VEGF(vascular endothelial growth factor)는 혈관신생을 유도하는 대표적 혈관생성인자로서, 신생혈관생성(angiogenesis) 뿐만 아니라, 혈관확장(vasodailation) 및 배아발생에서 혈관발달(vasculogenesis)을 조절하는 중요한 인자이다.

한편, 자외선과 같은 외부자극에 의해서 VEGF의 발현이 높아지는 것으로 알려져 있다. 분비된 VEGF는 혈관내피세포 표면에 존재하는 VEGF 수용체에 결합하여 혈관내피세포의 증식과 세포외기질분해효소의 분비를 촉진시켜, 혈관내피세포의 이동에 관여하는 기전 및 혈관내피세포의 부착 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

신생혈관생성(angiogenesis)은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 만들어지는 과정이다. 혈관을 구성하고 있는 혈관내피세포의 이동과 세포 간 장벽인 세포외기질(ECM)을 통과하는 침윤반응, 혈관을 이루는 세포의 성장 및 혈관 모양이 만들어지는 분화(Tube-like formation)의 단계를 포함한다.

정상상태에서는 혈관신생 유도물질과 억제물질(angiogenesis inhibitors)간의 평형이 유지되다가 평형이 깨지면 신생혈관생성이 발생하게 된다. 신생혈관생성은 피부홍조, 안면홍조 이외에도 피부노화, 상처치유, 기미, 다크써클, 모발에도 영향을 미친다고 알려져 있다.

한편, 외부 자극에 의해 피부 장벽 기능이 손상되면, 과도한 염증과 면역 반응이 일어나게 되고, 손상된 조직 및 세포에서 VEGF를 비롯한 다양한 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장인자 (growth factor)의 분비가 증가한다. 이를 통해 다양한 면역세포가 혈관 및 림프관을 통해 해당 조직에 모이면서 염증반응이 일어나게 된다.

분비된 VEGF로 인해 발생한 신생혈관형성과 혈관투과성 증가는 다양한 면역세포가 혈관을 통해 손상된 조직으로 모이게 되는 과정을 촉진시키며, 지속적으로 발생하게 되면 만성염증으로 이어지게 된다. 이런 기전을 통하여 피부가 붉게 보이고, 심할 경우 피부 표면으로 미세혈관이 보이는 현상이 나타나게 되는 것이다.

대한민국 특허공개번호 제10-2014-0091543호 (공개일자 2014. 07. 21)에는, 알파 아드레날린성 수용체 작용제를 포함하는 조성물을 안면피부에 국부적으로 적용함으로써, 포스포디에스터레이즈타입-5-억제제(PDE5)에 의한 안면피부의 홍조를 경감시키는 방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2015-0108371호 (공개일자 2015. 09. 25)에는, 잔토자일룸 피페리툼(일본 '페퍼'라고도 함) 종자 또는 종자 추출물을 함유하는 안면홍조를 제어하기 위한 기능성 식품이 기재되어 있다.

본 발명에서는 안면홍조 또는 피부홍조를 개선할 수 있는 천연물 유래의 소재를 발굴하고, 이를 화장료 조성물로 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 산수유 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

산수유(Cornus officinalis)는 층층나무과(Cornaceae)에 속하는 낙엽활엽 소교목으로, 산수유 열매의 육질을 건조한 것이다. 성질은 약간 따뜻하고, 맛은 시고 떫으며, 독이 없다. 타원형의 핵과로서 처음에는 녹색이었다가 8~10월에 붉게 익는다. 과육(열매)에는 코르닌(cornin), 모로니사이드(morroniside), 로가닌(loganin), 탄닌(tannin), 사포닌(saponin) 등의 배당체와 포도주산, 사과산, 주석산 등의 유기산이 함유되어 있다.

산수유는 10월 중순의 상강 이후에 수확하는데, 육질과 씨앗을 분리하여 육질은 술과 차 및 한약의 재료로 사용한다. "동의보감" "향약집성방" 등에 의하면 강음(强陰), 신정(腎精)과 신기(腎氣)보강, 수렴 등의 효능이 있다고 한다. 또한, 유해산소 제거 효과도 우수하여 피부를 새건해 주는 효과도 갖는다. 두통, 이명(耳鳴), 해수병, 해열, 월경과다 등에 약재로 쓰이며, 식은땀, 야뇨증 등의 민간요법에도 사용된다.

한편, 본 발명의 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 산수유 추출물은 바람직하게 산수유에 에탄올을 용매로 가하여 추출한 추출물을 사용하는 것이 좋다. 이때, 상기 에탄올은, 더욱 바람직하게 70% 에탄올인 것이 좋다.

한편, 본 발명의 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부홍조 또는 안면홍조 개선은, 바람직하게 혈관신생인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)의 발현 억제를 통한 것일 수 있다.

본 발명의 산수유 또는 이의 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부홍조 또는 안면홍조의 개선에 탁월한 효과를 발휘한다.

도 1은 산수유 추출물의 세포 독성 평가 결과이다.
도 2는 산수유 추출물 처리가 VEGF의 분비를 억제하는 것을 보여준다.
도 3은 산수유 추출물의 처리가 VEGF 처리에 의해 증가한 NO의 생성량을 감소시키는 것을 보여준다.
도 4는 산수유 추출물의 처리가 VEGF 처리에 의해 유발된 eNOS의 활성을 감소시키는 것을 보여준다.
도 5는 산수유 추출물의 처리가 VEGF의 처리에 의해 유발된 내피세포의 성장을 억제하는 것을 보여준다.
도 6은 산수유 추출물의 처리가 VEGF의 처리에 의해 유발된 신생혈관생성을 억제하는 것을 보여준다.

피부가 UV를 비롯한 다양한 자극원에 노출될 경우, VEGF의 발현이 높아지며, 높아진 VEGF는 신생혈관생성 및 혈관확장에 중요한 역할을 한다. 그런데, 본 발명에서 확인한 바에 의하면, 산수유 추출물 처리에 의해 VEGF 발현이 감소함을 확인할 수 있었고, 산수유 추출물을 처리한 군에서 신생혈관생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

한편, UV 등에 의해 증가된 VEGF는 eNOS(endothelial NOS)의 활성을 통해 NO 생성률을 높이며, 이 인자들을 조절함으로써, 신생혈관생성 및 혈관확장 기전에 관여한다. 하지만, 본 발명의 산수유 추출물을 처리할 경우, VEGF에 의해 증가한 NO의 생성 양이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, 산수유 추출물이 eNOS의 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하였는데, 산수유 추출물의 처리가 VEGF 처리에 의해 유발된 eNOS의 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

한편, VEGF는 신생혈관생성 및 혈관확장 외에 내피세포의 성장 및 이동을 촉진하는 것으로 보고되어 있다. 본 발명에서 산수유 추출물의 내피세포 성장 억제능을 확인해 보았는데, 산수유 추출물을 처리한 군에서 내피세포의 성장이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[실시예 1: 산수유 추출물의 제조]

건조된 산수유를 분쇄하여 준비한 혼합 분말 25 g에 용매인 70% 에탄올 500 ㎖를 첨가한 후, 교반기 (제조사: Heidoph, 규격: MR3001, MR3001K)를 이용하여 500 rpm으로 3시간 동안 교반 및 추출하였다. 추출 후, 여과지로 추출용액을 여과하여 회수한 여과액을 농축기 (Heidolph, LABOROTA 4000)를 이용하여 45℃에서 감압 농축하여 혼합 추출물을 수득하였다. 하기 실험에서는 상기의 과정을 통해 수득한 추출물을 시료로 사용하였다.

[실험예 1: 세포 독성 평가]

본 실험예에서는 산수유 추출물에 대한 세포 독성 평가를 MTT 어세이를 통해 평가하였다.

인간 유래 섬유아세포(HDF)와 내피세포(HUVEC)를 96웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 배양한 후, 상시 실시예 1에서 제조된 산수유 추출물을 상기 96웰 플레이트의 각 웰에 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕씩 넣고, 24시간 배양하였다.

24시간 후, 각 웰에 5 mg/㎖의 농도로 PBS에 희석된 MTT용액을 20 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 배양하고, 이소프로판올(isopropanol) 100 ㎕로 용출시켜 ELISA 리더 (VICTOR3, Perkin Elmer)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험군 (시료 처리군)과 대조군 (시료 무처리군)에 대한 흡광도를 측정하고, 세포독성 평가능으로 환산하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 여기서, 세포 생존률(%)은 하기의 수학식 1에 의하여 구하였다.

실험결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이, 산수유 추출물은 시험 농도 범위에서 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다 (도 1). 도 1은 산수유 추출물의 세포 독성 평가 결과이다.

[실험예 2: 산수유 추출물의 혈관신생인자(VEGF) 발현 조절능 확인]

피부가 UV를 비롯한 다양한 자극원에 노출될 경우, VEGF의 발현이 높아지며, 이렇게 발현된 VEGF는 신생혈관생성 과정에 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서, 본 실험예에서는 자외선(UV)에 의한 VEGF의 발현 변화 및 산수유 추출물 처리에 의한 VEGF 발현 조절 여부를 ELISA 방법을 통해 확인하고자 하였다.

HDF 세포를 6-웰 플레이트에 5×10⁵ cell/well이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 가하고 24시간 스타베이션(starvation) 과정을 진행하였다.

24시간 후, DPBS를 이용하여 세척하고, DPBS가 담겨있는 상태에서 UVB (12.5 mJ/cm²)를 조사하였다. UVB 자극을 준 후, 혈청이 포함되지 않은 배지에 100㎕/㎖ 농도로 시료 (실시예 1)를 희석하여 각 플레이트에 2 ml씩 처리하였다. 처리 후, 24시간 추가 배양한 세포배양액을 사용하여 ELSIA 방법 (Human VEGF ELISA assay, R&D system사, DVE00)으로 배양액으로 분비된 VEGF을 측정하였다.

실험 결과, 도 2에서 보듯이, 산수유 추출물 100 ㎕/㎖ 농도에서, VEGF의 분비가 억제됨을 확인할 수 있었다. 도 2는 산수유 추출물의 처리가 VEGF의 분비를 억제하는 것을 보여준다.

[ 실험예 3: 산수유 추출물의 NO 생성 저해능 평가]

증가한 VEGF는 eNOS(endothelial NOS)의 활성을 통해 NO 생성률을 높이며, 이 인자들을 조절함으로써 신생혈관생성 및 혈관확장 기전에 관여하고 있다.

HUVEC를 24-웰 플레이트에 8×10⁵ cell/well이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후, 혈청이 1% 포함된 배지를 이용하여, 24시간 스타베이션(starvation) 과정을 진행하였다.

24시간 후, 혈청이 1% 포함된 배지에 100 ㎕/㎖ 농도가 되도록 시료(실시예 1)를 희석하여 각 플레이트에 500 ㎕씩 처리하였다. 1시간 후, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 VEGF를 처리하였다. 처리 후, 24시간 동안 추가 배양하고, 배양한 세포배양액을 사용하여 ELISA 방법(Griess reagent system, Promega, G2930)으로 배양액에 생성된 NO 생성 정도를 측정하였다.

실험 결과, 도 3에서 보듯이, 산수유 추출물은 VEGF 처리에 의해 증가한 NO의 생성 양을 감소시키는 것으로 확인할 수 있었다. 도 3은 산수유 추출물의 처리가 VEGF 처리에 의해 증가한 NO의 생성량을 감소시키는 것을 보여준다.

[ 실험예 4: 산수유 추출물의 eNOS 활성 억제능 평가]

NO 생성 저해능이 확인된 시료(실시예 1)가 eNOS의 활성에 영향을 미치는지를 웨스턴 블롯 (Western Blot) 기법을 이용하여 확인하였다.

HUVEC를 6-웰 플레이트에 5×10⁵ cell/well이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후, 혈청이 1% 포함된 배지를 이용하여 24시간 스타베이션(starvation) 과정을 진행하였다.

24시간 후, 혈청이 1% 포함된 배지에 100 ㎕/㎖ 농도로 시료(실시예 1)를 희석하여 각 플레이트에 500 ㎕씩 처리하였다. 1시간 후, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 VEGF를 처리하였다. 처리 후, 24시간 추가 배양한 세포로부터 발현된 COX-2 단백질 양을 확인하고자 하였다.

상기에서 배양한 HUVEC를 DPBS로 세척하고, 라이시스 버퍼 (lysis buffer)를 100 ㎕씩 처리한 후, 스크레퍼(scraper)를 이용하여 세포를 회수하였다. 상기에서 회수된 세포를 얼음에 넣고 1시간 동안 반응시킨 후, 4℃, 12,000×g에서 20분간 원심분리를 수행하였다.

상등액을 새 튜브에 옮긴 후, BCA법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 그 후, 단백질, PBS 및 5×샘플버퍼(sample buffer)를 총 부피가 25 ㎕가 되도록 혼합하고, 끓는 물에서 5분 동안 유지하여 단백질을 변성시켰다.

상기에서 제조한 샘플을 SDS 젤에 로딩(loading)하고, 100V로 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 후, 젤에 있는 단백질을 멤브레인(membrane)으로 옮기기 위해 트랜스퍼(Transfer)를 진행하였다. 그 다음 멤브레인에 1차 항체(antibody)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, TBS-T로 5분간 2번 세척(washing)하였다. 그 후, 2차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBS-T로 10분간 4번 세척하였다. 그 후, 멤브레인을 ECL(Enhanced chemiluminescence) 반응을 시키고, 카세트(Cassette)에 멤브레인을 넣고 필름을 이용하여 검출(detection)하였다. 이때, 위와 동일한 방법으로 액틴 항체(actin antibody)를 반응시켜 밴드를 확인하였다.

실험결과, 도 4에서 보듯이, 산수유 추출물을 처리한 군에서 VEGF 처리에 의해 유발된 eNOS의 활성이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다. 도 4는 산수유 추출물의 처리가 VEGF 처리에 의해 유발된 eNOS의 활성을 감소시키는 것을 보여준다.

[ 실험예 5: 산수유 추출물의 내피세포 성장 억제능 확인]

VEGF는 내피세포의 성장 및 이동을 촉진하며, 이를 통하여 신생혈관생성 및 혈관확장의 기전에 관여하고 있다. 이에 본 실험예에서는 산수유 추출물의 내피세포 성장 억제능을 확인하고자 내피세포 성장을 측정하였다.

HUVEC를 6-웰 플레이트에 1×10⁵ cell/well이 되도록 접종한 후, 24시간 배양하였다. 배양 후, 혈청이 1% 포함된 배지를 이용하여 24시간 스타베이션(starvation) 과정을 진행하였다.

24시간 후, 혈청이 1% 포함된 배지에 100 ㎕/㎖ 농도로 시료(실시예 1)를 희석하여 각 플레이트에 500 ㎕씩 처리하였다. 1시간 후, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 VEGF를 처리하였다. 24시간 배양 후, 세포를 떼어내고 티판 블루 (typan blue)와 헤모사이토미터(hemocytometer)를 이용하여 세포 수를 계수하였다.

실험결과, 도 5에서 보듯이, 산수유 추출물을 처리한 군에서 내피세포의 성장이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 도 5는 산수유 추출물의 처리가 VEGF의 처리에 의해 유발된 내피세포의 성장을 억제하는 것을 보여준다.

[ 실험예 6: 산수유 추출물의 신생혈관생성 억제능 확인]

HDF 세포를 커버 슬립 (cover slip)이 깔려 있는 24-웰 플레이트에 5×10⁵ cell/well이 되도록 접종한 후, 3일간 배양하였다. 3일 후, HDF 세포가 접종되어 있는 웰에 HUVEC을 6×10³ cell/well의 농도로 접종하였다. 이때, 배지는 10% 혈청을 포함하는 EBM-2를 이용하였다.

24시간 후, 100 ㎕/㎖ 농도로 시료(실시예 1)를 희석하여 대조군을 제외한 나머지 웰에 넣어주고, 1시간 전처리를 진행하였다. 1시간 후, 최종 농도가 10 ng/ml이 되도록 VEGF를 처리하였으며, 음성대조군으로 수라민(suramin)을 20 μM로 처리하였다. 2~3일에 한 번씩 VEGF와 수라민, 시료가 포함되거나, 포함되지 않은 배지로 교환해 주었다. 약 10일간 배양한 후, 형광염색을 통해 신생혈관생성 억제능을 확인하였다.

실험결과, 도 6에서 보듯이, 산수유 추출물을 처리한 군에서 신생혈관생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 도 6은 산수유 추출물의 처리가 VEGF의 처리에 의해 유발된 신생혈관생성을 억제하는 것을 보여준다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 건조 후 분쇄한 산수유 분말에 20배의 70중량% 에탄올을 첨가하여 혼합물을 제조하는 단계 (a);
   상기 (a) 단계 후, 혼합물을 500 rpm으로 3시간 동안 교반 및 추출하는 단계 (b) 및
   상기 (b) 단계 후, 45℃에서 감압 농축하여 산수유 70중량% 에탄올 추출물을 수득하는 단계 (c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부홍조 또는 안면홍조 개선용 화장료 조성물의 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제

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