KR20240037208A - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물 및 이를 이용한 안면 홍조를 줄이는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 안면 피부에 처리하면 안면의 붉은기를 줄여 안면의 외관을 보기 좋게 하는 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.

Description

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물 {Composition for improving face redness comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient}
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 이용하여, 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 관한 것이다.
사람의 피부에는 혈관들이 분포되어 있다. 사람의 얼굴 피부는 얇고 많은 수의 혈관을 가지고 있어 다른 부위에 비하여 쉽게 붉어진다. 일반적으로 얼굴 피부가 비정상적으로 붉어지는 현상을 안면 홍조(face redness)라고 한다. 안면홍조는 피부미용적인 문제로서, 이를 유발할 수 있는 요인들은 매우 다양하다.
안면 홍조는 갱년기 여성에서 얼굴이 화끈거리면서 흔히 발생하는 증상이지만, 이밖에도 햇빛, 열, 스트레스, 날씨, 음식, 뜨거운 목욕, 약물 등이 원인으로 발생하기도 한다. 안면 홍조가 악화되면 주사(rosacea), 모세혈관확장증(telangiectasis)과 같은 심각한 피부 질환으로 발전할 수 있다.
안면 홍조를 치료 또는 완화시키기 위해 호르몬 처방, 생활습관이나 환경을 변화시키는 방법 등이 제안되고 있다. 그러나 호르몬 치료는 부작용 문제와 사람에 따라 치료 효과가 다른 문제가 있다. 또한 생활습관이나 환경 변화의 방법은 만족할 만한 홍조 개선 효과를 얻기까지 상당한 노력과 시간이 필요하다.
최근에는 천연물을 이용한 안면 홍조 개선제 개발에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 안면 홍조 개선용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 안면 홍조 개선 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 안면 홍조 개선의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다. 또한 식물 추출물을 유효성분으로 포함한 안면 홍조 개선용 기능성 화장품은 피부에 도포한 후 용액이 증발하는 과정에서 이물감이 발생할 수 있고, 효과 지속시간이 짧은 문제가 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 줄기세포 유래의 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 안면에 처리하면 안면의 붉은기가 줄어드는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1563577호 (2015.10.27) 대한민국 등록특허공보 제10-1829209호 (2018.02.14)
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 안면 홍조 개선용 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 이용하여 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물 및 이를 이용한 안면 홍조를 줄이는 미용방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 안면 홍조 개선에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물은, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제를 포함할 수 있다. 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물에 있어서, 상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물은, 상기 동결건조제제와, 희석제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 조성물은 현탁액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물은 마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 피부에 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 안면 홍조 개선 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 안면 붉은기 정도, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 안면 홍조 개선용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(안면 홍조 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 안면 홍조 개선 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법은, (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 안면 홍조 개선용 조성물은 마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 피부에 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법은, (c) 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물이 처리된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 안면 홍조 개선용 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 안면 홍조 개선용 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 안면 홍조 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 안면 홍조를 줄이는 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 안면 피부에 처리하면 안면의 붉은기를 줄여 안면의 외관을 보기 좋게 하는 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 9a 내지 도 9g는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
도 10은 Er:Yag 레이저 빔에 의해 얼굴 홍조를 유발하고 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 1일째 및 3일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다. 도 10A는 실험대상자 1의 눈밑의 붉은기를 측정한 결과 그래프이고, 도 10B는 실험대상자 1의 뺨의 붉은기를 측정한 결과 그래프이다.
도 11은 Er:Yag 레이저 빔에 의해 얼굴 홍조를 유발하고 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 14일째에 눈밑 및 뺨의 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 12는 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 시험대상자 3의 안면에 처리한 후 35일째에 안면의 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 13은 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 시험대상자 4의 안면에 처리한 후 20일째에 안면의 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 14는 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 시험대상자 5의 안면에 처리한 후 28일째에 안면의 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 Er:Yag 레이저 빔 조사로 얼굴 홍조를 유발한 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 실험대상자 6의 얼굴 오른쪽에 도포한 다음 15분 동안 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 후 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 16은 Pico 레이저 빔 조사로 얼굴 홍조를 유발한 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 비타민 C를 실험대상자 7의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고 이온토포레시스를 추가로 수행한 후 18일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 제조과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).
실시예 5: 엑소좀의 동결건조
실시예 5-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITME No.: 34424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 8). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 5-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 엑소좀 제품의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 5-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 5-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 9a 내지 도 9g). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 동결건조 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+
트레할로오스		 메티오닌+
만니톨		 트레할로오스+
만니톨		 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 9a 도 9b 도 9c 도 9d 도 9e 도 9f 도 9g
도 9a 내지 도 9g 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 6: 안면 홍조 개선용 조성물의 1차 안면부 임상 실험
Er:YAG 레이저 장비인 Joule(Sciton, Inc., 미합중국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 어븀 프락셀 레이저(Erbium Fraxel Laser)를 사람의 얼굴에 조사하였다[레이저 파라미터는 다음과 같음: 파장 2940 nm; 파장 에너지 7 J/cm2; 10×10 cm 스캐닝 모드(scanning mode); 1 패스(pass)].
실험대상자 1 및 2의 안면을 깨끗이 닦은 후 30분간 마취제를 안면에 도포하고 어븀 프락셀 레이저를 조사하였다. 레이저 빔 조사로 안면 홍조를 유발한 후 각 실험대상자 얼굴의 오른쪽 절반에는 7.39×108 입자/mL 농도의 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 도포하였고, 각 실험대상자 얼굴의 왼쪽 절반에는 생리적 식염수를 적당량 도포하였다. 그리고 나서 30분 동안 각 실험대상자의 얼굴 위에 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다.
대한민국 경기도 소재의 피에스아이 플러스(주)의 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 각 실험대상자 얼굴의 붉은기(redness)를 측정하였다. 레이저 빔 조사로 안면 홍조를 유발하고 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 각각 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포한 후 1일째 및 3일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 붉은기(redness)를 측정하였다. 각 부위에서 측정된 붉은기의 변화율(% Change of Redness)은 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 변화율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(처치 전 붉은기)]/(처치 전 붉은기)(%). 1일째 및 3일째 측정 결과 모두에서, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 얼굴 부위인 오른쪽 눈밑 부분 및 오른쪽 뺨 부분이 각각 생리적 식염수가 도포된 얼굴 부위인 왼쪽 눈밑 부분 및 왼쪽 뺨 부분에 비해 붉은기(redness)가 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 10A 및 도 10B).
또한, 전술한 바와 같은 방식으로, 레이저 빔 조사로 안면 홍조 유발 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 각각 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포한 후 14일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 붉은기(redness)를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 얼굴 부위인 오른쪽 눈밑 부분 및 오른쪽 뺨 부분이 각각 생리적 식염수가 도포된 얼굴 부위인 왼쪽 눈밑 부분 및 왼쪽 뺨 부분에 비해 붉은기(redness)가 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 11).
상기 실험결과들을 종합하면, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 안면에 처리하면 레이저에 의해 유발된 안면의 붉은기를 유의적으로 감소시키는 것을 알 수 있다. 이는 본 발명의 안면 홍조 개선용 조성물이 안면 홍조 개선을 통해 안면의 외관을 보기 좋게 하는 피부미용 효과를 나타낼 수 있음을 강력히 시사한다.
실시예 7: 안면 홍조 개선용 조성물의 2차 안면부 임상 실험
5×108 입자/vial의 농도로 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 동결건조 제품(실시예 5-1에서 준비된 동결건조 엑소좀)을 정제수와 혼합하여 2 mL의 수용액을 준비하였다. 이와 같이 준비된 줄기세포 유래 엑소좀 함유 안면 홍조 개선용 조성물을 아주 가느다란 니들이 장착된 MTS((Microneedle Therapy System)를 사용하여 안면 홍조 증상이 있는 실험 대상자 3 내지 5의 안면부에 2주 간격으로 2회 적용하였다. MTS 장비로는 대한민국 서울시 강서구 소재의 봄텍전자(주)의 MY-M을 사용하였다.
한편, 본 실시예에서는 실시예 5-1에서 준비된 동결건조 엑소좀을 수용액과 혼합한 후 안면 홍조 개선용 조성물로 사용하였으나, 대안으로 실시예 2에서 준비된 엑소좀(예를 들어, 1×108 입자/mL 농도 이상의 엑소좀)을 주사용수에 현탁한 후 안면 홍조 개선용 조성물로 사용할 수 있음은 물론이다.
대한민국 경기도 소재의 피에스아이 플러스(주)의 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 각 실험대상자 얼굴의 붉은기를 측정하였다. 얼굴 각 부위(이마, 콧등, 좌우 눈밑, 좌우 뺨)에서 측정된 붉은기의 변화율(% Change of Redness)은 실시예 6에 기재된 수식에 의하여 분석하였다.
실험대상자 3의 경우 본 발명의 안면 홍조 개선용 조성물 처치 전의 얼굴 붉은기에 비해 처치 후 35일째에 얼굴 붉은기가 이마, 콧등, 좌우 눈밑 및 좌우 뺨 모두에서 유의적으로 감소한 것이 확인되었다(도 12). 또한, 실험대상자 4의 경우에는 본 발명의 안면 홍조 개선용 조성물 처치 전의 얼굴 붉은기에 비해 처치 후 20일째에 얼굴 붉은기가 콧등, 좌측 눈밑 및 좌우 뺨에서 유의적으로 감소한 것이 확인되었다(도 13). 실험대상자 5의 경우에도 본 발명의 안면 홍조 개선용 조성물 처치 전의 얼굴 붉은기에 비해 처치 후 28일째에 얼굴 붉은기가 이마, 좌우 눈밑 및 좌우 뺨에서 유의적으로 감소한 것이 확인되었다(도 14).
상기 실험결과들을 종합하면, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 안면 피부에 처리하면 안면의 붉은기를 유의적으로 감소시켜 안면 홍조 개선을 통해 안면의 외관을 보기 좋게 하는 피부미용 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 안면 홍조 개선용 조성물의 3차 안면부 임상 실험
실시예 6에 기술된 방식과 동일한 방식으로, 레이저 빔으로 안면 홍조를 유도한 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀(7.39×108 입자/mL 농도)을 실험대상자 6의 얼굴 오른쪽에 도포하였다. 오른쪽 얼굴에는 15분 동안 이온토포레시스를 수행하였고 왼쪽 얼굴 위에는 15분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다. 이온토포레시스는 이온토포레시스 장비(IONZYME)(Environ에서 구입)를 사용하여 줄기세포 유래의 엑소좀이 도포된 오른쪽 얼굴에 15분 동안 0.5 mA의 미세전류를 흘려주는 방식으로 수행하였다. 실시예 6에 기재된 방식으로 처치 전후의 오른쪽 얼굴과 왼쪽 얼굴의 붉은기를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀을 얼굴에 도포한 후 이온토포레시스를 수행할 경우 단순히 러버 마스크를 적층하여 눌러 주는 것에 비해 붉은기가 바로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 15).
상기 실험결과에 따르면, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 안면 피부에 처리하고 이온토포레시스를 수행하면 안면의 붉은기를 즉시 현저하게 감소시켜 안면 홍조 개선 효과를 보다 극대화시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9: 안면 홍조 개선용 조성물의 4차 안면부 임상 실험
Pico 레이저 장비인 피코플러스(주식회사 루트로닉, 대한민국 경기도 소재)를 사용하여 Pico 레이저를 사람의 얼굴에 조사하여 안면 홍조를 유도하였다[레이저 파라미터는 다음과 같음: 파장 1064 nm; 파장 에너지 0.7 J/cm2; 레이저 스팟 사이즈 7mm; 레이저 조사 시간 450 ps(picosecond); 주파수 10Hz; 조사 횟수 3000 샷(shot)].
실험대상자 7의 안면을 깨끗이 닦은 후 30분간 마취제를 안면에 도포하고 Pico 레이저를 조사하였다. 레이저 빔 조사로 안면 홍조를 유도한 후 실험대상자 7의 오른쪽 얼굴에는 7.39×108 입자/mL 농도의 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 도포하였고, 실험대상자 7의 왼쪽 얼굴에는 비타민 C 용액(1% vitamin phosphate solution)을 적당량 도포하였다. 그리고 나서 실험대상자 7의 오른쪽 얼굴 및 왼쪽 얼굴에 각각 이온토포레시스를 수행하였다. 이온토포레시스는 이온토포레시스 장비(IONZYME)(Environ에서 구입)를 사용하여 줄기세포 유래의 엑소좀이 도포된 얼굴에 20분 동안 0.5 mA의 미세전류를 흘려주는 방식으로 수행하였다.
상기와 같은 처치 후 18일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 실시예 6과 같은 방식으로 안면 붉은기를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물이 처치된 오른쪽 얼굴에서는 대조군인 비타민 C 용액이 처치된 왼쪽 얼굴에 비해 안면 홍조 개선 효과가 현저한 것을 확인할 수 있었다(도 16).
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (11)

  1. 지방유래 줄기세포 배양액으로부터 분리된, 지방유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 안면 홍조 개선용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 피부에 투여되는, 안면 홍조 개선용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    화장료 조성물 또는 피부 외용제인 안면 홍조 개선용 조성물.
  4. (a) 지방유래 줄기세포 배양액으로부터 분리된, 지방유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 처리하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 안면 홍조 개선용 조성물은 마이크로니들링 또는 이온토포레시스에 의해 피부에 투여되는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  6. 제4항에 있어서,
    (c) 상기 지방유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안면 홍조 개선용 조성물이 처리된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 지방유래 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 안면 홍조 개선용 조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 안면 홍조 개선용 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (b1) 상기 안면 홍조 개선용 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 안면 홍조 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행되는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 치료용을 제외한 안면 홍조를 줄이는 미용방법.
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