KR20190104881A

KR20190104881A - 피부에 대한 레이저 빔 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법

Info

Publication number: KR20190104881A
Application number: KR1020190016149A
Authority: KR
Inventors: 조병성; 이용원
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2019-02-12
Publication date: 2019-09-11
Also published as: WO2019168281A1

Abstract

본 발명은 (a) 레이저 빔을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와, (b) 상기 레이저 빔 조사 전 또는 후에, 상기 레이저 빔 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 피부 미용방법을 제공한다. 본 발명의 피부 미용방법에 따라 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 모공 축소 효과 및 얼굴 광채 면적 증가라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.

Description

피부에 대한 레이저 빔 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법 {Method of skin care using the combination of radiating laser beam and treating exosomes onto skin}

본 발명은 피부에 대한 레이저 빔 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법에 관한 것이다.

얼굴이나 신체 등의 외모에 대한 관심이 증가함에 따라 피부 상태를 개선하고 외모의 부족한 부분을 보완하고자 하는 미용 수요가 늘어나고 있다.

피부질환 치료나 피부 외관 상태를 개선하기 위해 레이저빔을 피부에 조사하여 시술하는 다양한 레이저 치료 기법이 개발되고 있으며, 레이저 치료 기법의 이용을 위한 의료용 레이저 장치 역시 활발하게 연구되고 있다. 레이저 빔 조사는 피부 속 콜라겐 합성을 증가시켜 피부 재생을 돕고 피부탄력을 회복시켜 주름, 상처 등을 개선시키는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 레이저 빔 조사를 이용한 피부 미용 방법은 시술 부위에 열 손상을 입힌 후 그 주변 영역의 조직이 활성화되게 하여 피부가 재생되는 메카니즘을 이용한다. 시술부위 전체 피부에 레이저 빔을 조사하면 표피부터 진피층까지 광 에너지를 전달하여 피부를 넓게 재생시키기는 하지만, 높은 에너지 전달로 인해 시술부위에 심한 통증이 발생하고 시술 후 피부가 붉어지거나 붓는 부작용이 있다. 또한, 시술자의 실수로 인해 너무 깊이 레이저 열 손상이 가해지면 재생기전이 아예 불가능해질 수 있고 깊은 상처가 남을 수 있으며 홍반(erythema), 부종(edema), 과다색소침착(hyperpigmentation), 과소색소침착(hypopigmentation) 등의 부작용이 생길 수 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 레이저빔을 스팟 형태로 조사하는 방법이 이용되고 있으며, 이때 마이크로 렌즈 어레이나 레이저 스캐너를 이용하여 복수의 레이저빔 스팟(마이크로 레이저빔)을 형성하게 된다. 이러한 레이저빔 스팟을 이용한 시술방법은 미세 시술 영역을 형성하면서 일정한 투과 깊이까지 에너지를 전달하므로 후유증을 개선시킬 수 있다. 그러나, 이러한 레이저 시술 장비와 시술기법의 개선에도 불구하고 부작용은 여전히 발생하고 있다. 따라서, 레이저 빔 조사에 따른 부작용을 최소화하기 위한 다른 측면에서의 연구가 필요하다.

한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.

본 발명자들은 줄기세포 유래의 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1015881호 (2011.02.23) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)

본 발명의 목적은 피부에 대한 레이저 빔 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 레이저 빔을 피부에 조사하는 단계와, 상기 레이저 빔 조사 전(前), 상기 레이저 빔 조사 동안, 또는 상기 레이저 빔 조사 후(後), 상기 레이저 빔 조사 대상이 되는 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.

그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 명세서에서 용어, "피부 미용"은 레이저 빔 조사로 인한 부작용, 예를 들어 통증, 레이저 시술 후 피부가 붉어지거나 붓는 현상, 및/또는 색소침착(예를 들어 과다색소침착 및/또는 과소색소침착) 등을 감소, 완화 및/또는 개선하고/하거나, 피부 진정, 모공축소, 및/또는 피부밝기 개선(예를 들어, 얼굴 광채 면적 증가 등) 등의 긍정적인 효과를 가져오는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, (a) 레이저 빔을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와, (b) 상기 레이저 빔 조사 전 또는 후에, 상기 레이저 빔 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물은 크림 또는 로션일 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(레이저 빔 조사로 인한 부작용 감소 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 예를 들어, 레이저 시술 후 피부가 붉어지거나 붓는 현상 감소, 색소침착(예를 들어 과다색소침착 및/또는 과소색소침착) 개선, 피부 진정, 모공축소, 피부밝기 개선(예를 들어, 얼굴 광채 면적 증가 등) 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, (c) 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명에서 예시된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다. 상기 (c) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행될 수 있다.

본 발명의 피부 미용방법은 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기(redness)를 감소시키고 레이저 빔 조사로 인한 통증 감소 및 피부 진정(soothing) 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 피부 미용방법에 따라 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 모공 축소 효과 및 얼굴 광채 면적 증가라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.

추가로, 본 발명의 피부 미용방법은 줄기세포 유래의 엑소좀을 이온토포레시스 장치를 이용하여 피부에 적용할 경우 레이저 빔 조사에 의한 부작용 감소 효과 및 전술한 바와 같은 긍정적인 피부 미용 효과를 향상시킬 수 있다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 8은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 9는 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 10은 도 9의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 11은 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부에 처리하고 처리 전후의 피부 상태를 비교하는 사진이다.
도 12A는 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 도포한 얼굴 오른쪽과, 레이저 빔 조사 후 생리적 식염수를 도포한 얼굴 왼쪽을 구분하여 도시한 것이다. 도 12B는 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 각각 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포하고 일정 시간이 경과한 후 붉은기(redness)를 측정한 결과를 얼굴 구역별로 나타낸 도면이다.
도 13은 Er:Yag 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 1일째 및 3일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 14는 Er:Yag 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 14일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 15는 Er:Yag 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 실험대상자 3의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포하고 15분 동안 얼굴 오른쪽에는 이온토포레시스를 수행하고 얼굴 왼쪽에는 러버 마스크(control)를 적용한 후 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 16은 Pico 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 비타민 C를 실험대상자 4의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고 이온토포레시스를 추가로 수행한 후 18일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 17은 Pico 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 비타민 C를 실험대상자 4의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고 이온토포레시스를 추가로 수행한 후 18일째에 피부 모공 크기를 측정한 결과 그래프이다.
도 18은 Pico 레이저 빔 조사 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 비타민 C를 실험대상자 4의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포하고 이온토포레시스를 추가로 수행한 후 18일째에 얼굴 광채 면적을 측정한 결과 그래프이다.
도 19는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 20은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)의 구성을 나타내는 사시도이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO₂, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석

분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.

본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.

TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).

분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).

도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.

도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 제조과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 19).

실시예 5: 엑소좀의 피부 투과 능력 시험

형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 7).

PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×10⁵ 입자/mL 내지 1×10⁹ 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 또한, PKH-엑소좀을 돼지 피부 바깥면에 도포하고 부직포를 덮어 준 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×10⁵ 입자/mL 내지 1×10⁹ 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 또한, PKH-엑소좀을 부직포와 피부조직 사이에 주입한 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 9 및 도 10).

이상의 실험결과들을 종합하면, 이온토포레시스에 의해 피부에 미세 전류를 흘려주면서 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 적용할 경우, 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다. 따라서, 이온토포레시스 디바이스(피부에 대해 미세전류를 흐르게 하는 장치) 및/또는 이를 포함하는 엑소좀 키트(100)를 이용하여 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 적용할 경우 피부 침투능력이 보다 향상되어 레이저 빔 조사에 의한 부작용 감소 효과 및 전술한 바와 같은 긍정적인 피부 미용 효과를 향상시킬 수 있다.

실시예 6: 사람 피부에 대한 레이저 빔 조사와 줄기세포 유래의 엑소좀 처리

Er:Yag 레이저(어븀야그 레이저)를 피부에 조사하였다. 레이저 빔의 조사 횟수나 간격은 환자의 피부 상태나 피부 상태 개선 목적에 따라 조정할 수 있다. 또한, 매번의 레이저 빔 조사에 있어서 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀을 직접 피부에 적용할 수도 있고, 이온토포레시스 디바이스(피부에 대해 미세전류를 흐르게 하는 능동 경피 투과 장치) 또는 이를 구비하는 엑소좀 키트(100)를 이용하여 피부에 적용할 수도 있다. 레이저 빔 조사 직후의 사진(Before)과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀을 적용한 후 3일이 경과한 시점의 사진(After)을 비교하였다(도 11 참조). 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 결과, 사용 전과 비교하여 사용 후에 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 레이저 시술 후 피부가 붉어지거나 붓는 현상이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있음을 강력히 시사한다.

실시예 7: 사람 안면에 대한 레이저 빔 조사와 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 처리

실시예 7-1: 1차 안면부 임상 실험

Er:YAG 레이저 장비인 Joule(Sciton, Inc., 미합중국 캘리포니아주 소재)를 사용하여 어븀 프락셀 레이저(Erbium Fraxel Laser)를 사람의 얼굴에 조사하였다[레이저 파라미터는 다음과 같음: 파장 2940 nm; 파장 에너지 7 J/cm²; 10×10 cm 스캐닝 모드(scanning mode); 1 패스(pass)].

실험대상이 되는 2명의 성인남녀의 안면을 깨끗이 닦은 후 30분간 마취제를 안면에 도포하고 어븀 프락셀 레이저를 조사하였다. 도 12A에 도시된 바와 같이, 레이저 빔 조사 직후 각 실험대상자 얼굴의 오른쪽 절반에는 7.39×10⁸입자/mL 농도의 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 도포하였고, 각 실험대상자 얼굴의 왼쪽 절반에는 생리적 식염수를 적당량 도포하였다. 그리고 나서 30분 동안 각 실험대상자의 얼굴 위에 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다.

대한민국 경기도 소재의 피에스아이 플러스(주)의 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 각 실험대상자 얼굴의 붉은기(redness)를 측정하였다. 붉은기 측정을 위하여 레이저 빔 조사 직전의 사진(Before)과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀을 적용한 후 1일이 경과한 시점 및 3일이 경과한 시점의 사진(After)을 비교하였다. 붉은기 측정결과에 따라 레이저 빔 조사와 함께 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리할 때 레이저 빔 조사로 인한 부작용을 완화 내지 정상 상태로 회복시켜 주는지 여부를 평가하였다.

우선, 전술한 바와 같은 방식으로, 레이저 빔 조사 직후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 각각 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포한 후 1일째 및 3일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 붉은기(redness)를 측정하였다. 각 부위에서 측정된 붉은기의 증가율(% Increase of Redness)은 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 증가율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(처치 전 붉은기)]/(처치 전 붉은기)(%). 1일째 및 3일째 측정 결과 모두에서, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 얼굴 부위인 E 영역 및 G 영역이 각각 생리적 식염수가 도포된 얼굴 부위인 F 및 H 영역에 비해 붉은기(redness)가 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 13A 및 도 13B). 뿐만 아니라 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 얼굴 부위에서는 가피(痂皮)가 관찰되지 않았다.

또한, 전술한 바와 같은 방식으로, 레이저 빔 조사 직후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 각각 실험대상자 2의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 도포한 후 14일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 붉은기(redness)를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 얼굴 부위인 E 영역 및 G 영역이 각각 생리적 식염수가 도포된 얼굴 부위인 F 및 H 영역에 비해 붉은기(redness)가 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 14).

한편, 실험대상자 1 및 2에게 통증 감소 및 피부 진정 효과에 대한 설문조사에 대해 답하도록 하였다. 이에 대해 실험대상자 모두 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 부위가 생리적 식염수를 처리한 부위에 비해 레이저 빔 조사로 인한 통증이 적었고 피부 진정 효과가 있다고 응답하였다.

상기 실험결과들을 종합하면, 피부에 대해 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리할 경우 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)를 감소시키고 레이저 빔 조사로 인한 통증 감소 및 피부 진정 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있다.

실시예 7-2: 2차 안면부 임상 실험

실시예 7-1에 기술된 방식과 동일한 방식으로, 레이저 빔 조사 직후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀(7.39×10⁸입자/mL 농도)을 실험대상자 3의 얼굴 오른쪽에 도포하였다. 오른쪽 얼굴에는 15분 동안 이온토포레시스를 수행하였고 왼쪽 얼굴 위에는 15분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다. 이온토포레시스는 이온토포레시스 장비(IONZYME)(Environ에서 구입)를 사용하여 줄기세포 유래의 엑소좀이 도포된 오른쪽 얼굴에 20분 동안 0.5 mA의 미세전류를 흘려주는 방식으로 수행하였다. 실시예 7-1에 기재된 방식으로 처치 전후의 오른쪽 얼굴과 왼쪽 얼굴의 붉은기를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀을 얼굴에 도포한 후 이온토포레시스를 수행할 경우 단순히 러버 마스크를 적층하여 눌러 주는 것에 비해 붉은기가 바로 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 15).

한편, 본 실시예에서는 얼굴에 줄기세포 유래의 엑소좀을 도포한 후 IONZYME 이온토포레시스 장비를 이용하여 이온토포레시스를 수행하였으나, 레이저 빔 조사 직후에 줄기세포 유래의 엑소좀(12)이 포함된 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 사람의 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용함으로써 이온토포레시스를 수행할 수도 있다(도 20).

실시예 7-3: 3차 안면부 임상 실험

Pico 레이저 장비인 피코플러스(주식회사 루트로닉, 대한민국 경기도 소재)를 사용하여 Pico 레이저를 사람의 얼굴에 조사하였다[레이저 파라미터는 다음과 같음: 파장 1064 nm; 파장 에너지 0.7 J/cm²; 레이저 스팟 사이즈 7mm; 레이저 조사 시간 450 ps(picosecond); 주파수 10Hz; 조사 횟수 3000 샷(shot)].

실험대상이 되는 1명의 성인 여성의 안면을 깨끗이 닦은 후 30분간 마취제를 안면에 도포하고 Pico 레이저를 조사하였다. 레이저 빔 조사 직후 실험대상자 4의 오른쪽 얼굴에는 7.39×10⁸입자/mL 농도의 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 도포하였고, 실험대상자 4의 왼쪽 얼굴에는 비타민 C 용액(1% vitamin phosphate solution)을 적당량 도포하였다. 그리고 나서 실시예 7-2에서 기술된 바와 같은 방식으로 실험대상자 4의 오른쪽 얼굴 및 왼쪽 얼굴에 각각 이온토포레시스를 수행하였다.

상기와 같은 처치 후 18일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 붉은기(redness), 피부 모공 크기, 및 얼굴 광채 면적을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 오른쪽 얼굴에서는 비타민 C 용액이 처치된 왼쪽 얼굴에 비해 레이저 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)가 확연히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 16 참조). 또한, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 오른쪽 얼굴에서는 비타민 C 용액이 처치된 왼쪽 얼굴에 비해 피부 모공 축소 효과가 현저하였고(도 17), 얼굴 광채 면적도 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 18).

한편, 실험대상자에게 통증 감소 및 피부 진정 효과에 대한 설문조사에 대해 답하도록 하였다. 이에 대해 실험대상자는 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 부위가 비타민 C 용액을 처리한 부위에 비해 레이저 빔 조사로 인한 통증이 적었고 피부 진정 효과가 있다고 응답하였다.

상기 실험결과들을 종합하면, 피부에 대해 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리할 경우 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)를 감소시키고 레이저 빔 조사로 인한 통증 감소 및 피부 진정 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 레이저 빔 조사와 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피부 모공 축소 효과 및 얼굴 광채 면적 증가라는 긍정적인 효과도 가져오는 것을 알 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

100: 엑소좀 키트
10: 액상 침적 시트 마스크 12: 줄기세포 유래의 엑소좀
20: 경피투과 촉진 시트 마스크 22: 전지
24: 도전성 패턴

Claims

(a) 레이저 빔을 포유동물의 피부에 조사하는 단계와,
(b) 상기 레이저 빔 조사 전 또는 후에, 상기 레이저 빔 조사 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 레이저 빔 조사로 인한 피부 부작용을 감소시키는 피부 미용방법.
제1항에 있어서,
레이저 빔 조사로 인한 피부 붉은기 또는 통증 중 적어도 하나를 감소시키는, 피부 미용방법.
제2항에 있어서,
레이저 빔 조사로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시키는, 피부 미용방법.
제3항에 있어서,
피부 진정(soothing), 모공 축소, 또는 얼굴 광채 면적 증가 중 적어도 하나의 효과를 추가로 나타내는, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 현탁액인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제6항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 크림 또는 로션인, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(c) 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 피부 미용방법.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 피부 미용방법.
제10항에 있어서,
상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행되는, 피부 미용방법.
제11항에 있어서,
상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 피부 미용방법.
제12항에 있어서,
상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취인, 피부 미용방법.
제13항에 있어서,
상기 (c) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행되는, 피부 미용방법.