WO2019112238A2 - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel skin moisturizing composition
  • a novel skin moisturizing composition comprising stem cells derived exosomes as an effective ingredient.
  • the present invention also relates to a functional cosmetic composition for moisturizing the skin and an external preparation for skin comprising the composition.
  • the skin consists of three layers of epidermis, dermis and subcutaneous fat tissue.
  • the epidermis is divided into the stratum corneum, the transparent layer, the granular layer, and the basal layer from the outside to the inside.
  • the stratum corneum which is the outermost layer of the epidermis, is the most important structure of skin barrier function, consisting of flattened corneocytes and SC intercellular lipid.
  • the stratum corneum of the epidermis contains 10% to 20% of water and exists at the outermost part of the human body to inhibit the evaporation of water from the body and to prevent excessive moisture from penetrating from the outside.
  • the water content of the stratum corneum is less than 10%, the skin becomes rough and the function of the skin barrier is lost.
  • Skin barrier protects against external stimuli such as dry environment, ultraviolet rays, pollutants, etc., and protects against excessive divergence of body water through the skin. This protective function is only maintained when the stratum corneum is normally formed .
  • Dry skin is the most common dermatologic problem in the elderly. Moisturizing and barrier functions are deteriorated in aged skin due to decrease of moisturizing protein and decrease of lipid synthesis ability during skin aging. However, one of the main features of skin aging caused by ultraviolet rays and the like is known as a decrease in function of aquaporin.
  • Aquaporin proteins are widely expressed in bacteria, plants, and animals, and are selective pores that allow water, glycerol, and small solutes to travel through the cell membrane. To date, 13 kinds of aquaporin proteins have been identified in mammals. Aquaporin is a group of aquaglyceroporin (AQP3, AQP7, AQP5) that transports not only water but also small solutes such as glycerol (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4 and AQP5) , AQP10), and the unorthodox AQP group (AQP6, AQP8, AQP11, AQP12), which is under study for its specific function.
  • Aquaporin 3 is the most relevant to skin.
  • AQP3 is expressed in mouse and human keratinocytes, only from the basal layer to the granule layer, and disappears in the stratum corneum.
  • Skin without AQP3 has a problem in that the skin elasticity is lowered and recovery of skin barrier function is lowered.
  • AQP3 is present in skin epithelial cells and plays an important role in opening and closing the water passage in the cell membrane. When AQP3 is increased, the movement of moisture becomes active and the moisture is moved to the deep part of the skin, thereby lubricating the skin.
  • exosome which has intercellular signal transduction
  • Extracellular vesicles Cells release various membrane-type vesicles in the extracellular environment, and these release vesicles are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
  • the extracellular endoplasmic reticulum is sometimes referred to as cell membrane-derived endoplasmic reticulum, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes and, in some cases, differentiated from exosomes.
  • Exosome is an endoplasmic reticulum of several tens to several hundreds of nanometers in size, composed of double lipid membranes identical to the cell membrane structure, and contains proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomal cargo inside.
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
  • Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactivity factors depending on the nature and condition of the derived cells.
  • the proliferating stem cell-derived exosomes regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect the characteristics of stem cells involved in tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • the present inventors have conducted intensive studies on new functional cosmetics which have no adverse effects on the human body and have excellent skin moisturizing effect, and have found that exosome derived from stem cells increases the expression and activation of AQP3, It is confirmed that it is effective for moisturizing the skin by transferring the moisture deep into the skin, thus completing the present invention.
  • It is an object of the present invention to provide a novel skin moisturizing composition comprising stem cells derived exosome as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a functional cosmetic composition for skin moisturizing comprising the composition and an external preparation for skin.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies on the development of a new composition for moisturizing the skin. As a result, it has been confirmed that the exosome derived from stem cells increases the expression and production of AQP3, which plays an important role in water movement in the skin, Derived cosmetic composition containing an exosome as an active ingredient has been developed.
  • exosomes refers to an endoplasmic reticulum of several tens to several hundred nanometers (preferably about 30 to 200 nm) in size, consisting of double lipid membranes identical in structure to the cell membrane The particle size of the exosome can be varied according to the cell type, the separation method and the measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins called exosomal cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.).
  • Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
  • Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
  • exosome refers to a vesicle having a nano-sized vesicle structure secreted from the stem cells and released into the extracellular space and having a composition similar to that of exosome (for example, exosome- Pseudo-bezacl).
  • the type of the stem cell is not limited, but may be, for example, a mesenchymal stem cell, for example, a fat, a bone marrow, an umbilical cord or a cord blood derived stem cell, Derived stem cells.
  • the type of the adipose-derived stem cell is not limited as long as it does not cause a risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human adipose-derived stem cell.
  • the exosomes derived from stem cells used in the present invention can be used for skin moisturizing and exogenous stem cell-derived exosomes which are used in the art or can be used in the future as long as they do not adversely affect the human body . Therefore, it should be understood that the exosomes derived from the stem cells isolated according to the separation method of the following Examples should be understood as an example of exosome that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • skin moisturizing means that the homeostasis of the living body is maintained by appropriately controlling moisture loss (moisture evaporation) of the skin and the like.
  • Skin trouble means that the skin turns red due to external stimuli or physical changes, and itching appears, and in the case of severe cases, small protuberance or rash occurs.
  • the term "iontophoresis” as used herein refers to a method in which an ionized active ingredient is allowed to permeate through the skin by an electrical repulsive force by applying a minute current to the skin to which the effective substance is applied, .
  • the iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current flows from an external power source to an electrode patch on the skin to introduce minute current into the skin, A method in which minute current is introduced, a method in which minute current is introduced into skin through a patch equipped with a reversed electrodialysis means for generating current through a difference in ion concentration between a high concentration electrolyte solution and a low concentration electrolyte solution, and the like .
  • the present invention is not limited thereto, and it is needless to say that various types of iontophoresis can be used.
  • the skin moisturizing composition of one embodiment of the present invention contains exosome derived from stem cells as an effective ingredient.
  • the stem cell-derived exosome may increase the expression or production of AQP3 (Aquaporin 3).
  • the skin moisturizing composition according to one embodiment of the present invention may include a lyophilized preparation containing the above exosome derived from stem cells and methionine, mannitol and trehalose as an active ingredient.
  • the weight ratio of methionine, mannitol, and trehalose is 1: 1: 1.
  • the lyophilized preparation may further contain ascorbic acid and retinol.
  • the weight ratio of methionine, mannitol, trehalose, ascorbic acid, and retinol is 9: 9: 9: 0.5: 0.5.
  • the skin moisturizing composition of one embodiment of the present invention may include the lyophilized preparation and a diluent.
  • the diluent may be water for injection, physiological saline, phosphate buffered solution, purified water, or deionized water.
  • the diluent may further comprise hyaluronic acid or hyaluronate (for example, sodium hyaluronate).
  • the composition may be a suspension.
  • the skin moisturizing composition of one embodiment of the present invention may be a cosmetic composition or a skin external preparation.
  • the cosmetic composition may be a cream or lotion.
  • the stem cell-derived exosome is characterized in that it increases the skin hydration.
  • composition for skin moisturizing is made of an external preparation for skin and / or a cosmetic composition
  • components which are usually used in cosmetics or external skin preparations such as moisturizers , An antioxidant, an oily component, an ultraviolet absorber, an emulsifier, a surfactant, a thickener, an alcohol, a powder component, a colorant, an aqueous component, water, various skin nutrients and the like.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition may contain, in addition to exosomes derived from stem cells, a conventional skin remedy and / or cosmetic composition insofar as its action (skin moisturization, skin condition improvement, A moisturizing agent may be mixed and used.
  • a conventional skin remedy and / or cosmetic composition insofar as its action
  • skin moisturization skin condition improvement
  • a moisturizing agent may be mixed and used.
  • the stem cell-derived exosome of the present invention may be carried on or mixed with at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel.
  • the type of the hydrogel is not limited, but it is preferably a hydrogel obtained by dispersing the gel polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gel polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cacao gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol and glycerin.
  • the external preparation for skin and / or the cosmetic composition according to one embodiment of the present invention can be used in the form of, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, , Mist, foundation, powder, oil paper, and the like.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition may be applied or deposited on at least one surface of the patch, mask pack, or mask sheet.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is used for the purpose of moisturizing skin, preventing skin dryness, preventing skin trouble due to skin dryness, or improving skin condition
  • cosmetic formulations can be prepared in any formulations conventionally produced in the art .
  • a lotion, a mask pack, a mask sheet, a softener a nutritional lotion, a convergent lotion, a nutritional cream, a massage cream, an eye cream, a cleansing cream, an essence, an essence, a cleansing lotion, a cleansing foam
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition includes components commonly used in external preparations for skin and / or cosmetics and includes conventional additives such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, And may include a carrier. Further, in the respective formulations for the external preparation for skin and / or cosmetic composition, the other ingredients can be mixed and selected without difficulty by the person skilled in the art depending on the kind of the external preparation for skin and / or cosmetic composition or purpose of use.
  • the present invention also relates to a skin mask composition
  • a skin mask composition comprising a first mask pack, a mask sheet or a patch which is applied or immersed with a skin moisturizing composition containing an exosome derived from a stem cell as an active ingredient,
  • a skin moisturizing exosome kit comprising an iontophoresis device for flowing an electric current.
  • the stem cell-derived exosomes increase the expression or production of AQP3 (Aquaporin 3).
  • the skin moisturizing exosome kit of one embodiment of the present invention is characterized in that the first mask pack, the mask sheet or the patch is contacted or adhered onto the skin of the mammal, and the first mask pack, the mask sheet or the patch By placing the iontophoresis device, the first mask pack, the mask sheet or the patch can be contacted or attached to be used in such a manner that a minute current is supplied to the skin of the mammal to which the skin moisturizing composition is applied.
  • the composition for moisturizing the skin has been conventionally used as far as it does not damage its action (skin moisturization, prevention of dry skin, prevention of skin trouble due to skin dryness, improvement of skin condition, skin beauty, etc.)
  • a skin-improving agent and / or a moisturizing agent may be mixed together and used.
  • the composition for moisturizing the skin may be carried or mixed with at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel.
  • the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
  • the iontophoresis device for skin moisturizing is characterized in that the iontophoresis device comprises a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a dry battery, a mercury battery, a lithium battery, a nickel- A dialysis cell, or a second mask pack, a mask sheet, or a patch with the at least one battery mounted thereon.
  • the second mask pack, the mask sheet or the patch may be laminated on the first mask pack, the mask sheet or the patch.
  • At least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch is coated with a hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate) Or hyaluronic acid gel may be applied.
  • a hydrogel hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate) Or hyaluronic acid gel
  • the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. The gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
  • the microcurrent flows from the iontophoresis device so that the stem cell-derived exosomes can effectively penetrate the epidermis and penetrate deeply into the skin. Accordingly, it can more effectively contribute to moisturizing the skin.
  • the present invention provides a cosmetic method for controlling the condition of a mammalian skin by moisturizing the skin using a composition for moisturizing the skin, except for therapeutic use.
  • conditioning of the skin means improvement of the condition of the skin and / or prevention of the condition of the skin
  • improvement of the condition of the skin means visual and / Or a tactile perceptible positive change.
  • improving the condition of the skin may be moisturizing the skin, preventing dryness of the skin, preventing skin trouble due to drying of the skin, or moist and shiny skin condition.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention comprises the steps of: (a) applying the skin moisturizing composition directly to the skin of a mammal; (b) applying a patch, mask pack or mask sheet on which the skin moisturizing composition is applied or immersed Contacting or adhering to the skin of a mammal, or sequentially advancing (a) and (b) above.
  • lotion or cream may be used as the skin moisturizing composition.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention may comprise: (c) removing the patch, mask pack or mask sheet from the skin of the mammal after the step (b), and applying the skin moisturizing composition to the mammal And applying the composition to the skin.
  • lotion or cream may be used as the skin moisturizing composition.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention may further comprise performing iontophoresis by flowing a microcurrent to the skin of the mammal to which the skin moisturizing composition is applied.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention may further comprise contacting or attaching the iontophoresis device to the skin of the mammal.
  • the cosmetic method according to one embodiment of the present invention is a cosmetic method comprising: a first mask pack, a mask sheet or a patch which is coated or immersed with a skin moisturizing composition containing an exosome derived from a stem cell as an active ingredient; May be carried out using a skin moisturizing exosome kit comprising an iontophoresis device that delivers a microcurrent to the skin of an applied mammal.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention is a cosmetic method comprising the steps of: (a) applying a first mask pack, a mask sheet, or a patch to which a skin moisturizing composition containing an exosome derived from stem cells as an active ingredient is applied or immersed, (B) placing the iontophoresis device on the first mask pack, mask sheet or patch, and (c) contacting the first mask pack, mask sheet or patch with the skin, Or exfoliating a skin of a mammal to which the composition for skin moisturizing is applied; and (d) applying the stem cell-derived exosome to the skin of the mammal .
  • the stem cell-derived exosomes increase the expression or production of AQP3 (Aquaporin 3).
  • At least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch, at least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch may be coated with a hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronate (e.g., sodium hyaluronate) At least one of the gels may be applied.
  • the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. The gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
  • the iontophoresis device comprises a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a dry battery, a mercury battery, a lithium battery, a nickel-cadmium battery, Or a second mask pack, a mask sheet or a patch having the at least one battery mounted thereon.
  • the step (b) may be performed by laminating the second mask pack, the mask sheet or the patch on the first mask pack, the mask sheet or the patch.
  • the microcurrent flows from the iontophoresis device so that the stem cell-derived exosome can effectively penetrate the epidermis and deeply penetrate into the skin. Accordingly, it can more effectively contribute to moisturizing the skin.
  • the mammal may be a human, a dog, a cat, a rodent, a horse, a cow, a monkey, or a pig.
  • the stem cell-derived exosomes contained in the skin moisturizing composition of the present invention increase the expression of AQP3, which plays an important role in water migration in the skin. Accordingly, the skin moisturizing composition of the present invention increases the expression or production of AQP3, thereby activating the movement of moisture in the skin, thereby moisturizing the skin and obtaining a moisturizing effect by restoring the skin function.
  • the skin moisturizing composition containing the stem cell-derived exosome of the present invention as an active ingredient has a functional activity useful as a moisturizing functional cosmetic, that is, an activity to induce the expression of AQP3, And can be usefully utilized as an effective ingredient of a functional cosmetic composition for moisturizing.
  • the composition for moisturizing the skin of the present invention exhibits an effect of preventing, suppressing, alleviating or improving the skin moisturizing effect and skin irritation caused by dryness of the skin and improving the skin condition which is deteriorated due to drying of the skin, And exhibits excellent effects in skin care.
  • FIG. 1 shows the results of physical property analysis of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 1A shows the particle size distribution and number of particles by TRPS (tunable resistive pulse sensing) analysis.
  • Figure 1B shows particle size distribution and particle number by NTA (nanoparticle tracking analysis) analysis.
  • Fig. 1C shows particle images by transmission electron microscopy (TEM) according to magnification.
  • Figure 1D shows the Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • RTI ID 0.0 > 1E < / RTI > shows flow cytometric analysis results for CD63 and CD81 in marker assays for exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the result of confirming the absence of cytotoxicity after treatment of exosome according to one embodiment of the present invention with human skin fibroblast HS68 cells.
  • FIG. 3 is a graph showing a result of significantly increasing the moisture content in the stratum corneum of the skin on both right and left sides when the cosmetic composition for skin moisturizing according to one embodiment of the present invention is applied to the left and right faces of a person.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a significant increase in the rate of change of the moisture content in the stratum corneum of the skin on both right and left sides when the cosmetic composition for skin moisturizing according to one embodiment of the present invention is applied to the right and left faces of a person.
  • Fig. 5 shows fluorescence intensity measurement results of exosomes stained with PKH67.
  • FIG. 6 is an image of a fluorescence microscope confirming the extent of fluorescence-stained exosomes transferred into pig skin tissue.
  • FIG. 7 is a confocal fluorescence microscope image showing the extent of fluorescence-stained exosomes transferred into the mouse skin tissue.
  • Fig. 8 is a graph showing a comparison of the total fluorescence intensity obtained by measuring the fluorescence intensity on each image in Fig. 7; Fig.
  • FIG. 9 is a perspective view showing a configuration of an exosome kit 100 for skin moisturizing according to one embodiment of the present invention.
  • Fig. 10 is a photograph showing the skin condition before and after treatment of human skin with the exosome kit for skin moisturizing of the present invention.
  • Fig. 11 shows the result that skin moisturization is remarkably improved when the skin moisturizing exosomal kit of the present invention is applied to human skin.
  • FIGS. 12 and 13 are graphs showing that the expression level of AQP3 (Aquaporin 3) increases as a result of treating stem cells-derived exosomes with human epidermal keratinocytes (HEK).
  • AQP3 Amporin 3
  • FIG. 14 is a photograph showing the favorable structure of the lyophilized exosome according to the method of one embodiment of the present invention.
  • FIGS. 15A to 15G are photographs showing the characteristics of freeze-dried exosomes prepared by different combinations of the lyophilized protective agent components and lyophilization followed by the combination of lyophilized protective agent components.
  • HS68 cells a human dermal fibroblast, were purchased from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific) The cells were subcultured in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • adipose-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. Then, the cells were washed with a phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, non-phenol red medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant .
  • a phosphate-buffered saline purchased from ThermoFisher Scientific
  • Trehalose was added to the culture medium in an amount of 2% by weight in order to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity in the process of separating exosome.
  • the culture was filtered with a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cellular debris, waste products and large particles.
  • the filtered cultures were immediately separated to isolate exosomes.
  • the filtered culture was stored in a refrigerator (image below 10 ° C) and used for exosome isolation.
  • the filtered culture was frozen in an ultra-low temperature freezer at -60 ° C or lower, and thawed, followed by exosome isolation. Then, the exosomes were separated from the culture medium by using Tangential Flow Filtration (TFF).
  • TMF Tangential Flow Filtration
  • Example 1 a TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for separating, concentrating, desalting and diafiltration exosomes from a culture filtrated with a 0.22 ⁇ m filter.
  • a cartridge filter also called a hollow fiber filter (purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore) was used.
  • the TFF filter can be selected by a variety of molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by selected MWCOs, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, low molecular weight compounds, etc. smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • TFF filters of MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da were used.
  • the culture medium was concentrated to a volume of about 1/100 to 1/25 using the TFF method, and substances smaller than MWCO were removed to separate the exosomes.
  • Separated and concentrated exosomal solutions were further desalted and buffered (diafiltration) using the TFF method.
  • the desalination and buffer exchange are performed by continuous diafiltration or discontinuous diafiltration, and at least 4 times, preferably 6 times to 10 times or more, more preferably, Was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more.
  • 2% by weight of trehalose dissolved in PBS was added to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity.
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • TRPS tunable resistive pulse sensing
  • FIG. 1D shows the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers as a result of performing Western blotting on isolated exosomes according to the method of one embodiment of the present invention.
  • Anti-CD9 purchased from Abcam
  • anti-CD63 purchasedd from System Biosciences
  • anti-CD81 purchasedd from System Biosciences
  • anti-TSG101 purchasedd from Abcam
  • FIG. 1E shows the presence of CD63 and CD81 markers as a result of analysis using flow cytometry on exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention.
  • Human CD63 isolation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD63 PE-Mouse anti markers were stained using the PE-mouse CD63 (purchased from BD) and PE-mouse anti-human CD81 (purchased from BD), and analyzed using a flow cytometer (ACEA Biosciences) Respectively.
  • exosomes derived from stem cells used in the present invention are not limited to the exosomes of the above-mentioned embodiments, and it is possible to use various stem cell-derived exosomes which are used in the art or can be used in the future Of course. It is to be understood that the exosomes derived from the stem cells isolated according to the above embodiments are to be understood as an example of exosomes derived from stem cells which can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • exosomes were treated by concentration to the cells and the proliferation rate of the cells was confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS, and the cells were mixed with 80 ⁇ 90% confluency and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed, and the cell survival rate was evaluated by culturing the exosome prepared in Example 2 for each concentration and culturing for 24 to 72 hours.
  • WST-1 reagent purchased from Takara
  • MTT reagent purchased from Sigma
  • CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
  • Aramar Blue reagent alamarBlue reagent purchased from ThermoFisher Scientific
  • a microplate reader purchased from Molecular Devices
  • the comparative group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosome, and it was confirmed that the exosome-induced cytotoxicity did not appear within the tested concentration range (FIG. 2).
  • a lyophilized protective agent containing methionine, mannitol and trehalose was prepared for lyophilization of exosomes.
  • An aqueous solution to which the lyophilized protective agent was added was prepared in 1 mL of an aqueous solution containing ascorbic acid and retinol each at 0.5 mg / mL (manufactured by Biofuji Co., Ltd. (manufactured by Hapon County, Jeonnam, Korea)].
  • the lyophilized protective agent is added to a solution containing ascorbic acid and retinol.
  • an aqueous solution may be prepared by adding a lyophilized protective agent to injection water, purified water, physiological saline, or deionized water.
  • concentrations of methionine, mannitol and trehalose in the aqueous solution were adjusted to be 9 mg / mL, respectively.
  • Example 2 (5 ⁇ 10 8 particles) prepared in Example 2 were mixed with an aqueous solution containing a lyophilized protective agent, and then freeze-dried using the freeze-drying equipment (VIRTIS, ITME No .: 34424) Drying was carried out.
  • the lyophilization was carried out in the order of conditions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 in Table 1 below.
  • Freeze-drying conditions Total time (min) 4320 Condition Time (min) Temperature (°C) Pressure (mmHg) One 700 -50 760 2 60 -50 760 3 999 -50 0 4 999 -50 0 5 999 -50 0 6 370 -50 0 7 120 -20 0 8 73 10 0
  • the lyophilized protective agent containing methionine, mannitol and trehalose was treated to freeze-dry the lyophilized lyophilized product. As a result, it was confirmed that the color was milky white and exhibited a good shape maintaining a porous sponge shape ). That is, in the method of lyophilization of exosome of the present invention, the lyophilized product exhibiting excellent properties can be obtained by lengthening the drying time under reduced pressure and by using a combination of methionine, mannitol and trehalose as the lyophilized protective agent.
  • Example 5-2 Comparison of properties of exosome product according to freeze-dried protective agent composition
  • a lyophilized protective agent component containing at least one of methionine, mannitol and trehalose
  • 7 types of aqueous solutions were prepared by adding the lyophilized protective agent component alone, a combination of two components, or a combination of three components.
  • the concentration of each freeze-dried protective agent component in the aqueous solution was adjusted to be 9 mg / mL.
  • the exoose (5 ⁇ 10 8 particles) prepared in Example 2 was mixed with an aqueous solution containing each combination of freeze-dried protective agent components, followed by lyophilization .
  • Example 6 Cosmetic composition formulation of one embodiment of the present invention
  • composition of the cosmetic composition was prepared by diluting the stock solution of 1704 ⁇ g / mL prepared in Example 2 with the components listed in Table 3, and suspending the same.
  • the final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 x 10 < 4 > particles / mL. The content of each component is shown in Table 3 below.
  • the exosome stock solution of 1704 ⁇ g / mL prepared in Example 2 was diluted and mixed with the ingredients listed in Table 4 to suspend the cosmetic composition (cream).
  • the final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 x 10 < 4 > particles / mL. The content of each component is shown in Table 4 below.
  • the stock solution of the exosome prepared at the concentration of 1704 ⁇ g / mL prepared in Example 2 was diluted and mixed with the ingredients listed in Table 5 below to suspend.
  • the obtained cosmetic composition was applied or immersed to prepare a mask pack.
  • the exosomes were applied or immersed in a mask pack at a concentration of 4 x 10 < 3 > particles / mL.
  • the content of each component is shown in Table 5 below.
  • Example 6 Twenty-one women in their twenties to thirties, who had no acute or chronic physical disease and had normal skin dryness, were selected as test subjects.
  • the milky lotion and light pink cream of Example 6 were administered twice a day (morning and evening) And applied to the right and left faces.
  • the skin moisture content of the facial area was measured with a moisture meter (Corneometer CM825) (Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany) before the use of the lotion and cream, two weeks after use, and four weeks after use. Skin moisturisation tests were performed on the lotions and creams. All 21 subjects completed the tests without dropouts.
  • Measurements (A.U.) of the corneometer at the left and right test sites were 51.50 and 51.14 after 2 weeks of use of the lotion and cream, respectively, and 55.50 and 54.66 after 4 weeks of use, respectively (FIG. 3).
  • changes in the water content of the stratum corneum at each test site were identified as 57.81% and 59.07% after 2 weeks of using the lotion and cream, respectively, and 70.09% and 70.01% after 4 weeks of use, respectively (FIG.
  • Both the left and right test sites exhibited a skin (horny layer) moisture content that increased from two weeks after use of the lotion and cream to a statistically significant level (P ⁇ 0.05) before use, It is thought that it can help.
  • the cosmetic composition of the present invention exhibits excellent effects in moisturizing the skin.
  • Example 8 Skin permeability test of exosome derived from stem cells contained in cosmetic composition for skin moisturizing
  • PKH67 dye (purchased from Sigma) was used to prepare fluorescently stained exosomes. 1 mM PKH67 was diluted in Diluent C (purchased from Sigma) to prepare a 10 ⁇ M PKH67 solution, mixed with an appropriate concentration of exosome solution, and allowed to react at room temperature for 10 minutes in the absence of light. After the reaction, an MW3000 spin column (purchased from ThermoFisher Scientific) was used to remove the remaining PKH67 dye from the exosomes stained with PKH67 (hereinafter abbreviated as "PKH-exosomes"). After confirming the use of a fluorescence analyzer (purchased from Molecular Devices), PKH67 not reactive with exosomes was removed, and fluorescence of sufficient intensity was detected in PKH-exosomes (FIG. 5).
  • PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 particles / mL, and then applied to the outer surface of the pig skin.
  • PBS phosphate buffer
  • the nonwoven fabric was covered and allowed to react for an appropriate period of time, for example, 30 minutes to 1 hour to allow the PKH-exosomes to be delivered to the subcutaneous tissues.
  • the PKH-exosomes were applied to the outer surface of the pig skin and covered with the nonwoven fabric, followed by flowing a microcurrent for a predetermined time, for example, 30 minutes to 1 hour.
  • the pig skin tissue was immersed in a 3.7% formaldehyde solution, reacted overnight, and washed three times for 5 minutes each with phosphate buffered saline.
  • the washed pig skin tissue was immersed in a 30% sucrose solution and treated with OCT compound.
  • sections were prepared on a longitudinal section using a microtome, and tissue sections were placed on a slide glass.
  • the preparation of the tissue section may be carried out before the tissue is fixed with formaldehyde solution. Fluorescence detected from PKH-exosomes in tissue sections was observed using fluorescence microscopy.
  • PKH-exosomes transmitted to the subcutaneous tissue through the epidermis of the pig skin tissue were identified.
  • the exosomes were more effectively passed through the epidermis, deeply transferred into the skin tissue, and more effectively absorbed to the skin when active current was delivered (active transdermal delivery) (see FIG. 6).
  • PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 particles / mL, and then applied to the outside of the skin tissue of the mice.
  • PBS phosphate buffer
  • the nonwoven fabric was pre-positioned outside the mouse skin tissue, and PKH-exosomes were injected between the nonwoven fabric and skin tissue. Then, the reaction was carried out for 30 minutes to 1 hour.
  • the PKH-exosomes were injected between the nonwoven fabric and the skin tissue, and the microcurrent was flowed for a predetermined time, for example, 30 minutes to 1 hour. After completion of the reaction, the PKH-exosomes transferred into the skin tissue were confirmed immediately using a confocal fluorescence microscope (Leica, SP8X) or the skin tissue and the PKH-exosomal solution were further reacted for 1 hour to 6 hours , And PKH-exosomes were identified by confocal fluorescence microscopy. As a result, it was confirmed that the exosomes were more effectively passed through the epidermis and deeply transferred into the skin tissues and more effectively absorbed to the skin when active transdermal delivery was performed (see FIGS. 7 and 8) ).
  • Example 9 Treatment of exosome kit for skin moisturizing against human skin
  • the skin moisturizing exosomatic kit 100 comprises a liquid immersion sheet mask 10 (a composition containing a stem cell-derived exosome, Sheet mask) and an percutaneous permeation promoting sheet mask (silver sheet mask) 20 which is an iontophoresis device.
  • a stem cell-derived exosome (12) is applied or deposited on the surface or inside of the liquid immersion sheet mask (10).
  • a battery 22 for generating a microcurrent is mounted on the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20 and a conductive pattern 24 electrically connected to the cell 22 is attached to the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20, So that the micro current generated from the battery 22 can be uniformly transmitted to the entirety of the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20.
  • the conductive pattern 24 is formed by printing or plating a conductive metal such as gold, silver, or copper.
  • the “skin moisturizing exosome kit 100" having the above-described structure is applied to a face of a person (hereinafter referred to as "case 1") having a flushing symptom and skin troubles associated with itching due to skin dryness and skin dryness To assess whether skin troubles and flushing symptoms are alleviated or improved.
  • the skin moisturizing exosome kit 100 of the present invention was applied once to the face of a person with flushing symptom (hereinafter referred to as "case 2") to evaluate whether the overall skin tone and flushing symptom improved.
  • a liquid immersion sheet mask 10 containing 5 ⁇ 10 5 stem cell-derived exosomes 12 was adhered uniformly to the entire face of cases 1 and 2 in accordance with the eyes and mouth parts,
  • the activated percutaneous permeation enhancing sheet mask 20 was laminated on the liquid immersion sheet mask 10 for about 25 to 30 minutes.
  • the skin moisturizing exosomal kit 10 comprising the liquid-immersion sheet mask 10 containing the stem cell-derived exosomes 12 at a concentration of 5 x 10 5 particles / mask and the percutaneous permeation- (Case 1), the overall skin tone was improved and the flushing was alleviated even in "case 2" (see FIG. 10) See case 2 in FIG. 10).
  • the skin moistening exotherm of the present invention comprising the liquid immersion sheet mask 10 on which the composition containing the stem cell-derived exosome as an active ingredient is immersed and the percutaneous permeation promoting sheet mask (iontophoresis device)
  • the kit 100 may be said to have the effect of preventing, suppressing, alleviating or alleviating the skin moisturizing effect and the redness symptoms and skin troubles associated with skin dryness.
  • the acute and chronic physical disease-free healthy women 20 for the stem cells a bit derived from the exo (Example 2 little ready-exo-in) containing a skin disease 1 ⁇ 10 7 of the particles / mL (Translucent oil-in-water) and the skin moisturizing exosome kit 100 of the present invention were used once every three days in the evening to test the skin moisturizing effect.
  • the amount of skin moisture was measured by a moisture meter (Corneometer CM825) (Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany) before use of the ampoule and exosome kit 100, 2 weeks after use, 4 weeks after use, Respectively.
  • the liquid immersion sheet mask 10 was brought into close contact with the eyes and the mouth, and the entire surface of the face was evenly adhered. Then, an activated percutaneous permeation- The mask 20 was laminated on the liquid immersion sheet mask 10 and used for about 25 to 30 minutes.
  • the subjects to be tested were 5 stages of excellent skin moisturization (4), good (3), normal (2), poor (1) and very poor (0) after using the skin moisturizing exosome kit (100) To answer the questionnaire.
  • the mean value and standard deviation of the questionnaire value and the percentage of the subjects to the answer were obtained for the skin moisturizing item.
  • 100% After completion of the test, the subjects were asked to respond to the questionnaire about feeling of use of the skin moisturizing exosome kit (100) of the present invention.
  • the skin moisturizing exosome kit 100 of the present invention exhibits superior skin moisturizing effect as compared with the conventional clinical treatments, as confirmed by the above-mentioned clinical test.
  • aquaporin 3 human epidermal keratinocytes
  • human epidermal keratinocyte purchased from HEK, Gibco
  • an adipocyte stem cell culture obtained from Cell Biotech (Seoul, Korea) (The first batch exosome) derived from the stem cells or the exosome (the second batch exosome) derived from the stem cells prepared according to the first and second embodiments were treated according to the method of Example 1 and Example 2, respectively.
  • CDNA was prepared from the RNA isolated from the cells and the amount of mRNA change of AQP3 (Aquaporin 3), which is an important protein in skin moisturization, was measured using a real-time PCR method.
  • AQP3 Amporin 3
  • Table 6 The types and sequences of the primers used in the real-time PCR are shown in Table 6 below.
  • the forward primer (5 '- > 3')
  • the reverse primer (5 '- > 3') AQP3 CCG TGA CCT TTG CCA TGT G (SEQ ID NO: 1) TAG CAA AGA TGC CGG CTG TG (SEQ ID NO: 2)
  • the exosome derived from stem cells of the present invention increased the expression amount of AQP3 mRNA in the cells.
  • the expression of AQP3 in human epidermal keratinocytes was increased by 7.7% when treated with 30 ⁇ g / mL of exosomes derived from the stem cells of the first batch compared to the negative control
  • the expression of AQP3 in human epidermal keratinocytes was increased by 69.4% when treated with 300 ⁇ g / mL of exosomes derived from stem cells compared to the negative control.
  • the exosome derived from stem cells increases the expression of AQP3, which plays an important role in the water movement in the skin. That is, the skin moisturizing composition of the present invention increases the expression or production of AQP3, thereby activating the skin movement of moisture, thereby moisturizing the skin and obtaining a moisturizing effect by restoring the skin function.
  • the skin moisturizing composition containing the stem cell-derived exosome as an active ingredient has a functional activity useful as a moisturizing functional cosmetic, that is, an activity of inducing the expression of AQP3, and the stem cell- And can be usefully utilized as an effective ingredient of a cosmetic composition.

Abstract

본 발명의 피부 보습용 조성물은 AQP3의 발현이나 생성을 증가시켜 수분의 피부 이동을 활발하게 함으로써 피부를 촉촉하게 하여 피부 기능 회복을 통한 보습 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 피부 보습용 조성물은 피부보습 효과 및 피부건조에 의한 가려움증을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과를 나타내고, 피부건조로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.

Description

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 피부 보습용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 보습용 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제에 관한 것이다.
피부는 표피, 진피, 피하지방조직의 3개 층으로 크게 구성된다. 표피(epidermis)는 바깥쪽에서 안쪽으로 각질층, 투명층, 과립층, 기저층으로 나뉜다. 표피의 최외곽 층인 피부 각질층(stratum corneum)은 피부장벽 기능의 가장 중요한 구조로서, 무핵의 편평한 각질세포(corneocytes)와, 각질세포간 지질(SC intercellular lipid)로 이루어져 있다.
표피의 각질층은 10% 내지 20%의 수분을 함유하고 인체의 최외각에 존재하여 체내로부터 수분이 증발하는 것을 억제하고, 외부로부터 과잉의 수분이 침투하는 것을 막아주는 역할을 한다. 그러나 각질층의 수분 함량이 10% 미만이 되면 피부는 거칠어지고 피부장벽의 기능을 잃게 된다.
피부 장벽은 외부로부터 건조한 환경, 자외선, 오염물질 등의 다양한 자극에 대한 방어뿐만 아니라 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 방지하는 보호기능을 하는데, 이러한 보호기능은 각질층이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 유지될 수 있다.
건조피부는 노인층에서 가장 흔한 피부과적 문제이다. 피부 노화 시 보습 단백질의 감소와 지질 합성 능력의 감소로 인해 노화된 피부에서 보습 및 장벽기능이 저하된다. 그런데, 자외선 등에 의한 피부 노화의 주요한 특징 중 하나가 아쿠아포린의 기능 저하로 알려져 있다.
아쿠아포린 단백질은 세균, 식물, 동물 등에서 광범위하게 발현되는데, 물, 글리세롤과 작은 용해물질들이 세포막을 통해 이동할 수 있도록 해주는 선택적 포어(selective pore)이다. 현재까지 포유류에서 13종류의 아쿠아포린 단백질들이 밝혀져 있다. 아쿠아포린은 수송능력에 따라 물만 이동시키는 AQP 그룹 (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5), 물 분자 뿐만 아니라 글리세롤과 같은 작은 용질도 수송하는 아쿠아글리세로포린(aquaglyceroporin) 그룹 (AQP3, AQP7, AQP9, AQP10), 그리고 그 구체적인 기능에 대한 연구가 진행중인 언오쏘독스(unorthodox) AQP 그룹 (AQP6, AQP8, AQP11, AQP12)으로 나뉘어진다.
상기 아쿠아포린 단백질들 중 피부와 가장 관련이 깊은 것이 아쿠아포린 3(Aquaporin 3; AQP3)이다. AQP3는 마우스와 인간의 각질세포에서 발현되는데, 기저층부터 과립층까지만 발현되고 각질층에서는 사라진다. AQP3가 없는 피부는 피부 탄력성이 떨어지고, 피부 장벽기능의 회복이 저하되는 문제가 있다. AQP3는 피부상피세포에 존재하여 세포막에서 수분통로를 열고 닫는 중요한 역할을 한다. AQP3가 증가하면 수분의 이동이 활발해지면서 피부 깊은 곳까지 수분을 이동시켜 피부를 촉촉하게 하는 윤활 작용을 하게 된다.
최근 냉난방의 인위적인 온도 조절, 각종 스트레스나 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 잦은 세안 및 자연적인 피부 노화 등으로 인해 각질층의 수분이 감소하여 피부 건조증이 증가하고 있고, 이에 따라 피부 보습제의 필요성도 증가하고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 피부 보습용 화장품은 보습 효과가 일시적이고 지속적으로 피부 보습 효과를 유지하지 못하는 단점이 있다.
이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용한 피부 보습제 개발에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 피부 보습용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 피부 보습 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 피부 보습의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다. 특히, AQP3의 발현이나 생성을 증가시켜 수분의 피부 이동을 활발하게 함으로써 피부를 촉촉하게 하여 피부 기능 회복을 통한 보습 효과를 얻는 보습제 개발은 미진한 상황이다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 인체에 부작용이 없으며 피부 보습 효과가 우수한 새로운 기능성 화장품에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 유래의 엑소좀이 피부에서의 물 이동에 중요한 역할을 하는 AQP3의 발현 증가 및 활성화를 통해 피부 깊숙이 수분을 전달하여 피부 보습에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 피부 보습용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 보습용 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 피부 보습용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 피부 보습을 위한 새로운 조성물의 개발에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀이 피부에서의 물 이동에 중요한 역할을 하는 AQP3의 발현 내지 생성을 증가시키는 것을 확인하고 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 새로운 피부 보습용 기능성 화장료 조성물을 개발하기에 이르렀다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부 보습에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 생체의 항상성을 유지하는 것을 의미한다. "피부 트러블"이란 외부 자극이나 신체적 변화에 의해 피부가 붉게 변하고 가려움증이 나타나며, 심한 경우 작은 돌기나 뾰루지 등이 생기는 현상을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물에 있어서, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물은, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제를 포함할 수 있다. 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물에 있어서, 상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물은, 상기 동결건조제제와, 희석제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 조성물은 현탁액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물은 크림 또는 로션일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물에 있어서, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은, 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부보습, 피부상태 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부보습, 피부건조 예방, 피부건조로 인한 피부 트러블 예방 또는 피부상태 개선 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함하는 피부 보습용 엑소좀 키트를 제공한다. 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시킨다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 엑소좀 키트는, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 이온토포레시스 디바이스를 위치시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 방식으로 사용될 수 있다.
상기 피부 보습용 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부 보습, 피부 건조증 예방, 피부 건조로 인한 피부트러블 예방, 피부 상태의 개선, 피부 미용 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부 보습용 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 엑소좀 키트에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적층되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 엑소좀 키트에 따르면, 상기 이온토포레시스 디바이스로부터 미세전류가 흐름으로써 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하고 피부 내부 깊숙이 침투할 수 있게 된다. 이에 따라 피부 보습에 보다 효과적으로 기여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 피부 보습용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부 보습, 피부 건조 예방, 피부 건조로 인한 피부 트러블 예방, 또는 촉촉하고 윤기가 있는 피부 상태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 피부 보습용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 피부 보습용 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부 보습용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 피부 보습용 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 이온토포레시스 장치를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시키는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함하는 피부 보습용 엑소좀 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착하는 단계와, (b) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 이온토포레시스 디바이스를 위치시키는 단계와, (c) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 포함한다. 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시킨다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스로부터 미세전류가 흐름으로써 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하고 피부 내부 깊숙이 침투할 수 있게 된다. 이에 따라 피부 보습에 보다 효과적으로 기여할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 피부 보습용 조성물에 함유된 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부에서의 물 이동에 중요한 역할을 하는 AQP3의 발현을 증가시킨다. 이에 따라 본 발명의 피부 보습용 조성물은 AQP3의 발현이나 생성을 증가시켜 수분의 피부 이동을 활발하게 함으로써 피부를 촉촉하게 하여 피부 기능 회복을 통한 보습 효과를 얻을 수 있다. 즉, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 조성물은 보습용 기능성 화장품으로서 유용한 기능적 활성, 즉 AQP3의 발현을 유도하는 활성을 가지며, 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부 보습용 기능성 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 피부 보습용 조성물은 피부보습 효과 및 피부건조에 의한 가려움증을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과를 나타내고, 피부건조로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 화장료 조성물을 사람의 좌우측 얼굴에 적용한 경우, 좌우측 모두 피부 각질층 내 수분 함량이 현저히 증가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예의 피부 보습용 화장료 조성물을 사람의 좌우측 얼굴에 적용한 경우, 좌우측 모두 피부 각질층 내 수분 함유량의 변화율이 크게 증가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 6은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 7은 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 8은 도 7의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 피부 보습용 엑소좀 키트(100)의 구성을 나타내는 사시도이다.
도 10은 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트를 사람 피부에 처리하고 처리 전후의 피부 상태를 비교하는 사진이다.
도 11은 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트를 사람 피부에 처치한 경우, 피부 보습이 현저히 개선된 결과를 도시한다.
도 12 및 도 13은 인체 표피 각질세포(human epidermal keratinocyte; HEK)에 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 결과, AQP3(Aquaporin 3)의 발현량이 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 15a 내지 도 15g는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포 유래의 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: 엑소좀의 동결건조
실시예 5-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITME No.: 34424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 14). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 5-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 엑소좀 제품의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 5-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 5-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 15a 내지 도 15g). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+트레할로오스 메티오닌+만니톨 트레할로오스+만니톨 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 15a 도 15b 도 15c 도 15d 도 15e 도 15f 도 15g
도 15a 내지 도 15g 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 6: 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물 제형
(로션의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 3에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(로션)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 3과 같다.
로션의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 1
글리세린 7.375
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 6
세틸 에틸헥사노에이트 5
프로판디올 5
페닐 트리메티콘 3.5
스테아르산 3
1,2-헥산디올 2
판테놀 2
세테아릴 올리베이트 1.8
소르비탄 올리베이트 1.2
디이소스테아릴 말레이트 1
프룩탄 1
암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/VP 코폴리머 0.3
아라키딜 알코올 0.25
베헤닐 알코올 0.15
아라키딜 글루코사이드 0.1
하이드로제네이티드 레시틴 0.1
시어버터 0.09
잔탄검 0.05
라벤더 오일 0.02
베르가모트 오일 0.02
세라마이드엔피 (Ceramide NP) 0.02
오렌지껍질 오일 0.02
피토스핑고신 0.015
팔미토일 테트라펩타이드-7 0.01
팔미토일 트리펩타이드-1 0.01
정제수 잔량
(크림의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 4에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(크림)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 4와 같다.
크림의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 1
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 12
글리세린 9.75
부틸렌글리콜 7
세테아릴알코올 3.5
하이드로제네이티드 식물성오일 3.5
1,2-헥산디올 2
스테아르산 2
페닐트리메티콘 2
호호바씨오일 2
비즈왁스 1.7
글리세릴스테아레이트 1.5
스테아릴알코올 1.45
글리세릴스테아레이트에스이 1
세틸알코올 1
판테놀 1
시어버터 0.88
솔비탄세스퀴올리에이트 0.5
폴리글리세릴-2스테아레이트 0.45
암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머 0.3
하이드로제네이티드 레시틴 0.1
베르가모트오일 0.04
세라마이드엔피 0.04
피토스핑고신 0.03
아이비고드열매추출물 0.0225
한련초추출물 0.0225
라벤더오일 0.02
오렌지껍질오일 0.02
카퍼트리펩타이드-1 0.01
팔미토일 테트라펩타이드-7 0.01
팔미토일 트리펩타이드-1 0.01
칼라민 0.001
정제수 잔량
(마스크팩의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 5에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 얻어진 화장료 조성물을 도포 내지는 침적시킨 마스크팩을 제조하였다. 엑소좀은 4×103 입자/mL의 농도로 마스크팩에 도포 내지는 침적되었다. 각 성분의 함량은 하기 표 5와 같다.
마스크팩의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 0.1
글리세린 3.070045
디프로필렌글리콜 3.03
메틸프로판디올 2
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 1.500025
올리브오일 0.8
1,2-헥산디올 0.7235
폴리솔베이트60 0.7
솔비탄스테아레이트 0.6475
알지닌 0.13
카보머 0.13
하이드록시에틸셀룰로오스 0.13
알란토인 0.1
트레할로오스 0.1
녹차추출물 0.07
부틸렌글리콜 0.07
생강추출물 0.07
스페인감초뿌리추출물 0.07
콥티스뿌리추출물 0.07
수크로오스코코에이트 0.0525
에틸헥실글리세린 0.05
디포타슘글리시리제이트 0.03
디소듐이디티에이 0.02
토코페릴아세테이트 0.02
판테놀 0.02
세라마이드엔피 0.000001
소듐히알루로네이트 0.01
자일리틸글루코사이드 0.004
안하이드로자일리톨 0.0028
자일리톨 0.0012
글루코오스 0.0004
하이드로제네이티드 레시틴 0.000005
향료 0.012
콜레스테롤 0.000001
정제수 잔량
실시예 7: 사람 피부에 대한 보습 효과의 시험
급·만성 신체 질환이 없고 평소 피부 건조증이 있는 20대~30대 여성 21명을 피험자로 선정하고, 실시예 6의 유백색의 로션 및 연한 핑크색의 크림을 하루에 두번(아침과 저녁) 피험자가 스스로 좌우측 얼굴에 도포하도록 하였다. 상기 로션 및 크림 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후에, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)로 안면부의 피부 수분 함량을 측정하여 피부 보습력을 평가하였다. 상기 로션 및 크림에 대한 피부 보습 평가 시험을 실시하였으며, 중도 탈락자 없이 21명의 피험자가 모두 시험을 완료하였다.
좌측과 우측 시험 부위에서 수분측정기(Corneometer)의 측정값 (A.U.)은 상기 로션 및 크림 사용 2주 후에 각각 51.50 및 51.14로 나타났고, 사용 4주 후에는 각각 55.50 및 54.66으로 나타났다(도 3). 또한, 각 시험 부위의 각질층 수분함량 변화는 상기 로션 및 크림 사용 2주 후에 57.81% 및 59.07%로 확인되었고, 사용 4주 후에는 각각 70.09% 및 70.01%로 확인되었다(도 4). 좌측과 우측 시험부위 모두 상기 로션 및 크림 사용 2주 후부터 사용 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (P<0.05)으로 증가한 피부(각질층) 수분 함량을 나타내어, 상기 로션 및 크림이 피부 수분 함량 개선(보습)에 도움을 줄 수 있는 것으로 판단되었다.
한편, 시험대상자가 상기 로션 및 크림을 사용하는 기간 동안 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에도 이상소견은 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습에 있어서 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 8: 피부 보습용 화장료 조성물에 함유되는 줄기세포 유래의 엑소좀의 피부 투과 능력 시험
형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 5).
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 또한, PKH-엑소좀을 돼지 피부 바깥면에 도포하고 부직포를 덮어 준 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 또한, PKH-엑소좀을 부직포와 피부조직 사이에 주입한 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).
이상의 실험결과들을 종합하면, 이온토포레시스에 의해 피부에 미세 전류를 흘려주면서 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 적용할 경우, 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다. 이에 따라 피부 보습에 보다 효과적으로 기여할 수 있다. 따라서, 이온토포레시스 디바이스(피부에 대해 미세전류를 흐르게 하는 장치)를 포함하는 피부 보습용 엑소좀 키트를 이용하여 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 적용할 경우 피부 침투능력이 보다 향상되어 피부 보습 내지는 피부 미용 효과를 보다 극대화시킬 수 있다.
실시예 9: 사람 피부에 대한 피부 보습용 엑소좀 키트의 처치
도 9에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 피부 보습용 엑소좀 키트(100)는 액상 침적 시트 마스크(10)(줄기세포 유래의 엑소좀을 함유하는 조성물이 도포되거나 침적된 흰색 시트 마스크)와 이온토포레시스 디바이스인 경피투과 촉진 시트 마스크(은색 시트 마스크)(20)로 구성되어 있다. 액상 침적 시트 마스크(10)의 표면 내지는 내부에는 줄기세포 유래의 엑소좀(12)이 도포되거나 침적되어 있다. 또한, 경피투과 촉진 시트 마스크(20)에는 미세전류를 발생시키는 전지(22)가 장착되어 있고, 이러한 전지(22)와 전기적으로 연결되어 있는 도전성 패턴(24)이 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 상에 형성되어 전지(22)로부터 발생된 미세전류를 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 전반에 골고루 전달할 수 있다. 도전성 패턴(24)은 금, 은, 또는 구리 등의 도전성 금속이 프린팅되거나 도금(plating)되어 형성된다.
상기와 같은 구성을 갖는 "피부 보습용 엑소좀 키트(100)"를 피부건조 및 피부건조로 인한 가려움증과 관련이 있는 홍조 증상과 피부 트러블이 심한 사람(이하, "case 1"이라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 피부 트러블과 홍조 증상이 완화 내지는 개선되는지를 평가하였다. 또한, 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)를 홍조 증상이 있는 사람(이하, "case 2"라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 전체적인 피부톤과 홍조 증상이 개선되는지를 평가하였다. 5×105 입자의 줄기세포 유래의 엑소좀(12)이 포함된 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 case 1 및 2의 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용하였다.
그 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀(12)을 5×105 입자/마스크의 농도로 함유하는 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(20)로 구성된 "피부 보습용 엑소좀 키트(100)"의 한번의 사용만으로 "case 1"에서 피부 건조로 인한 홍조 및 피부 트러블이 현저히 개선되었고(도 10의 case 1 참조), "case 2"에서도 전체적인 피부톤이 개선되었으며 홍조가 완화되었다(도 10의 case 2 참조). 따라서, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물이 침적된 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(이온토포레시스 디바이스)(20)로 구성된 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)는 피부 보습 효과와, 피부건조와 관련이 있는 홍조 증상 및 피부트러블을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
실시예 10: 사람 피부에 대한 보습 효과의 시험
피부질환을 포함하는 급·만성 신체 질환이 없는 건강한 여성 20명(만 35~59세)에 대해, 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 1×107 입자/mL의 농도로 함유하는 앰플(반투명 유액상)과 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)를 3일에 한번 저녁에 사용하여 피부보습 효과를 시험하였다. 상기 앰플 및 엑소좀 키트(100)의 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후에, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)로 피부 수분량을 측정하여 피부 보습 개선 효과를 평가하였다.
세안 후 상기 앰플의 내용물을 얼굴에 골고루 바르고 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용하였다.
본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)의 사용 전후에 있어서 피부 수분 함유량을 평가한 결과, 사용 전과 비교하여 사용 2주 후, 사용 4주 후에 유의적인 개선 효과가 얻어졌다(도 11의 상단). 또한, 피부 수분 함유량의 변화율이 다른 임상 처치들의 경우 평균 10%인데 비해 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)를 4주 동안 사용한 경우에는 21.383%로서 평균과 대비하여 매우 좋은 것으로 평가되었다(도 11의 하단).
시험 종료 후 유효성 설문조사(Global Assessment of Efficacy)를 실시하였다. 시험대상자가 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100) 사용 후 피부 보습에 대하여 아주좋음(4), 좋음(3), 보통(2), 나쁨(1), 아주나쁨(0)의 5단계로 설문조사에 답하도록 하였다. 실시한 설문조사에서 피부보습 항목에 대해 설문 값의 평균값과 표준편차 및 답변에 대한 시험대상자 수의 백분율을 구하였다. 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)에 대한 설문조사 결과, 피부보습 항목에 대하여 시험대상자의 100%가 보통이상으로 평가하였다. 또한, 시험 종료 후 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100) 사용감에 대한 설문조사에 대하여 시험대상자가 답하도록 하였다. 시험대상자가 피부 촉촉함, 매끄러움, 발림성, 흡수성, 향, 전반적 사용감에 대하여 아주 좋음(4), 좋음(3), 보통(2), 나쁨(1), 아주 나쁨(0)의 5단계로 평가하도록 하였다. 평가항목 별로 설문 값의 평균값과 표준편차 및 답변에 대한 시험대상자 수의 백분율을 구하였다. 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)에 대한 설문평가 결과, 모든 평가항목에 대하여 시험대상자의 100%가 보통이상으로 평가하였다.
한편, 시험대상자가 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)를 사용하는 기간 동안 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에도 이상소견은 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 피부 보습용 엑소좀 키트(100)는 상기와 같은 임상시험을 통해 확인되는 바와 같이 종래의 임상 처치에 비해 우수한 피부 보습 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 11: AQP3 발현 유도 효과의 확인
인체 표피 각질세포(HEK)에 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 경우 AQP3(aquaporin 3) 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 이를 위해 인체 표피 각질세포(human epidermal keratinocyte; HEK, Gibco에서 구입)를 멀티웰 플레이트에 분주하여 배양한 후, (주)세포바이오(대한민국, 서울시 소재)로부터 구입한 지방줄기세포 배양액을 실시예 2의 방법에 따라 분리한 줄기세포 유래의 엑소좀(제1 배치 엑소좀), 또는 실시예 1 및 실시예 2에 따라 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀(제2 배치 엑소좀)을 처리하였다. 상기 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3(Aquaporin 3)의 mRNA 변화량을 측정하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 6과 같다.
리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열
유전자 서열
정방향 프라이머 (5' → 3') 역방향 프라이머 (5' → 3')
AQP3 CCG TGA CCT TTG CCA TGT G (서열번호 1) TAG CAA AGA TGC CGG CTG TG (서열번호 2)
AQP3의 mRNA 변화량을 측정한 결과, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀은 상기 세포에서 AQP3의 mRNA 발현량을 증가시켰다. 즉, 도 12에 도시된 바와 같이, 제1 배치의 줄기세포 유래의 엑소좀을 30 μg/mL 처리 시 인체 표피 각질세포에서의 AQP3의 발현이 음성 대조군에 비해 7.7% 증가하였고, 제1 배치의 줄기세포 유래의 엑소좀 300 μg/mL 처리 시 인체 표피 각질세포에서의 AQP3의 발현이 음성 대조군에 비해 69.4% 증가하였다. 또한, 도 13에 도시된 바와 같이, 제2 배치의 줄기세포 유래의 엑소좀 3 μg/mL 처리 시 인체 표피 각질세포에서의 AQP3의 발현이 음성 대조군에 비해 6.2% 증가하였고, 제2 배치의 줄기세포 유래의 엑소좀 6 μg/mL 처리 시 인체 표피 각질세포에서의 AQP3의 발현이 음성 대조군에 비해 29.7% 증가하였다.
상기와 같은 실험결과들로부터 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부에서의 물 이동에 중요한 역할을 하는 AQP3의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 피부 보습용 조성물은 AQP3의 발현이나 생성을 증가시켜 수분의 피부 이동을 활발하게 함으로써 피부를 촉촉하게 하여 피부 기능 회복을 통한 보습 효과를 얻을 수 있다.
따라서, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 조성물은 보습용 기능성 화장품으로서 유용한 기능적 활성, 즉 AQP3의 발현을 유도하는 활성을 가지며, 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부 보습용 기능성 화장료 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (28)

  1. 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시키는, 피부 보습용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시키는, 피부 보습용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제를 포함하는, 피부 보습용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유하는, 피부 보습용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 동결건조제제와, 희석제를 포함하는, 피부 보습용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수인 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 추가로 포함하는, 피부 보습용 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    화장료 조성물 또는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 크림 또는 로션인, 피부 보습용 조성물.
  13. 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와,
    상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함하는, 피부 보습용 엑소좀 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시키는, 피부 보습용 엑소좀 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 이온토포레시스 디바이스를 위치시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 엑소좀 키트.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취인, 피부 보습용 엑소좀 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적층되어 사용되는 것을 특징으로 하는, 피부 보습용 엑소좀 키트.
  18. (a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 피부 보습용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 치료용을 제외한 피부 보습을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서는 피부 보습용 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  20. 제18항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부 보습용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서는 피부 보습용 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 것을 더 포함하는, 미용방법.
  23. 제22항에 있어서,
    이온토포레시스 장치를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시키는 것을 더 포함하는, 미용방법.
  24. 제18항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
  25. (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착하는 단계와,
    (b) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 이온토포레시스 디바이스를 위치시키는 단계와,
    (c) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 피부 보습용 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스를 수행하는 단계와,
    (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 줄기세포 유래의 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 피부 보습을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 AQP3(Aquaporin 3)의 발현 또는 생성을 증가시키는, 미용방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취인, 미용방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행되는, 미용방법.
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