WO2021125558A1 - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물 - Google Patents

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물 Download PDF

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WO2021125558A1
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hair
composition
blackening
whitening
dyeing
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조병성
김광일
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주식회사 엑소코바이오
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for hair blackening, preventing hair whitening, or for hair dyeing, which includes stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • the present invention relates to a cosmetic method for darkening the hair or dyeing the hair from a light color to a dark color using the composition for blackening hair, preventing hair whitening or hair dyeing.
  • Hair is composed of cuticle, medulla and cortex.
  • the cortex is the most important part of the hair and is located between the medulla and the epidermis while enveloping the medulla.
  • the cortex is a part related to hair strength, elasticity, texture, texture, color, etc.
  • the pigment in the cortex determines the natural color of the hair.
  • Melanin is divided into red-yellow pheomelanin and black-brown eumelanin, and melanin is an important factor that determines hair color.
  • Melanin is produced in melanosomes, which are organelles in melanocytes present in the upper part of the hair, and the produced melanin is transferred to surrounding keratinocytes through the dendrites of melanocytes and then moves upward along with hair growth.
  • Gray hair or gray hair is caused by a decrease in the number of hair melanocytes and a decrease in melanin production due to a decrease in the function of melanocytes. Gray hair appears more clearly in people with dark brown hair than in whites with light hair color, and it is a kind of aging phenomenon that occurs because melanin production stops in melanocytes.
  • black hair dyeing is a temporary method, and when gray hair grows, it must be dyed again, and oxidation-type black hair dyeing has a problem in that it damages the skin by using an oxidizing agent.
  • the component contained in the dye of the hair dye may become an irritant component and cause contact dermatitis or skin allergy. Therefore, it is necessary to develop a cosmetic method for darkening or dyeing hair while minimizing side effects on the scalp and the human body.
  • cell secretome contains various bioactive factors that control cell behavior, and in particular, 'exosome' with intercellular signaling function has been reported in cell secretion. Research on its ingredients and functions is actively underway.
  • extracellular vesicles Cells release various membrane types of ERs to the extracellular environment, and these ERs are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
  • the extracellular vesicles are also called cell membrane-derived ERs, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, they are used separately from exosomes.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers made up of a double phospholipid membrane identical to the structure of the cell membrane, and the inside contains proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differently regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors according to the nature and state of the cell from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, it controls cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflects the characteristics of stem cells related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • exosomes called avatars of cells contain bioactive factors such as growth factors similar to cells, and serve as a carrier for transporting bioactive factors between cells, that is, communication between cells.
  • Exosomes are known not only to be released from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae. .
  • the present inventors have been repeating intensive research on new application fields of stem cell-derived exosomes and grafting with medical or cosmetic technology, and when stem cell-derived exosomes are treated on the scalp, hair changes from light color to dark color By confirming that the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing, a cosmetic composition, and an external preparation for skin comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic method for darkening the hair or dyeing the hair from a light color to a dark color by using the composition for blackening hair, preventing hair whitening or hair dyeing.
  • the present invention is a composition for blackening, preventing hair whitening, or hair dye containing stem cell-derived exosomes as an active ingredient, and using the same to darken hair or change hair color from light color to dark color It provides a cosmetic method for dyeing with
  • extracellular vesicles generally encompasses membrane vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, or equivalents thereof. used in the sense that Depending on the isolation environment, conditions, and methods, etc., the extracellular vesicle may have the same meaning as an exosome, and may have the same or similar size as the exosome, but may also have a meaning including nanovesicles that do not have the composition of the exosome.
  • exosomes refers to an endoplasmic reticulum having a size of several tens to hundreds of nanometers (preferably about 30 to 200 nm) consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of the cell membrane (provided that the separation target is The particle size of exosomes may vary depending on the type of cell used, separation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015)) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differently regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. is known
  • exosome has a nano-sized vesicle structure secreted from stem cells and released into the extracellular space and has a composition similar to that of exosomes (eg, exosome- It means to include all similar vesicles).
  • the type of the stem cell is not limited, but as an example that does not limit the present invention, embryonic stem cells, adult stem cells, embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells or induced pluripotent stem cells (iPSC) It may be a derived mesenchymal stem cell.
  • the adult stem cells include one or more adult stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, and pluripotent stem cells. It may be a stem cell.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, Wharton's jelly and placenta.
  • the type of stem cells is not limited as long as there is no risk of infection by pathogens and does not cause immune rejection, but preferably human-derived stem cells.
  • the stem cell-derived exosomes used in the present invention are effective in preventing hair blackening, dyeing, or hair whitening, and as long as they do not cause adverse effects on the human body, various stem cell-derived exosomes that are used in the art or that can be used in the future It is of course possible to use Therefore, the stem cell-derived exosomes isolated according to the separation method of the embodiments to be described later should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • hair is a thread-like structure made of keratinized epithelial cells and coming out to the skin surface, and includes hair or body hair.
  • hair blackening refers to a phenomenon in which the amount of a colored pigment (eg, melanin pigment) of the hair is increased to make the hair black or to exhibit a dark color. Hair blackening also includes preventing and preventing whitening or graying of hair.
  • a colored pigment eg, melanin pigment
  • hair whitening refers to a phenomenon in which the amount of a color pigment (eg, melanin pigment) of the hair is reduced, so that the hair becomes white or exhibits a pale color.
  • a color pigment eg, melanin pigment
  • the term “dye hair” or “dye hair” means that the amount of a colored pigment is increased to darken the brightness of the hair, or to change the hair color from a light color to a dark color other than black.
  • eumelanin produces brown and black hair
  • pheomelanin is a pale tint that makes blonde hair.
  • red hair color is represented by red and black pigments
  • blonde hair is a result of mixing red and yellow pigments.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention contains stem cell-derived exosomes as an active ingredient.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may include a freeze-dried formulation comprising the stem cell-derived exosome and methionine, mannitol and trehalose as active ingredients. .
  • the weight ratio of methionine, mannitol and trehalose is 1:1:1.
  • the freeze-dried preparation may further contain ascorbic acid and retinol.
  • the weight ratio of methionine, mannitol, trehalose, ascorbic acid and retinol is 9:9:9:0.5:0.5.
  • the composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may include the freeze-drying agent and a diluent.
  • the diluent may be water for injection, physiological saline, phosphate buffer, purified water, or deionized water.
  • the diluent may further include hyaluronic acid or a salt of hyaluronate (eg, sodium hyaluronate).
  • the composition may be a suspension.
  • composition for blackening hair, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as an injection.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may be administered to the scalp by microneedling or injection.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may be a cosmetic composition or an external preparation for skin.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect hair blackening, hair whitening prevention or hair dyeing effect
  • the blending ratio of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention can be appropriately selected according to the type, amount, form, etc. of the additional ingredients as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be included in about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention depends on the degree of blackening or dyeing of the hair, the type of formulation, the formulation method, the patient's age, sex, weight, health status, diet, excretion rate, administration time and administration method. can be adjusted accordingly.
  • the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention when administered to an adult, it may be administered in one to several divided doses at a dose of 0.001 mg/kg to 100 mg/kg per day.
  • composition for blackening, preventing hair whitening or hair dyeing of one embodiment of the present invention is prepared as an external preparation for skin and/or a cosmetic composition, it is usually used in cosmetics or external preparations within the scope of not impairing the effects of the present invention.
  • Ingredients such as moisturizing agents, antioxidants, oily ingredients, ultraviolet absorbers, emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder ingredients, colorants, water-based ingredients, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
  • the external skin preparation and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention is a hair dye used in the past as long as it does not impair its action (hair blackening, hair whitening prevention, or hair coloration, etc.) in addition to stem cell-derived exosomes, and/or Alternatively, a hair bleaching agent may be mixed and used together.
  • the stem cell-derived exosomes of the present invention may be supported on or mixed with at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (eg, sodium hyaluronate, etc.), or a hyaluronic acid gel.
  • the type of the hydrogel is not limited, but may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum.
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
  • the skin external preparation and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be in various forms, such as creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, sprays, aerosols, mists, foundations, powders, etc. can be applied to
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is used for the purpose of blackening hair, preventing hair whitening or hair dyeing
  • the cosmetic formulation may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art.
  • the external preparation for skin and/or cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes ingredients commonly used in external preparations for skin and/or cosmetics, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances. and a carrier.
  • ingredients commonly used in external preparations for skin and/or cosmetics for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances.
  • a carrier for example, a carrier.
  • other ingredients may be appropriately selected and formulated by those skilled in the art without difficulty depending on the type or purpose of use of the external preparation for skin and/or cosmetic composition.
  • the present invention provides a cosmetic method for darkening the hair or dyeing the hair from a light color to a dark color by using the composition for hair blackening, hair whitening prevention or hair dyeing.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention comprises the steps of (a) preparing a composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient, (b) for the blackening of the hair, It includes the step of treating the scalp of a mammal with a composition for preventing hair whitening or dyeing hair.
  • the composition for hair blackening, preventing hair whitening, or hair dyeing may be administered to the scalp by microneedling or injection.
  • composition for hair blackening, preventing hair whitening, or hair dyeing comprising the stem cell-derived exosomes of the present invention as an active ingredient has a hair blackening effect that darkens hair when treated on the scalp and hair dye that changes the hair color from light color to dark color show the effect.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the physical properties of the exosomes obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A shows the particle size distribution and particle number obtained by NTA (nanoparticle tracking analysis).
  • FIG. 1B is a photograph of a particle image taken by TEM (transmitted electron microscopy).
  • FIG. 1C shows the Western blot result for the positive marker of the exosome obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1D shows the Western blot result for the negative marker of the exosome obtained according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1E shows the results of flow cytometry for CD9, CD63 and CD81 in the marker analysis for exosomes obtained according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the result of confirming that there is no cytotoxicity after treating the exosomes obtained according to an embodiment of the present invention to HS68 cells, which are human skin fibroblasts.
  • Figure 3 is a photograph showing the good properties of the lyophilized exosomes according to the method of one embodiment of the present invention.
  • 4A to 4G are photographs of the properties of the lyophilized exosomes for each lyophilization protectant component combination after lyophilization is performed with different combinations of lyophilization protectant components.
  • FIG. 5 is a photograph comparing the hair color before and after treating the scalp of the test subject with the composition for blackening, preventing hair whitening, or dyeing the hair comprising the stem cell-derived exosome as an active ingredient according to an embodiment of the present invention; to be.
  • 6A and 6B are graphs showing that the amount of melanin released outside the cell and the amount of melanin accumulated inside the cell increases when the melanoma cells are treated with the stem cell-derived exosomes according to an embodiment of the present invention.
  • HS68 cells human dermal fibroblasts, were purchased from ATCC and supplemented with 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotics-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific). It was subcultured in the containing DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium at 5% CO 2 , 37° C. conditions.
  • adipose-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 , 37°C conditions. Then, after washing with phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), it was replaced with a serum-free, phenol-free medium and cultured for 1 to 10 days, and the supernatant (hereinafter, cultured solution) was recovered. .
  • trehalose 2 wt% of trehalose was added to the culture medium in order to obtain exosomes having a uniform particle size distribution and high purity.
  • the culture medium was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, wastes, and large particles.
  • the filtered culture solution was immediately separated through the separation process to separate the exosomes.
  • the filtered culture solution was stored in a refrigerator (image below 10 °C) and used for exosome separation.
  • the filtered culture solution was stored frozen in a cryogenic freezer below -60 ° C., and then thawed, followed by exosome isolation. Thereafter, the exosomes were separated from the culture medium using a tangential flow filtration (TFF).
  • TMF tangential flow filtration
  • TFF Tangential Flow Filtration
  • a cartridge filter aka hollow fiber filter; purchased from GE Healthcare
  • a cassette filter purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore
  • TFF filters can be selected by various molecular weight cutoff (MWCO). Exosomes were selectively separated and concentrated by the selected MWCO, and particles smaller than the MWCO, proteins, lipids, nucleic acids, and low molecular weight compounds were removed.
  • a TFF filter of MWCO 500,000 Da was used. While the culture medium was concentrated to a volume of about 1/100 to 1/25 using the TFF method, substances smaller than MWCO were removed to separate the exosomes.
  • the separated and concentrated exosome solution was further desalted and buffer exchanged (diafiltration) using the TFF method.
  • desalting and buffer exchange were performed continuously (continuous diafiltration) or intermittently (discontinuous diafiltration), and at least 4 times, preferably 6 times to 10 times or more, more preferably with respect to the starting volume. This was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more.
  • 2 wt% of trehalose dissolved in PBS was added to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity.
  • the isolated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • TEM transmitted electron microscopy
  • Figure 1C is a result of performing a Western blot for the positive marker of the exosome isolated according to the separation method of an embodiment of the present invention, the presence of CD63, CD9, CD81, Alix and TSG101 markers were confirmed.
  • Anti-CD63, anti-CD9, anti-CD81, anti-Alix and anti-TSG101 were used as antibodies for each marker, respectively.
  • Figure 1D is a result of performing a Western blot for the negative marker of the exosome isolated according to the separation method of one embodiment of the present invention.
  • Anti-GM130 and anti-Calnexin were used as antibodies to each marker, respectively.
  • GM130 and Calnexin are negative markers that should not be present in exosomes when characterizing exosomes.
  • FIG. 1D GM130 and Calnexin were confirmed to be present in the adipose stem cell lysate, but it was confirmed not to be present in the exosomes isolated according to the separation method of one embodiment of the present invention. Therefore, when combining the results of Figures 1C and 1D, it can be seen that the exosomes isolated according to the separation method of one embodiment of the present invention are exosomes satisfying the positive and negative marker characterization.
  • 1E is a result of analyzing the exosomes isolated according to the separation method of an embodiment of the present invention using a flow cytometer, confirming the presence of CD9, CD63 and CD81 markers.
  • an exosome-human CD81 isolation/detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD9 PE-Mouse anti -human CD9
  • PE-Mouse anti-human CD63 purchasedd from BD
  • PE-mouse anti-human CD81 PE-mouse anti-human CD81
  • BD flow cytometer
  • HS68 cells which are human skin fibroblasts
  • HS68 cells were treated with exosomes for each concentration and the cell proliferation rate was confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and then aliquoted to have a confluency of 80 to 90% and cultured at 37° C., 5% CO 2 in an incubator for 24 hours. After 24 hours, the culture medium was removed and the exosomes prepared in Example 2 were treated for each concentration, and cell viability was evaluated while culturing for 24 to 72 hours.
  • the comparative group was based on the number of cells cultured in a normal cell culture medium in which the exosomes were not treated, and it was confirmed that cytotoxicity by the exosomes of the present invention was not observed within the tested concentration range (FIG. 2).
  • a lyophilization protectant containing methionine, mannitol and trehalose was prepared.
  • An aqueous solution in which the freeze-drying protectant was added to 1 mL of an aqueous solution containing ascorbic acid and retinol at 0.5 mg/mL, respectively (manufactured by BioFDNC (Hwasun-gun, Jeollanam-do) was prepared.
  • the freeze-drying protectant was added to a solution containing ascorbic acid and retinol, but an aqueous solution may be prepared by adding the freeze-drying protectant to water for injection, purified water, physiological saline, or deionized water.
  • concentrations of methionine, mannitol and trehalose in the aqueous solution were each 9 mg/mL.
  • freeze-drying equipment manufactured by VIRTIS, ITEM No.: 344424
  • VIRTIS VIRTIS, ITEM No.: 344424
  • Example 5-2 Comparison of properties of exosome products according to lyophilized protective agent components
  • a lyophilization protectant component the properties of the exosomes when the exosomes were lyophilized using various lyophilization protection agents including at least one of methionine, mannitol and trehalose (hereinafter, referred to as a lyophilization protectant component) were compared.
  • a lyophilization protectant component a lyophilization protectant component
  • seven kinds of aqueous solutions were prepared in which the freeze-drying protectant component alone, a combination of two components, or a combination of three components was added.
  • the concentration of each lyophilization protectant component in the aqueous solution was set to 9 mg/mL.
  • Example 5-1 According to the freeze-drying conditions and method of Example 5-1, the exosomes (5 ⁇ 10 9 particles) prepared in Example 2 were mixed in an aqueous solution containing each combination of the freeze-drying protectant components, and then freeze-drying was performed. .
  • Example 6 Clinical trial to confirm the hair dyeing effect of a composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing
  • aqueous solution was prepared by mixing a freeze-dried product (lyophilized exosome prepared in Example 5-1) containing stem cell-derived exosomes at a concentration of 5 ⁇ 10 9 particles/vial with purified water.
  • the composition for blackening, preventing hair whitening, or dyeing hair containing the stem cell-derived exosomes prepared as described above was injected into the scalp of a male test subject having relatively light hair color.
  • the freeze-dried exosome prepared in Example 5-1 was mixed with an aqueous solution and then used as a composition for hair blackening, hair whitening, or hair dyeing, but as an alternative, the exosome prepared in Example 2 (for example, For example, exosomes having a concentration of 1 ⁇ 10 9 particles/mL or more) can be used as a composition for hair blackening, hair whitening, or hair dye after suspending in water for injection.
  • hair photos were taken centered on the crown (refer to the photo marked "before” in FIG. 5). And, after a certain period of time has elapsed after the treatment of the composition for hair blackening, hair whitening, or hair dyeing, a photo of the hair was taken centered on the crown of the subject (refer to the photo marked "after” in FIG. 5).
  • the composition for blackening, preventing hair whitening, or dyeing hair containing the stem cell-derived exosomes of the present invention as an active ingredient has a hair blackening effect that darkens the hair when it is treated on the scalp or reduces the hair color in a light color. It can be seen that there is a hair dye effect that changes the color to a dark color.
  • the hair blackening, hair whitening prevention, or hair dyeing effect of the stem cell-derived exosomes of one embodiment of the present invention prepared in Example 2 was confirmed through the degree of inhibition of melanin production for mouse melanoma.
  • B16-F1 cells purchased from ATCC
  • B16-F1 cells were cultured in a medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin in DMEM lacking phenol red.
  • B16-F1 cells were seeded in a 12-well plate at a density of 4 ⁇ 10 4 cells/mL and then cultured at 37° C. and 5% CO 2 conditions for 24 hours. Then, the stem cell-derived exosomes prepared in Example 2 and ⁇ -MSH ( ⁇ -melanocyte stimulating hormone) (purchased from Sigma Aldrigh) were treated together. ⁇ -MSH was treated with a final concentration of 100 nM as a substance inducing melanin production by stimulating melanoma cells. The effect of increasing melanin production was confirmed by treating the stem cell-derived exosomes prepared in Example 2 together with ⁇ -MSH at a concentration of 3 ⁇ g/mL or 6 ⁇ g/mL. On the other hand, as the melanin production inhibitory material, arbutin (purchased from Sigma Aldrich), a tyrosinase inhibitor involved in melanin production, was used at a concentration of 1 mM.
  • arbutin purchased from Sigma Aldrich
  • B16-F1 cells were treated with ⁇ -MSH alone, stem cell-derived exosomes and ⁇ -MSH, or arbutin and ⁇ -MSH prepared in Example 2, and then cultured at 37° C., 5% CO 2 conditions for 72 hours. After obtaining the culture medium and cells, the amount of melanin released out of the cell and the amount of melanin accumulated inside the cell were measured.
  • Synthetic melanin (purchased from Sigma Aldrich) was dissolved in 1 N ammonium hydroxide (purchased from Sigma Aldrich) at a concentration of 2 mg/mL in order to quantify melanin from the OD405 measurement values obtained through each analysis as described above. This was diluted to prepare standard solutions having concentrations of 20, 10, 5, 2.5, 1.25 and 0 ⁇ g/mL, and absorbance was measured at OD405 using an absorbance measuring instrument (SpectraMax i3X; purchased from Molecular Devices). A quantitative curve was obtained using the measured values, and the amount of melanin secreted out of the cell and the amount of melanin accumulated inside the cell were measured.
  • 1 N ammonium hydroxide purchased from Sigma Aldrich
  • the amount of melanin in each sample measured using the quantitative curve was normalized using the amount of protein in each sample.
  • the amount of melanin measured as described above is the measured value of melanin released out of B16-F1 cells not treated with ⁇ -MSH (indicated as “Normal” in FIG. 6A) and inside B16-F1 cells not treated with ⁇ -MSH. Accumulated melanin measurements (indicated as "Normal” in FIG. 6B) were compared.
  • the stem cell-derived exosomes prepared in Example 2 increased melanin synthesis in melanoma cells and secreted the increased melanin out of melanoma cells to significantly increase the amount of melanin outside the melanoma cells.
  • the stem cell-derived exosomes according to an embodiment of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for hair blackening, preventing hair whitening or hair dyeing, a cosmetic composition and/or an external preparation for skin.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물 및 이를 이용하여 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 두피에 처리하면 모발을 검게 하는 모발 흑화 효과와 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 변화시키는 염모 효과를 나타낸다.

Description

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 이용하여, 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법에 관한 것이다.
모발은 모표피(Cuticle), 모수질(Medulla) 및 모피질(Cortex)로 구성되어 있다. 모피질은 모발의 가장 중요한 부분으로 모수질을 감싸면서 모수질과 모표피 사이에 위치한다. 모피질은 모발 강도, 탄력, 질감, 감촉, 색상 등과 관련된 부분으로 모피질 안의 색소가 모발의 자연 색상을 결정한다.
멜라닌은 적황색인 페오멜라닌(Pheomelanin)과 흑갈색인 유멜라닌(Eumelanin)으로 나뉘며, 멜라닌은 모발의 색상을 결정하는 중요한 인자이다. 멜라닌은 모발상부에 존재하는 멜라노사이트 내의 소기관인 멜라노좀에서 생성되고, 생성된 멜라닌은 멜라노사이트의 수지상 돌기를 통하여 주위의 케라티노사이트로 전달된 후 모발의 성장과 함께 위쪽으로 이동한다.
백발 또는 백모는 모발 멜라노사이트의 수적 감소 및 멜라노사이트의 기능저하에 의한 멜라닌 생성의 감소에 의해 유발된다. 백발은 모발색이 밝은 백인에 비해 흑갈색계의 모발을 갖는 인종에서 더욱 뚜렷하게 나타나며, 멜라노사이트에서 멜라닌 생성이 멈추기 때문에 일어나는 일종의 노화현상이다.
미관상 좋지 않은 백발을 감추기 위하여 염색시술이 사용되고 있으나, 흑발염색은 일시적인 방법으로 백발이 성장하면 다시 염색하지 않으면 안되고, 산화형 흑발염색은 산화제의 사용에 의해 피부에 손상을 주는 문제점이 있다. 특히, 모발 염색약의 염료에 포함되어 있는 성분은 자극성분이 되어 접촉성 피부염 또는 피부 알러지를 일으킬 수 있다. 따라서, 두피 및 인체에 미치는 부작용을 최소화하면서 모발을 검게 하거나 염색하는 미용방법의 개발이 필요하다.
이와 관련하여 검정콩이나 검정깨 등의 천연물이 모발을 검게 하고 백발을 방지한다는 연구결과가 있고, 이러한 연구결과에 기초하여 천연물을 원료로 하는 모발 흑화 내지는 모발 백화 방지용 조성물이 개발되고 있다. 그러나 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 모발 흑화 내지는 모발 백화 방지의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 줄기세포 유래의 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 유래의 엑소좀을 두피에 처리하면 모발이 옅은 색에서 짙은 색으로 변화하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 약학 조성물, 화장료 조성물 및 피부외용제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 이용하여, 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물 및 이를 이용하여 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 모발 흑화, 염모, 또는 모발 백화 방지에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "모발"은 각질화된 상피세포로 이루어져 피부 표면으로 나오는 실 모양으로 된 구조물로서, 머리카락 또는 체모를 포함한다.
본 명세서에서 용어, "모발 흑화"는 모발의 유색 색소(예를 들어 멜라닌 색소)의 양이 증가되어 모발이 검게 되거나 짙은 색을 나타내게 되는 현상을 의미한다. 모발 흑화는 모발의 백화나 백발을 예방 및 방지하는 것도 포함한다.
본 명세서에서 용어, "모발 백화"는 모발의 유색 색소(예를 들어 멜라닌 색소)의 양이 감소되어 모발이 하얗게 되거나 옅은 색을 나타내게 되는 현상을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "염모" 또는 "모발 염색"은 유색 색소의 양이 증가되어 모발의 밝기를 어둡게 하거나, 모발을 옅은 색에서 검정색 이외의 다른 짙은 색으로 변화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 유멜라닌은 갈색과 검정색의 모발을 만들고, 페오멜라닌은 옅은 색의 색조로서 금발을 만든다. 또한, 붉은 모발색은 붉은 색소와 검정 색소에 의해 나타나며, 금발머리는 붉은 색소와 노랑 색소가 혼합된 결과이다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제를 포함할 수 있다. 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물에 있어서, 상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은, 상기 동결건조제제와, 희석제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 조성물은 현탁액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 마이크로니들링 또는 주사에 의해 두피에 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 모발 흑화, 모발 백화 방지 또는 염모 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 모발의 흑화 내지는 염색 정도, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(모발 흑화, 모발 백화 방지 또는 염모 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 염모제 및/또는 모발 백화 방지제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 모발 흑화, 모발 백화 방지 또는 염모 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 클렌징크림, 에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 이용하여, 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 미용 방법은, (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 포유동물의 두피에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 마이크로니들링 또는 주사에 의해 두피에 투여될 수 있다.
본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 두피에 처리하면 모발을 검게 하는 모발 흑화 효과와 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 변화시키는 염모 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 4A 내지 도 4G는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 실험대상자의 두피에 처리하기 전후의 모발색을 비교한 사진이다.
도 6A 및 도 6B는 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀을 멜라노마 세포에 처리한 경우 세포 밖으로 방출된 멜라닌 양과 세포 내부에 축적된 멜라닌 양이 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.
도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: 엑소좀의 동결건조
실시예 5-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×109 입자)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITEM No.: 344424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 5-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 엑소좀 제품의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 5-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 5-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×109 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 4A 내지 도 4G). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 동결건조 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+
트레할로오스		 메티오닌+
만니톨		 트레할로오스+
만니톨		 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 4A 도 4B 도 4C 도 4D 도 4E 도 4F 도 4G
도 4A 내지 도 4G 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 6: 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물의 염모 효과 확인 임상실험
5×109 입자/vial의 농도로 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 동결건조 제품(실시예 5-1에서 준비된 동결건조 엑소좀)을 정제수와 혼합하여 수용액을 준비하였다. 이와 같이 준비된 줄기세포 유래 엑소좀 함유 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 비교적 옅은 모발색을 갖는 남성 실험대상자의 두피에 주사하였다.
한편, 본 실시예에서는 실시예 5-1에서 준비된 동결건조 엑소좀을 수용액과 혼합한 후 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물로 사용하였으나, 대안으로 실시예 2에서 준비된 엑소좀(예를 들어, 1×109 입자/mL 농도 이상의 엑소좀)을 주사용수에 현탁한 후 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물로 사용할 수 있음은 물론이다.
상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 실험대상자에게 주사하기 전에 정수리 부분을 중심으로 모발 사진을 촬영하였다(도 5에서 "before"로 표시된 사진 참조). 그리고, 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물 처리 후 일정 시일이 경과한 다음 실험대상자의 정수리 부분을 중심으로 모발 사진을 촬영하였다(도 5에서 "after"로 표시된 사진 참조).
도 5에 도시된 바와 같이, 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물의 처리 전후의 모발색을 비교한 결과, 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 처리한 경우 처리 전에 비해 모발이 현저하게 짙은 색으로 변화한 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험결과에 따르면, 본 발명의 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 두피에 처리 시 모발을 검게 하는 모발 흑화 효과 또는 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 변화시키는 염모 효과가 있는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 멜라닌 생성 증가 효과
실시예 2에서 준비된 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀의 모발 흑화, 모발 백화 방지 또는 염모 효과를 마우스 멜라노마에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 통해 확인하였다. 상기 멜라노마 세포로는 마우스 흑색종에서 유래한 세포인 B16-F1 세포(ATCC에서 구입)를 사용하였다. B16-F1 세포를 페놀레드가 결핍된 DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 배지에서 배양하였다.
B16-F1세포를 4×104 세포/mL의 밀도로 12-웰 플레이트에 분주한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그런 다음, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀과 α-MSH(α-melanocyte stimulating hormane)(Sigma Aldrigh에서 구입)를 함께 처리하였다. α-MSH는 멜라노마 세포를 자극하여 멜라닌 생성을 유발하는 물질로 최종 100 nM의 농도로 처리하였다. α-MSH와 함께 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀을 3 μg/mL 또는 6 μg/mL의 농도로 처리하여 멜라닌 생성 증가 효과를 확인하였다. 한편, 멜라닌 생성 억제 물질로는 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제 저해제(tyrosinase inhibitor)인 알부틴(arbutin; Sigma Aldrich에서 구입)을 1 mM 농도로 사용하였다.
α-MSH 단독, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀과 α-MSH, 또는 알부틴과 α-MSH를 B16-F1 세포에 처리한 후 72시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후 배양액과 세포를 수득하여 세포 밖으로 방출된 멜라닌 양과 세포 내부에 축적된 멜라닌 양을 측정하였다.
B16-F1 세포 밖으로 방출된 멜라닌 양을 측정하기 위하여 수득한 배양액을 원심분리한 후 흡광도 측정 장비(SpectraMax i3X; Molecular Devices에서 구입)를 사용하여 OD405에서 흡광도를 측정하였다. B16-F1 세포 내부에 축적된 멜라닌 양을 측정하기 위하여 플레이트 바닥에 부착된 B16-F1 세포를 인산염 완충용액(DPBS)로 세척한 후 400 μL/시료의 PRO-PREP 단백질 추출 용액(PRO-PREP Protein Extraction Solution)(Invitron에서 구입)을 처리하고 얼음 위에서 15분간 반응시켜 세포 파쇄액을 얻었다. 수득한 세포 파쇄액을 원심분리하여 세포 찌거기를 제거한 후 상층액의 일부에 대해 BCA 단백질 정량법으로 단백질 정량을 수행하였다. 원심분리 후 얻은 상층액에 10% DMSO가 포함된 1 N NaOH를 첨가하여 80℃에서 30분간 반응시킨 후 흡광도 측정 장비(SpectraMax i3X; Molecular Devices에서 구입)를 사용하여 OD405에서 흡광도를 측정하였다.
상기와 같은 각각의 분석을 통해 얻어진 OD405 측정값으로부터 멜라닌을 정량하기 위하여 합성 멜라닌(Sigma Aldrich에서 구입)을 1 N 수산화암모늄(ammonium hydroxide; Sigma Aldrich에서 구입)에 2 mg/mL의 농도로 녹인 후 이를 희석하여 20, 10, 5, 2.5, 1.25 및 0 μg/mL의 농도를 갖는 표준 용액을 만들고, 흡광도 측정 장비(SpectraMax i3X; Molecular Devices에서 구입)를 사용하여 OD405에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같이 측정된 값들을 이용하여 정량 곡선을 얻어 세포 밖으로 분비된 멜라닌 양과 세포 내부에 축적된 멜라닌 양을 측정하였다. 또한, 상기 정량 곡선을 이용하여 측정된 각 시료의 멜라닌 양은 각 시료의 단백질량을 이용하여 정규화하였다. 상기와 같이 측정된 멜라닌 양을 α-MSH를 처리하지 않은 B16-F1 세포 밖으로 방출된 멜라닌 측정값(도 6A에서 "Normal"로 표시)과, α-MSH를 처리하지 않은 B16-F1 세포 내부에 축적된 멜라닌 측정값(도 6B에서 "Normal"로 표시)과 비교하였다.
그 결과, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀을 6 μg/mL의 농도로 처리한 경우 α-MSH 만을 처리하고 다른 물질은 처리하지 않은 대조군("No treatment")에 비해 멜라노마 세포 내부에 축적된 멜라닌이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었고, 특히 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀(3 μg/mL 및 6 μg/mL)은 대조군("No treatment")에 비해 멜라노마 세포 밖으로 방출된 멜라닌 양을 현저하게 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 6A 및 도 6B).
이러한 실험결과들에 따르면, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래의 엑소좀은 멜라노마 세포에서 멜라닌 합성을 증가시키고 증가된 멜라닌을 멜라노마 세포 밖으로 분비시켜 멜라노마 세포 밖 멜라닌 양을 현저하게 증가시켰음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀은 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 약학 조성물, 화장료 조성물 및/또는 피부외용제의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (13)

  1. 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 유래의 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제를 포함하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    희석제를 추가로 포함하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수인 것을 특징으로 하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 추가로 포함하는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    현탁액인, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물인, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    주사제인, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로니들링 또는 주사에 의해 두피에 투여되는, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    화장료 조성물 또는 피부 외용제인, 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물.
  12. (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물을 포유동물의 두피에 처리하는 단계를 포함하는, 모발을 검게 하거나 모발을 옅은 색에서 짙은 색으로 염색하는 미용방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 모발 흑화용, 모발 백화 방지용 또는 염모용 조성물은 마이크로니들링 또는 주사에 의해 피부에 투여되는, 미용방법.
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