WO2020027467A1 - 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a lyophilized preparation of stem cell-derived exosomes used for the prevention, inhibition, alleviation, improvement or treatment of inflammation, and an anti-inflammatory composition comprising the same as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for preventing, inhibiting, alleviating, ameliorating or treating an inflammatory disease using the anti-inflammatory composition.
  • Inflammation is a defensive response of a living body in response to pathological conditions caused by physical or chemical trauma, infection by bacteria, fungi or viruses, various allergens and the like. Inflammatory responses appear as part of the innate immune response. Inflammatory responses involve a variety of substances and physiological and chemical phenomena. Recent studies have shown that a variety of inflammatory cytokines play an important role in the inflammatory response. The major cytokines involved in the inflammatory response include IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-12, IFN- ⁇ , and their expression and secretion increase and activation are inflammatory mediators. It is associated with a series of complex physiological reactions including secretion, immune cell infiltration, cell migration and tissue destruction, as well as symptoms such as erythema, edema, fever and pain.
  • inflammatory reactions are not a big problem when removing infectious agents and regenerating damaged tissues, but the disease area is restored to normal, but if the infectious agents are not removed or due to internal substances, excessive or persistent inflammatory reactions occur. It causes inflammatory diseases.
  • Nonsteroidal anti-inflammatory agents steroidal anti-inflammatory agents, neuropeptide antagonists, COX inhibitors, antihistamines, and immunosuppressive agents such as cyclosporin A are used for the relief or treatment of inflammatory reactions or the resulting inflammatory diseases, but skin atrophy, vasodilation, pigmentation There are problems that cause side effects such as loss of room, hypersensitivity reactions, resistance, and neutropenia. In addition, these agents have limitations that help control symptoms to an appropriate level, rather than fundamental treatment.
  • the cell secretome contains a variety of bioactive factors that control the behavior (behavior) of the cell, especially in the cell secretion 'exosome (exosome) that has an intercellular signaling function 'Is included, the research on the ingredients and functions are actively in progress.
  • Extracellular vesicles are called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, may be used separately from exosomes.
  • Exosomes are tens to hundreds of nanometers of endoplasmic reticulum consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and regulated differently depending on the environment of the secretory cell.
  • Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
  • Exosomes contain specific genetic materials and bioactive factors depending on the nature and state of the cells from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, it regulates cellular behavior such as cell migration, proliferation and differentiation and reflects stem cell characteristics related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • the exosome called the avatar of the cell contains bioactive factors such as growth factors, similar to the cells, but when the exosomes are stored at room temperature, there occurs a problem of stability that the activity of the bioactive factors is reduced.
  • bioactive factors such as growth factors
  • changes in the physical properties and stability of the overall exosomes depending on the storage time and method, etc. may also lower the activity of the bioactive factors contained in the exosomes.
  • the present inventors have been intensively researching new formulations that can stably maintain and store stem cell-derived exosomes and grafting them with medical or cosmetic technologies, while stabilizing stem cell-derived exosomes, while having excellent anti-inflammatory effects.
  • the present invention has been completed by developing a lyophilized preparation of the derived exosome and an anti-inflammatory composition comprising the same.
  • Another object of the present invention to provide an anti-inflammatory pharmaceutical composition, a functional cosmetic composition and an external preparation for skin containing the anti-inflammatory composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing, suppressing, alleviating, ameliorating or treating an inflammatory disease using the anti-inflammatory composition.
  • the present invention provides a lyophilized preparation of stem cell-derived exosomes used for the prevention, inhibition, alleviation, improvement or treatment of inflammation, and an anti-inflammatory composition comprising the same as an active ingredient.
  • exosomes refers to vesicles of a size ranging from tens to hundreds of nanometers (preferably approximately 30 to 200 nm) consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, provided that Particle size of exosomes can vary depending on the cell type, isolation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes include proteins called exosome cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) and the like.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and regulated differently depending on the environment of the secretory cell. Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
  • exosome has a nano-size vesicle structure secreted by stem cells and released into the extracellular space and a vesicle having a composition similar to exosomes (eg, exosomes- Pseudo vesicles).
  • the type of the stem cells is not limited, but as an example not limiting the present invention, preferably may be mesenchymal stem cells, for example, fat, bone marrow, umbilical cord or cord blood-derived stem cells, more preferably Fat-derived stem cells.
  • the type of the adipose derived stem cells is not limited as long as there is no risk of infection by the pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but preferably, human adipose derived stem cells.
  • stem cell-derived exosomes used in the present invention have an anti-inflammatory effect and do not cause adverse effects on the human body
  • various stem cell-derived exosomes may be used in the art or may be used in the future. Therefore, the stem cell-derived exosomes separated according to the separation method of the embodiments described below should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, it is clearly clarified that the present invention is not limited thereto.
  • the term "iontophoresis” refers to a method of allowing an ionized active ingredient to penetrate the skin with electrical repulsion by changing a skin's electrical environment by applying a potential difference by flowing a microcurrent to the skin to which the active material is applied. Means.
  • the iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current from an external power source flows into the electrode patch on the skin and a microcurrent is introduced into the skin, and a battery is mounted on the electrode patch itself.
  • microcurrents are introduced, the manner in which microcurrents are introduced into the skin through a patch equipped with reversed electrodialysis means for generating a current through the difference in ion concentration between the high and low electrolyte solutions.
  • a patch equipped with reversed electrodialysis means for generating a current through the difference in ion concentration between the high and low electrolyte solutions can be.
  • the present invention is not limited thereto, and various methods of iontophoresis may be used.
  • the anti-inflammatory composition of the present invention is used to prevent, suppress, alleviate, ameliorate or treat an inflammatory disease
  • the inflammatory disease is not limited to the present invention, for example, dermatitis, atopic dermatitis, eczema, bacterial infection, viral infection or fungus.
  • Lyophilized agent of stem cell-derived exosomes for the prevention, inhibition, alleviation, improvement or treatment of inflammation of one embodiment of the present invention comprises stem cell-derived exosomes, methionine, mannitol and trehalose as active ingredients .
  • methionine methionine
  • mannitol mannitol
  • trehalose the weight ratio of methionine, mannitol and trehalose is 1: 1: 1.
  • the lyophilized preparation of the stem cell-derived exosome of one embodiment of the present invention may further contain ascorbic acid and retinol.
  • the weight ratio of methionine, mannitol, trehalose, ascorbic acid and retinol is 9: 9: 9: 0.5: 0.5.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention includes a lyophilized preparation of the stem cell-derived exosomes, and a diluent.
  • the diluent may be water for injection, physiological saline, phosphate buffer, purified water, or deionized water.
  • the diluent may further comprise hyaluronic acid or hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate).
  • the anti-inflammatory composition may be a suspension.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the invention can be administered by microneedling, iontophoresis or injection.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention may be an anti-inflammatory pharmaceutical composition, cosmetic composition or external skin preparation.
  • the anti-inflammatory composition may be prepared as an injection.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • an effective amount of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect an anti-inflammatory effect.
  • the blending ratio of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be appropriately selected depending on the kind, amount, form, etc. of the additional ingredients as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be included in about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight.
  • suitable dosages of the pharmaceutical compositions of one embodiment of the invention include the type of inflammatory disease, the severity of inflammation, the type of formulation, the method of formulation, the age, sex, weight, health condition, diet, excretion rate, time of administration and administration of the patient. It can be adjusted according to the method. For example, when administering the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention to adults, it can be administered in one to several divided doses of 0.001 mg / kg to 100 mg / kg per day.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention is prepared from an external preparation for skin and / or a cosmetic composition
  • components normally used in cosmetics or external preparations for skin such as moisturizers, antioxidants, Oily components, ultraviolet absorbers, emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients and the like can be appropriately blended as necessary.
  • the skin external preparation and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention in addition to the lyophilized preparation of stem cell-derived exosomes or an anti-inflammatory composition comprising the same, does not impair its function (for example, anti-inflammatory effect).
  • Conventionally used anti-inflammatory and / or anti-inflammatory agents can be used together.
  • the lyophilized preparation of the stem cell-derived exosomes of the present invention or an anti-inflammatory composition comprising the same may be hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel. It may be supported or mixed.
  • the type of the hydrogel is not limited, but preferably, the gel may be a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum.
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention may include, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, and aerosols. It can be applied to various forms such as, mist, foundation, powder and oil paper.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition may be applied or deposited on at least one surface of a patch, mask pack or mask sheet.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is used for the purpose of preventing, inhibiting, alleviating or ameliorating inflammation
  • the cosmetic formulation may be prepared in any formulation commonly prepared in the art.
  • the external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention comprises ingredients conventionally used in external preparations for skin and / or cosmetics, such as conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. And a carrier.
  • ingredients conventionally used in external preparations for skin and / or cosmetics such as conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings.
  • a carrier e.g., a carrier.
  • other ingredients may be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the kind or purpose of use of the external preparation for skin and / or cosmetic composition.
  • the present invention also provides a method for preventing, inhibiting, alleviating, ameliorating or treating an inflammatory disease using the anti-inflammatory composition.
  • a method of preventing, inhibiting, alleviating, ameliorating or treating an inflammatory disease of an embodiment of the present invention includes the steps of (a) preparing the anti-inflammatory composition, and (b) treating the anti-inflammatory composition at an inflammatory disease site. do.
  • the anti-inflammatory composition may be administered to the skin of a mammal by microneedling, iontophoresis or injection.
  • Method of preventing, inhibiting, alleviating, improving or treating an inflammatory disease of an embodiment of the present invention (c) to conduct iontophoresis by flowing a microcurrent to the skin of the mammal treated with the anti-inflammatory composition And (d) delivering the anti-inflammatory composition into mammalian skin through the microcurrent.
  • the anti-inflammatory composition is, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, It can be applied to various types of pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, aerosols, mists, foundations, powders, and oily papers.
  • the anti-inflammatory composition may be applied or deposited on at least one surface of a mask pack, a mask sheet or a patch.
  • the step (b) includes (b1) applying the anti-inflammatory composition directly to the mammal's skin, (b2) It may be carried out by contacting or attaching a mask pack, a mask sheet or a patch to which the anti-inflammatory composition is applied or deposited on the skin of the mammal, or by sequentially proceeding with (b1) and (b2).
  • At least one surface of the mask pack, mask sheet, or patch may include a hydrogel, hyaluronic acid, and hyaluronic acid salt (eg, Sodium hyaluronate, etc.), or at least one of the hyaluronic acid gels may be applied.
  • the type of the hydrogel is not limited, but may be preferably a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol. The gelling polymer and polyhydric alcohol may be exemplified in the foregoing description.
  • step (c) may be performed by contacting or attaching an iontophoresis device to the skin of the mammal.
  • the iontophoresis device may be a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a battery, a mercury battery, a lithium battery, And at least one cell selected from the group consisting of nickel-cadmium cells, and reverse electrodialysis cells.
  • Lyophilized preparation of the stem cell-derived exosomes of the present invention or an anti-inflammatory composition comprising the same as an active ingredient has excellent anti-inflammatory effect while stabilizing stem cell-derived exosomes, in particular, stem cell-derived exosomes isolated and purified from stem cell culture medium. Compared to the excellent anti-inflammatory effect.
  • the lyophilized preparation of the stem cell-derived exosome of the present invention or an anti-inflammatory composition comprising the same as an active ingredient can be used to effectively prevent, suppress, alleviate, improve or treat an inflammatory reaction or an inflammatory disease.
  • FIG. 1 shows the results of physical characterization of the stem cell-derived exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A shows particle size distribution and number of particles obtained by nanoparticle tracking analysis (NTA).
  • FIG. 1B is a particle image photograph taken with transmitted electron microscopy (TEM).
  • FIG. 1C shows Western blot results for the positive markers of stem cell derived exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • “D” shows Western blot results for negative markers of stem cell derived exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 1E shows the results of flow cytometry for CD9, CD63 and CD81 in the marker analysis of stem cell derived exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows the results confirmed that there is no cytotoxicity after treating the stem cell-derived exosomes according to an embodiment of the present invention to HS68 cells, which are human skin fibroblasts.
  • Figure 3 is a photograph showing the good properties of the lyophilized exosomes according to the method of one embodiment of the present invention.
  • Figures 4a to 4g is a picture of the properties of the lyophilized exosomes for each combination of lyophilized protective agent components after performing a different combination of lyophilized protective agent components and lyophilization.
  • 5 to 8 are graphs showing the results of inflammatory cytokine analysis using a multiplex panel, the stem cell-derived exosomes prepared in Example 2 together with LPS for RAW 264.7 cells (exo separated and purified from stem cell culture medium) 2) concentrations (based on the number of particles per mL) indicate that the production of IL- ⁇ , IL-6, IL-27, and IFN- ⁇ induced by LPS decreases in a concentration-dependent manner of exosomes.
  • 9 to 12 are graphs showing the results of inflammatory cytokine analysis using the multiplex panel, and the lyophilized preparation of the stem cell-derived exosome prepared in Example 5-1 with LPS for RAW 264.7 cells
  • concentration based on the number of particles per mL
  • HS68 cells which are human dermal fibroblasts, were purchased from ATCC and were prepared by 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific). Passage was carried out in DMEM (purchased by ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Fat-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. according to cell culture methods known in the art. Then, washed with phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), and then incubated with serum-free and phenol-free medium for 1 to 10 days, and the supernatant (hereinafter, culture) was recovered. .
  • exosomes In the separation of exosomes, 2% by weight of trehalose was added to the culture to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity. After the addition of trehalose, the culture solution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste, and large particles. The filtered culture immediately separated exosomes through a separation process. In addition, the filtered culture was stored in a refrigerator (image 10 °C or less) and used for exosome separation. In addition, the filtered culture was frozen and stored in a cryogenic freezer of -60 °C or less and thawed and then exosomes were separated. Thereafter, exosomes were separated from the culture using a tangential flow filtration device (TFF).
  • TMF tangential flow filtration device
  • Example 1 the exosomes were separated from the culture medium filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and the TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for concentration, desalting, and diafiltration.
  • the filter for the TFF method was a cartridge filter (aka hollow fiber filter; purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore).
  • TFF filters can be selected by various molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by the selected MWCO, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, and small molecule compounds smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da TFF filter was used to isolate and concentrate the exosomes.
  • the culture solution was concentrated to a volume of 1/100 to 1/25 by using the TFF method, while exosomes were separated by removing substances smaller than MWCO.
  • the separated and concentrated exosome solution was further subjected to desalting and diafiltration using the TFF method.
  • desalting and buffer exchange were carried out continuously or discontinuous diafiltration, at least 4 times, preferably 6 to 10 times, more preferably, relative to the starting volume. It was performed using a buffer solution having a volume of at least 12 times.
  • To the buffer solution was added 2% by weight of trehalose dissolved in PBS to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity.
  • the isolated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • the uniformity and size of the isolated exosomes were analyzed using a transmitted electron microscopy (TEM).
  • TEM transmitted electron microscopy
  • 1C is a result of Western blot for the positive marker of the exosomes separated according to the separation method of one embodiment of the present invention, confirming the presence of the CD63, CD9, CD81, Alix and TSG101 markers.
  • Anti-CD63, anti-CD9, anti-CD81, anti-Alix and anti-TSG101 were used as antibodies to each marker, respectively.
  • Figure 1D is the result of performing a Western blot for the negative marker of the exosomes separated according to the separation method of one embodiment of the present invention.
  • Anti-GM130 and anti-calnexin were used as antibodies to each marker, respectively.
  • GM130 and Calnexin are negative markers that should not be present in exosomes when characterizing exosomes.
  • GM130 and Calnexin (Calnexin) was found to be present in the lysate of fat stem cells, it was confirmed that it does not exist in the exosomes isolated according to the separation method of one embodiment of the present invention. Therefore, when combining the results of FIGS. 1C and 1D, it can be seen that the exosomes separated according to the separation method of one embodiment of the present invention are exosomes that satisfy the positive marker and negative marker characterization.
  • Figure 1E confirmed the presence of the CD9, CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer for the exosomes separated according to the separation method of one embodiment of the present invention.
  • an exosome-human CD81 separation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD9 PE-Mouse anti -human CD9
  • PE-Mouse anti-human CD63 purchasedd from BD
  • BD PE-mouse anti-human CD81 Markers were then stained using a flow cytometer (ACEA Biosciences).
  • HS68 cells which are human skin fibroblasts
  • HS68 cells were treated with exosomes at different concentrations, and cell proliferation rates were confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and then aliquoted to have a confluency of 80-90% and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed and the exosomes prepared in Example 2 were treated for each concentration to incubate for 24 to 72 hours to evaluate cell viability.
  • WST-1 reagent purchased from Takara
  • MTT reagent purchased from Sigma
  • CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
  • Aramamar blue reagent Measurements were made using alamarBlue reagent (purchased from ThermoFisher Scientific) and a microplate reader (purchased from Molecular Devices).
  • the comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosomes, it was confirmed that no cytotoxicity by the exosomes of the present invention within the concentration range tested (Fig. 2).
  • Lyophilization protectors including methionine, mannitol and trehalose were prepared for lyophilization of exosomes.
  • An aqueous solution to which the lyophilized protective agent was added was prepared in 1 mL of an aqueous solution (produced by Biof.D. Co., Ltd., Hwasun-gun, South Korea) containing ascorbic acid and retinol at 0.5 mg / mL, respectively.
  • the lyophilized protective agent is added to the solution containing ascorbic acid and retinol, but an aqueous solution may be prepared by adding the lyophilized protective agent to water for injection, purified water, physiological saline, or deionized water.
  • concentrations of methionine, mannitol and trehalose in the aqueous solution were set to 9 mg / mL, respectively.
  • Example 2 After mixing the exosomes (5 ⁇ 10 8 particles) prepared in Example 2 to the aqueous solution containing a lyophilized protective agent and freeze using the lyophilization equipment (Manufacturer: VIRTIS, ITME No .: 34424) under the conditions of Table 1 below Drying was performed. Lyophilization was carried out in the order of conditions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 of Table 1.
  • Freeze Drying Conditions Total time (min) 4320 Condition Time (min) Temperature (°C) Pressure (mmHg) One 700 -50 760 2 60 -50 760 3 999 -50 0 4 999 -50 0 5 999 -50 0 6 370 -50 0 7 120 -20 0 8 73 10 0
  • Example 5-1 the properties of exosomes when the exosomes were lyophilized using various lyophilized protective agents including at least one of methionine, mannitol and trehalose (hereinafter referred to as lyophilized protective ingredient components) were compared.
  • lyophilized protective ingredient components including at least one of methionine, mannitol and trehalose
  • lyophilized protective ingredient components were compared.
  • lyophilized protective ingredient components seven kinds of aqueous solutions in which a lyophilized protective agent component alone, a combination of two components, or three component combinations were added.
  • the concentration of each lyophilized protective agent component in the aqueous solution was adjusted to 9 mg / mL.
  • the exosomes (5 ⁇ 10 8 particles) prepared in Example 2 were mixed with an aqueous solution containing each combination of lyophilized protective agent components and then lyophilized. .
  • the exo-drying of the exosomes using the lyophilized protective agent composed of the combination of methionine, mannitol and trehalose of the present invention showed the best product appearance.
  • the exosomes lyophilized by the combination of one or two of the three components were found to be poor in product appearance than in the present invention.
  • RAW 264.7 cells were suspended in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; purchased from ThermoFisher Scientific) medium supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin and then 2.5 ⁇ 10 4 cells / well in 96-well plates. Inoculated at a density of and the stem cell-derived exosomes (exosomes isolated and purified from stem cell culture medium) prepared in Example 2 were treated at different concentrations (based on the number of particles per mL), followed by 37 ° C and 5% CO 2 incubator. Incubated for 24 hours at.
  • DMEM Dynabecco Modified Eagle Medium
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • penicillin-streptomycin penicillin-streptomycin
  • the lyophilization agent (5 ⁇ 10 9 particles / vial) of the stem cell-derived exosome of Example 5-1 was mixed with the culture medium in the same manner as the stem cell-derived exosome treatment described above. After diluting the aqueous solution (anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention) by concentration (based on the number of particles per mL), the treated RAW 264.7 cells were incubated for 24 hours in 37 °C, 5% CO 2 incubator. Meanwhile, dexamethasone was used as the positive control material (denoted DEX in FIGS. 5 to 12).
  • an MTT assay was performed to measure the change in cell viability by stem cell-derived exosomes and the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention and to correct the amount of cytokine production.
  • the culture medium of the finished RAW 264.7 cells was exchanged with DMEM medium containing 0.5 mg / mL Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (purchased from Sigma) and incubated for 1 hour. After removing the supernatant so that the formazan (formazan) formed on the cell culture plate is not scattered, and dissolved with dimethyl sulfoxide (purchased from AMRESCO), the absorbance was measured at 570 nm to confirm cell viability. Each cytokine (IL- ⁇ , IL-6, IL-27 and IFN- ⁇ ) production was corrected by cell viability.
  • inflammatory cytokine analysis using a multiplex panel IL- ⁇ , IL-induced by LPS when the stem cell-derived exosomes with LPS for RAW 264.7 cells 6, IL-27 and IFN- ⁇ production was confirmed that the concentration-dependent decrease in stem cell-derived exosomes.
  • inflammatory cytokine analysis using a multiplex panel induced by LPS even when treated with an anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention with LPS for RAW 264.7 cells It was confirmed that the production of IL- ⁇ , IL-6, IL-27 and IFN- ⁇ is significantly reduced depending on the concentration of the anti-inflammatory composition.
  • the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention maintains the anti-inflammatory efficacy of stem cell-derived exosomes containing as an active ingredient, and changes in physical properties of stem cell-derived exosomes during lyophilization, storage and distribution It can be seen that there is no. In particular, comparing the anti-inflammatory efficacy of the stem cell-derived exosomes (Figs. 5 to 8) and the anti-inflammatory efficacy of the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention (Figs.
  • stem cell-derived exosomes are 2.0 ⁇ 10 9 While it does not inhibit the production of the four inflammatory cytokines at a concentration of particle number / mL or inhibits only about 40%, the anti-inflammatory composition of one embodiment of the present invention has a similar concentration of 2.5 ⁇ 10 9 particle number / mL. It was confirmed that the suppression of the production of the four inflammatory cytokines by about 90% or more. Therefore, the anti-inflammatory composition of the present invention can be useful in preventing, inhibiting, alleviating, improving or treating inflammatory diseases by stabilizing the stem cell-derived exosomes in a commercially available manner and showing much better anti-inflammatory effect than the stem cell-derived exosomes. have.

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Abstract

본 발명은 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물을 제공한다. 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물은 줄기세포 유래 엑소좀을 안정화시키면서도 항염 효과가 우수하며, 특히 줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 줄기세포 유래 엑소좀에 비해 월등히 뛰어난 항염 효능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물은 염증반응 내지는 염증성 질환을 효과적으로 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물
본 발명은 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항염조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
염증은 물리적 또는 화학적 외상, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스에 의한 감염, 각종 알레르기 유발 물질 등에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 생체의 방어 반응이다. 염증반응은 선천성 면역 반응의 일환으로 나타난다. 염증반응에는 다양한 물질 및 생리·화학적 현상이 관여하는데, 최근의 연구에 따르면 다양한 염증성 사이토카인이 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 염증반응에 관여하는 주요 사이토카인으로는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-β 등이 있으며, 이들의 발현량 및 분비량 증가와 활성화는 염증매개물질 분비, 면역세포 침윤, 세포 이동 및 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열 및 통증 등의 증상과 관련이 있다.
일반적으로, 염증반응은 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하면 큰 문제가 되지 않고 질환 부위가 정상으로 회복되지만, 감염원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 급·만성 염증성 질환을 유발하게 된다.
염증반응이나 이로 인한 염증성 질환의 완화 내지는 치료를 위해 비스테로이드계 항염제, 스테로이드계 항염제, 신경 펩타이드 길항제, COX 억제제, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제를 사용하지만, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 과민 반응, 내성, 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한, 이들 약제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 한계도 있다.
최근에는 천연물을 이용한 염증성 질환 치료제나 기능성 화장품 개발에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 염증성 질환 치료제나 기능성 화장품의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 항염 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 실질적인 항염 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 엑소좀을 실온에서 보관할 경우 생체활성 인자들의 활성이 저하되는 안정성의 문제가 발생한다. 또한, 엑소좀을 단순 냉장 보관할 경우에도 보관 시간 및 방법 등에 따라 전체적인 엑소좀의 물성 및 안정성에 변화가 생기고, 엑소좀에 포함된 생체활성 인자들의 활성도 저하될 수 있다.
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 유래 엑소좀을 안정화시키면서도 항염 효과가 우수한 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 포함하는 항염조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항염조성물을 포함하는 항염증 약학 조성물, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항염조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀은 항염 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 항염조성물은 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용되며, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증, 궤양성 대장염, 관절염, 류머티스성 관절염, 간염, 신장염 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위한 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제는 줄기세포 유래 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함한다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 항염조성물은 상기 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제와, 희석제를 포함한다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 항염조성물은 현탁액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 항염조성물은 마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 항염조성물은 항염증 약학 조성물, 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 상기 항염조성물은 주사제로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 항염조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 염증 질환의 종류, 염증의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편. 본 발명의 일 구체예의 항염조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 포함하는 항염조성물 이외에, 그 작용(예를 들어, 항염 효과 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 항염제 및/또는 소염제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 포함하는 항염조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 염증의 예방, 억제, 완화 또는 개선 등을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항염조성물을 이용하여, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법은, (a) 상기 항염조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 항염조성물을 염증성 질환 부위에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 항염조성물은 마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 포유동물의 피부에 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법은, (c) 상기 항염조성물이 처리된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 항염조성물을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 항염조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항염조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 항염조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 항염조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함할 수 있다.
본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물은 줄기세포 유래 엑소좀을 안정화시키면서도 항염 효과가 우수하며, 특히 줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 줄기세포 유래 엑소좀에 비해 월등히 뛰어난 항염 효능을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항염조성물은 염증반응 내지는 염증성 질환을 효과적으로 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 4a 내지 도 4g는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
도 5 내지 도 8은 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과를 도시한 그래프로서, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀(줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 엑소좀)을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 엑소좀의 농도의존적으로 감소하는 것을 나타낸다.
도 9 내지 도 12는 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과를 도시한 그래프로서, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 실시예 5-1에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제를 배양배지와 혼합하여 희석한 수용액을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 동결건조제제의 농도의존적으로 현저하게 감소하는 것을 나타낸다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.
도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: 엑소좀의 동결건조
실시예 5-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITME No.: 34424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 5-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 동결건조 엑소좀의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 5-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 5-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 4a 내지 도 4g). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 동결건조 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+트레할로오스 메티오닌+만니톨 트레할로오스+만니톨 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 4a 도 4b 도 4c 도 4d 도 4e 도 4f 도 4g
도 4a 내지 도 4g 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 6: 염증성 사이토카인 생성 감소 효과 확인
마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 실시예 2의 줄기세포 유래 엑소좀과 실시예 5-1의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제의 염증성 사이토카인 생성 감소 효과를 다음과 같이 확인하였다.
RAW 264.7 세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 96웰 플레이트에 2.5×104 세포/웰의 밀도로 접종하였고, 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀(줄기세포 배양액으로부터 분리·정제된 엑소좀)을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 또한, 전술한 줄기세포 유래 엑소좀 처리 방식과 동일한 방식으로, RAW 264.7 세포에 대해 실시예 5-1의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제(5×109 입자/vial)를 배양배지와 혼합하여 희석한 수용액(본 발명의 일 구체예의 항염조성물)을 농도별(mL 당 입자수 기준)로 처리한 후, 처리된 RAW 264.7 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 한편, 양성대조군 물질로는 덱사메타손을 사용하였다(도 5 내지 도 12에 DEX로 표기됨).
그리고 나서, 100 ng/mL의 LPS(Sigma에서 구입)를 처리하였고 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 RAW 264.7 세포의 활성화를 유도하였다.
배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 상등액(Culture supernatant)을 수거하였고, 배양 상등액 내의 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량을 LEGENDplexTM 비드-기반 면역 측정법(bead-based immnnoassay) 마우스 염증 패널(mouse inflammation panel)(Biolegend에서 구입) 및 노보사이트 유세포 분석기(NovoCyte Flow Cytometer)(ACEA에서 구입)를 이용하여 측정하여 항염증 효과를 확인하였다.
또한, 줄기세포 유래 엑소좀과 본 발명의 일 구체예의 항염조성물에 의한 세포 생존율 변화 측정과 이를 통한 사이토카인 생성량 보정을 위하여 MTT 어세이를 수행하였다. 배양이 끝난 RAW 264.7 세포의 배양 배지를 0.5 mg/mL 티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)(Sigma에서 구입)를 포함한 DMEM 배지로 교환하였고 1시간 동안 배양하였다. 이후 세포배양 플레이트 바닥에 형성된 포르마잔(formazan)이 흩어지지 않게 상등액을 제거하였고 디메틸 설폭시드(Dimethyl Sulfoxide)(AMRESCO에서 구입)로 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다. 그리고 각각의 사이토카인(IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β) 생성량을 세포 생존율로 보정하였다.
도 5 내지 도 8에 도시된 바와 같이, 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 줄기세포 유래 엑소좀의 농도의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 9 내지 도 12에 도시된 비와 같이, 멀티플렉스 패널을 이용한 염증성 사이토카인 분석 결과, RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 일 구체예의 항염조성물을 처리한 경우에도 LPS에 의해 유도되는 IL-β, IL-6, IL-27 및 IFN-β의 생성량이 항염조성물의 농도의존적으로 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 일 구체예의 항염조성물은 유효성분으로 함유하고 있는 줄기세포 유래 엑소좀의 항염 효능을 안정하게 유지하고 있으며, 동결건조, 보관 및 유통 과정에서 줄기세포 유래 엑소좀의 물성 변화가 없음을 알 수 있다. 특히, 줄기세포 유래 엑소좀의 항염 효능(도 5 내지 도 8)과 본 발명의 일 구체예의 항염조성물의 항염 효능(도 9 내지 도 12)을 비교하면, 줄기세포 유래 엑소좀은 2.0×109 입자수/mL의 농도에서 상기 4종의 염증성 사이토카인의 생성을 억제하지 못하거나 대략 40% 정도만 억제하지만, 본 발명의 일 구체예의 항염조성물은 유사한 농도인 2.5×109 입자수/mL의 농도에서 상기 4종의 염증성 사이토카인의 생성을 대략 90% 이상 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 항염조성물은 줄기세포 유래 엑소좀을 상업적으로 활용가능하도록 안정화시키면서도 줄기세포 유래 엑소좀 보다도 훨씬 우수한 항염 효능을 나타내어 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (17)

  1. 줄기세포 유래 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는, 염증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위한 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제.
  2. 제1항에 있어서,
    아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유하는, 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제.
  3. 줄기세포 유래 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제와,
    희석제를 포함하는 항염조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 또는 탈이온수인 것을 특징으로 하는, 항염조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 추가로 포함하는, 항염조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    현탁액인, 항염조성물.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 투여되는, 항염조성물.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학 조성물, 화장료 조성물 또는 피부 외용제인, 항염조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    주사제인 것을 특징으로 하는, 항염조성물.
  10. (a) 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 항염조성물을 준비하는 단계와, (b) 상기 항염조성물을 염증성 질환 부위에 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 항염조성물은 마이크로니들링, 이온토포레시스 또는 주사에 의해 피부에 투여되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    (c) 상기 항염조성물이 처리된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 항염조성물을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 항염조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항염조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (b1) 상기 항염조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 항염조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 이온토포레시스 디바이스를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시켜 수행되는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하는, 염증성 질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
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