WO2019231050A1 - 피부 보습 및 소양감 개선을 위한 화장료 조성물 - Google Patents

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WO2019231050A1
WO2019231050A1 PCT/KR2018/010262 KR2018010262W WO2019231050A1 WO 2019231050 A1 WO2019231050 A1 WO 2019231050A1 KR 2018010262 W KR2018010262 W KR 2018010262W WO 2019231050 A1 WO2019231050 A1 WO 2019231050A1
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cosmetic composition
skin
exosomes
present
mask
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PCT/KR2018/010262
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조병성
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주식회사 엑소코바이오
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    • A23V2200/318—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on skin health and hair or coat

Definitions

  • the present invention relates to a novel functional cosmetic composition for improving skin moisturizing and pruritus.
  • the present invention relates to providing a cosmetic method for controlling the condition of the mammalian skin by improving the skin moisturizing and dryness except for the treatment, using the cosmetic composition.
  • Skin itching or pruritus is a sensation that is common in most skin disorders along with pain, and can be defined as an unpleasant sensation that causes the desire to scratch or rub the skin in the clinic.
  • Scratching the skin due to itching can lead to injuries and bacterial infections and inflammation. These bacterial infections and inflammations activate immune cells, such as T-cells and macrophages, and secrete several cytokines and the like, further exacerbating the itch. Patients with itching scratch the affected area consciously or unconsciously. Severe scratching or rubbing of the affected area can result in severe scratches and various side effects such as erythema, cracks, ulcers, hives or pigmentation.
  • TSLP thymic stromal lymphopoietin
  • stratum corneum of the skin contains structures and substances that store moisture and prevent evaporation, which plays a very important role in maintaining the body's moisture.
  • the moisturizing condition of the skin may deteriorate and dryness may easily occur.
  • the dryness of the skin may cause itching or worsening.
  • skin itch is closely related to skin moisturization.
  • ceramide lipid complex In order to improve skin itch, a method of applying a ceramide lipid complex to moisturize and restore the skin barrier, or antihistamines, steroids, antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anesthetics, immunosuppressants, and phototherapy has been generally used. .
  • these methods have the problem of showing specificity depending on the type of itching, with temporary or limited therapeutic effects, and corticosteroids and corticosteroids need to be used for a short time in acute or severe cases considering side effects. .
  • An object of the present invention is to provide a novel functional cosmetic composition for improving skin moisturizing and pruritus.
  • Another object of the present invention to provide a cosmetic method for controlling the condition of the skin of the mammal by improving the skin moisturizing and dryness except for the treatment using the cosmetic composition.
  • the present inventors have conducted intensive studies on the development of new compositions for the prevention, inhibition, alleviation or improvement of pruritus caused by skin moisturizing and skin dryness, and thus effective phytosphingosine, ceramide nP, exosomes, panthenol and the like.
  • a new functional cosmetic composition containing as a component has been developed.
  • exosomes refers to vesicles of a size ranging from tens to hundreds of nanometers (preferably approximately 30 to 200 nm) consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, provided that Particle size of exosomes may vary depending on the cell type, isolation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes include proteins called exosome cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) and the like.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and regulated differently depending on the environment of the secretory cell. Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.
  • exosome is secreted from various animals, plants, bacteria, fungi, algae, etc. cells, preferably stem cells and released into the extracellular space It is meant to include all vesicles (eg, exosome-like vesicles) having a nano-size vesicle structure and having a composition similar to exosomes.
  • the type of the stem cells is not limited, but as an example, which does not limit the present invention, preferably may be mesenchymal stem cells, for example, fat, bone marrow, umbilical cord or cord blood-derived stem cells, more preferably Fat-derived stem cells.
  • the type of the adipose derived stem cells is not limited as long as there is no risk of infection by the pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but preferably, human adipose derived stem cells.
  • the exosomes used in the present invention are effective in preventing, inhibiting, alleviating, improving or treating skin moisturizing, itching, and various exosomes that are used in the art or may be used in the future as long as they do not cause adverse effects on the human body. Of course it can. Therefore, the exosomes separated according to the separation method of the embodiments described below should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, it will be apparent that the present invention is not limited thereto.
  • skin itching is not particularly limited, and as an example, itching by skin drying; Itching due to urticaria; Itching by insect bites; Itching caused by sweating, acne, sores, frostbite, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or psoriasis; Itching caused by various skin diseases; Scalp and itching.
  • the present invention does not exclude skin itch of various causes other than skin itch listed above.
  • the present invention includes all itching known in the art, for example dermatological cause itch, systemic cause itch, neuropathic cause itch and psychogenic cause itch.
  • skin moisturizing means maintaining the homeostasis of the living body by appropriately controlling the moisture loss (moisture evaporation) of the skin and the like.
  • Cosmetic composition of one embodiment of the present invention phytosphingosine, ceramide N-P and exosomes as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, aerosols, mists, foundations, It can be applied to various forms such as powder and oil paper.
  • the cosmetic composition may be applied or deposited on at least one side of the patch, mask pack or mask sheet.
  • Cosmetic composition of one embodiment of the present invention is characterized in that the lotion.
  • the lotion may further include at least one of panthenol, fructan, or shea butter.
  • the lotion may further include at least one of palmitoyl tetrapeptide-7 or palmitoyl tripeptide-1.
  • Cosmetic composition of one embodiment of the present invention is characterized in that the cream.
  • the cream may further comprise at least one of panthenol, calamine, or shea butter.
  • the lotion may further include at least one of palmitoyl tetrapeptide-7 or palmitoyl tripeptide-1.
  • Cosmetic composition of one embodiment of the present invention can reduce the amount of mRNA expression or production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin).
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • components commonly used in cosmetics such as moisturizers, antioxidants, oily ingredients, ultraviolet absorbers, emulsifiers, surfactants, thickeners, within the range of not impairing the effects of the present invention , Alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients and the like can be appropriately blended as necessary.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention in addition to the above components, a conventionally used pruritus treatment and / or moisturizing agent is mixed together without impairing its action (such as skin dryness or alleviation or improvement of pruritus symptoms caused by it) Can be used.
  • the composition may be supported or mixed with at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or a hyaluronic acid gel.
  • the type of the hydrogel is not limited, but may be preferably a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol.
  • the gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum.
  • the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is used for the purpose of preventing, suppressing, alleviating or improving pruritus caused by skin moisturizing or dryness
  • the cosmetic formulation may be prepared in any formulation commonly prepared in the art.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components conventionally used in cosmetics, and may include, for example, conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • other components can be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the kind or purpose of use of the cosmetic composition.
  • Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the condition of the mammalian skin by improving the skin moisturizing and dryness except for the treatment using the cosmetic composition.
  • controlling the condition of the skin means improving the condition of the skin and / or preventing the condition of the skin, and improving the condition of the skin is a visual and / or Or it means a positive change that can be perceived tactilely.
  • improving the condition of the skin may be moistening or smoothing the condition of the skin, or improving the worsened skin condition by scratching or rubbing the skin with itching.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention may be performed using the cosmetic composition as described above.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention (a) applying the cosmetic composition directly to the skin of a mammal, (b) applying a patch or mask patch or mask sheet coated with the cosmetic composition Contacting or attaching to the skin of a mammal, or proceeding sequentially with (a) and (b) above.
  • a lotion or cream may be used as the cosmetic composition.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention (c) after the step (b) to remove the patch, mask pack or mask sheet from the skin of the mammal, and the cosmetic composition to the skin of the mammal
  • the method may further include applying.
  • a lotion or cream may be used as the cosmetic composition.
  • the mammal may be human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.
  • the cosmetic composition of the present invention exhibits the effect of preventing, inhibiting, alleviating or improving the skin's moisturizing effect and itching due to skin drying, and improving or restoring the skin condition worsened due to skin drying or itching or restoring to a normal state. It shows an excellent effect.
  • FIG. 1 shows the results of physical characterization of the exosomes obtained in accordance with one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1A shows particle size distribution and particle number by tunable resistive pulse sensing (TRPS) analysis.
  • FIG. 1B shows particle size distribution and number of particles by nanoparticle tracking analysis (NTA) analysis.
  • FIG. 1C shows the particle images by magnification by means of the transmitted electron microscopy (TEM) analysis.
  • FIG. 1D shows Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 1E shows the results of flow cytometry for CD63 and CD81 in marker analysis for exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
  • Figure 2 shows the results confirmed that there is no cytotoxic after treating the exosome obtained according to an embodiment of the present invention to HS68 cells, which are human skin fibroblasts.
  • Figure 3 is a result of treating the exosomes used in the cosmetic composition of the present invention with Poly I: C for HaCaT cells that are human keratinocytes (human keratinocyte), it was confirmed that the mRNA expression of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) decreased It is a graph showing the real-time PCR results.
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • Figure 4 is a Western keratinocyte HaCaT cells treated with exosomes used in the cosmetic composition of the present invention with Poly I: C, Western, showing that the production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) is reduced The blot result.
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • Figure 5 is a graph showing the result of significantly increased the water content in the stratum corneum of the skin when the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is applied to the left and right face of a person.
  • FIG. 6 is a graph showing a result of greatly increasing the rate of change of the water content in the stratum corneum of the skin when the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is applied to the left and right faces of a person.
  • FIG. 7 is a graph showing that when the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is applied to the left and right faces of a person, the pruritic subjective evaluation index by the subject is improved.
  • FIG. 8 is a dose-dependent dose of exosomes as a result of pre-treatment of exosomes used in the cosmetic composition of the present invention prior to poly I: C treatment for HaCaT cells, which are human keratinocytes. It is a graph showing the real-time PCR results confirmed that the mRNA expression level of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) decreased.
  • TSLP Thimic stromal lymphopoietin
  • HS68 cells which are human dermal fibroblasts, were purchased from ATCC and were prepared by 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific). Passage was carried out in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
  • Fat-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. according to cell culture methods known in the art. Then, washed with phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, phenol-free medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant (hereinafter, culture) was recovered. .
  • phosphate-buffered saline purchased from ThermoFisher Scientific
  • exosomes In the separation of exosomes, 2% by weight of trehalose was added to the culture to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity. After the addition of trehalose, the culture solution was filtered through a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, waste, and large particles. The filtered culture immediately separated the exosomes through a separation process. In addition, the filtered culture was stored in the refrigerator (image 10 °C or less) and then used for exosome separation. In addition, the filtered culture solution was stored frozen in an cryogenic freezer of -60 °C or less and thawed and then exosomes were separated. Thereafter, exosomes were separated from the culture using a tangential flow filtration device (TFF).
  • TMF tangential flow filtration device
  • Example 1 the exosomes were separated from the culture medium filtered with a 0.22 ⁇ m filter, and the TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for concentration, desalting and diafiltration.
  • the filter for the TFF method was a cartridge filter (aka hollow fiber filter; purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore).
  • TFF filters can be selected by various molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by the selected MWCO, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, and small molecule compounds smaller than MWCO were removed.
  • MWCO molecular weight cutoffs
  • MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da TFF filter was used to isolate and concentrate the exosomes.
  • the culture solution was concentrated to a volume of 1/100 to 1/25 by using the TFF method, while exosomes were separated by removing substances smaller than MWCO.
  • the separated and concentrated exosome solution was further subjected to desalting and diafiltration using the TFF method.
  • desalting and buffer exchange were carried out continuously (discontinuous diafiltration) or at least 4 times, preferably 6 times to 10 times, more preferably, relative to the starting volume. It was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more. To the buffer solution was added 2% by weight of trehalose dissolved in PBS to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity.
  • the isolated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern) or tunable resistive pulse sensing (TRPS; purchased from Izon Science).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • TRPS tunable resistive pulse sensing
  • the uniformity and size of the isolated exosomes were analyzed using a transmitted electron microscopy (TEM).
  • TRPS, NTA, TEM analysis results of the exosomes isolated in accordance with one embodiment of the present invention are shown in Figures 1A to 1C.
  • FIG. 1D shows the results of Western blot for exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention, confirming the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers.
  • Anti-CD9 purchased from Abcam
  • anti-CD63 purchasedd from System Biosciences
  • anti-CD81 purchasedd from System Biosciences
  • anti-TSG101 purchasedd from Abcam
  • Figure 1E confirmed the presence of the CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer for the exosomes isolated in accordance with the method of one embodiment of the present invention.
  • an exosome-human CD63 separation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
  • PE-mouse anti-human CD63 PE-Mouse anti markers were stained using -human CD63
  • PE-mouse anti-human CD81 purchasedd from BD
  • exosomes used in the present invention is not limited to the exosomes of the embodiments as described above, of course, can be used a variety of exosomes that are used in the art or can be used in the future. Exosomes isolated according to the above embodiments should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, it is apparent that the present invention is not limited thereto.
  • HS68 cells which are human skin fibroblasts
  • HS68 cells were treated with exosomes at different concentrations, and cell proliferation rates were confirmed.
  • HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and then aliquoted to have a confluency of 80-90% and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed and the exosomes prepared in Example 2 were treated for each concentration, and cultured for 24 to 72 hours to evaluate cell viability.
  • WST-1 reagent purchased from Takara
  • MTT reagent purchased from Sigma
  • CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
  • Aramamar blue reagent Measurements were made using alamarBlue reagent (purchased from ThermoFisher Scientific) and a microplate reader (purchased from Molecular Devices).
  • the comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium without exosomes, it was confirmed that no cytotoxicity by exosomes within the tested concentration range (Fig. 2).
  • TSLP is excessively increased in epithelial cells or human keratinocytes of patients with severe itching, and is known as a substance causing skin itch. Therefore, confirming whether or not a specific candidate substance inhibits TSLP induced in skin keratinocytes can confirm the itch suppression or alleviation effect of the candidate substance.
  • HaCaT cells which are human keratinocytes, are suspended in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% amphotericin B (purchased from Sigma), and 1% penicillin-streptomycin. Each well of a 12 well plate was inoculated at a density of 1 ⁇ 10 5 and incubated for 24 hours.
  • HaCaT cells which are human keratinocytes, are suspended in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% amphotericin B (purchased from Sigma), and 1% penicillin-streptomycin. After inoculation, each well of a 6-well plate (6-well plate) was inoculated at a density of 5 ⁇ 10 5 and incubated for 24 hours. Then, after 24 hours of incubation in serum-free DMEM medium, the attached cells were washed twice with PBS. Exosome prepared in Example 2 was used in the cosmetic composition of the present invention) and treated for 24 hours.
  • TSLP protein amount in each experimental group was measured by Western blot using TSLP antibody (Abcam, Cambridge, MA). The amount of protein was quantified by the BCA method using the standard material BSA (bovine serum albumin). TSLP protein amount in each experimental group was corrected by normalizing with GAPDH protein amount.
  • the exosomes used in the cosmetic composition of the present invention reduced the mRNA expression amount and the protein production amount of TSLP, which cause itching, in the skin keratinocytes (FIGS. 3 and 4). These results effectively exert the exosome used in the cosmetic composition of the present invention against TSLP, which is the main target for causing itching, and the cosmetic composition of the present invention can be usefully used for the prevention, inhibition, improvement, alleviation or treatment of itching. Strongly suggest that it is.
  • HaCaT cells human keratinocytes, were cultured in 154CF medium (0.03 mM CaCl 2 ) (ThermoFisher Scientific) supplemented with 10% Human Keratinocyte Growth Supplement (HKGS), 1% amphotericin B (purchased from Sigma), and 1% penicillin-streptomycin. After the suspension in the medium, each well of the 24 well plate (24 well plate) was inoculated at a density of 5 ⁇ 10 4 and incubated for 24 hours. Then, after 24 hours of incubation in serum-free 154CF medium, the attached cells were washed twice with PBS, and in the serum-free medium according to the experimental group classification shown in FIG.
  • the exosomes used in the cosmetic composition of the present invention reduced the mRNA expression amount of TSLP, which causes the itch, in skin keratinocytes in a dose-dependent manner (FIG. 8).
  • This result is effective for TSLP, the main target for causing itch, exosomes used in the cosmetic composition of the present invention
  • the cosmetic composition of the present invention can be usefully used for the prevention, inhibition, improvement, alleviation or treatment of itching Strongly suggest that it is.
  • Example 6 Cosmetic Composition Formulation of One Embodiment of the Present Invention
  • the exosome stock solution of 1704 ⁇ g / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 2 below to prepare a cosmetic composition (lotion).
  • the final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 ⁇ 10 4 particles / mL. The content of each component is shown in Table 2 below.
  • the exosome stock solution of 1704 ⁇ g / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 3 below to prepare a cosmetic composition (cream).
  • the final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 ⁇ 10 4 particles / mL. The content of each component is shown in Table 3 below.
  • exosome stock solution of 1704 ⁇ g / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 4 below to prepare a mask pack coated or deposited with the obtained cosmetic composition. Exosomes were applied or deposited onto the maskpack at a concentration of 4 ⁇ 10 3 particles / mL. The content of each component is shown in Table 4 below.
  • Example 7 Test of moisturizing and pruritus improving effect on human skin
  • the measured values (A.U.) of the coronometer at the left and right test sites were 51.50 and 51.14 after 2 weeks of lotion and cream use, respectively, and 55.50 and 54.66 after 4 weeks of use (FIG. 5).
  • changes in the stratum corneum moisture content of each test site were found to be 57.81% and 59.07% after 2 weeks of use of the lotion and cream, and 70.09% and 70.01% after 4 weeks of use, respectively (FIG. 6).
  • Both the left and right test areas showed skin (stratum corneum) moisture content increased statistically significant level (P ⁇ 0.05) from 2 weeks after the use of the lotion and cream, so that the lotion and cream improved skin moisture content (moisture) I thought it could help.
  • the cosmetic composition of the present invention shows an excellent effect in the relief and improvement of pruritus caused by skin moisturizing and skin drying.

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Abstract

본 발명은 피토스핑고신, 세라마이드엔피 및 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 피부보습 효과 및 피부건조에 의한 가려움증을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과를 나타내고, 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.

Description

피부 보습 및 소양감 개선을 위한 화장료 조성물
본 발명은 피부 보습 및 소양감 개선을 위한 새로운 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습 및 건조증 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
피부 가려움증 또는 소양감(pruritus)은 통증과 함께 대부분의 피부질환에서 흔히 유발되는 감각으로서, 임상에서는 피부를 긁거나 문지르고 싶은 욕망을 일으키는 불쾌한 감각으로 정의될 수 있다.
가려움증으로 인해 피부를 긁다 보면 상처가 나게 되고 세균감염 및 염증이 동반된다. 이러한 세균감염 및 염증으로 인해 T-세포 및 대식세포와 같은 면역세포들이 활성화되고 여러 사이토카인 등이 분비되어 가려움증을 더욱 악화시킨다. 가려움증이 있는 환자는 의식 또는 무의식적으로 환부를 긁게 된다. 환부를 심하게 긁거나 문지르는 경우, 긁은 흔적이 심하게 남게 되거나 홍반, 균열, 궤양, 두드러기 또는 색소침착 등의 다양한 부작용이 나타날 수 있다.
현재까지의 연구 결과에 따르면, 가려움증 매개물질이 여러 피부질환에서 가려움증을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 면역세포(T 세포, 대식세포 등)로부터 분비된 여러 사이토카인 및 히스타민이 가려움증을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)가 피부염의 중증도와 연관되어 있고, 가려움 증세의 원인이라고 알려졌다(Wilson SR et al., The epithelial cell-derived atopic dermatitis cytokine TSLP activates neurons to induce itch. Cell. 2013;155(2):285-95).
특히, 피부 가려움증은 건조된 피부에서 발생하기 쉬우며, 건조된 피부와 피부질환은 피부 가려움증을 악화시킨다. 피부의 각질층에는 수분을 저장하고 증발을 막는 구조 및 물질들이 있어 체내 수분유지에 매우 중요한 기능을 담당하고 있다. 피부의 보습상태가 악화되어 건조증이 쉽게 발생할 수 있는데, 피부 건조로 인해 가려움증이 발생 내지는 악화된다. 따라서, 피부 가려움증은 피부 보습과 밀접한 관련이 있다.
피부 가려움증을 개선하기 위하여 피부 보습 및 피부장벽을 복구하는 세라마이드의 지질복합체를 적용하거나, 항히스타민제, 스테로이드, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 마취제, 면역억제제, 광선치료 등의 방법이 일반적으로 사용되어 왔다. 그러나 이들 방법은 치료 효과가 일시적이거나 제한적으로 가려움증의 종류에 따라 특이성을 나타내는 문제가 있으며, 부신피질 호르몬제 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)는 부작용을 고려하여 급성 또는 심한 경우에 한하여 단기간 사용해야 하는 문제가 있다.
이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용하여 가려움증을 억제 내지는 완화하고자 하는 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 가려움증 억제 또는 완화용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 가려움증 억제 또는 완화 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 가려움증 억제 또는 완화의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 인체에 부작용이 없으며, 피부 보습 효과가 우수하고 피부 건조로 인한 소양감을 예방, 억제 내지는 완화할 수 있는 새로운 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 피부 보습 및 소양감 개선을 위한 새로운 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습 및 건조증 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 피부 보습 및 피부 건조로 인한 소양감의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 위한 새로운 조성물의 개발에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, 피토스핑고신, 세라마이드엔피, 엑소좀, 및 판테놀 등을 유효성분으로 함유하는 새로운 기능성 화장료 조성물을 개발하기에 이르렀다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포, 바람직하게는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어 "피부 가려움증"은 특별히 제한되지 않으며, 하나의 예시로서, 피부건조에 의한 가려움증; 두드러기에 의한 가려움증; 벌레물림에 의한 가려움증; 땀띠, 여드름, 짓무름, 동상, 접촉성 피부염, 지루성 피부염 또는 건선 등으로 유발되는 가려움증; 각종 피부질환에 의한 가려움증; 두피 가려움증 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 이상에서 열거한 피부 가려움증 이외의 다양한 원인의 피부 가려움증을 배제하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명은 당업계에 알려진 모든 가려움증, 예를 들어 피부과적 원인 가려움증, 전신성 원인 가려움증, 신경병증성 원인 가려움증 및 심인성 원인 가려움증 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 생체의 항상성을 유지하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은, 피토스핑고신, 세라마이드엔피 및 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 로션인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에 있어서, 상기 로션은 판테놀, 프룩탄, 또는 시어버터 중 적어도 1종을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 로션은 팔미토일 테트라펩타이드-7 또는 팔미토일 트리펩타이드-1 중 적어도 1종을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 크림인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에 있어서, 상기 크림은 판테놀, 칼라민, 또는 시어버터 중 적어도 1종을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 로션은 팔미토일 테트라펩타이드-7 또는 팔미토일 트리펩타이드-1 중 적어도 1종을 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량 또는 생성량을 감소시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물에는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 상기 성분들 이외에, 그 작용(피부 건조 또는 이로 인한 소양감 증상 완화 내지는 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 소양감 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부보습 또는 건조증으로 인한 소양감 예방, 억제, 완화 또는 개선을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습 및 건조증 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부의 상태를 촉촉하게 하거나 매끈하게 하는 것, 또는 가려움증으로 피부를 긁거나 문질러서 나빠진 피부 상태의 개선일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 전술한 바와 같은 화장료 조성물을 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부보습 효과 및 피부건조에 의한 가려움증을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과를 나타내고, 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C와 함께 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C와 함께 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 생성량이 감소한 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물을 사람의 좌우측 얼굴에 적용한 경우, 좌우측 모두 피부 각질층 내 수분 함량이 현저히 증가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물을 사람의 좌우측 얼굴에 적용한 경우, 좌우측 모두 피부 각질층 내 수분 함유량의 변화율이 크게 증가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물을 사람의 좌우측 얼굴에 적용한 경우, 피험자에 의한 소양감 주관적 평가 지수가 개선된 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C를 처리하기 전에 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀을 전처리(pre-treatment)한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명에서 사용되는 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: HaCaT 세포를 이용한 TSLP 억제 효과 측정
실시예 5-1: Poly I:C와 엑소좀 동시 처리 (co-treatment)
TSLP는 가려움증이 심한 환자의 상피세포나 피부각질세포(human keratinocytes)에서 과도하게 증가되어 있고, 피부 가려움증의 원인이 되는 물질로 알려져 있다. 따라서, 특정 후보물질이 피부각질세포에서 유도되는 TSLP를 억제하는지 여부를 확인하면 후보물질의 가려움증 억제 내지 완화 효과를 확인할 수 있다. 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 12웰 플레이트 (12 well plate)의 각 웰에 1×105의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 DMEM 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 3에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 Poly I:C (Sigma에서 구입) 및 히스타민(Histamine)(Sigma에서 구입)과, 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 화장료 조성물에 사용됨)을 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 각 실험군의 HaCaT 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 가려움증의 주요 원인이 되는 TSLP의 mRNA 변화량을 측정하였다. TSLP 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 β-액틴 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기 표 1과 같다.
리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열
유전자 서열
정방향 프라이머 (5' → 3') 역방향 프라이머 (5' → 3')
TSLP GCTATCTGGTGCCCAGGCTAT (서열번호 1) CGACGCCACAATCCTTGTAAT (서열번호 2)
β-actin GGCCATCTCTTGCTCGAAGT (서열번호 3) GACACCTTCAACACCCCAGC (서열번호 4)
또한, 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 6웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰에 5×105의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 DMEM 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 4에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 Poly I:C (Sigma에서 구입) 및 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 화장료 조성물에 사용됨)을 처리하여 24시간 배양하였다. 각 실험군에서의 TSLP 단백질의 생성량을 TSLP 항체 (Abcam, Cambridge, MA)를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 단백질 양은 표준 물질인 BSA(bovine serum albumin)를 사용한 BCA 방법으로 정량하였다. 각 실험군에서의 TSLP 단백질 양은 GAPDH 단백질 양으로 정규화(normalization)하여 보정하였다.
그 결과, 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀은 피부각질세포에서, 가려움증의 원인이 되는 TSLP의 mRNA 발현량 및 단백질 생성량을 감소시키는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이러한 결과들은 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀이 가려움증을 일으키는 주요 표적인 TSLP에 대해 효과적으로 작용하며, 본 발명의 화장료 조성물은 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 5-2: Poly I:C 처리 전에 엑소좀 전처리 (pre-treatment)
인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% HKGS(Human Keratinocyte Growth Supplement), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 154CF 배지(0.03mM CaCl2)(ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 24웰 플레이트 (24 well plate)의 각 웰에 5×104의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 154CF 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 8에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 화장료 조성물에 사용됨)을 전처리(pre-treatment)하여 24시간 배양한 다음, Poly I:C (Sigma에서 구입)를 처리하고 4시간 배양하였다. 각 실험군의 HaCaT 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 가려움증의 주요 원인이 되는 TSLP의 mRNA 변화량을 측정하였다. TSLP 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 β-액틴 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 상기 표 1과 같다.
그 결과, 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀은 피부각질세포에서, 가려움증의 원인이 되는 TSLP의 mRNA 발현량을 엑소좀의 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는 본 발명의 화장료 조성물에 사용되는 엑소좀이 가려움증을 일으키는 주요 표적인 TSLP에 대해 효과적으로 작용하며, 본 발명의 화장료 조성물은 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 6: 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물 제형
(로션의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 2에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(로션)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 2와 같다.
로션의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 1
글리세린 7.375
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 6
세틸 에틸헥사노에이트 5
프로판디올 5
페닐 트리메티콘 3.5
스테아르산 3
1,2-헥산디올 2
판테놀 2
세테아릴 올리베이트 1.8
소르비탄 올리베이트 1.2
디이소스테아릴 말레이트 1
프룩탄 1
암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/VP 코폴리머 0.3
아라키딜 알코올 0.25
베헤닐 알코올 0.15
아라키딜 글루코사이드 0.1
하이드로제네이티드 레시틴 0.1
시어버터 0.09
잔탄검 0.05
라벤더 오일 0.02
베르가모트 오일 0.02
세라마이드엔피 (Ceramide NP) 0.02
오렌지껍질 오일 0.02
피토스핑고신 0.015
팔미토일 테트라펩타이드-7 0.01
팔미토일 트리펩타이드-1 0.01
정제수 잔량
(크림의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 3에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(크림)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 3과 같다.
크림의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 1
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 12
글리세린 9.75
부틸렌글리콜 7
세테아릴알코올 3.5
하이드로제네이티드 식물성오일 3.5
1,2-헥산디올 2
스테아르산 2
페닐트리메티콘 2
호호바씨오일 2
비즈왁스 1.7
글리세릴스테아레이트 1.5
스테아릴알코올 1.45
글리세릴스테아레이트에스이 1
세틸알코올 1
판테놀 1
시어버터 0.88
솔비탄세스퀴올리에이트 0.5
폴리글리세릴-2스테아레이트 0.45
암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머 0.3
하이드로제네이티드 레시틴 0.1
베르가모트오일 0.04
세라마이드엔피 0.04
피토스핑고신 0.03
아이비고드열매추출물 0.0225
한련초추출물 0.0225
라벤더오일 0.02
오렌지껍질오일 0.02
카퍼트리펩타이드-1 0.01
팔미토일 테트라펩타이드-7 0.01
팔미토일 트리펩타이드-1 0.01
칼라민 0.001
정제수 잔량
(마스크팩의 제조)
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 4에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 얻어진 화장료 조성물을 도포 내지는 침적시킨 마스크팩을 제조하였다. 엑소좀은 4×103 입자/mL의 농도로 마스크팩에 도포 내지는 침적되었다. 각 성분의 함량은 하기 표 4와 같다.
마스크팩의 성분 및 함량
성분 함량 (중량%)
실시예 2에서 준비된 엑소좀 0.1
글리세린 3.070045
디프로필렌글리콜 3.03
메틸프로판디올 2
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 1.500025
올리브오일 0.8
1,2-헥산디올 0.7235
폴리솔베이트60 0.7
솔비탄스테아레이트 0.6475
알지닌 0.13
카보머 0.13
하이드록시에틸셀룰로오스 0.13
알란토인 0.1
트레할로오스 0.1
녹차추출물 0.07
부틸렌글리콜 0.07
생강추출물 0.07
스페인감초뿌리추출물 0.07
콥티스뿌리추출물 0.07
수크로오스코코에이트 0.0525
에틸헥실글리세린 0.05
디포타슘글리시리제이트 0.03
디소듐이디티에이 0.02
토코페릴아세테이트 0.02
판테놀 0.02
세라마이드엔피 0.000001
소듐히알루로네이트 0.01
자일리틸글루코사이드 0.004
안하이드로자일리톨 0.0028
자일리톨 0.0012
글루코오스 0.0004
하이드로제네이티드 레시틴 0.000005
향료 0.012
콜레스테롤 0.000001
정제수 잔량
실시예 7: 사람 피부에 대한 보습 및 소양감 개선 효과의 시험
급·만성 신체 질환이 없고 평소 건조에 의한 가려움증이 있는 20대~30대 여성 21명을 피험자로 선정하고, 실시예 6의 유백색의 로션 및 연한 핑크색의 크림을 하루에 두번(아침과 저녁) 피험자가 스스로 좌우측 얼굴에 도포하도록 하였다. 상기 로션 및 크림 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후에, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)로 안면부의 피부 수분 함량을 측정하여 피부 보습력을 평가하였다. 상기 로션 및 크림에 대한 피부 보습 및 소양감 완화 평가 시험을 실시하였으며, 중도 탈락자 없이 21명의 피험자가 모두 시험을 완료하였다.
좌측과 우측 시험 부위에서 수분측정기(Corneometer)의 측정값 (A.U.)은 상기 로션 및 크림 사용 2주 후에 각각 51.50 및 51.14로 나타났고, 사용 4주 후에는 각각 55.50 및 54.66으로 나타났다(도 5). 또한, 각 시험 부위의 각질층 수분함량 변화는 상기 로션 및 크림 사용 2주 후에 57.81% 및 59.07%로 확인되었고, 사용 4주 후에는 각각 70.09% 및 70.01%로 확인되었다(도 6). 좌측과 우측 시험부위 모두 상기 로션 및 크림 사용 2주 후부터 사용 전에 비해 통계적으로 유의한 수준 (P<0.05)으로 증가한 피부(각질층) 수분 함량을 나타내어, 상기 로션 및 크림이 피부 수분 함량 개선(보습)에 도움을 줄 수 있는 것으로 판단되었다.
또한, 피험자의 피부 건조에 기인한 주관적인 소양감을 평가하였다. 피험자가 상기 로션 및 크림 사용 후 소양감에 대하여 "가려움이 전혀 없음(0)". "가려움이 약간 있음(1)", "가려움이 중간 정도 있음(2)", "가려움이 많이 있음(3)". "가려움이 매우 심함(4)"의 5단계로 설문조사에 답하도록 하였다. 이러한 주관적 평가 점수표에 따라 소양감에 대한 피험자의 주관적 평가를 수행하였다. 피험자의 피부 건조에 기인한 소양감의 주관적 평가 값은 상기 로션 및 크림 사용 전 1.05, 사용 2주 후에 0.43, 그리고 사용 4주 후에 0.10으로 확인되었다(도 7). 상기 로션 및 크림 사용 2주차부터 사용 전에 비해 통계적으로 유의하게 (P<0.05) 개선된 결과를 나타내어 상기 로션 및 크림이 피부건조에 의한 소양감 완화에 도움을 줄 수 있는 것으로 판단된다.
한편, 시험대상자가 상기 로션 및 크림을 사용하는 기간 동안 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에도 이상소견은 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습과 피부건조로 인한 소양감의 완화 및 개선에 있어서 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. 피토스핑고신, 세라마이드엔피 및 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 보습 및 소양감 개선을 위한 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    로션인, 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    판테놀, 프룩탄, 또는 시어버터 중 적어도 1종을 더 포함하는, 화장료 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    추가적으로, 팔미토일 테트라펩타이드-7 또는 팔미토일 트리펩타이드-1 중 적어도 1종을 더 포함하는, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    크림인, 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    판테놀, 칼라민, 또는 시어버터 중 적어도 1종을 더 포함하는, 화장료 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    추가적으로, 팔미토일 테트라펩타이드-7 또는 팔미토일 트리펩타이드-1 중 적어도 1종을 더 포함하는, 화장료 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량 또는 생성량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
  11. (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 치료용을 제외한 피부 보습 및 건조증 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  13. 제11항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
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