KR20200016183A

KR20200016183A - 피부 필링과 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법

Info

Publication number: KR20200016183A
Application number: KR1020190094480A
Authority: KR
Inventors: 조병성; 김광일; 이용원
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2020-02-14

Abstract

본 발명은 (a) 포유동물의 피부를 필링하는 단계와, (b) 상기 필링 전 또는 후에, 상기 필링 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는 피부 미용방법을 제공한다. 본 발명의 피부 미용방법은 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기를 감소시키고, 피부 필링으로 인한 피부 가려움 및 화끈거림이 감소하는 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 피부 미용방법에 따라 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피지분비 감소 효과라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.

Description

피부 필링과 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법 {Method for skin care using the combination of skin peeling and treating exosomes onto skin}

본 발명은 피부 필링과 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법에 관한 것이다.

얼굴이나 신체 등의 외모에 대한 관심이 증가함에 따라 피부 상태를 개선하고 외모의 부족한 부분을 보완하고자 하는 미용 수요가 늘어나고 있다. 이와 관련하여 피부 외관 상태 개선 및 피부 미용 등을 위해 피부 필링이 주목받고 있다.

피부 필링은 사용되는 매체에 따라 물리적 필링, 화학적 필링, 레이저 필링 등으로 구분되고, 깊이에 따라 표피의 상층부만 벗겨내는 표층 필링과, 표피 아래 부분의 유두진피까지 벗겨내는 중층 필링과, 표피 전체를 벗겨내면서 진피 상층부의 망상 진피까지 영향을 미치는 심부 필링으로 구분된다.

물리적 피부 필링은 기기를 이용하여 물리적으로 각질층을 벗겨내는 방법으로서, 그 예로서 크리스털 가루를 이용한 크리스털 필링(crystal peeling)과, 다이아몬드 칩을 이용한 다이아몬드 필링(diamond peeling)이 있다. 그러나, 물리적 피부 필링은 시술자의 숙련도에 따라 효과가 다르게 나타날 수 있고, 피부 상태나 시술 강도에 따라 긁힘 증상과 점상 출혈이 있을 수 있다.

또한, 화학적 피부 필링은 필링 제제를 피부에 도포하여 필링 제제가 도포된 피부의 단백질이 응고되어 괴사가 일어나게 하고 괴사된 부분이 딱지로 떨어져 나가면서 피부가 재생되도록 하는 방법이다. 화학적 피부 필링에 사용되는 필링 제제로는 AHA(alpha hydroxy acid), 살리실산(salicylic acid), TCA(trichloroacetic acid), BHA(beta hydroxy acid) 등이 있다. 필링 제제로서는 AHA 계열이 가장 많이 사용되는데, 이중에서도 글리콜산(glycolic acid)과 젖산(lactic acid)이 주로 사용된다. 그러나, 필링 제제는 따가운 증상, 피부 자극 등을 일으킬 수 있고, 경우에 따라 진피층으로 깊숙이 침투해 화상을 일으키기도 한다.

즉, 피부 필링은 빠른 피부 개선 효과의 장점은 있으나, 일상 생활에 지장을 초래하는 문제와, 피부 장벽 손상에 따른 통증과 심한 건조증, 발열, 홍반 현상, 각질 탈락이 유발될 수 있는 단점이 있다.

한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.

본 발명자들은 엑소좀의 새로운 응용분야 및 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하면 피부 필링으로 인한 부작용을 완화 내지 정상 상태로 회복시키면서 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 등록특허공보 제10-1166985호 (2012.07.24) 대한민국 등록특허공보 제10-1388052호 (2014.04.25)

본 발명의 목적은 피부 필링과 줄기세포 유래의 엑소좀 처리를 병용한 피부 미용방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포유동물의 피부를 필링하는 단계와, 상기 필링 전(前), 상기 필링 동안, 또는 상기 필링 후(後), 상기 필링 대상이 되는 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 피부 미용방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.

그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기 등을 감소시키는 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 명세서에서 용어, "피부 필링"이란 물리적 매체 또는 화학적 제제를 이용하여 표피의 일부 또는 전체를 제거한 후 새로운 표피를 형성하고 진피 섬유를 재생시켜 피부의 외관 및/또는 느낌에 있어 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 가져오게 하는 작업을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "피부 미용"은 피부 필링으로 인한 부작용, 예를 들어 통증, 피부 필링 후 피부가 붉어지거나 붓는 현상 등을 감소, 완화 및/또는 개선하고/하거나, 피부 진정 및/또는 피지분비 감소 등의 긍정적인 효과를 가져오는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, (a) 포유동물의 피부를 필링하는 단계와, (b) 상기 필링 전 또는 후에, 상기 필링 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, 피부 필링으로 인한 피부 붉은기, 피부 가려움 또는 화끈거림 중 적어도 하나를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법은, 피지분비 감소 효과를 추가로 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물은 크림 또는 로션일 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부 필링으로 인한 부작용 감소 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 줄기세포 유래의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 예를 들어, 피부 붉은기 감소, 피지분비 감소 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 피부 미용방법에 있어서, 상기 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명에서 예시된 것일 수 있다.

본 발명의 피부 미용방법은 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 피부에 처리하여 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기를 감소시키고, 피부 필링으로 인한 피부 가려움 및 화끈거림이 감소하는 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 피부 미용방법에 따라 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피지분비 감소 효과라는 긍정적인 피부 미용 효과도 나타낼 수 있다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래의 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 피부 필링 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 10일째에 붉은기(redness)를 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 피부 필링 후 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래의 엑소좀 및 생리적 식염수를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽 및 왼쪽에 각각 도포한 후 10일째에 피지분비량을 측정한 결과 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 세포의 배양

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO₂, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO₂, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제

실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.

도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.

도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.

도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).

실시예 5: 피부 필링과 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 처리

시술 전에 대한민국 경기도 소재의 피에스아이 플러스(주)의 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저(Mark-Vu facial skin analyzer)를 사용하여 실험대상자 1의 오른쪽 얼굴과 왼쪽 얼굴의 붉은기(시술 전 붉은기) 및 피지분비량(시술 전 피지분비량)을 측정하였다. 실험대상자 1에게 글리콜산 30% 용액을 처치하고 10분 내지 15분간 방치한 후 탄산수소나트륨으로 중화시켜 피부 필링을 시술하였다. 피부 필링 시술 후 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀 (2×10⁹입자/mL 농도)(실시예 2에서 준비된 엑소좀) 원액(현탁액) 1 ml를 실험대상자 1의 얼굴 오른쪽에 도포하였고, 실험대상자 1의 얼굴 왼쪽에는 생리적 식염수를 도포하였다. 그리고 실험대상자 1의 얼굴 위에 30분 동안 러버 마스크(rubber mask)를 적층하여 눌러 주었다.

상기와 같은 시술 후 10일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 실험대상자 1의 안면 붉은기를 측정하였고, 이를 피부 필링 시술 전에 측정된 실험대상자 1의 안면 붉은기와 비교하였다. 실험대상자 1의 붉은기의 변화율(% Change of Redness)을 다음 수식에 의하여 분석하였다: 붉은기 변화율 = [(N일째 측정된 붉은기)-(시술 전 붉은기)]/(시술 전 붉은기)(%). 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 1의 오른쪽 얼굴에서 대조군인 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에 비해 피부 필링으로 인한 부작용인 얼굴의 붉은기(redness)가 현저하게 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 3).

또한, 상기와 같은 시술 후 10일째에 마크-뷰 페이셜 스킨 애널라이저를 사용하여 실험대상자 1의 피지분비량을 측정하였고, 이를 피부 필링 시술 전에 측정된 실험대상자 1의 피지분비량과 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 일 구체예의 줄기세포 유래의 엑소좀이 처치된 실험대상자 1의 오른쪽 얼굴에서 대조군인 생리적 식염수가 처치된 실험대상자 1의 왼쪽 얼굴에 비해 피지분비 감소 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다(도 4).

한편, 실험대상자 1에게 피부 가려움 및 화끈거림에 대한 설문조사에 대해 답하도록 하였다. 이에 대해 실험대상자 1은 줄기세포 유래의 엑소좀을 처리한 부위가 생리적 식염수를 처리한 부위에 비해 가려움 및 화끈거림이 현저히 감소하였다고 응답하였다.

상기 실험결과에 따르면, 피부에 대해 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리할 경우 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기를 감소시키고, 피부 필링으로 인한 피부 가려움 및 화끈거림이 감소하는 효과가 있음을 알 수 있다. 또한, 피부 필링과 함께 줄기세포 유래의 엑소좀을 병용처리하면 피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 피지분비 감소 효과라는 긍정적인 효과도 가져오는 것을 알 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims

(a) 포유동물의 피부를 필링(peeling)하는 단계와,
(b) 상기 필링 전 또는 후에, 상기 필링 대상이 되는 포유동물의 피부에 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 피부 필링으로 인한 피부 부작용을 감소시키는 피부 미용방법.
제1항에 있어서,
피부 필링으로 인한 피부 붉은기, 피부 가려움 또는 화끈거림 중 적어도 하나를 감소시키는, 피부 미용방법.
제2항에 있어서,
피부 필링으로 인한 부작용인 피부 붉은기와 붓는 현상이 사라지는데 걸리는 시간인 다운타임(downtime)을 단축시키는, 피부 미용방법.
제3항에 있어서,
피지분비 감소 효과를 추가로 나타내는, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 현탁액인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제인 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제6항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 크림 또는 로션인, 피부 미용방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 피부 미용방법.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는, 피부 미용방법.
제9항에 있어서,
상기 (b) 단계는 (b1) 상기 조성물을 상기 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b2) 상기 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (b1) 및 (b2)를 순차적으로 진행하는 것에 의해 수행되는, 피부 미용방법.