KR20140066456A

KR20140066456A - 피부각질세포 유래 엑소좀, 엑소좀을 포함하는 분획물의 피부재생용 화장품 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140066456A
Application number: KR1020120133709A
Authority: KR
Inventors: 이환명; 김보경; 원경종; 김도윤; 유호진; 윤미소
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2012-11-23
Publication date: 2014-06-02

Abstract

본 발명은 피부 재생용 또는 화장품 조성물에 대한 것으로, 특히 표피 각질세포 및/또는 진피 섬유아세포의 증식 및/또는 이동을 위한 조성물이며, 더욱 상세하게는 피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하여, 표피 각질세포 및/또는 진피 섬유아세포의 증식 및/또는 이동을 촉진시킴으로써, 피부재생이 가능하도록 하게 하는 효과를 가진다. 이러한 본 발명에서 상기 엑소좀은 세포친화적이어서 피부재생이나 상처치유를 위한 의약 또는 화장품 원료로써 사용 가능하고, 나아가 상기 엑소좀은 이미 분화된 피부 세포로부터 얻을 수 있기 때문에 미분화된 줄기세포를 이용하는 경우 야기되는 이상증식이나 부작용 등의 위험이 없는 것을 특징으로 한다.

Description

피부각질세포 유래 엑소좀, 엑소좀을 포함하는 분획물의 피부재생용 화장품 조성물 및 이의 용도{A exosome derived from keratinocytes, cosmetic composition for skin cell regeneration of fraction having exosome and the use thereof}

본 발명은 피부 각질 세포에서 분리한 엑소좀을 포함하는 화장품 조성물 및 피부 외용제에 관한 것으로, 보다 구체적으로 피부 재생 및 상처 치유 효과가 있는 화장품 조성물 및 피부 외용제에 관한 것이다.

인체의 피부(skin)는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutaneous tissue)의 세 개 층으로 이루어져 있다. 표피는 피부의 최외각에 존재하며, 안으로는 수분의 증발을 막고, 밖으로는 다양한 외부 항원으로부터 몸을 보호하는 역할을 한다. 표피는 아래서부터 기저층(stratum basale), 유극층(stratum spinosum), 과립층(stratum granulosum), 투명층(stratum lucidum) 및 각질층(stratum corneum)으로 이루어져 있다. 표피는 멜라닌세포(melanocyte)를 포함하고 있어 멜라닌 색소를 합성하여 자외선을 차단하는 역할을 하며, 랑게르한스 세포가 존재하여 면역기능을 담당하고 있다. 표피는 대부분 각질세포로 이루어져 있으며, 기저층으로부터 각질세포의 증식, 이동과 분화를 통하여 표피의 최외각인 각질층의 중층편평상피(stratified epithelium)이 된다.

표피는 자외선 및 다양한 외부항원 등 다양한 원인으로부터 직접적이고 잦은 자극으로 인해 손상되기 쉬우며, 이들의 회복은 인체 내부의 항상성 유지에 있어서 매우 중요하다. 그러나 화학물질의 오염, 스트레스 및 나이가 들어감에 따라 각질세포의 노화가 진행되어 손상된 피부의 재생 및 상처치유의 회복속도가 줄어들게 된다. 따라서, 피부 각질 세포의 증식과 이동을 촉진하는 물질의 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 노화, 상처 및 피부 병변으로 인하여 생리활성이 저하된 각질세포의 증식을 유도하여 피부재생 및 상처치유를 유도할 수 있다. 또한 피부는 한달 간격으로 이루어지는 각질주기(turn over cycle)를 통하여 일정한 두께를 유지하며, 이 각질 주기가 정상적이지 않을 경우 건조해지고 각질이 생성된다. 따라서 각질세포의 이동을 유도하여 노화된 세포를 자연탈락시켜 피부조직의 건강과 아름다움을 유지할 수 있다.

한편, 인간을 포함한 다세포 생명체에서 세포간 정보교환(intercellular communication)은 생명현상의 필수적인 과정이다. 세포들은 성장인자(growth factor)와 사이토카인(cytokine)등과 같은 다양한 종류의 가용성의 세포간정보교환 물질들과 더불어 생체나노입자(수십 nm에서 수 μm의 크기)들을 세포밖으로 분비하고 있다. 다양한 세포에서 분비되는 생체나노입자는 그 크기와 분비기작의 차이에 따라 엑소좀(exosome, 30-100 nm)과 멤브레인 베지클(membrane vesicle, 200-1000 nm)로 구분할 수 있고(도 1 참조), 이들은 마이크로파티클(micropaticle), 쉐딩 베지클(shedding vesicle), 마이크로베지클(microvesicle)등의 용어로 불리워지고 있다.

이러한 생체나노입자는 세포내외부의 자극에 의해 생성되어 세포막을 통해 분비되고, 세포 내 단백질과 지질 및 mRNA 등의 다양한 성분들을 포함하고 있으며, 면역반응 조절, 암세포의 침윤 촉진 및 혈관신생을 유도하는 등 다양한 기능을 수행한다고 알려져 있지만, 아직까지 이들의 구체적인 생리적 기능은 모르고 있다.

그 중, 엑소좀(exosome)은 다양한 생체나노입자 중 지름이 30-100 nm의 접시모양의 형태적 특징을 가지고 있으며, 세포 내외부의 자극에 의해 능동적으로 분비하는 생체나노입자이다. 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 면역학적으로 중요한 단백질인 주조직적합체와 열충격 단백질을 포함하고 있다고 알려져 있어, 강력한 항종양 면역 반응을 유도함이 알려져 있다. 주조직적합체는 사람 및 동물에 있어서 모든 면역반응을 총괄 관리하는 유전자 복합체이며, 열충격 단백질은 온도나 여러 형태의 스트레스가 갑자기 증가하였을 때에, 세포에서 일시적으로 합성되는 단백질로 열 스트레스로부터 세포를 보호하는 구실을 하며 생물의 생존에 필수적인 역할을 한다. 또한, 엑소좀은 다른 세포 및 조직에 결합하여 막구성요소, 단백질(성장호르몬, 사이토카인 등), RNA 등을 전달 및 다양한 역할을 하고 있다고 알려져 있다.

최근, 엑소좀의 중요성이 재인식되어 지고 있으며, 특히 암세포에서 분비되는 엑소좀을 이용하여 치료 및 진단을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 상처치유 및 피부재생에 활용되고 있는 성장인자(growth factor)들은 단순 단백질(soluble protein)의 형태로 되어 있어, 다양한 단백질 분해효소(protease) 및 결합인자들에 의해 활성을 쉽게 잃을 수 있다. 그러나, 엑소좀에 포함되어 있는 성장호르몬 및 단백질들은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 가용성 형태의 성장인자 및 사이토카인들보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다.

하지만, 엑소좀이 이와 같이 다양한 역할을 나타낼 수 있음에도 불구하고, 지금까지, 인간 각질세포에서 분비되는 엑소좀의 기능에 대한 연구는 세계적으로 전무한 실정이다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 피부 각질세포의 증식 및/또는 이동을 촉진시킴으로써 피부재생을 가능하게 하고, 미분화된 줄기세포를 이용하는 경우 야기되는 이상증식이나 부작용 등의 위험이 없이, 피부재생이나 상처치유를 위한 의약 또는 화장품 원료로써 사용 가능한 원료 조성물을 제공하는 것이 목적이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 피부 재생용 조성물은, 피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 것이 특징이다.

여기서, 상기 피부 세포는 분화된 피부 각질세포인 것이 바람직하다.

그리고, 상기 엑소좀은 1~100 ㎍/㎖ 범위 내의 농도를 가지는 것이 가능하다.

또한, 상기 피부 재생용은 피부 각질세포 또는 진피 섬유아세포의 증식 또는 이동용이거나 증식 또는 이동 유도용일 수 있다.

또한, 상기 엑소좀은 열에 가열되어 변성 또는 변형되는 물질을 주요성분으로 포함하는 것이 바람직하며, 상기 열에 가열되어 변성 또는 변형되는 물질은 단백질인 것이 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀은 열에 가열되더라도 변성 또는 변형되지 않는 물질을 주요성분으로 포함하고, 피부 각질세포 또는 진피 섬유아세포의 증식용인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물일 수 있다. 여기서, 상기 열에 가열되더라도 변성 또는 변형되지 않는 물질은 지질인 것이 바람직하다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 조성물이 화장품 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물이다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

이러한 본 발명은 피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하여, 피부 각질세포의 증식 및/또는 이동을 촉진시킴으로써, 피부재생을 가능하게 하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 엑소좀은 세포 친화적이어서 피부재생이나 상처치유를 위한 의약 또는 화장품 원료로써 사용 가능하고, 나아가 상기 엑소좀은 이미 분화된 피부 세포로부터 얻을 수 있기 때문에 미분화된 줄기세포를 이용하는 경우 야기되는 이상증식이나 부작용 등의 위험이 없이 높은 안정성을 가진다.

도 1은 본 발명에 따른 엑소좀을 포함하는 생체 나노 입자가 세포에서 분비되는 기작의 일례를 설명하기 위한 개념도이고,
도 2는 본 발명에 따라 피부 각질세포에서 엑소좀을 분리하는 과정의 일례를 나타낸 흐름도이고,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 피부 각질세포에서 분리한 엑소좀의 AFM(Atomic Force Microscopy)결과를 나타낸 사진과 그래프이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 엑소좀에 의한 각질세포의 증식 효과를 나타내는 그래프이고,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 엑소좀에 의한 각질세포의 이동 효과를 나타내는 그래프이고,
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 엑소좀에 의한 피부 재생 효과를 나타내는 사진이고,
도 7은 본 발명의 도 6의 엑소좀에 의한 피부 재생 효과를 정량화 하여 나타내는 그래프이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 엑소좀에 의한 진피형성 섬유아세포의 증식 효과를 나타내는 그래프이고,
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리한 엑소좀에 의한 진피형성 섬유아세포의 이동 효과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 이에 대하여 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명은 피부 재생용 조성물에 대한 것으로, 피부를 구성하는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutaneous tissue) 등을 재생하고, 이를 통해 상처를 치유하는 기능을 가지는 조성물이다. 즉, 본 발명은 피부 세포의 엑소좀(exosome, 생체나노입자) 및 엑소좀을 포함하는 분획물의 피부재생용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 그 중에서도, 본 발명의 조성물은 표피의 대부분을 차지하는 각질세포 및/또는 진피를 구성하는 섬유아세포의 증식/이동을 유도하는 물질이며, 이를 통하여 피부재생 및 상처치유 기능을 가지는 조성물이다.

본 발명자들은 피부 세포(특히, 각질세포 및/또는 진피 섬유아세포)의 증식 및 이동을 유도하는 물질을 개발하기 위해 단백질 및 지질에 대해 연구하던 중, 피부 각질세포가 분비하는 엑소좀이 피부 세포(각질세포 및/또는 섬유아세포)의 증식을 활성화시킬 뿐만 아니라, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 이동을 활성화시키는 작용이 있음을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명은 피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물이다. 이러한 본 발명은 인간 피부 각질전구세포 자체가 아닌 피부 세포로부터 분비되는 엑소좀을 포함하는 것을 특징으로 하여, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 증식 및/또는 이동을 촉진시킴으로써, 피부재생을 가능하게 하는 효과가 있다.

여기서, 상기 피부 세포는 피부로부터 분리하여 얻을 수 있는 다양한 세포를 모두 포함하고, 바람직하게는 피부로부터 분화된 피부 각질세포인 것이 적합하다. 즉, 본 발명의 엑소좀은 이미 분화된 피부 세포로부터 얻을 수 있기 때문에 미분화된 줄기세포를 이용하는 경우 야기되는 이상증식이나 부작용 등의 위험이 없이 높은 안정성을 가지고, 세포 친화적이어서 피부재생이나 상처치유를 위한 의약 또는 화장품 원료로써 사용 가능하다.

이러한 본 발명에 있어서, 피부 세포, 바람직하게는 피부 각질세포로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 이 기술분야에 알려진 다양한 방법을 모두 포함한다. 예를 들어, 후술하는 실시예에서와 같이 피부각질세포주(HaCaT keratinocyte cell line)를 원심분리함으로써 생체나노입자를 얻을 수 있고, 그 중에서 30 ~ 100 nm의 직경을 가지는 엑소좀만을 이용하는 것이 가능하다.

그리고, 상기 엑소좀은 1~100 ㎍/㎖ 범위 내의 농도를 가지는 것이 바람직한데, 엑소좀의 농도가 상기 범위보다 낮으면 세포의 증식 및/또는 이동 효과가 미흡하고, 상기 범위를 넘으면 효과 상승 정도가 포화될 뿐만 아니라 과도한 엑소좀 함량에 의해 다른 부작용이 발생할 수 있어서 부적합하다.

한편, 본 발명자들은 상기와 같은 엑소좀 중 어떠한 성분이 피부 각질세포의 증식 및/또는 이동에 효과적으로 작용하여, 피부 재생에 효과적인지 여부를 확인하고자, 상기 엑소좀을 가열한 것과 가열하지 않은 것으로 비교 실험을 하였다. 그 결과, 후술하는 실시예 및 실험예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 엑소좀의 성분 중, 지질 및/또는 열에 안정한 성분은 피부 세포의 증식 유도에 적합하고, 단백질 및/또는 열에 불안정한 성분은 피부 세포의 이동을 촉진시켜서, 피부를 재생시키는데 적합함을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 상기 엑소좀은 열에 가열되지 않은 것이 바람직하고, 열에 가열되면 변성 또는 변형되는 물질(예를 들어, 단백질)을 주요성분으로 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 이러한 물질을 주요성분으로 함유하는 경우, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포를 포함하는 피부 세포의 증식과 이동뿐만 아니라, 피부 세포의 재생도 가능하다.

또한, 본 발명의 상기 엑소좀이 열에 의해 가열되는 경우에는, 피부 세포의 이동과 피부 재생 효과가 다소 미흡한 것으로 확인됨에 따라, 본 발명에 따른 상기 엑소좀은 열에 가열된 것일 수 있고, 이에 따라 열에 가열되더라도 변성 또는 변형되지 않는 물질(예를 들어, 지질)을 주요성분으로 포함하는 경우에는, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 증식용으로 적합한 것을 알 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 피부 각질세포의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 것일 수 있고, 이에 따라 피부 재생 및/또는 상처 치유 기능을 가지는 피부 외용제 또는 화장료 조성물일 수 있다.

여기에는, 상기 엑소좀의 약제학적으로 허용 가능한 염 등이 다수 포함될 수 있고, 이러한 조성물은 피부 재생 뿐만 아니라, 피부 상처 치유와 생리활성 등의 다양한 효과를 가질 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 : 엑소좀의 분리 및 획득

본 실시예에서는 피부 세포로써 피부각질세포주(HaCaT keratinocyte cell line)를 사용하였고, 이와 함께 우태혈청(FBS: Fetal Bovine Serum) 10%과 페니실린(penicillin) 100 U/㎖, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/㎖을 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 배지에 녹여 사용하였다.

도 2는 본 발명에 따라 피부 각질세포에서 엑소좀을 분리하는 과정의 일례를 나타낸 흐름도이다. 즉, 상기 피부각질세포주를 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하고, 상기 피부각질세포주가 80 ~ 90% 정도 성장하면, PBS(Phophate Buffered Saline:인산완충용액)로 세척하였으며, 여기에 우태혈청(FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신이 들어가지 않은 DMEM 배지를 넣어 다시 24시간 배양한다. 이후 상층액만 따로 모아 500 xg로 원심분리하여 상층액내 부유세포를 제거하고, 1,000 xg에서 세포 잔여물(cell debris)을 제거하였으며, 10,000 xg에서 세포 소기관을 제거하였다.

그런 다음, 세포 및 세포 잔여물이 제거된 배지를 초미세여과(ultrafilteration, 100 kDa cut/off) 시켜서 농축하였다. 그 다음, 침전제(exo-quick)를 처리하고 4℃에서 12시간 반응시킨 후, 1,500 xg에서 30분간 원심분리하여, 엑소좀을 분리하였다. 분리한 엑소좀은 PBS(Phophate Buffered Saline:인산완충용액)에 녹여 BCA assay(Bicinchoninic acid assay)를 통하여 단백질 양을 확인 후, 부분 표본(aliquot)하여 -20℃에 보관하였다.

실험예 1 : 엑소좀의 크기 규명

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 얻은 생체나노입자를 Atomic Force Microsopy(AFM)을 대상으로 크기 및 지름을 확인하였다. 즉, AFM을 통해 엑소좀을 촬영하여, 그 이미지상의 엑소좀 입자를 크기와 높이에 따라 분석하였으며, 이는 도 3의 사진 및 그래프와 같이 나타났다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 피부 각질세포에서 엑소좀을 분리하는 방법을 이용하여 분리한 엑소좀을 원자현미경(AFM: Atomic Force Microscopy)으로 관찰한 결과를 나타낸 도면이다. 도 3에서 그래프의 가로축은 입자의 지름을, 세로축은 높이를 나타낸 것으로, 본 발명의 실시예에서 얻은 생체나노입자는 그 크기가 30㎚ ~ 100㎚에 해당하여, 엑소좀임을 확인할 수 있다.

실험예 2 : 엑소좀의 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포 증식 효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 엑소좀을 이용하여 세포증식실험(Proliferation assay)을 통하여, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 증식 활성을 측정하였다.

즉, 세포 배양을 위해 well-plate로 96 well을 사용하였고, 이것을 0.1㎎/㎖ 콜라겐(collagen, type 1)으로 코팅하였다. 여기에 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포를 각각 2 X 10³/100 ㎕/well로 넣고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 12시간 배양하였다. 그런 다음, 0.1 ~ 20 ㎍/㎖ 농도의 가열한 엑소좀과 가열하지 않은 엑소좀을 각 well에 처리하고, 48시간 동안 배양한다. 그 후, 배양한 엑소좀의 각 well에 EZcytox를 처리하고, 450 nm에서 흡광도 측정한 후, 백분율로 환산하여 세포증식에 대한 결과를 확보하였다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 분리한 엑소좀의 표피 각질세포의 증식효과를 나타낸 그래프이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 의해 분리한 엑소좀의 진피 섬유아세포의 증식효과를 나타낸 그래프이다. 여기서, 음성대조군은 어떠한 엑소좀도 이용하지 않은 것이고, 양성대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epithermal growth factor)를 이용한 것이다.

도 4 및 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 표피 각질세포에서 추출한 엑소좀은 농도를 증가시킬수록 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포를 더욱 증식시키는 것으로 나타났다. 즉, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 증식은 각질세포에서 추출한 엑소좀의 농도에 비례한다는 것으로 나타났고, 가열한 엑소좀과 가열하지 않은 엑소좀이 차이가 없는 것으로 보아, 지질이나 열에 안정한 물질이 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 증식을 유도하는 것으로 판단된다.

실험예 3 : 엑소좀의 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포 이동 효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 엑소좀을 이용하여 세포이동실험(Migration assay)을 통하여, 표피 각질세포 및 진피 섬유아세포의 이동 활성을 측정하였다.

즉, 48 well chemotactic boyden chamber를 이용하여, 하단 챔버(lower chamber)에 가열한 엑소좀과 가열하지 않은 엑소좀을 각각 0.1 ~ 20 ㎍/㎖의 농도로 처리하고, 콜라겐(collagen)이 코팅된 폴리카보네이트 멤브레인(polycarbonate membrane) 8 μm pore에 올려 주었다. 이후, 상단 챔버(Upper chamber)에 각질세포 및 섬유아세포(50,000 cells/well)를 각각 넣어주고, 3시간 배양하였다. 그런 다음, 챔버 분리 후 폴리카보네이트 멤브레인을 꺼내어, 이를 Diff-Quik solution을 이용하여 세포를 고정 및 염색하고, 이동하지 않은 세포를 제거한 후 현미경을 통하여 이동한 세포를 세어, 백분율로 환산하였다. 그 결과는 도 5(표피 각질세포)와 도 9(진피 섬유아세포)에 나타난 바와 같다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 각질세포에서 추출한 엑소좀에 의해 각질세포의 이동효과를 나타내는 그래프이고, 도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 각질세포에서 추출한 엑소좀에 의해 진피 섬유아세포의 이동효과를 나타내는 그래프이다. 여기서, 음성대조군은 어떠한 엑소좀도 이용하지 않은 것이고, 양성대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epithermal growth factor)를 이용한 것이다.

도 5와 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 피부각질세포에서 분리된 엑소좀을 가열하지 않은 경우, 세포이동실험결과 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 이동이 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 가열한 엑소좀의 농도 증가는 각질세포와 섬유아세포의 이동에 영향을 주지 않는 것으로 나타난 것을 보아 단백질이나 열에 불안정한 물질이 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 이동을 유도하는 것으로 판단된다.

실험예 3 : 엑소좀의 피부재생 효과 측정

상기 실시예 1에서 얻은 엑소좀을 이용하여 스프라우팅 어세이(Sprouting assay)법으로 피부재생 활성을 측정하였다.

즉, 콜라겐(Collagen, type I)과 피부세포를 2.5 ⅹ 10⁷cells/㎖이 되도록 섞은 후, NaOH(1 M) 용액을 이용하여 중화하고, 24 well에 5㎕씩 스팟팅(spoting) 하고, 5 ~ 10분 정도 상온에서 건조하여, 인공피부조직을 형성하였다. 그리고, 본 발명의 엑소좀(가열한 엑소좀과 가열하지 않은 엑소좀)을 각 well에 0.1 ~ 20 ㎍/㎖씩 처리하고, 48 ~ 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 그런 다음, 배양액을 제거하고, Diff-Quik solution을 이용하여 세포와 조직을 고정 및 염색하였으며, 염색된 세포를 촬영하여 도 6과 도 7에 도시된 바와 같은 결과를 얻었다.

도 6는 본 발명의 일실시예에 따른 각질세포에서 추출한 엑소좀에 의한 인공피부의 재생활성을 나타낸 것이고, 여기서, 음성대조군은 어떠한 엑소좀도 이용하지 않은 것이고, 양성대조군은 종래에 상처치유 및/또는 피부재생에 활용되고 있는 표피성장인자(epithermal growth factor)를 이용한 것이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따라 피부각질세포에서 분리된 엑소좀을 가열하지 않은 경우, 피부재생의 효과가 농도에 의존적인 것을 알 수 있으며, 이에 따르면 단백질이나 열에 불안정한 물질이 각질세포의 피부재생 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

도 7는 본 발명의 도 6에 나타낸 엑소좀에 의한 피부 재생효과를 정량화 하여 나타낸 그래프이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 피부 각질세포에서 분비된 엑소좀은 피부 세포의 증식을 활성화시킬 뿐만 아니라, 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 이동을 활성화시켜서, 피부 조직을 재생 시킬 수 있음을 알 수 있다.

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims

피부 세포로부터 얻은 엑소좀을 포함하는 피부 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 세포는 분화된 피부 각질세포인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 엑소좀은 1~100 ㎍/㎖ 범위 내의 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 피부 재생용은 피부 각질세포 또는 진피 섬유아세포의 증식 또는 이동용인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 열에 가열되면 변성 또는 변형되는 물질을 주요성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 열에 가열되면 변성 또는 변형되는 물질은 단백질인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 열에 가열되더라도 변성 또는 변형되지 않는 물질을 주요성분으로 포함하고,
피부 각질세포 또는 진피 섬유아세포의 증식용인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 열에 가열되더라도 변성 또는 변형되지 않는 물질은 지질인 것을 특징으로 하는 피부 재생용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
화장품 원료로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장품 조성물.