JP2023513394A - 細胞外小胞及びその皮膚製品における使用 - Google Patents

細胞外小胞及びその皮膚製品における使用 Download PDF

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Abstract

皮膚に使用される薬物、健康機能製品又はスキンケア製品としての誘導性細胞外小胞の使用。誘導性小胞と、皮膚薬物又はケア物質とを含む組成物。

Description

本発明は、生物医薬分野に属し、細胞外小胞及びその皮膚製品における使用に関する。
細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ，ＥＶ）は、細胞から分泌される、タンパク質、核酸及び様々なサイトカインを含むナノスケール担体である。細胞外小胞は、内分泌又は傍分泌の方式により標的細胞に作用することができ、細胞間の物質輸送及び情報交換の過程において重要な役割を果たしている。研究により、細胞外小胞によって媒介される情報交換は、生体の生理的又は病理的過程において重要な調節的役割を果たしており、免疫調節、腫瘍増殖、血管形成、損傷修復などに関与することが見出された。現在、当該分野の研究は、主にエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）に焦点を当てている。エクソソームは、直径が約３０－１５０ｎｍの細胞外小胞であり、その内部にＲＮＡ、脂質及びタンパク質などの成分が含まれる。エクソソームは、生体の様々な生理的／病理的調節に広く関与しており、多くの疾患の診断、治療及び予後評価に使用することができる。今まで、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、エクソソームの産生能力が最も高い細胞であると考えられている。大量の研究により、ＭＳＣ由来のエクソソームは、ＭＳＣの生物学的機能を模倣することができ、細胞の成長と分化の促進、組織欠陥の修復などにおいて重要な調節的役割を果たしていることが見出された。そのため、近年、ＭＳＣ由来のエクソソームによる細胞小胞療法は、顕著な発展を遂げた。しかし、現在、エクソソームによる細胞小胞療法には依然として多くの問題（主にエクソソームの抽出及び精製の過程が複雑で、かかる時間が長く、設備及び試薬に対する要求が高く、生理的エクソソームの産生量が比較的低いなど）がある。これらの欠陥のため、エクソソーム療法の臨床へのトランスレーション及び応用が制限されている。
毛髪脱落を引き起こす疾患は多くあり、最も一般的なのは円形脱毛症である。円形脱毛症（Ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｅａｔａ）は、「ゴーストシェービング」と呼ばれており、突然起こる斑状の限局性脱毛であり、局所皮膚が正常で、自覚症状がない。現在のところ、病因は不明であるが、病理検査では毛嚢が減少し、毛嚢の周囲にリンパ球の浸潤がみられ、他の自己免疫疾患を伴うこともある（Ａｌｏｐｅｃｉａ Ａｒｅａｔａ：Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ，Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｎｅｗ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｄａｒｗｉｎ Ｅ，Ｈｉｒｔ ＰＡ，Ｆｅｒｔｉｇ Ｒ，Ｄｏｌｉｎｅｒ Ｂ，Ｄｅｌｃａｎｔｏ Ｇ，Ｊｉｍｅｎｅｚ ＪＪ．Ｉｎｔ Ｊ Ｔｒｉｃｈｏｌｏｇｙ．２０１８；１０（２）：５１－６０）。ほとんどの一般的な円形脱毛症は自然治癒する傾向にあるが、少数の症例では繰り返して発症したため、治療が困難であるが、併用して脱毛症を治療可能な治療法が多くある。円形脱毛症は、いかなる年齢でも発症する可能性があり、若年成人に多く見られ、男女間の発症率に顕著な違いがない。皮膚損傷は、円形又は楕円形の非瘢痕性脱毛として現れ、脱毛斑周辺に「感嘆符」様な毛が見られることが多い。髪が完全又はほぼ完全に抜け落ちる疾患は、完全脱毛症と呼ばれる。全身の毛髪（体毛を含む）が全て抜け落ちる脱毛症は、全身脱毛症と呼ばれ、蛇行状脱毛も見られる。患部皮膚に毛髪がない以外、他に異常はない。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを用いてイミキモドを局所塗抹する方法により円形脱毛症モデルを構築できることが報告された文献があるが、いまだに円形脱毛症に対する有効な治療方法がない。
一形態では、本発明によれば、皮膚製品若しくは皮膚付属器製品の調製における誘導性小胞の使用、又は皮膚製品若しくは皮膚付属器製品としての誘導性小胞の使用が提供される。
本発明において、「皮膚製品」とは、皮膚に対して効果を有する製品、例えば、皮膚に対して治療、改善、修復、シワ取り又は傷消しなどの効果を有する製品を指し、皮膚に直接又は間接作用可能であり、薬物、薬物担体、食品、健康機能製品、スキンケア製品又は美容医療用品であってもよい。
いくつかの実施形態において、前記製品は、薬物、薬物担体、食品、健康機能製品、スキンケア製品又は美容医療用品である。
いくつかの実施形態において、前記皮膚は、表皮、真皮又は皮下組織である。
いくつかの実施形態において、前記皮膚付属器は、毛、髪、汗腺、皮脂腺、手の爪又は足の爪である。
研究過程において、本発明者らは、ヌードマウスにＩＥＶを注射したら、ＩＥＶは心臓、腎臓及び脳内に分布しないが、手の爪に分布することを偶然に見出し、ＩＥＶの標的性に関係があると推測している。
さらなる研究により、本発明者らは、ＩＥＶが毛髪再生、傷口癒合に対して優れた治療効果を有することを見出した。ＩＥＶは、皮膚又は皮膚付属器に対して治療効果を有するとともに、皮膚又は皮膚付属器を標的とすることにより、特に皮膚製品若しくは皮膚付属器製品の調製に適用され、又は皮膚製品若しくは皮膚付属器製品として適用される。
また、本発明によれば、誘導性小胞と皮膚薬物又はケア物質とを含む組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、前記皮膚薬物及びケア物質は、細胞外小胞内に包まれ、又は細胞外小胞と分かれて組成物に存在する。
いくつかの実施形態において、前記組成物の剤形は、好ましくは、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル及び貼付剤から選択される。いくつかの実施形態において、前記貼付剤は、マイクロニードルパッチから選択される。いくつかの実施形態において、前記剤形は、注射剤及びマイクロニードルパッチから選択される。
いくつかの実施形態において、前記誘導性小胞は、外力によって正常な生存期間にある幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される小胞である。いくつかの実施形態において、前記誘導性小胞は、スタウロスポリンの添加、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせにより幹細胞又は幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される。
別の形態では、本発明によれば、組成物が提供される。前記組成物は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞からなる第１剤と、老化防止物質又はＷｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーターからなる第２剤とを含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞外小胞とは、前駆細胞（例えば、幹細胞、特に間葉系幹細胞）が正常に生存しているときに介入又は誘導されてアポトーシスすることで産生した亜細胞産物を指し、誘導性小胞とも呼ばれる。好ましくは、前駆細胞は、初期前駆細胞である。
通常、このような亜細胞産物は、膜構造を有し、遺伝物質ＤＮＡを含み、分裂不可で、運動及び遊走可能であり、細胞と細胞外小胞（アポトーシス小体、エクソソームなど）との間の物質である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、血液幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞由来の胞外小胞は、エクソソーム、移動体、微小胞、アポトーシス小体、誘導性細胞外小胞から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞由来の胞外小胞は、誘導性細胞外小胞から選択される。
いくつかの実施形態において、前記老化防止物質は、メトホルミン、レスベラトロールから選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記老化防止物質は、メトホルミンから選択される。
いくつかの実施形態において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔ／β-カテニン経路から選択される。
いくつかの実施形態において、前記ポジティブレギュレーターは、アゴニストから選択される。
いくつかの実施形態において、前記アゴニストは、Ｌｉｃｌ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ、Ｗｎｔアゴニスト及びＷＡＹ ２６２６１１から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記アゴニストは、Ｌｉｃｌから選択される。
いくつかの実施形態において、前記ポジティブレギュレーターは、運動するための提示から選択される。
いくつかの実施形態において、前記提示は、パッケージ、ラベル及び説明書から選択される１種又は複数種である。
いくつかの実施形態において、前記組成物に含まれる幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞と、老化防止物質との比は、（０．５－５）×１０７個：（０．０５－１０）ｍｇである。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、１×１０７－３×１０７個の幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞と、０．１－５ｍｇの老化防止物質とを含む。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、１．８×１０７－２．７×１０７個の幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞を含む。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、０．２－３ｍｇの老化防止物質を含む。
前記組成物を使用する際に、前記細胞外小胞を、静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、髄腔内注射又は注入、及び臓器内注入からなる群より選択される経路により投与することができる。例えば、静脈注射の場合、尾静脈より注射することができる。臓器内注入は、解剖学的空間、例えば、胆嚢、胃腸腔、食道、肺系（吸入による）及び／又は膀胱への注入を含む。
例として、胃腸腔注入である腹腔内注射は、尾静脈注射に比べ、同等の治療効果を得ることができる。腹腔内注射の安全性及び操作性は、尾静脈注射よりも優れている。
いくつかの実施形態において、組成物中の２種類の試薬は、単一の医薬組成物として提供され、いくつかの実施形態において、２種類の試薬のうちのそれぞれのキット又は２種類の試薬の組み合わせのディスペンサーというパッケージが期待できる。理解できるように、本発明の内容は、単一剤形又は別々の剤形の組み合わせ、同時又は交替にもかかわらず、被験体に対する２種類の試薬のうちのいずれか１種の共同投与を含む。
いくつかの実施形態において、前記細胞外小胞は、スタウロスポリンの添加、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせにより間葉系幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される。
いくつかの実施形態において、前記細胞外小胞は、スタウロスポリンの添加により間葉系幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される。
いくつかの実施形態において、前記間葉系幹細胞の世代数は、２～５代目であってもよいが、これに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は、１ｎＭ以上、好ましく１－１５０００ｎＭ、好ましくは２００－１００００ｎＭ、好ましくは２５０－１０００ｎＭ、好ましくは５００－１０００ｎＭである。また、スタウロスポリンの濃度は、２８０－９０００ｎＭ、２３０－８５００ｎＭ、５００－１０００ｎＭ、５００－９００ｎＭ又は５００－８００ｎＭであってもよい。いくつかの実施形態において、前記スタウロスポリンの濃度は５００ｎＭである。
いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．４５μｍ以下である。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．４５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１－０．４５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１－０．３５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１５－０．３５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１５－０．３μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１５－０．２μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．４μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．３８μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．３５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．３２μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．３μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．２５μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．０５－０．２２μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１５－０．２２μｍである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞の直径は０．１５－０．４５μｍ又は０．２－０．３μｍであってもよい。
いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞は、マーカーであるシンタキシン４を有する。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞は、マーカーであるシンタキシン４を高発現する。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞でのマーカーであるシンタキシン４の発現は、ＭＳＣ又はエクソソームよりも高い。いくつかの実施形態において、前記マーカーであるシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のシンタキシン４の発現量の３－６倍である。いくつかの実施形態において、前記マーカーであるシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のシンタキシン４の発現量の３．５－５倍である。いくつかの実施形態において、前記マーカーであるシンタキシン４の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のシンタキシン４の発現量の４．４５倍である。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１及びインテグリンα５のうちの１種又は複数種をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記マーカーは、シンタキシン４、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１及びインテグリンα５の組み合わせである。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞は、マーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５を高発現する。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５の発現量は、ＭＳＣ又はエクソソームよりも高い。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ１－２倍、２－３倍、１－３倍及び３－４倍である。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ１．５－２倍、２．５－３倍、１．５－２．５倍及び３．５－４倍である。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞中のマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５の発現量は、間葉系幹細胞に由来するエクソソーム中のマーカーの発現量に対してそれぞれ１．７６倍、２．８１倍、２．４１倍、３．６８倍である。本発明において、前記誘導性細胞外小胞は、エクソソームと本質的に異なり、例えば、エクソソームに比べ、本発明に記載の誘導性細胞外小胞ＩＥＶは、シンタキシン４を高発現するとともに、アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５の発現量は、エクソソームよりも顕著に高い（実施例３を参照）。マーカー発現量の違いに加え、前記誘導性細胞外小胞ＩＥＶは、機能又は治療効果にも幹細胞及び他の細胞外小胞（例えば、エクソソーム）と異なる特性を示す。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６をさらに発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５を発現しない。いくつかの実施形態において、前記誘導性細胞外小胞は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＣ１ｑのうちの１つ又は複数をさらに発現する。
いくつかの実施形態において、毛髪再生又は傷口癒合を促進するための薬物の調製における前記組成物の使用がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。前記組成物の剤形は、好ましくは注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル及び貼付剤から選択される。
いくつかの実施形態において、前記貼付剤は、マイクロニードルパッチから選択される。いくつかの実施形態において、前記剤形は、注射剤、マイクロニードルパッチ及び錠剤から選択される。
いくつかの実施形態において、前記細胞外小胞の調製方法であって、
インビトロで間葉系幹細胞を培養し、コンフルエントが８０％－９０％になったときにＰＢＳで２－５回洗い流すステップ１）と、
ステップ１）で得られた間葉系幹細胞を５００－１０００ｎＭのスタウロスポリンを含む無血清培地に加え、３７℃で１６－２４ｈインキュベートし、細胞上清液を収集するステップ２）と、
ステップ２）で収集された細胞上清液を４℃、５００－１５０００ｇで５－３０分間遠心分離し、上清液を収集するステップ３）と、
ステップ３）で収集された細胞上清液を４℃、１５００－２５００ｇで５－３０分間遠心分離し、上清液を収集するステップ４）と、
ステップ４）で収集された細胞上清液を４℃、１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離して得られた沈殿物が細胞外小胞であるステップ５）と、
を含む調製方法がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、細胞外小胞の洗浄ステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記洗浄ステップは、具体的には、ステップ５）で得られた細胞外小胞をＰＢＳで再懸濁させ、４℃、１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離して得られた沈殿物が細胞外小胞であるステップ６）である。
別の態様では、本発明によれば、幹細胞服用製品の併用薬の調製における老化防止物質の使用がさらに提供される。
本発明の実施形態における「幹細胞服用製品」は、幹細胞又は幹細胞由来小胞を動物体内に入らせることができる製品又は方法を含むが、これらに限定されない。
例示的な例として、幹細胞服用製品を動物体内に入らせることができる製品は、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル又は貼付剤を含む。
例示的な例として、幹細胞服用製品を動物体内に入らせることができる方法は、経口投与、注射、貼付、塗布、スプレー、滴注を含む。
本発明の実施形態における「併用薬」は、別の１種又は複数種の薬物と一緒に体内に入る薬物を含む。併用薬は、同時又はほぼ同時に体内に入ることができる。
例示的な例として、ほぼ同時に入るとは、１つずつ入ってもよいか、又は同一日中の異なる時刻で体内に入ってもよい。例えば、複数の薬剤又はその有効成から１種の剤形を調製してもよいか、又は２種以上の剤形がほぼ同時に体内に入ってもよい。例えば、互いに約１時間以内である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞服用製品は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞である。
いくつかの実施形態において、前記幹細胞服用製品は、動物体内に取り込まれるための幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞である。好ましくは、前記動物は、哺乳動物である。好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトである。
別の態様では、本発明によれば、幹細胞服用製品と、併用製品とを含む幹細胞服用システムがさらに提供される。前記併用製品は、老化防止物質及びＷｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーターから選択される１種又は２種である。前記幹細胞服用製品は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞を含む。前記老化防止物質又はＷｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーターは、上記と同様である。
別の態様では、本発明によれば、Ｗｎｔシグナル伝達経路によって制御される幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞の代謝により毛髪再生又は傷口癒合を促進する薬物の調製における幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞の使用がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、前記毛髪再生又は傷口癒合を促進する薬物は、幹細胞或幹細胞由来の胞外小胞と、老化防止物質とを含む。前記幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞及び老化防止物質は、上記と同様である。
別の態様では、本発明によれば、幹細胞服用製品の動物体内からの排出、毛髪再生、又は傷口癒合を促進する方法がさらに提供される。前記方法は、幹細胞服用製品を服用する期間において同時又はほぼ同時に老化防止物質を服用し、又は運動することを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、「Ｗｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーター」は、Ｗｎｔをアップレギュレーション又は活性化できる試薬又は方法を含み、例えば、アゴニストであるが、これに限定されない。前記「方法」の実現は、被験体のための提示、説明、処方又は指示などを含む。
別の態様では、本発明によれば、必要がある被験体に前記誘導性小胞、組成物、幹細胞服用システムを投与するステップを含む皮膚又は皮膚付属器疾患の治療方法がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、前記皮膚又は皮膚付属器疾患は、創傷、脱毛症、瘢痕、熱傷及び潰瘍から選択される。いくつかの実施形態において、前記創傷は、切除による傷口、切り傷、刺傷及び穿刺による傷口から選択される。
誘導多能性幹細胞は特定の転写因子を導入して終末分化した体細胞をリプログラミングすることにより形成された多能性幹細胞を含む。
実施例１に係るフローサイトメトリーによる検出を示す図である。 実施例２に係るＩＥＶの調製技術のフローチャートである。 フローサイトメトリー技術により分析されたＭＳＣ（１０６個のＭＳＣ）が産生したＩＥＶ数の統計結果である。 図４Ａから図４Ｆは、ＩＥＶ粒子の直径検出を示す。図４Ａは、フローサイトメトリーにより検出されたＩＥＶの粒径分布図である。図４Ｂは、側方散乱光（ＳＳＣ）によるＩＥＶの散乱光強度の分析であり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｃは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の標準化小粒子ミクロスフェアを用いるＩＥＶの散乱光強度の分析であり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｄは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察されたＩＥＶであり、ＩＥＶの粒径分布を示す。図４Ｅは、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）であり、ＩＥＶ粒径分布を示す。図４Ｆは、ナノフローサイトメトリー検出技術によるＩＥＶに対する単一小胞レベルの粒径検出であり、ＩＥＶの粒径分布である。 図５Ａから図５Ｋは、フローサイトメトリーによりＩＥＶの表面膜タンパク質を分析した結果である。 図６Ａから図６Ｄは、ＩＥＶの内容物分析である。図６Ａは、ＤＩＡ定量化技術によるＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム、ＭＳＣ－ＩＥＶの定量プロテオミクス分析結果である。図６Ｂは、ＩＥＶが特異的に高発現するタンパク質をスクリーニングして作成したヒートマップである。図６Ｃは、示差的タンパク質のＧＯ濃縮分析によりＩＥＶ発現アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４分子を分析した結果である。図６Ｄは、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによりＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム、ＭＳＣ－ＩＥＶ発現アネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４を検証した結果である。 実施例３に係る皮膚表面でのＩＥＶの動的代謝模式図である。 ＩＥＶが経時的に皮下組織から真皮層及び表皮へ徐々に移動することを示す。 ７日目にマウスの体表から抜いた毛髪の毛嚢にＰＫＨ２６－ＩＥＶが存在することを発見したことを示す。 インビボイメージング技術により検出した１、３、７日目のマウス全身におけるＩＥＶ分布状況を示す。 ７日目のマウスの各臓器におけるＩＥＶの分布と、対照群との比較を示す。 ３日目のマウスの手の爪及び切歯におけるＩＥＶの代謝模式図である。 実施例４で異なる処理をなされたマウスの０、１０、１４日目の背部毛髪の再生状況の模式図である。 実施例４で異なる処理をなされたマウスの０、１０、１４日目の背部毛髪の再生面積の統計分析模式図である。 実施例６で異なる処理をなされたマウスの０、１１、１３、１６日目の背部毛髪の再生状況の模式図である。 実施例５で異なる薬物とＩＥＶとを併用した７日後の皮膚表面におけるＩＥＶの分布図である。 実施例５で異なる薬物とＩＥＶとを併用した後の毛髪再生促進効果の模式図である。 実施例６でＷｎｔアゴニストＬｉｃｌを投与した後のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ結果を示す。 実施例６でＷｎｔ阻害剤Ｘａｖ９３９を投与した後のＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ結果を示す。 実施例６におけるＸａｖ９３９の作用下での免疫蛍光結果を示す。 実施例６で異なる処理をなされた細胞スミア（ｃｅｌｌ ｓｍｅａｒ）の結果を示す。 実施例６で異なる処理をなされた後の表皮におけるＩＥＶの排出状況の免疫蛍光結果を示す。 運動後の循環におけるＤＫＫ１のレベルを示す。 運動なし及び運動後の血液中のＩＥＶの数及びフローサイトメトリー結果を示す。 運動後の皮膚表面におけるＩＥＶの排出量の免疫蛍光結果を示す。 インビボイメージング技術により検出された１日間又は３日間運動した後のマウス全身におけるＩＥＶの分布状況を示す。 インビボイメージング技術により検出された１日間又は３日間運動後のマウス皮膚におけるＩＥＶの分布状況を示す。 フローサイトメトリーにより検出された７日間運動後のインビボ（血液） 中のＩＥＶの結果を示す。 実施例７における傷口癒合に対するＩＥＶ及びＭＳＣ処理の促進作用を示す。 実施例７における傷口癒合に対する異なる処理群の作用模式図である。 実施例７における異なる処理群の免疫蛍光分析結果を示す。 実施例１０でＩＥＶを水光導入する前後の被験体の顎部位のシワの比較図である。 実施例１１における電子顕微鏡下でのｉＰＳＣに由来のＩＥＶを示す。 実施例１２でハイコンテント分析システムにより撮影されたｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの死亡過程図である。 実施例１２でフローサイトメトリー分析によりアポトーシスが誘導されたｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣを示す。 実施例１２でフローサイトメトリー分析により得られたｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣのアネキシン５の発現陽性率を示す。 実施例１２におけるＮＴＡで特徴付けられるｈｉＰＳＣ－ＩＥＶ及びｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶの粒径を示す。 実施例１２におけるＮＴＡで特徴付けられるｈｉＰＳＣ－ＩＥＶ及びｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶの収量を示す。 実施例１２におけるＮＴＡで特徴付けられるｈｉＰＳＣ－ＩＥＶ及びｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶの電位を示す。 実施例１２の皮膚損傷モデルにおける異なる処理群の異なる時点での傷口状況及び傷口面積の統計図である。
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段をさらに説明する。具体的な実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。本発明の思想に基づいて当業者が行った非本質的な修正及び調整は、依然として本発明の保護範囲に含まれる。
本発明の実施例において、ＩＥＶは誘導性小胞の略称であり、誘導性小胞又は誘導性細胞外小胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ＩＥＶ）と呼ばれてもよい。誘導性細胞外小胞とは、前駆細胞（例えば、幹細胞）が正常に生存しているときに介入又は誘導されてアポトーシスすることで産生した亜細胞産物を指す。通常、このような亜細胞産物は、膜構造を有し、アポトーシスマーカーを発現し、一部が遺伝物質ＤＮＡを含む。本発明者らは、誘導性細胞外小胞が細胞及び通常の細胞外小胞（例えば、エクソソームなど）と異なる物質であることを見出した。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞、例えば、非アポトーシス細胞、非老化細胞、老化により増殖が停滞したものではない細胞、凍結後に蘇生したものではない細胞、悪性化して異常増殖したものではない細胞又は損傷がない細胞などである。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、細胞培養過程において細胞が８０－１００％コンフルエントになったときの細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、対数増殖期の細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、ヒト又はマウス組織に由来する初代培養細胞及びその継代培養細胞から採取される。いくつかの実施形態において、前記正常に生存しているときの細胞は、樹立された細胞系又は細胞株から採取される。いくつかの実施形態において、前記前駆細胞は、初期細胞から採取される。
本発明において、ＩＥＶはＩＥＶｓと同じである。
本発明において、ＳＴＳはスタウロスポリンである。
本発明において、「組成物」中の成分は、混合物として存在してもよく、分かれて包装されてもよい。分かれて包装される成分は、それぞれ佐剤を含んでもよい。前記佐剤とは、薬学的に薬物の治療効果を補助可能な手段を指す。組成物中の成分が分かれて包装される場合、分かれて包装されるそれぞれの成分は、同時に投与されてもよく、任意の前後順序で投与されてもよく、この場合、患者に１つの薬物を投与して治療し、次に他の薬物を投与する。前記患者は、哺乳動物被験体、特にヒトである。
本発明において、前記「組成物」は、１つの成分がもう１つの成分で包まれる形態で存在してもよい。いくつかの実施形態において、組成物では、前記誘導性小胞は薬物担体として疾患を治療又は予防する薬物を前記誘導性小胞内に包む。
「含む」又は「含有する」とは、組成物（例えば、媒質）及び方法が列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味する。組成物及び方法を定義するために使用されるときに、「基本的に・・・からなる」とは、前記目的組み合わせに対していかなる重要な意義を有する他の要素を排除することを意味する。したがって、基本的に本発明書で定義される元素からなる組成物は、保護が要求される本発明の基本及び新規特徴に実質的に影響しない他の材料又はステップを排除しない。「・・・からなる」とは、他の組成部分の微量元素及び実質的な方法ステップを排除することを意味する。これらの用語のそれぞれで定義される実施形態は、全て本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において、「及び／又は」という用語は、関連する１つ又は複数の列挙される項目のいずれか及び全ての可能な組み合わせを指しかつ含む。２つ以上の項目のリスト中で使用される際に、「及び／又は」という用語は、列挙される項目のうちのいずれか１つを単独で使用でき、又は２つ以上の列挙される項目のいずれかの組み合わせを使用できることを示す。例えば、組成物、組み合わせ、構造などが成分Ａ、Ｂ、Ｃ及び／又はＤを含む（又は含有する）として記述される場合、この組成物は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ｄ単独、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＡとＤの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、ＢとＤの組み合わせ、ＣとＤの組み合わせ、ＡとＢとＣの組み合わせ、ＡとＢとＤの組み合わせ、ＡとＣとＤの組み合わせ、ＢとＣとＤの組み合わせ、又はＡとＢとＣとＤの組み合わせを含んで使用することができる。
実施例１：ＭＳＣの分離培養
動物倫理委員会の指導に従って過剰なＣＯ２でマウスを安楽死させ、無菌条件下で脛骨及び大腿骨を摘出し、それらに付着した筋肉及び結合組織を除去し、さらに骨幹端を分離して骨髄腔を露出させ、１０ｍＬ無菌注射器で体積分率１０％の胎牛血清を含むＰＢＳを吸い出して骨髄腔を繰り返して洗い流し、孔径７０μｍの細胞濾過網で濾過した後、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清液を除去した後、底部の細胞沈殿を収集し、ＰＢＳで再懸濁させ、さらに５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、最終的な細胞沈殿を収集した。次に、細胞をフローサイトメトリーにより選別し、ＣＤ３４－及びＣＤ９０＋を選別標準として骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＭＳＣ）を得た。最後に、Ｄｅｘ（－）培養液で細胞を再懸濁させ、直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２４ｈ後、上清液における壁に付着していない細胞を吸引除去し、ＰＢＳで洗浄した後、Ｄｅｘ（－）培養液を加えて引き続き培養した。１週間後に同量のＤｅｘ（＋）培養液を加え、さらに１週間後に密集した初代ＢＭＭＳＣコロニーが観察された。トリプシンを用いて３７℃でインキュベートしてＢＭＭＳＣを消化し、継代増幅させ、その後、３日ごとにＤｅｘ（＋）培養液を交換し、培養皿いっぱいになった後、継代した。Ｐ２代のＢＭＭＳＣを用いて後の実験を行った。
Ｄｅｘ（－）培養液成分を表１に示し、Ｄｅｘ（＋）培養液成分を表２に示す。
Figure 2023513394000002
Figure 2023513394000003
フローサイトメトリーによる表面マーカーの分析方法により分離されたＢＭＭＳＣの純度を評価した。表面マーカーの同定については、トリプシンで消化してＰ２代のＢＭＭＳＣを収集した後、ＰＢＳで１回洗浄し、５×１０５／ｍＬの密度で細胞を３％ＦＢＳ含有ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＰＥ蛍光色素を結合したＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ４５及びＣＤ３４抗体を１μＬ添加し、ブランク群には添加しなかった。４℃、暗所で３０ｍｉｎインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、フローサイトメーターにかけた。検出結果を図１に示す。
実施例２：ＢＭＭＳＣに由来するＩＥＶの調製
実施例１で２代目まで培養したＭＳＣ（骨髄由来ＭＳＣ）を実施例１における培地（Ｄｅｘ（＋）培養液）で８０％－９０％コンフルエントまで引き続き培養した後、ＰＢＳで２回洗い流し、５００ｎＭのＳＴＳを含む無血清培地（α－ＭＥＭ培地）を加えてアポトーシスを誘導し、３７℃で１６－２４ｈインキュベートし、細胞上清液を収集し、４℃、８００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を収集し、４℃、２０００ｇで１０分間遠心分離し、再度上清液を収集し、４℃、１６０００ｇで３０分間遠心分離し、得られた沈殿物はＩＥＶであった。５００μｌのＰＢＳで再懸濁させ、４℃、１６０００ｇで再度３０分間遠心分離し、洗浄後のＩＥＶを得た。
調製経路を図２に示す。
比較例１：同種ＭＳＣに由来するエクソソームの分離及び抽出
実施例１で２代目まで培養したＭＳＣ（骨髄由来ＭＳＣ，ＢＭＭＳＣ）を実施例１における培地で８０％－９０％コンフルエントまで引き続き培養した後、ＰＢＳで２回洗い流し、無血清培地を加え、３７℃で４８ｈインキュベートし、細胞上清液を収集し、エクソソームの分離及び抽出に使用した。
抽出手順は、８００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を收集し、２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清液を収集し、１６０００ｇで３０分間遠心分離し、上清液を収集し、１２００００ｇで９０分間遠心分離し、上清液を除去し、無菌ＰＢＳで沈殿を再懸濁させ、１２００００ｇでさらに９０分間遠心分離し、上清を除去し、底部のエクソソームを収集し、無菌ＰＢＳで再懸濁させることを含む。
実施例３：ＩＥＶの分析
（１）ＩＥＶの定量及び膜タンパク質の分析
フローサイトメトリーにより実施例２で得られたＩＥＶを定量分析した。測定時点は１時間目、４時間目、８時間目、１６時間目及び２４時間目であった。結果として、１０６個のＭＳＣは、１時間目、４時間目、８時間目、１６時間目及び２４時間目まで誘導された後、それぞれ０．７６×１０８、１．２９×１０８、１．９５×１０８、２．４８×１０８、３．１４×１０８個のＩＥＶを産出することができ、明らかなように、２４時間誘導された後、単一のＭＳＣは３００個のＩＥＶを産出することができた（図３）。
また、フローサイトメトリーにより検出したところ、ＩＥＶの粒径分布が１μｍ以下に集中し、９４．９７％を占めることが発見された（図４Ａ）。
側方散乱光（ＳＳＣ）の分析結果は、同様にＩＥＶ散乱光強度が１μｍ以下の範囲に集中することを示している（図４Ｂ）。
さらに、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製の標準化小粒子ミクロスフェア（０．２μｍ、０．５μｍ、１μｍ）によりＩＥＶの散乱光強度を分析した結果、ＩＥＶの粒径が０．２μｍ以下に集中することを示している（図４Ｃ）。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による観察結果は、フローサイトメトリーによる検出結果と類似し、ほとんどの小胞の直径は２００ｎｍ及び２００ｎｍ以下であることを示している（図４Ｄ）。
ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）結果は、透過型電子顕微鏡による観察結果に一致し、ＩＥＶ粒径の平均値は１６９ｎｍであることを示している（図４Ｅ）。
最先端のナノフローサイトメトリー検出技術により単一小胞レベルの粒径検出を行った結果も、ＩＥＶの平均粒径は１００．６３ｎｍであることを示している（図４Ｆ）。
フローサイトメトリーにより実施例３で抽出されたＩＥＶの表面膜タンパク質を分析した結果、ＭＳＣに由来するＩＥＶはＭＳＣと類似する表面タンパク質、即ち、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ３４、ＣＤ４５陰性を発現することができる。また、ＩＥＶは、細胞外小胞の普遍性表面タンパク質ＣＤ９，ＣＤ６３，ＣＤ８１及びＣ１ｑを発現することができた（図５Ａ－５Ｋ）。
（２）ＩＥＶの内容物分析
タンパク質ＤＩＡ定量化技術によりＭＳＣ、ＭＳＣ－エクソソーム（比較例１で抽出されたもの）、ＭＳＣ－ＩＥＶ（実施例２で得られたもの）の定量プロテオミクス分析を完成した。結果として、ＭＳＣ－エクソソーム及びＭＳＣ－ＩＥＶのタンパク質内容物発現は、母細胞と比較的高い一致性を有し、１７０種類のタンパク質はＩＥＶにおいて特異的に高発現された（図６Ａ）。バイオインフォマティクス解析により、ＩＥＶが特異的に高発現するタンパク質をスクリーニングし、ヒートマップを作成し（図６Ｂ）、さらに、示差的タンパク質のＧＯ濃縮分析結果と合わせて、ＩＥＶはアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４分子を特異的に高発現できることを明確にした（図６Ｃ）。同種ＭＳＣに由来するエクソソームに比べ、ＩＥＶの５種類の特徴的分子の発現量がいずれも顕著にアップレギュレーションされた。具体的には、ＩＥＶにおけるマーカーであるアネキシンＶ、フロチリン－１、カドヘリン１１、インテグリンα５及びシンタキシン４は、エクソソームにおける対応するマーカーの発現量に対してそれぞれ１．７６倍、２．８１倍、２．４１倍、３．６８倍及び４．４５倍であった。最後に、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技術によりさらに検証した結果、ＤＩＡ定量分析の結果に一致した（図６Ｄ）。
ＭＳＣ－エクソソーム：ＭＳＣに由来するエクソソーム
ＭＳＣ－ＩＥＶ：ＭＳＣに由来するＩＥＶ
前記内容物分析におけるＭＳＣと、エクソソーム及びＩＥＶを抽出するＭＳＣとは同一のＭＳＣ細胞株であった。
実施例４：ＩＥＶは皮膚及び毛髪を経由して排出可能である。
実施例２で調製されたＩＥＶを４×１０６個取り、ＤＩＲで標識し、２００μLのＰＢＳで再懸濁させ、尾静脈からヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕの体内に全身注射し、１、３、７日観察した後、生体イメージング機により皮膚表面でのＩＥＶの分布を検出した。結果を図７Ａ－７Ｃに示す。
図７Ａから分かるように、ＩＥＶは皮膚表面に達することができ、３日目に数が最も多く、７日目にほぼ消え、皮膚表面でのＩＥＶの動的代謝の過程を示す（図７Ａ）。免疫蛍光結果は、ＰＫＨ２６－ＩＥＶがＣ５７マウスに全身注射された後、経時的に皮下組織から真皮層及び表皮へ徐々に移動することを示している。７日目に皮膚表面の角質層に大量のＩＥＶの存在が観察され、全身注射されたＩＥＶは皮膚角質層の脱落に伴って排泄されることを示唆している（図７Ｂ）。また、７日目にマウス体表から抜いた毛髪の毛嚢にＰＫＨ２６－ＩＥＶの存在が観察され、全身注射されたＩＥＶは毛髪の脱落にも伴って代謝されることを示している（図７Ｃ）。
また、インビボイメージングデータ及び免疫蛍光結果は、いずれもＩＥＶが心臓、腎臓、脳に分布しないが、手の爪に分布することを示しており、ＩＥＶが代謝に伴って体内から排出されることをさらに実証している（図８Ａ－図８Ｃ）。
本実施例では、ＩＥＶは皮膚及び毛髪により排出されることを示しており、ＩＥＶの注射又はインビボでの含有量の増加は安全性を有することを証明している。
実施例５：ＩＥＶは毛髪再生を促進することができる。
７週齢の雌Ｃ５７マウス（毛髪休止期）を脱毛処理し、それぞれＰＢＳ、ＩＥＶ、ＭＳＣ及び２％ミノキシジル（Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）を皮下注射した。１０日目と１４日目のマウス背部の毛髪再生面積を比較した実験結果は、ＩＥＶ及びＭＳＣが対照群に比べて顕著な毛髪再生促進効果を有し、従来の脱毛症防止薬物ミノキシジルに比べ、１４日目にＩＥＶ及びＭＳＣはともにより顕著な毛髪再生促進効果を有することを示している（図９Ａ－９Ｂ）。
実施例６：マイクロニードルパッチにより導入されたＩＥＶは毛髪再生を促進することができる。
１３００本のマイクロニードルパッチを用いてＣ５７マウスの背部にヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣＭＳＣ）に由来するＩＥＶを導入した。
ＵＣＭＳＣに由来するＩＥＶの取得方法
使用される細胞は、南京泰盛生物科技有限公司によって提供される臍帯由来間葉系幹細胞（ＵＣＭＳＣ）であった。得られたＵＣＭＳＣについてＳＴＳ（５００ｎｍ）で１０時間処理してアポトーシスを誘導した後、以下の手順に従ってＩＥＶを抽出した。
１．誘導が終了した後、インキュベータから誘導された細胞を取り出し、ピペットで吹き掛けることにより皿底及び皿壁を洗浄した。均一に混合した後、懸濁液を吸い出し、それぞれ番号が対応する無菌遠心分離管に収集し、遠心分離した。遠心分離の時間は１０ｍｉｎ、遠心分離の回転速度は８００ｇ、温度は４℃であった。
２．遠心分離が終了した後、前記遠心分離管中の上清液を吸い出し、番号が対応する新たに用意された無菌遠心分離管に収集し、２回目の遠心分離により精製するまで保存した。遠心分離管中の沈殿はアポトーシス率の検出に使用された。
３．同時に前記遠心分離後に収集された上清液を引き続き遠心分離した。遠心分離の時間は１０ｍｉｎ、遠心分離の回転速度は２０００ｇ、温度は４℃であった。
４．遠心分離が終了した後、上清液を収集し、沈殿を捨て、プロセス中で観察を行った。
５．上清液をそれぞれ番号が対応する新しい無菌管に移し、使用まで保存した。
６．前記２回目の遠心分離の後に、遠心分離管中に収集された上清液を引き続き遠心分離した。遠心分離の時間は３０ｍｉｎ、遠心分離の回転速度は１６０００ｇ、温度は４℃であった。
７．遠心分離が終了した後、沈殿を収集し、上清液を捨て、プロセス中で観察を行った。
８．生理食塩水を用意し、遠心分離が終了した後、上清液を捨て、遠心分離管にそれぞれ適量の生理食塩水を加え、液相が均一になったことが肉眼観察されるまで吹き掛け、懸濁、洗浄した。引き続き遠心分離した。遠心分離の時間は３０ｍｉｎ、遠心分離の回転速度は１６０００ｇ、温度は４℃であった。
９．遠心分離が終了した後、上清液を捨て、遠心分離管に適量の生理食塩水を加えて沈殿物と懸濁させた。
無菌条件下で操作した。粘着テープでマイクロニードルパッチを剃毛後のＣ５７マウスの背部皮膚に固定し、１時間後に試験皮膚表面にＩＥＶ（４×１０６個；臍帯由来間葉系幹細胞に由来）を塗布した。
各処理群の設計を表３に示す。
Figure 2023513394000004
図１０に示すように、１３００本のマイクロニードルパッチによるＩＥＶの導入は、良好な毛髪再生促進効果を有した。
実施例７：ラパマイシン、メトホルミン、ダサチニブ及びレスベラトロールとＩＥＶとの併用による皮膚におけるＩＥＶ排出の顕著な向上及び毛髪再生速度の向上などの効果及び比較
ＰＫＨ２６－ＩＥＶをＣ５７マウスに全身注射し、ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ，５ｍｇ／ｋｇ）、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ，１００ｍｇ／ｋｇ）、ダサチニブ（Ｄａｄａｔｉｎｉｂ，５ｍｇ／ｋｇ）及びレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ７日間連続して腹腔内注射した後、免疫蛍光結果は、メトホルミンが皮膚組織におけるＩＥＶの排出量を顕著に増加でき、レスベラトロールがそれに次ぎ、ラパマイシン及びダサチニブが顕著な増強作用を有さないことを示している（図１１）。
マウスの毛髪再生結果は、ＩＥＶが毛髪再生を顕著に促進でき、メトホルミン又はレスベラトロールなどの老化防止物質との併用が毛髪再生に対するＩＥＶの促進作用を増強できることを示している（図１２）。
本実施例では、メトホルミン又はレスベラトロールとＩＥＶとの併用は、皮膚におけるＩＥＶの排出を効果的に促進でき、インビボでのＩＥＶの時間を短縮させ、ＩＥＶの安全性を向上できることを示している。
本実施例では、メトホルミン又はレスベラトロールとＩＥＶとの併用は、毛髪再生を促進できることをさらに示しており、老化防止物質とＩＥＶとの組成物が毛髪再生を促進する薬物として使用される可能性があることを示唆している。
実施例８：Ｗｎｔシグナル伝達経路による皮膚におけるＩＥＶの機能的代謝の制御
Ｗｎｔ伝達経路は、細胞生物学における典型的なシグナル伝達経路であり、細胞を幹細胞に類似する状態に保持させ、新しい細胞を産生し続けるのを助けることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、皮膚の自己再生において重要な作用を発揮している。
ＷｎｔアゴニストＬｉｃｌを１０ｍｇ／ｋｇでＰＢＳに溶解し、３ 日間連続して腹腔内注射し、Ｗｎｔ阻害剤Ｘａｖ９３９を１ｍｇ／ｋｇで１０％ＤＭＳＯの生理食塩水に溶解し、３日間連続して腹腔内注射した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ結果は、ＷｎｔアゴニストＬｉｃｌを使用した後、皮膚におけるＩＥＶの排泄が顕著に増強され、Ｗｎｔ阻害剤Ｘａｖ９３９を使用した後、皮膚におけるＩＥＶの排泄が顕著に低下することを示している（図１３Ａ－Ｂ）。免疫蛍光結果は、同様にＸａｖ９３９の影響下で皮膚表面における皮下注射されたＰＫＨ２６－ＩＥＶの排出が大幅に減少することを示している（図１３Ｃ）。また、細胞スミア結果は、ＩＥＶに対する皮膚由来間葉系幹細胞の取り込み能力がＬｉｃｌ及びＸａｖ９３９の影響を受けることを示している（図１３Ｄ）。さらに重要なことには、免疫蛍光結果は、ＩＥＶを注射した後、皮膚における活性β－カテニン（ａｃｔｉｖｅ－β-ｃａｔｅｎｉｎ）の強度が大幅に増強されることを示しており、ＩＥＶが皮膚中のＷｎｔシグナル伝達経路の活性化を刺激することができ、Ｘａｖ９３９阻害剤がこの活性化過程を弱くすることができ、活性β－カテニンの強度の変化が表皮層におけるＩＥＶの排出量の変化に一致することを示唆している（図１３Ｅ）。
運動はＷｎｔシグナル伝達経路に対して制御作用を有することが実証されている。ＥＬＩＳＡ結果として、運動後の循環中のＤＫＫ１レベルが顕著に低下しており（図１４Ａ）、運動がインビボでのＷｎｔシグナル伝達経路を活性化できることを示している。
フローサイトメトリー結果は、運動後にマウス体内の生理学的ＩＥＶが大幅に減少することを示しており（図１４Ｂ）、免疫蛍光結果は、運動後に皮膚表面におけるＰＫＨ２６－ＩＥＶの排出が増加することを示しており（図１４Ｃ）、インビボイメージング結果は、１日間運動した後に体内及び皮膚におけるＩＥＶの分布が大幅に増加し、３日間運動した後に対照群に比べて減少し始めた（図１４Ｄ－Ｅ）。フローサイトメトリーにより運動後の体内のＰＫＨ－６７で標識されたＩＥＶの数を検出した結果、７日間運動した後、血液中のＰＫＨ６７－ＩＥＶが対照群よりも大幅に減少することを示している（図１４Ｆ）。上記のデータは、運動がＷｎｔシグナル伝達経路を活性化し、皮膚からのＩＥＶの排泄を促進できることを示唆している。
実施例９：ＩＥＶが傷口癒合を促進することができる。
マウスに対して１ｃｍ×１ｃｍの全層創傷を作成し、傷口癒合に対するＭＳＣ及びＩＥＶの全身注射の促進作用を検出した。結果は、ＩＥＶ及びＭＳＣがいずれも傷口癒合に対して促進作用を有し（図１５Ａ）、かつ顕著な違いがないことを示している。ＷｎｔアゴニストＬｉｃｌは、傷口癒合に対するＩＥＶの促進作用を速めることができ、阻害剤Ｘａｖ９３９は、傷口癒合に対するＩＥＶの促進作用を顕著に遅らせることができる。免疫蛍光結果は、Ｌｉｃｌ群では傷口でのＩＥＶの凝集が顕著に増加し、Ｘａｖ９３９群では傷口でのＩＥＶの凝集が顕著に減少し、Ｗｎｔシグナル伝達経路がＩＥＶの排泄を制御することにより傷口癒合に影響を与えることができることを示している（図１５Ｂ－Ｃ）。
実施例１０：ＩＥＶ局所注射のシワ取り効果
ＩＥＶの取得方法は実施例６と同様であった。
水光注射機によりＩＥＶを注射導入した。
水光注射の原理
負圧技術により皮膚の異なる深さで必要な物質を正確に補充することができ、マイクロニードルを皮膚に入れる前に負圧機を用いて皮膚を引き上げ、そしてマイクロニードルを表皮の深部に正確に入れる。注入量、注射頻度は調節可能である。また、ニードルが出る前に注射器の圧力が既に開放されたため、栄養物質が損失することがない。
導入ステップ
ステップ９で調製されたＵＣＭＳＣに由来するＩＥＶを注射器に入れ、水光注射機の係止溝に置き、注射深さを０．３ｍｍに調節した。
試験過程全体を被験体に伝え、了承及び同意をもらった。試験部位を消毒し、水光注射機のニードルを試験部位（顎部位）に合わせ、負圧を起動し、操作プロセスに従って実行し、ＩＥＶを試験部位に注入した。
図１６に示すように、水光注射機によりＩＥＶを導入した５０日後（２０２０年１月１６日から２０２０年３月８日）、注射部位のシワは顕著に改善され、ＩＥＶは良好なシワ取り効果を有し、美容医療業界への応用が期待できることを示している。
実施例１１：誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞；ｉＰＳＣ）細胞培養及びそれに由来するＩＥＶの調製
（１）レンチウイルスの調製
１ｍＬのＤＭＥＭをＥＰ管に移し、５μｇの遺伝子発現プラスミド及び５μｇのｖｓｖｇプラスミドを加え、２５μＬのリポソームを加え、室温で２０分間軽く撹拌した。混合物を培養されたＧＰ２－２９３細胞（９５％均一混合）に滴下し、回転させて混合物を均一に分布させた。１２時間後に、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋グルタミン）に交換した。培地交換の２４時間後、ウイルスを含む培地を収集し、４８時間後にさらに培地を収集した。
（２）細胞リプログラミングの誘導
各ウェル（１２ウェルプレート）にステップ（１）で培養されたＧＰ２－２９３細胞を５×１０５個接種し、８０％コンフルエントになった後、５００－１０００μＬ／ウェルの培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活性化）＋グルタミン）にウイルスを１００ｎｇ加え、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）を加え、１２ｈインキュベートした後、新しい培地に交換し、上記のステップを繰り返した。７日内で、５×１０４個の誘導された細胞を、フィーダー細胞（ｍＥＦ）を含む１０ｃｍ培養皿に接種した。翌日に、培地を、ｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ）を含むＥｓ培地に交換し、１日おきに交換した。５日後、細胞がクローンを開始し、４０日後もＥｓ様クローンがない場合、失敗したと判定した。
（３）細胞継代
６０％コンフルエントになった後、各皿に０．５ｍｌのａｃｃｕｔａｓｅを添加し、室温下で１分間静置した。分離された細胞凝集体を１５ｍＬ遠心分離管に移し、別途２ｍＬのｍＴｅＳＲ１を用いていかなる残りの凝集体を収集した。洗浄液を１５ｍｌ試験管に加えた。室温下、２００×ｇで細胞凝集体を含む１５ｍＬ試験管を５分間遠心分離した。上清液を吸い出した。細胞を再懸濁させ、細胞を凝集状態に保持することを確保した。ヒトｉＰＳ細胞及びｍＴｅＳＲ１をマトリゲルがコーティングされた新しいプレート上に凝集させた。培養皿を３７℃インキュベータに入れ、細胞凝集体の凝集塊の運動を均一に分布するように、培養皿を素速く左右移動させた。３７℃、５％二酸化炭素及び９５％湿度の条件下で培養した。培養液を毎日交換した。
（４）ｉＰＳに由来するＩＥＶの調製
実施例２の調製方法と同様である。
４００倍光学顕微鏡下でのｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＩＥＶを図１７に示す。
実施例１２：分化能が異なる幹細胞に由来するＩＥＶ
一般的な実験方法
フローサイトメトリーによる細胞アポトーシスの検出
スタウロスポリン（５００ｎＭ）でＰ２６－Ｐ２９代に継代したｈｉＰＳＣ（ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈｉＰＳＣ））及びＰ７－Ｐ９代に継代したｈＵＣＭＳＣ（ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＭＳＣ））を約９ｈ誘導し、細胞をアポトーシスさせ、アネキシンＶ（１５ｍｉｎ）及び７ＡＡＤ（３ｍｉｎ）で染色し、フローサイトメトリーにより細胞アポトーシス率を検出した。本実施例では、Ｐ２６代に継代したｈｉＰＳＣ及びＰ７代に継代したｈＵＣＭＳＣを使用した。
ＩＥＶを分離し、フローサイトメトリーによりアネキシンＶの発現率を検出した。具体的には、分画遠心法によりＩＥＶを調製した。手順は、８００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、その後、２０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、その後、１６０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、その後、１６０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、ＩＥＶを取得し、アネキシンＶで１５ｍｉｎ染色し、フローサイトメーターにかけた。
皮膚損傷モデルの構築
マウスの背部で辺の長さが１．７ｃｍの正方形の皮膚傷口を作成した。１、４、８、１２日目にそれぞれＩＥＶ（ｈｉＰＳＣ－ＩＥＶ、ｈＵＣＭＳＣの注射量はいずれも６×１０７個／回）を尾静脈投与し、毎日撮影して傷口の大きさを記録した。１４日目にサンプルを採取した。
結果
１、本発明者らはハイコンテントでｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの死亡過程を撮影した。図１８に示すように、両者の死亡過程に違いがあり、ｈｉＰＳＣは、核と細胞質を中心として多中心収縮し、次いで泡発生を伴って樹枝状の分岐を形成する一方、ｈＵＣＭＳＣは、核を中心として単一中心収縮すると同時に、分岐形成及び泡発生などを伴ったことを見出した。
２、図１９に示すように、アポトーシスを誘導するｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣについてフローサイトメトリーによりアポトーシス率を分析した結果、ほとんどの細胞がアポトーシスしたことを証明している。
３、図２０に示すように、上記のように分画遠心法により得られたＩＥＶについて、フローサイトメトリーによりアネキシン５発現の陽性率を分析した結果、ｈｉＰＳＣ及びｈＵＣＭＳＣの発現率はともに８０％以上であった。
４、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により２種類のＩＥＶを特徴付けた。
４．１図２１に示すように、ｈｉＰＳＣ－ＩＥＶの粒径は約１００ｎｍ、ｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶの粒径は約１８０ｎｍであった。
４．２図２２に示すように、ＩＥＶの収量は２１９７１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｈｉＰＳＣ、８８６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｈＵＣＭＳＣであった。
４．３図２３に示すように、ｈｉＰＳＣ－ＩＥＶの電位は約－１２ｍＶ、ｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶの電位は約－４５ｍＶであった。
５、皮膚損傷モデルを用いて２種類の細胞に由来するＩＥＶについてインビボ修復再生機能を比較した。
図２４に示される結果は、ｈｉＰＳＣ－ＩＥＶが傷口の癒合を顕著に促進でき、ｈｉＰＳＣ－ＩＥＶがｈＵＣＭＳＣ－ＩＥＶに比べてより高い組織修復再生機能を有することを示している。
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施例を考慮すると、示された実施例は本発明の好ましい例に過ぎず、本発明の範囲を制限すると見なされるべきではない。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定される。そのため、これらの特許請求の範囲及び精神に含まれるすべての発明を特許請求している。

Claims (15)

  1. 皮膚製品若しくは皮膚付属器製品の調製における誘導性小胞の使用、又は皮膚製品若しくは皮膚付属器製品としての誘導性小胞の使用。
  2. 前記製品は、薬物、薬物担体、食品、健康機能製品、スキンケア製品又は美容医療用品であり、
    好ましくは、前記皮膚は、表皮、真皮又は皮下組織であり、
    好ましくは、前記皮膚付属器は、毛、髪、汗腺、皮脂腺、手の爪又は足の爪であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  3. 誘導性小胞及び皮膚薬物又はケア物質を含むことを特徴とする、組成物。
  4. 前記皮膚薬物及びケア物質は、細胞外小胞内に包まれ、或いは、
    細胞外小胞と分かれて組成物に存在し、
    好ましくは、前記組成物の剤形は、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル及び貼付剤から選択され、
    好ましくは、前記貼付剤は、マイクロニードルパッチから選択され、
    好ましくは、前記剤形は、注射剤及びマイクロニードルパッチから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記誘導性小胞は、外力によって正常な生存期間にある幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される小胞であり、
    好ましくは、前記誘導性小胞は、スタウロスポリンの添加、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせにより幹細胞又は幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生され、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、血液幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用又は組成物。
  6. 幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞からなる第１剤と、
    老化防止物質又はＷｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーターからなる第２剤と、
    を含むことを特徴とする、組成物。
  7. 前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞由来の胞外小胞は、エクソソーム、移動体、微小胞、アポトーシス小体、誘導性細胞外小胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞由来の胞外小胞は、誘導性細胞外小胞から選択され、
    好ましくは、前記誘導性小胞は、外力によって正常な生存期間にある幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生される小胞であり、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミン及びレスベラトロールから選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミンから選択され、
    好ましくは、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路から選択され、
    好ましくは、前記ポジティブレギュレーターは、アゴニストから選択され、
    好ましくは、前記アゴニストは、Ｌｉｃｌ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ、Ｗｎｔアゴニスト及びＷＡＹ２６２６１１から選択される１種又は複数種であり、より好ましくはＬｉｃｌであり、
    好ましくは、前記ポジティブレギュレーターは、運動の提示を含むことから選択され、
    好ましくは、前記提示は、パッケージ、ラベル及び説明書から選択される１種又は複数種であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記組成物に含まれる幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞と、老化防止物質との比は、（０．５－５）×１０７個：（０．０５－１０）ｍｇであり、
    好ましくは、１×１０７－３×１０７個の幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞と、０．１－５ ｍｇの老化防止物質とを含み、
    好ましくは、１．８×１０７－２．７×１０７個の幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞を含み、
    好ましくは、０．２－３ｍｇの老化防止物質を含むことを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記幹細胞由来の胞外小胞は、スタウロスポリンの添加、紫外線照射、飢餓法及び熱応力法のうちの１種又は複数種の組み合わせにより間葉系幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生され、
    好ましくは、前記幹細胞由来の胞外小胞は、スタウロスポリンの添加により間葉系幹細胞のアポトーシスを誘導することにより産生され、
    好ましくは、前記スタウロスポリンの濃度は、５００－１０００ｎＭであり、
    好ましくは、前記スタウロスポリンの濃度は、５００－９００ｎＭであり、
    好ましくは、前記スタウロスポリンの濃度は、５００ｎＭ－８００ｎＭであり、
    好ましくは、前記スタウロスポリンの濃度は、５００ｎＭであり、
    好ましくは、前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み、
    好ましくは、前記組成物の剤形は、注射用凍結乾燥粉末、注射剤、錠剤、カプセル及び貼付剤から選択され、
    好ましくは、前記貼付剤は、マイクロニードルパッチから選択され、
    好ましくは、前記剤形は、注射剤、マイクロニードルパッチ及び錠剤から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  10. 毛髪再生又は傷口癒合を促進するための薬物の調製における請求項６から９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  11. 前記幹細胞由来の胞外小胞の調製方法は、
    インビトロで間葉系幹細胞を培養し、コンフルエントが８０％－９０％になったときにＰＢＳで２－５回洗い流すステップ１）と、
    ステップ１）で得られた間葉系幹細胞を５００－１０００ｎＭのスタウロスポリンを含む無血清培地に加え、３７℃で１６－２４ｈインキュベートし、細胞上清液を収集するステップ２）と、
    ステップ２）で収集された細胞上清液を４℃、５００－１５０００ｇで５－３０分間遠心分離し、上清液を収集するステップ３）と、
    ステップ３）で収集された細胞上清液を４℃、１５００－２５００ｇで５－３０分間遠心分離し、上清液を収集するステップ４）と、
    ステップ４）で収集された細胞上清液を４℃、１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離して得られた沈殿物が細胞外小胞であるステップ５）と、
    を含み、
    好ましくは、細胞外小胞の洗浄ステップをさらに含み、
    好ましくは、前記洗浄ステップは、具体的には、ステップ５）で得られた細胞外小胞をＰＢＳで再懸濁させ、４℃、１００００－３００００ｇで１５－６０分間遠心分離して得られた沈殿物が細胞外小胞であるステップ６）であることを特徴とする、請求項６から９のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 幹細胞服用製品の併用薬の調製における老化防止物質の使用であって、
    好ましくは、前記幹細胞服用製品は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞であり、
    好ましくは、前記幹細胞服用製品は、動物体内に取り込まれるための幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞であり、好ましくは、前記動物は、哺乳動物であり、好ましくは、前記哺乳動物は、ヒトであり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、血液幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記的幹細胞由来の胞外小胞は、エクソソーム、移動体、微小胞、アポトーシス小体、誘導性細胞外小胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞由来の胞外小胞は、誘導性細胞外小胞から選択され、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミン、レスベラトロールから選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミンから選択されることを特徴とする、使用。
  13. 幹細胞服用システムであって、
    請求項１２に記載の幹細胞服用製品と、
    老化防止物質及びＷｎｔシグナル伝達経路のポジティブレギュレーターから選択される１種又は２種である併用製品と、
    を含み、
    前記幹細胞服用製品は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞を含み、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミン，レスベラトロールから選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミンから選択され、
    好ましくは、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔ／β－カテニン経路であり、
    好ましくは、前記ポジティブレギュレーターは、アゴニストから選択され、
    好ましくは、前記アゴニストは、Ｌｉｃｌ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－２１６７６３、ＢＩＯ、Ｗｎｔアゴニスト及びＷＡＹ ２６２６１１から選択される１種又は複数種であり、より好ましくは、Ｌｉｃｌであり、
    好ましくは、前記ポジティブレギュレーターは、運動するための提示から選択され、
    好ましくは、前記提示は、パッケージ、ラベル及び説明書から選択される１種又は複数種であることを特徴とする、幹細胞服用システム。
  14. Ｗｎｔシグナル伝達経路によって制御される幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞の代謝により毛髪再生又は傷口癒合を促進する薬物の調製における幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞の使用であって、
    好ましくは、前記薬物は、幹細胞又は幹細胞由来の胞外小胞と、老化防止物質とを含み、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、尿液由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨膜由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、血液幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、口腔由来間葉系幹細胞、皮膚由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞は、誘導多能性幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、血液幹細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記的幹細胞由来の胞外小胞は、エクソソーム、移動体、微小胞、アポトーシス小体、誘導性細胞外小胞から選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記幹細胞由来の胞外小胞は、誘導性細胞外小胞から選択され、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミン，レスベラトロールから選択される１種又は複数種であり、
    好ましくは、前記老化防止物質は、メトホルミンから選択されることを特徴とする、使用。
  15. 皮膚又は皮膚付属器疾患の治療方法であって、
    必要がある被験体に請求項１から１４のいずれか１項に記載の誘導性小胞、組成物、幹細胞服用システムを投与するステップを含み、
    好ましくは、前記皮膚又は皮膚付属器疾患は、創傷、脱毛症、瘢痕、熱傷及び潰瘍から選択され、
    好ましくは、前記創傷は、切除による傷口、切り傷、刺傷及び穿刺による傷口から選択され、
    好ましくは、前記皮膚は、表皮、真皮又は皮下組織であり、
    好ましくは、前記皮膚付属器は、毛、髪、汗腺、皮脂腺、手の爪又は足の爪であることを特徴とする、治療方法。
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