CN113876928B - 成纤维细胞外囊泡制备及在美容和药品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及成纤维细胞外囊泡制备及在美容和药品中的应用。本发明通过从成纤维细胞中制备得到了外囊泡，另外筛选鉴定制备得到了抗氧化抗衰老活性的多肽RO‑2，二者分别均具有较好的抗氧化活性，同时二者组合使用更是具有协同的增效效果，具有在抗衰老的美容或药品领域有很好的应用前景。

Description

成纤维细胞外囊泡制备及在美容和药品中的应用
技术领域
本发明涉及药物以及化妆品领域，具体的，涉及成纤维细胞外囊泡制备及在美容和药品中的应用。
背景技术
衰老是一个持续的变化过程，国际主流认为自由基损伤人体细胞，从而引起众多疾病，加速人体衰老。自由基从生成到淬灭，深刻影响着脂褐素的形成、线粒体DNA的突变、诱导细胞凋亡和蛋白质的合成，自由基与衰老间的关系，自由基可引起的疾病，从而提出了如何延缓衰老，为人类减缓自身衰老提供了一定的科学依据。体系中各种生物分子具有大量的活泼基团，它们必然相互作用发生化学反应使生物分子缓慢交联以趋向化学活性的稳定。随着时间的推移，交联程度不断增加，生物分子的活泼基团不断消耗减少，原有的分子结构逐渐改变，这些变化的积累会使生物组织逐渐出现衰老现象。氧自由基是皮肤与身体加速衰老的第一杀手。
在美容行业，如何有效的预防皮肤的衰老是目前研究的重要方向。
细胞外囊泡(extra-cellular vesicles，EVs)，包括外泌体，是来源于细胞的颗粒物，包含了大量蛋白质和小核酸类物质，可以调节局部或者远端靶细胞，进而发挥其生物学作用。
外泌体可以从多种细胞释放到细胞外环境中，例如：肿瘤细胞、树突状细胞、淋巴样细胞、间皮细胞、上皮细胞或来自不同组织或器官的细胞。它包含蛋白质、mRNAs、miRNA和信号分子，这些分子反映了细胞的生理状态，同时也是潜在生物标记分子的丰富来源。迄今为止，在尿液、血清、唾液和母乳等体液中都检测到了外泌体，可见其分布之广与功能之强。
已有研究发现人诱导多能干细胞外泌体可以显著降低衰老相关β-半乳糖苷酶的表达水平，并上调HDFs中胶原的表达，为干细胞外泌体美容抗衰提供了理论依据。目前，各大美容机构推出的干细胞医美护肤产品：氧化剂、维甲酸、肽，生长因子等已被用来保护或修复皮肤，研究表明，皮肤填充物在平滑面部轮廓方面更有效，比局部治疗更持久。
研究表明新生儿脐带间充质干细胞(UC-MSCs)来源的细胞外囊泡(UC-EVs)可以逆转成人骨髓间充质干细胞(AB-MSCs)的衰老，显著增强后者成骨和损伤修复能力，尤其是，体内使用脐带间充质干细胞外囊泡(UC-EVs)可明显延缓自然衰老小鼠的衰老，对骨骼、肾脏以及血管平滑肌等多种组织器官的退行性变有显著影响。干细胞外泌体在治疗衰老相关疾病中也有较多报道。心血管疾病在老年群体高发，心源性细胞外泌体会通过特异性的巨噬细胞极化治疗急性心肌梗死。
多肽是目前用于皮肤抗衰老的另外一个重要方向。比如信号类胜肽(Signalpeptides)这类胜肽和胶原蛋白非常相关，它可以刺激胶原蛋白的生成。不止是胶原蛋白，这类胜肽还能促进弹性蛋白、透明质酸、糖胺聚糖和纤维连接蛋白的生成。最出名的要属棕榈酰五肽-4，这个成分因为在实验中证实能够减少皱纹的产生，已经被宝洁垄断。迷迭香，拉丁学名(Rosmarinus officinalis)，是双子叶植物纲、唇形科、迷迭香属植物灌木。从迷迭香的花和叶子中能提取具有优良抗氧化性的抗氧化剂和迷迭香精油，迷迭香抗氧化剂。目前针对迭迭香抗氧化多肽的研究还不多，因此，从该植物中分离制备相应的抗氧化、抗衰老多肽也是重要的研究方向。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种高活性的成纤维细胞外囊泡及其制备方法以及抗氧化多肽制备抗衰老的美容产品或药物。
一方面，本发明提供一种高活性的成纤维细胞外囊泡及其制备方法，具体的，将幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素100U/ml、链霉素100u/ml的PBS充分洗涤，D-hanks清洗一次，剔除皮下组织后用无菌眼科剪将皮肤标本剪成小块，放置于II型胶原酶消化液中4℃消化过夜，24h后于超净台中无菌分离表皮和真皮。弃表皮，将真皮剪碎，然后转移至0.25％蛋白酶(不含EDTA)中约15min，以含10％小牛血清的高糖-DMEM培养液终止消化，2000r/min离心5min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶，加约4ml含10％小牛血清的高糖-DMEM培养液，注意勿使组织浮起，将培养瓶置于37℃,50％CO2培养箱中，次日补加培养液5ml。原代细胞长满约80％以上即可传代，传代时用0.25％胰酶(不含EDTA)消化，倒置显微镜下见胞体回缩时轻拍培养瓶，并接着加人含10％小牛血清的DMEM-高糖培养液中止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞，并将细胞收集于10ml离心管。2000r·min离心5min,弃上清，按1：3接种传代，常规培养，获得细胞即为成纤维细胞；将成纤维细胞培养至80％左右融合时，吸去上清，PBS洗3遍，更换为无血清低糖培养基，继续培养24h。收集上清，3000g离心10min,去除细胞和细胞碎片。收集离心后的上清，依次经过450nm和220nm的滤器，去除直径大的囊泡。收集过滤后的培养液，加入到100000MWCO Millipore超滤离心管中，以3000g离心60min浓缩过滤。加入PBS到超滤管中清洗，用上述离心方法再次离心，直到超滤管中液体为100-200μl。收集超滤管中的细胞外囊泡，存于-80℃冰箱中备用。
另外一方面，本发明从抗氧化的植物迭迭香中通过特定的二步酶解法即第一阶段酶解，采用中性蛋白酶，酶解温度45℃、调节溶液pH6、酶解时间3h、加酶量6％；第二阶段酶解，采用加木瓜蛋白酶，酶解温度60℃，pH6、酶解时间7h、加酶量3％，实现了分离特定具有抗氧化活性的抗氧化多肽RO-2，所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明采用的二步酶解法是通过优化设计，
更进一步的，本发明提供一种抗皱、抗老化药物组合物，所述组合物中含有成纤维细胞外囊泡以及抗氧化多肽，其中所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示。
更进一步的，本发明提供一种抗皱、抗老化药的化妆品，所述化妆品中含有成纤维细胞外囊泡以及抗氧化多肽，其中所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示。
更进一步的，所述组合物或者化妆品中进一步的含有相应载体。
有益效果
本发明通过从成纤维细胞中制备得到了外囊泡，另外筛选鉴定制备得到了抗氧化抗衰老活性的多肽，二者分别均具有较好的抗氧化活性，同时二者组合使用更是具有协同的增效效果，具有在抗衰老的美容或药品领域有很好的应用前景。
附图说明
图1衰老细胞百分数结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。
实施例1迭迭香抗氧化组分初筛
(一)、多肽混合物的制备
将迭迭香湿草10g液氮冷冻后，研磨破碎，与去离子水以1︰6的料液比混合打浆，90℃下加热预处理20min，冷却后，第一阶段酶解，采用中性蛋白酶，酶解温度45℃、调节溶液pH6、酶解时间3h、加酶量6％；第二阶段酶解，采用加木瓜蛋白酶，酶解温度60℃，pH6、酶解时间7h、加酶量3％。反应结束后，置于沸水中灭酶10min，冷却，四层纱布过滤除去滤渣，将滤液在8000r/min下离心10min，上清液即为多肽混合物，取上清液待用。
对上清液中水解度测定，采用甲醛滴定法测定水解度，具体步骤如下：
(1)分别取酶解前和酶解后的溶液5mL置于100mL容量瓶中，加超纯水定容到刻度线。
(2)取稀释后的溶液20mL放置于250mL的锥形瓶中，加入60mL的超纯水混匀。
(3)用标定过的浓度约为0.05mol/L的NaOH滴定锥形瓶中的溶液至pH值为8.2，向锥形瓶中加入10mL的甲醛，混匀，用同样的NaOH滴定至其pH为9.2。记录NaOH消耗体积。
(4)试验中用80mL超纯水做空白对照，每个样品做三次重复试验。计算公式如下：DH(％)＝(AN-AN0)/N×100
AN—酶解液中游离的氨基氮的含量(g/100mL)；
AN0—酶解前原料溶液中氨基氮的含量(g/100mL)；
N—原料溶液中总的蛋白氮的含量(g/100mL)；
待测溶液中氨基酸态氮的含量测定公式：
N＝{【(V1-V2)×C×0.014】/(5×V3÷100)}×100
N—氨基氮含量(g/mL)；
V1—样品稀释液加入甲醛后消耗NaOH的标液的体积(mL)；
V2—空白对照液加入甲醛后消耗NaOH的标液的体积(mL)；
V3—待测液的体积取用量(mL)；
C—所配NaOH标液的浓度(mol/L)；
0.014—与1.00mL NaOH标定液相当的氮的质量(g)；
结果显示，采用二步酶解法制备的多肽上清液的水解度为65.8％，具有较好的水解效果。
(二)、一次纯化
葡聚糖凝胶SephadexG-25：将处理好的上清液样品配制成质量浓度50mg/mL的溶液，在SephadexG-25凝胶柱上进行分离纯化，上样量为10mL。以去离子水为洗脱液，洗脱流速为0.5mL/min，采用自动部分收集器收集洗脱液(3mL/管)，用紫外检测仪在280nm处检测，收集各洗脱峰，真空浓缩，冷冻干燥各级洗脱组分；以DPPH自由基清除率为检测指标筛选抗氧化活性最高的组分。其中，DPPH清除率的测定方法为：取洗脱峰及等体积0.2mmol/L DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀，30min后用无水乙醇作参比测定其吸光度。同时测定0.2mmol/L DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度。根据下列公式计算清除率：清除率(％)＝((A1-A3)/A2)X100％,式中：A3为未加待测液时DPPH溶液吸光度；A1：为加待测液时DPPH溶液的吸光度；A2为待测液在测定波长吸光度；测定波长517nm。
将酶水解液经经Sephadex G-25凝胶柱分离得到RO-1/RO-2/RO-3三个洗脱峰。收集3样品。
表1洗脱峰抗氧化活性
Figure BDA0003316560920000051
Figure BDA0003316560920000061
由表1可知，RO-2/RO-3均具有较好的DPPH清除作用，下面对RO-2多肽进行鉴定和进一步研究。
实施例2RO-2抗氧化多肽的鉴定
RO-2样品配成0.5mg/mL溶液上C18反相高效液相色谱检测。实验条件为：上样量：10uL，体积流量：0.8mL/min，洗脱液为A液：5％乙腈、0.05％三氟乙酸；B液：80％乙腈、0.05％三氟乙酸(均为体积分数)。线性洗脱程序为：O-1min，V(A)：V(B)＝85：15，1-40min，V(A)：V(B)＝50：50，温度3O℃，220nm检测。
反向高效液相色谱(RP—HPLC)鉴定RO-2的纯度。结果表明，经SephadexG-25柱层析纯化后得到的RO-2反向高效液相色谱为单一主峰，按峰面积计算，其纯度为约为89.2％，这说明该组分已为相对单一的多肽。
氨基酸序列分析：
检测参数：20kV的加速电压，激光波长355min；试剂及进样操作：试剂及配置：样品用φ＝0.1％的三氟乙酸配制成10-4mol/L溶液。基体4-HCCA用φ＝0.1％的三氟乙酸溶液和乙腈体积比为2：1的混合液配制7mg/mL的溶液。进样操作：将已配置好的样品1μL与4μL的基体(4-HCCA)溶液混合均匀。取1μL混合液滴加到样品台上，室温干燥后，将样品台送人离子源进行测定；氨基酸序列的分析方法：通过MS/MS图谱解析得到多肽氨基酸序列为SEQ IDNO：1所示。将所述氨基酸序列通过人工合成备用。
实施例3成纤维细胞外囊泡的制备
取幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素100U/ml、链霉素100u/ml的PBS充分洗涤，D-hanks清洗一次，剔除皮下组织后用无菌眼科剪将皮肤标本剪成小块，放置于II型胶原酶消化液中4℃消化过夜，24h后于超净台中无菌分离表皮和真皮。弃表皮，将真皮剪碎，然后转移至0.25％蛋白酶(不含EDTA)中约15min，以含10％小牛血清的高糖-DMEM培养液终止消化，2000r/min离心5min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶，加约4ml含10％小牛血清的高糖-DMEM培养液，注意勿使组织浮起，将培养瓶置于37℃,50％CO2培养箱中，次日补加培养液5ml。原代细胞长满约80％以上即可传代，传代时用0.25％胰酶(不含EDTA)消化，倒置显微镜下见胞体回缩时轻拍培养瓶，并接着加人含10％小牛血清的DMEM-高糖培养液中止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞，并将细胞收集于10ml离心管。2000r·min离心5min,弃上清，按1：3接种传代，常规培养。
取P4代细胞以5X104个/ml接种于预先放有无菌盖玻片的6孔板内制作细胞爬片，37℃,50％CO2培养4h后取出爬片，PBS洗3次。4％的多聚甲醛(pH7.2)固定细胞30min,PBS洗3次。接下来按试剂盒操作说明进行细胞鉴定采用免疫化学染色S-ABC法，一抗为波形蛋白兔抗单克隆抗体，按1，100比例稀释，新鲜配置的DAB显色液，室温下显色约为3min，复染，封片。光学显微镜100倍视野下观察计数阳性细胞，计算阳性细胞数的百分比为100％Vimentin表达阳性，说明传代制备了纯净的成纤维细胞。
将成纤维细胞培养至80％左右融合时，吸去上清，PBS洗3遍，更换为无血清低糖培养基，继续培养24h。收集上清，3000g离心10min,去除细胞和细胞碎片。收集离心后的上清，依次经过450nm和220nm的滤器，去除直径大的囊泡。收集过滤后的培养液，加入到100000MWCO Millipore超滤离心管中，以3000g离心60min浓缩过滤。加入PBS到超滤管中清洗，用上述离心方法再次离心，直到超滤管中液体为100-200μl。收集超滤管中的细胞外囊泡，所述外囊泡的直径大约80-120nm左右，调整浓度为20mg/mL备用。
实施例4抗衰老实验
雄性昆明小鼠，体重20～25g，随机分为六组，即正常对照组、D-半乳糖致氧化损伤模型组，多肽处理组，外囊泡处理组，多肽联合外囊泡处理组，阳性对照组。除正常对照组外，其余各组小鼠每天皮下注射D-半乳糖400mg/kg，持续32d，对照组小鼠则每d皮下注射等量生理盐水，多肽处理组每天按10mg/kg的剂量皮下注射/d，外囊泡处理组为皮下注射10mg/只/d，联合组为每天按10mg/kg的剂量皮下注射加外囊泡皮下注射10mg/只/d；阳性对照组为维生素C10mg/kg的剂量皮下注射/d；正常对照组及模型组用10mg蒸馏水皮下注射，每3d称重1次。
在第32d注射D-半乳糖和各组试剂2h后，取肝脏，粉碎，制成10％w/v肝组织匀浆，3000r/min离心，取上清，采用本领域常规的测定SOD、GSH-Px活性及MDA含量的测定方法来测定(TBA法、DTNB法和福林-酚法)。结果如表1所示。
表1各组小鼠血清中各组分活性影响结果
各组 MDA(nmol/ml) SOD(U/ml) GSH-PX(U/0.1ml)
正常对照组 14.6±1.1 522.1±34.2 620.3±34.5
模型组 23.1±1.5 461.3±29.7 430.1±34.7
多肽处理组 17.8±0.9 500.4±25.3 590.4±29.7
外囊泡处理组 19.1±1.7 489.7±19.5 553.9±30.1
多肽联合外囊泡处理组 14.9±0.8 533.8±22.4 614.5±22.3
阳性对照组 20.1±1.6 472.4±18.3 243.2±17.9
MDA是一种脂质过氧化物，测定MDA的含量可反映出细胞受损伤的程度。由图1可以看出，与对照组相比，氧化损伤模型组小鼠肝脏MDA含量极显著增加，SOD活性和GSH-Px活性极显著下降。而与模型组相比，各实验组小鼠肝脏MDA含量均降低，GSH-Px活性均升高，另外，多肽组和外囊泡组以及联合处理组SOD活性均得到显著升高。提示本发明的RO-2多肽和外囊泡作为外源性的抗氧化物质，能够提高机体内源性抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂质过氧化损伤。
实施例5抗老化实验
将实施例4制备的人成纤维细胞经过24h贴壁培养后，吸除培养液，加入少量PBS,然后将细胞分别添加外囊泡或者或者多肽或者二者的组合预处理2h后放置在UVB灯管正下方照射，将UVB灯管放置于高6cm的试管架上，用紫外光能量检测仪检测紫外光能量，照射剂量为100mj/cm2实验共分4组，对照组：无UVB照射，无预处理；UVB组：UVB照射，无预处理；外囊泡添加预处理组：UVB照射,外囊泡0.5μg/ml处理；多肽预处理组：UVB照射,多肽1μg/ml处理，多肽联合外囊泡预处理组：UVB照射,多肽1μg/ml处理。
UVB照射后培养72h,SA-β-gal染色固定液将细胞固定，经PBS洗涤后，加入配置好的染色工作液，37摄氏度孵育过夜，第2天普通光学显微镜下观察并计数衰老细胞，计算衰老细胞百分数。结果如图1所示。
与对照组比较，UVB组中SA-p-gal染色阳性细胞较空白对照以及个处理组均高，提示紫外线照射72h后，衰老细胞数量显著增多；而经过外囊泡或多肽处理后，染色阳性细胞明显降低，特别是多肽联合外囊泡预处理组更是低至(3.0±0.31)％,这说明经过处理可使衰老细胞的数量减少。
上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。
序列表
<110> 北京远胜达生物科技发展有限公司
<120> 成纤维细胞外囊泡制备及在美容和药品中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Phe Gln Asn Asp Asn Trp Gln Arg Val Pro Asp Gln Val Glu
1 5 10

Claims (6)

1.成纤维细胞外囊泡以及抗氧化多肽在制备抗皱、抗老化药物组合物中的用途，其中所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示；其中所述外囊泡是采用如下方法制备获得：将成纤维细胞培养至80%左右融合时，吸去上清，PBS洗3遍，更换为无血清低糖培养基，继续培养24h；收集上清，3000g离心10min,去除细胞和细胞碎片；收集离心后的上清，依次经过450nm和220nm的滤器，去除直径大的囊泡；收集过滤后的培养液，加入到超滤离心管中，以3000g离心60min浓缩过滤；加入PBS到超滤管中清洗，用上述离心方法再次离心，直到超滤管中液体为100-200μl，收集超滤管中的细胞外囊泡即为目标外囊泡。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于还添加其他抗氧化活性物质。
4.一种抗皱、抗老化药物组合物，所述组合物中含有成纤维细胞外囊泡以及抗氧化多肽，其中所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示。
5.一种抗皱、抗老化的化妆品，所述化妆品中含有成纤维细胞外囊泡以及抗氧化多肽，其中所述多肽RO-2序列如SEQ ID NO：1所示。
6.如权利要求4所述的药物组合物或者如权利要求5所述的化妆品，其特征在于：所述成纤维细胞外囊泡的制备方法如下：将成纤维细胞培养至80%左右融合时，吸去上清，PBS洗3遍，更换为无血清低糖培养基，继续培养24h；收集上清，3000g离心10min,去除细胞和细胞碎片；收集离心后的上清，依次经过450nm和220nm的滤器，去除直径大的囊泡；收集过滤后的培养液，加入到超滤离心管中，以3000g离心60min浓缩过滤；加入PBS到超滤管中清洗，用上述离心方法再次离心，直到超滤管中液体为100-200μl，收集超滤管中的细胞外囊泡即为目标外囊泡。
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