CN113698452A - 一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用，涉及多肽皮肤修复技术领域。其包括具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽。该多肽兼具分散性好、酸碱性环境稳定、生产成本低等特点。基于疏水性氨基酸比例设计的合理性从而使得促皮肤修复肽可以在水性和脂性物质中均匀分散。促皮肤修复肽具有较强的促进皮肤修复、促进胶原蛋白表达、抗氧化等功能，可以应用于制备体表创伤修复、烧伤修复、皮肤溃疡修复、减少疤痕产生的皮肤修复和加快疤痕修复的药物以及用于制备再生美容护肤品化妆品等领域。

Description

一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及多肽皮肤修复技术领域，具体而言，涉及一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用。

背景技术

目前市场上的化妆品，主要有两种类型：一种是以化学原料为主要成份的化妆品，另一种是以植物原料为主要成份的化妆品。化学类型的化妆品见效快，但含有激素、果酸、铅汞等有毒有害物质，长期使用将对人体皮肤造成较大的伤害；而植物类型的化妆品比较安全、健康，但主要是从皮肤表层补水、补充维生素等营养，营养元素不能深入细胞内部，因此，存在起效慢、效果不明显的问题。

同上述化妆品相比，添加动物来源生长因子的化妆品具有一定优势，包括BFGF碱性合成纤维生长因子、AFGF酸性纤维生长因子、EGF表皮细胞生长因子、KGF角质细胞生长因子、干细胞因子等。目前这样的化妆品主要是以表皮生长因子(EGF)为代表的系列产品。但随着EGF等再化妆品领域的禁用，开发新的生物活性因子化妆品原料具有重要意义和重大市场前景。

《中国药用动物志》记载两栖类动物可入药用于治疗创面，如华西雨蛙具有活血止痛、活血生肌的功效，用于跌打损伤瘀血肿痛出血，外伤伤口久不愈合者；湖蛙(Ranaridibunda)皮肤分泌液粗样涂抹在经人工造创的小鼠皮肤表面，发现它对小鼠的皮肤愈合有明显的促进作用。从2014年首次发现两栖类皮肤修复肽以来，目前发现的动物来源的促皮肤修复肽有：云南臭蛙皮肤多肽OA-GL12，OA-FF10，OA-1；无指盘臭蛙皮肤多肽AH90，W49；中国凹耳臭蛙皮肤多肽Ot-WHP；腹斑倭蛙皮肤多肽cathelicidin-NV；海娃皮肤多肽tigerinin-RC1和tigerinin-RC2等。

现有的细胞和动物模型研究表明，AH90可以促进细胞的迁移和粘附，促进皮肤损伤动物模型皮肤愈合；通过激活NF-κB和c-Jun细胞信号通路而导致TGF-β的表达上调，进而再通过活化TGF-β的下游Smads通路而发挥一系列的细胞效应；能促进内源性促创伤愈合因子(TGF-β1)的表达而不产生促有丝分裂活性。而Tylotoin可直接增强角质形成细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的运动和增殖，从而加速创面的再上皮化和肉芽组织形成；也能促进转化生长因子的释放β1(转化生长因子-β1)以及白细胞介素6(IL-6)表达。而Ot-WHP能显著增加创面中性粒细胞的数量，并适度促进中性粒细胞的吞噬和佛波酯(PMA)诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形成；Ot-WHP能显著增加创面巨噬细胞的数量，并通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子直接诱导巨噬细胞产生趋化因子、细胞因子和生长因子-κB(核因子-κB)信号通路。

总的来说，这些多肽可以促进细胞的迁移和粘附、增强角质形成细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的运动和增殖、直接诱导巨噬细胞产生调节因子，促进皮肤伤口愈合。

然而，这些多肽不仅存在不能兼容在水性和脂性物质中的分散性的问题，而且与化妆品常用的辅料配伍后还存在生化性质不稳定的问题，当进入生物体内后还存在生化性质不稳定等安全隐患。此外，在化妆品的制备中的生物学活性不稳定。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用以解决上述技术问题。

发明人发现造成多肽无法兼容水性和脂性物质中的分散性问题的根源在于，多肽的疏水性能的高低。多肽的疏水性过高或过低都无法兼顾在水性和脂性物质中实现均匀分散。

而生化性质不稳定的问题根源在于，多肽的等电点的合理性。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种促皮肤修复肽，其包括具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽。

本发明提供的促皮肤修复肽的一级结构为Lys-Cys-Trp-Arg-Trp-Lys-Arg-Trp-Cys-Lys(KCWRWKRWCK)。发明人通过从头设计疏水氨基酸的比例从而克服了多肽在水性和脂性物质中的分散性问题，本发明提供的多肽的疏水性为37％，可以在水性和脂性物质中均匀分散，保障最终产品原料的均一性。

通过设计碱性氨基酸的比例，使得多肽的等电点为10.33，与等电点较低的多肽相比，本发明提供的多肽可以在酸性溶剂中能保持很好的稳定性，有利于制备过程工艺简化及制备更多剂型产品。

上述多肽的序列长度为10个氨基酸，与过长的多肽相比，本发明提供的多肽的生产成本较低。本发明多肽的分子量为1477.80Da。

现有的多肽以及本发明中的多肽的疏水比例及等电点统计表如下所示：

在本发明应用较佳的实施方式中，上述多肽的第2位氨基酸和第9位氨基酸以二硫键连接以使多肽为环状。形成环状多肽有利于增加与辅料配伍后稳定性，也有利于增加进入生物体后的稳定性。

本发明提供了一种促皮肤修复肽在制备皮肤损伤修复药物中的应用。

皮肤损伤修复包括如下至少一种的修复类型：体表创伤修复、烧伤修复、皮肤溃疡修复、减少疤痕产生的皮肤修复和加快疤痕修复。

上述体表创伤包括由外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温等外部致伤因子或者局部血液供应障碍、疾病等内部因素引起的各种体表创伤。

上述应用包括如下至少一种的表现形式：

促进巨噬细胞在创口募集或巨噬细胞的募集数量增加；

增加创伤修复中肌成纤维细胞的数量；

促进血管的形成；

ERK1/2通路的激活；p38通路的抑制；和促进细胞的迁移。

在一种实施方式中，上述促进细胞迁移是指促进角质细胞的迁移。

本发明还提供了一种促皮肤修复肽在制备化妆品中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述化妆品为洗面乳、浴液、化妆水、卸妆液、精华液、乳液、蜜类、奶类、护发乳、精华乳、润面霜、粉底霜、精华霜、妆前霜或油状化妆品。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述油状化妆品为卸妆油、润肤油、润发油或精华油。

本发明还提供了一种多肽组合物，其包括促皮肤修复肽、化妆品辅料和其他化妆品原料。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述化妆品辅料选自如下至少一种的辅料：

保湿剂、乳化剂、矿物油、植物油、增稠剂、pH调节剂、香精和防腐剂。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述保湿剂选自如下至少一种的物质：甘油、多元醇、透明质酸钠、神经酰胺、海藻糖、聚山梨醇酯-30、氨基酸保湿剂；

乳化剂选自羊毛脂；

增稠剂选自如下至少一种的物质：卡波姆，羟乙基纤维素和黄原胶；

pH调节剂选自如下至少一种的物质：柠檬酸、柠檬酸盐、乳酸、乳酸盐、三乙醇胺和精氨酸；

防腐剂选自如下至少一种的物质：1,2-己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述其他化妆品原料选自如下至少一种的物质：天然角鲨烷、鲸蜡醇、熊果苷、曲酸及其衍生物、甘草黄酮、多肽物质、植物提取物、细胞因子、α-红没药醇、氮酮、高岭土、聚乙烯醇、汉生胶、TiO₂和维生素；

优选地，曲酸衍生物选自曲酸双棕榈酯；

优选地，多肽物质选自如下至少一种的物质：肌肽、促皮肤修复肽、角蛋白酶、五肽-3、谷胱甘肽、鹅肌肽和蛇肉肽；

植物提取物选自如下至少一种的物质：燕麦仁提取液、铁皮石斛提取物、芦荟粉、薄荷醇；

细胞因子选自如下至少一种的物质：表皮生长因子和神经生长因子；

维生素选自如下至少一种的物质：维生素B3、维生素C和维生素E。

本发明还提供了一种促皮肤修复肽的制备方法，其包括如下步骤：采用固相合成的方法或重组表达的方法合成多肽；

优选地，当采用固相合成的方法时，先合成粗多肽，然后将粗多肽进行纯化；

优选地，纯化是通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种促皮肤修复肽，该多肽兼具分散性好、酸碱性环境稳定、生产成本低等特点。基于疏水性氨基酸比例设计的合理性从而使得促皮肤修复肽可以在水性和脂性物质中均匀分散。促皮肤修复肽具有较强的促进皮肤修复、促进胶原蛋白表达、抗氧化等功能，可以应用于制备体表创伤修复、烧伤修复、皮肤溃疡修复、减少疤痕产生的皮肤修复和加快疤痕修复的药物以及用于制备再生美容护肤品化妆品等领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为TYL在血清中的稳定性实验结果图；

图2为TYL在动物模型中的促皮肤修复活性实验结果图；

图3为TYL促进细胞迁移的实验结果图；

图4为TYL对细胞迁移率的影响的统计结果图；

图5为治疗第3天创口皮肤巨噬细胞的募集显微图；

图6为TYL对成纤维细胞的影响结果图；

图7为TYL对血管生成的影响结果图；

图8为TYL对MAPKs信号通路的影响实验结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了促皮肤修复肽(如下的实施例以及实验例中促皮肤修复肽以TYL命名)的制备方法。

其包括如下依次进行的步骤：

(1)根据如下的一级结构用固相合成法合成得到粗多肽，连接第2位和第9位半胱氨酸，形成一对二硫键；

TYL：Lys-Cys-Trp-Arg-Trp-Lys-Arg-Trp-Cys-Lys，

(KCWRWKRWCK，SEQ ID NO.1)。

(2)进行纯化：将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；

HPLC纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100A)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长为215nm，在25℃下测定。

(3)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其分子量为1477.80Da；

测定方法如下：将步骤(2)纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。

(4)通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为10.33。还原二硫键后，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构为Lys-Cys-Trp-Arg-Trp-Lys-Arg-Trp-Cys-Lys。

实验例1

本实验例测定了实施例1制备的促皮肤修复肽TYL的稳定性。

为了检测TYL在血浆中的稳定性，首先将多肽在小鼠血浆中稀释(使用EDTA-K2作为8周龄雄性C57BL/6小鼠的抗凝剂)至最终浓度为10ug/ml，在37℃孵育0、2、4、6、8和10h后，取等份10μl样品与4％H₃PO₄进行蛋白质沉淀，将混合物涡旋混合2min，然后在4℃下以13000rpm离心15min。注入3微升上清液进行液相色谱-串联质谱检测(LC/MS/MS，ExactivePlus，Thermo Scientific)，进行检查。

结果显示，TYL在血清中的稳定性较好。孵育10小时无大量降解(图1)。

实验例2

本实验例测定了实施例1制备的促皮肤修复肽TYL的在脂性物质中的分散性。

以多肽在羊毛脂中均一性和分散性测定为例。取1000g羊毛脂、多肽1000mg，室温下与SHW/R型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120转/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成每管5ml。这种条件下的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物(约相当0.1mg 10ml)量瓶中，加20％乙醇溶液，使其溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2ml用Folin酚法进行蛋白定量。

实验表明20份样品中的平均含量均在理论含量的90％以内。说明设计的促皮肤修复肽在脂性环境中具有很好的分散性。可以用于受损表皮的修复与再生药物的制备护肤品的开发。

实验例3

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL对小鼠皮肤损伤模型的伤口愈合作用实验。

随机选取6-8周大(20g左右)昆明小鼠用1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射(100μL/20g)麻醉后，用剪刀尽量剪净其背部毛发。酒精消毒后，在其背部用打孔器开两个直径8mm的创口。以PBS溶液为空白对照组(对应图2中的“对照”)；以人源EGF(hEFG，20μg/ml)为EGF组(对应图2中的“EGF”)；促皮肤修复肽TYL(20μg/mL)为实验组；EGF和均用PBS溶液配制。每天给药两次，每次20μL。样品加在右侧创面，左侧创面加相应的空白/阳性对照。每两天用相机拍下创面变化，直到加药创面完全脱痂愈合为止。拍照时用量尺比照创口作标尺。

如图2所示，在为期8天的创面结果观察中可以看出，促皮肤修复肽TYL浓度为20μg/ml对创伤愈合效果明显优于浓度为20μg/ml人源hEGF，可见促皮肤修复肽TYL具备显著提高伤口修复能力。因此，本发明提供的促皮肤修复肽可应用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物、减少疤痕产生、加快疤痕修复的药物。

实验例4

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL溶血性测定实验。

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸细胞/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的促皮肤修复肽样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm条件下离心5min，上清液于540nm处测光吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。

表1.促皮肤修复肽溶血活性

HC₁₀和HC₅₀分别是引起人红细胞溶血10％和50％的多肽浓度。Hmax是最高肽浓度(320ug/ml)下溶血的百分比(％)。

表1结果表明：促皮肤修复肽TYL在浓度为320μg/ml时的溶血率小于2％。说明溶血活性极低，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在皮肤修复的化妆品添加剂领域进一步的开发应用。

实验例5

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL的细胞毒性测定实验。

用MTT法检测该组促皮肤修复肽对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。

人皮肤成纤维细胞HFF-1购于昆明细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化使得细胞脱离下来，用上述培养基清洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将100μl细胞悬浮液加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到10⁵个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％CO₂培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μlDMSO，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nm，参考波长630nm。

表2.促皮肤修复肽TYL对HFF-1细胞的毒性

多肽(浓度200μg/ml)	细胞毒性％
		TYL	3.78±0.35

结果如表2所示，表明促皮肤修复肽TYL浓度为200μg/ml时的细胞毒性均小于4％，说明本发明提供的促皮肤修复肽对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。

实验例6

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL的促细胞迁移活性实验。

利用细胞划痕实验测定。将对数生长期的HaCAT细胞(中国科学院昆明动物研究所细胞库)，以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的培养液制成细胞悬液，按1×10⁶个/孔的密度接种到6孔板，置37℃，5％CO₂培养箱内培养至细胞完全长满培养孔。吸弃培养液，PBS洗涤一次。用无菌枪头在每个试验孔中央垂直于培养孔自上而下划一条线，为保证宽度一致，尽量均匀用力。小心洗去培养液，并用PBS吹洗几次，洗去划痕产生的细胞团，使划痕边缘整齐。小心吸除PBS后，加入无血清的新鲜培养基和适当浓度的样品，显微镜下拍照后。继续置于细胞培养箱中培养。培养过程中，每隔6个小时观察一次，并拍照记录。为保证每次拍照选择的是相同的视野，接种细胞之前在每个培养孔底部用记号笔做好标记。所得图像数据用Image Pro Plus 6.0分析处理。

在划痕每侧边缘均匀选取30个点后取其中线代表划痕边缘，测量划痕间距，并用以下公式计算划痕修复率：划痕修复率＝(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度。实验重复三次。

采用细胞划痕法检测了血清处理的TYL和TYL在50μg/ml浓度下对HaCAT细胞迁移活性的影响。实验结果如图3所示，血清处理的TYL和TYL在作用24小时、48小时后，与对照组相比有了明显的差别，24h和48h划痕修复率分别达到60％和80％以上(图4)。说明TYL具有促进角质细胞迁移的作用。且血清孵育对多肽活性无较大影响，说明TYL在血清中稳定。

实验例7

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL对巨噬细胞的募集的实验。

巨噬细胞是创面愈合的重要细胞，其作用贯穿整个创面修复过程，它不但清除吞噬坏死组织、病原微生物和异物，而且分泌多种细胞因子趋化修复细胞、刺激细胞增殖、胶原沉积、促进血管化和肉芽新生。

为了研究对巨噬细胞在创口的募集的影响，于治疗后的第3天(与实施例3为同一批实验)取创面组织，制备石蜡切片，切片厚3μm，用小鼠成熟巨噬细胞的特异性F4/80抗体，检测了巨噬细胞在创口募集的情况。

结果如图5所示：A图为放大40倍的显微图，图中所示，治疗后3天，治疗组巨噬细胞的募集明显高于对照，募集的巨噬细胞数量比对照高出两倍左右，差别具有极其显著性。说明本发明提供的TYL多肽可以促进巨噬细胞在创口的募集。

巨噬细胞是创伤愈合中结束炎症期，启动修复期的细胞。在伤口愈合的微环境中，它分泌TGF-β、PDGF、FGF、IL-1、TNF-α等细胞因子，这些因子刺激成纤维细胞的增殖及血管的形成，促进细胞功能活化，大量合成胶原蛋白、弹性纤维和纤连蛋白，并间接的参与胶原的合成和降解过程。因此促进巨噬细胞在创口募集的作用，将有利于胶原蛋白的合成与创伤的愈合。

实验例8

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL对成纤维细胞的影响的实验。

取创面标本石蜡切片(取自实施例3的动物实验)，进行Anti-SMA免疫组化染色，阳性产物为棕黄色或深棕色。用HMIAS-2000彩色医学图文分析系统进行图像采集。

免疫组化实验步骤如下(SABC法)：

(1)石蜡切片脱腊：二甲苯脱腊10min，2次。(2)水化：无水乙醇、95％、90％、80％、70％酒精各2min，自来水洗1min。(3)阻断内源性过氧化物酶：3％H₂O₂甲醇水溶液室温15min，PBS缓冲液洗5min，2次。(4)抗原的修复：(加热法)0.01mol/l的柠檬酸钠缓冲液，调pH值6.0，微波炉中高档，3.5min，室温冷却30-60min。(5)PBS缓冲液洗5min，3次。(6)用蜡片在组织周围画一封闭圈，防止抗体外流，维持抗体浓度不变。(7)滴加溶液A(蛋白阻断液)，室温孵育10min，PBS缓冲液洗5min，3次。(8)滴加适当稀释的一抗(兔抗鼠)Anti-F4/80，Anti-SMA单克隆抗体，置于湿盒中，4℃恒温箱过夜。(9)PBS缓冲液洗5min，3次。(10)滴加溶液B(生物素标记的二抗，羊抗兔)，室温10min，PBS缓冲液洗3min，3次。(11)滴加溶液C(辣根过氧化物酶标记的链霉菌抗生素蛋白)，室温10min，PBS缓冲液洗5min，3次。(12)DAB(现用现配)显色，约2min，显微镜下观察至特异性染色清晰，无背景染色，终止显色，自来水冲洗。(13)苏木素速染10s，用前过滤。(14)70％、80％、90％、95％酒精、无水乙醇脱水5min。(15)二甲苯透明10min，2次。(16)中性树脂封片。

α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是肌成纤维细胞的主要免疫组织化学特征，是肌成纤维细胞的标志蛋白。创口内肌成纤维细胞的收缩会引起创口的收缩。

在之前的动物实验中我们发现TYL治疗组在治疗6天后，创口收缩幅度明显增大。于治疗后的第6天取创面组织，制备石蜡切片，切片厚3μm，用特异性α-SMA抗体检测了α-SMA在创口的表达情况。免疫组化(图6)结果表明：治疗第6天，与对照组相比TYL治疗组新生肉芽组织中α-SMA阳性肌成纤维细胞明显增多，比对照增加3倍左右，差别具有极其显著性。

创伤修复过程中创伤部位的有些成纤维细胞开始并持续表达α-SMA，呈现收缩特性，逐渐转变为肌成纤维细胞，α-SMA是成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的标志之一。随着肌成纤维细胞的活跃增生及其牵拉作用，和伤口边缘整层皮肤组织(含表皮和表皮组织)的再生，并沿伤口边缘及其底部向中心的移动，于是伤口逐渐缩小并逐渐消失。因此在创伤修复中后期肌成纤维细胞数量的多少，往往极大地影响了创口愈合的速度和程度。在本实验中发现TYL能明显增加创伤修复中后期肌成纤维细胞的数量，从而极大地促进了创口愈合的速度和程度。

实验例9

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL对血管生成的作用影响的实验。

HUVEC用含20％FBS，50×低血清生长添加剂(LSGS)的M200培养基培养至对数期，0.25％胰酶消化后，离心900rpm、5min、37℃，去除含血清培养基。用含50×LGSG，M200培养基重新悬浮细胞。Matrigel基质胶提前在4℃冷库内溶化，用预冷的枪头取50μl/孔Matrigel基质胶加入96孔板，避免气泡产生，轻轻摇晃培养板，使其铺平，每组设3个复孔。放入37℃温箱30min，使胶凝固后，每孔加人200μl对数生长期的HUVEC细胞悬液，细胞数为1×10⁶个/ml，再分别加入相应浓度的10μl TYL样品和PBS。于37℃，5％CO₂培养箱中培养18h后相差显微镜下观察各试验组血管腔形成情况。以形成的管腔数量表示HUVEC细胞的血管形成能力。

实验结果参照图7所示，与对照相比，TYL在50ug/ml的浓度下能明显促进血管的形成。

实验例10

本实验例设计了促皮肤修复肽TYL对MAPKs信号通路的影响的实验。

Raw 264.7细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养至对数生长期，胰酶消化后，按细胞密度为1×10⁶个/ml接种于6孔细胞培养板。于37℃，5％CO₂培养箱中培养4-6h，细胞完全贴壁后，用PBS洗涤2-3次，换为无血清培养基饥饿处理细胞16h。每孔加入不同浓度样品20μl，空白对照加入20μl灭菌Milli-Q水。样品作用1h后，加入LPS(终浓度为1μg/ml)，继续作用15min。

吸弃培养液，用1ml预冷的PBS洗涤细胞2次。每孔细胞内加入250μl RIPA细胞裂解液[50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1％Nonidet P-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mMEDTA,1mM PMSF，1mM NaF，1mM Na₃VO₄，各1μg/ml的抑肽酶，亮抑肽酶和胃蛋白酶抑制剂]，冰上裂解30min。4℃，12,000g条件下离心20min，小心吸取上清，并将上清分装至新的离心管中，吸取2μl用Bradford法测定蛋白浓度。剩余按一定体积分装后迅速冻于-20℃。

将等量于40微克蛋白的细胞裂解物与6×SDS样品缓冲液混匀后，95-100℃加热5min，冷却后加入各泳道。恒压电泳：浓缩胶90V，分离胶120V。电泳结束后用湿转法转至PVDF膜。转膜结束后用TBS洗涤5min后，用5ml封闭液(1×TBS，0.1％Tween-20，5％脱脂奶粉)室温封闭1h。用TBST洗涤膜三次，每次5min。然后与预先稀释好的一抗反应，置滚动摇床于4℃过夜。用TBST洗涤三次，每次5min。然后与用封闭缓冲液预先稀释的二抗反应，轻轻振荡1h。用TBST洗涤三次，每次5min。按照制造商的说明配制ECL反应底物，暗室中曝光显色。

实验结果表明，(图8)不同浓度的TYL成浓度依赖的激活ERK1/2通路，同时抑制p38通路。MAPK中ERK通路主要促进细胞的增殖，而JNK和p38MAPK通路可促进细胞的死亡。TYL激活ERK1/2通路，同时抑制p38通路的作用相互协同，共同促进了细胞的存活，而抑制了细胞的凋亡。TYL促进皮肤修复功能与ERK1/2通路的激活有关。

综上，促皮肤修复肽TYL可促进细胞迁移，促进巨噬细胞和成纤维细胞的招募，促进血管生成，同时实验证实，促皮肤修复肽TYL通过MAPK信号通路发挥作用。动物模型显示TYL多肽具有良好的促伤口修复功能，且无溶血活性和细胞毒性，具有良好的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川丽妍工坊生物科技有限公司

<120> 一种促皮肤修复肽、制备方法及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Cys Trp Arg Trp Lys Arg Trp Cys Lys

1 5 10

Claims (10)

1.一种促皮肤修复肽，其特征在于，其包括具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽。

2.根据权利要求1所述的促皮肤修复肽，其特征在于，所述多肽的第2位氨基酸和第9位氨基酸以二硫键连接以使所述多肽为环状。

3.一种如权利要求1或2所述的促皮肤修复肽在制备皮肤损伤修复药物中的应用；

优选地，所述皮肤损伤修复包括如下至少一种的修复类型：体表创伤修复、烧伤修复、皮肤溃疡修复、减少疤痕产生的皮肤修复和加快疤痕修复；

优选地，所述应用包括如下至少一种的表现形式：

促进巨噬细胞在创口募集或巨噬细胞的募集数量增加；

增加创伤修复中肌成纤维细胞的数量；

促进血管的形成；

ERK1/2通路的激活；p38通路的抑制；和促进细胞的迁移。

4.一种如权利要求1或2所述的促皮肤修复肽在制备化妆品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化妆品为洗面乳、浴液、化妆水、卸妆液、精华液、乳液、蜜类、奶类、护发乳、精华乳、润面霜、粉底霜、精华霜、妆前霜或油状化妆品；

优选地，所述油状化妆品为卸妆油、润肤油、润发油或精华油。

6.一种多肽组合物，其特征在于，其包括权利要求1-2任意一项所述的促皮肤修复肽、化妆品辅料和其他化妆品原料。

7.根据权利要求6所述的多肽组合物，其特征在于，所述化妆品辅料选自如下至少一种的辅料：

保湿剂、乳化剂、矿物油、植物油、增稠剂、pH调节剂、香精和防腐剂。

8.根据权利要求7所述的多肽组合物，其特征在于，所述保湿剂选自如下至少一种的物质：甘油、多元醇、透明质酸钠、神经酰胺、海藻糖、聚山梨醇酯-30、氨基酸保湿剂；

所述乳化剂选自羊毛脂；

所述增稠剂选自如下至少一种的物质：卡波姆，羟乙基纤维素和黄原胶；

所述pH调节剂选自如下至少一种的物质：柠檬酸、柠檬酸盐、乳酸、乳酸盐、三乙醇胺和精氨酸；

所述防腐剂选自如下至少一种的物质：1,2-己二醇、对羟基苯乙酮和乙基己基甘油。

9.根据权利要求7所述的多肽组合物，其特征在于，所述其他化妆品原料选自如下至少一种的物质：天然角鲨烷、鲸蜡醇、熊果苷、曲酸及其衍生物、甘草黄酮、多肽物质、植物提取物、细胞因子、α-红没药醇、氮酮、高岭土、聚乙烯醇、汉生胶、TiO₂和维生素；

优选地，曲酸衍生物选自曲酸双棕榈酯；

优选地，所述多肽物质选自如下至少一种的物质：肌肽、促皮肤修复肽、角蛋白酶、五肽-3、谷胱甘肽、鹅肌肽和蛇肉肽；

所述植物提取物选自如下至少一种的物质：燕麦仁提取液、铁皮石斛提取物、芦荟粉、薄荷醇；

所述细胞因子选自如下至少一种的物质：表皮生长因子和神经生长因子；

所述维生素选自如下至少一种的物质：维生素B3、维生素C和维生素E。

10.一种如权利要求1-2任意一项所述的促皮肤修复肽的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：采用固相合成的方法或重组表达的方法合成多肽；

优选地，当采用固相合成的方法时，先合成粗多肽，然后将所述粗多肽进行纯化；

优选地，所述纯化是通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

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