CN110903348A

CN110903348A - 一种促进伤口愈合的小肽及其应用

Info

Publication number: CN110903348A
Application number: CN201911258218.6A
Authority: CN
Inventors: 沈新春; 隋慧琳; 汪芳
Original assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Current assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: CN110903348B

Abstract

本发明提供一种促进伤口愈合的小肽及其应用，属于生物技术领域。该促进伤口愈合的小肽，其氨基酸序列SEQ ID NO:1所示。本发明提供所述小肽在制备外伤皮肤受损治疗药物中的应用、在制备美容护肤产品中的应用。本发明还提供外伤皮肤受损治疗药物和美容护肤产品，含有所述促进伤口愈合的小肽。本发明小肽，能够显著促进伤口的愈合。

Description

一种促进伤口愈合的小肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种促进伤口愈合的小肽及其应用。

背景技术

皮肤是机体抵抗外界损伤的第一道防线，慢性或者不适当的伤口愈合危害人群的生活质量，并存在引起慢性皮肤溃烂及并发症的风险。皮肤一旦受损，机体就会立即调节进行损伤修复。伤口愈合的过程是一个动态的，包括三个高度整合和重叠的阶段：（1）炎症反应阶段，包括血液成分外溢导致血小板聚集、凝血和炎症细胞向创面迁移；（2）增殖阶段，包括角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的迁移和增殖，导致再生上皮和肉芽组织的形成；（3）组织重塑阶段，恢复组织结构完整性和功能。大量的细胞和分子生物学研究表明，许多细胞因子、生长因子和蛋白酶密切参与伤口愈合过程，完成正常组织修复。

小麦胚芽是小麦籽粒中的一部分，具有丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素和矿物质等。小麦胚芽作为一种储量丰富的小麦加工副产品，不仅营养价值高，蛋白质含量达到31%，含有丰富的生物活性物质。

现有技术中缺乏促进伤口愈合的小肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种小肽，该小肽能够显著促进伤口的愈合。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种促进伤口愈合的小肽，其氨基酸序列SEQ ID NO:1所示。

本发明提供所述小肽在制备外伤皮肤受损治疗药物中的应用、在制备美容护肤产品中的应用。

本发明还提供一种制备外伤皮肤受损治疗药物，含有所述促进伤口愈合的小肽。

本发明还提供一种美容护肤产品，含有所述促进伤口愈合的小肽。

本发明小肽能够显著促进伤口愈合。实验证明本发明提供的小肽能够促进L929成纤维细胞和人永生化角质细胞HaCaT的增殖，促进L929成纤维细胞和人永生化角质细胞HaCaT迁移。本发明提供的小肽还能够促进大鼠真皮层损伤的修复，对LPS诱导的RAW264.7分泌NO具有显著的抑制作用，对促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌具有抑制作用，对抗炎因子IL-10的分泌具有促进作用，显著减少细胞浸润，增加α-SMA，显著提高创口闭合速度。

附图说明

图1是小肽YDW的质谱图。

图2是小肽YDW的高效液相色谱图。

图3小肽YDW对HaCaT细胞和L929细胞细胞增殖活力的影响，横坐标为试验孔中处理的小肽浓度。其中“**”表示与同种细胞中采用0 μM小肽YDW溶液处理的试验孔相比有极显著性差异（p<0.01）;“*”表示与同种细胞中采用0 μM小肽YDW溶液处理的试验孔相比有显著性差异（p<0.05）。

图4小肽YDW对LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌NO的影响，横坐标显示了各孔中是否添加LPS或YDW浓度。“##”表示与空白孔（无LPS诱导无YDW治疗）相比有极显著性差异；“*”表示与对照孔（LPS诱导无YDW治疗组）相比有显著性差异（p<0.05）;“**”表示与LPS诱导无YDW治疗组相比有极显著性差异（p<0.01）。

图5YDW对RAW 264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响，（A）IL-1β的含量（B）IL-6的含量（C）IL-10的含量（D）TNF-α的含量，其中横坐标显示了各孔中是否添加LPS或YDW浓度。“##”表示与空白组（无LPS诱导无YDW治疗）相比有极显著性差异；“*”：与对照组（LPS诱导无YDW治疗组）相比有显著性差异（p<0.05）;**：与与LPS诱导无YDW治疗组相比有极显著性差异（p<0.01）

图6不同浓度YDW对L929成纤维细胞迁移的影响，其中（A）是不同浓度YDW对L929成纤维细胞迁移的影响拍照图，左边的时间为创面在加入小肽YDW后的培养时间，最上面一行显示了YDW的浓度；（B）是L929成纤维细胞在不同浓度YDW中培养不同时间后的细胞迁移率。图中不同字代表同一时间不同浓度YDW处理之间存在差异性（p<0.05）。

图7不同浓度 YDW对HaCaT细胞迁移的影响。其中（A）是不同浓度YDW对HaCaT细胞迁移的影响拍照图，左边的时间为创面在加入小肽YDW后的培养时间，最上面一行显示了YDW的浓度；（B）显示了HaCaT细胞在不同浓度YDW中培养不同时间后的细胞迁移率，横坐标为加入YDW后的培养时间。图中不同字代表同一时间不同浓度YDW处理之间存在差异性（p<0.05）。

图8中（A）显示了不同药物处理0、4、7、10天对大鼠伤口模型的影响；（B）显示了大鼠伤口模型在不同药物处理0，4，7，10天伤口愈合情况，纵坐标显示了受伤后不同天数创面面积占原创面面积的百分比。“*”表示同一天内与control组相比具有显著性差异（p<0.05）；“**”表示同一天内与control组相比具有极显著性差异（p<0.01）。

图9 大鼠伤口各处理后的组织切片中F4/80和α-SMA的检测，其中（A）显示了大鼠伤口各处理后的组织切片中F4/80和α-SMA的免疫荧光检测结果；（B）显示了F4/80阳性表达占细胞的百分比（C）α-SMA阳性表达占细胞的百分比。“*”表示与contrl组相比具有显著性差异（p<0.05）。“**”表示与control相比具有极显著性差异（p<0.01）。

具体实施方式

实施例1 小肽YDW的液相和质谱图

小肽YDW的氨基酸序列如下：YDWPGGRN（SEQ ID NO:1），分子量为964.5 Da。小肽YDW购自金斯瑞生物科技有限公司。

实施例2 小肽YDW对小鼠成纤维细胞L929和人永生化表皮细胞HaCaT的增殖作用

将小肽YDW按照终浓度为5 μM、20 μM、80 μM溶于RPMI 1640培养液中，用MTT法检测小肽YDW对小鼠成纤维细胞L929和人永生化表皮细胞HaCaT增殖活性的影响。具体方法如下：将人永生化表皮细胞HaCaT（湖南丰晖生物科技有限公司）和小鼠成纤维细胞L929（湖南丰晖生物科技有限公司），分别采用含有10%（体积百分浓度）FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养液配置成5×10⁴个细胞/mL的细胞悬液。将100 μL细胞悬液添加至96孔板的每个试验孔中，在CO₂培养箱中培养12小时以粘附细胞，设置以RPMI 1640培养液替代细胞悬液的空白组。细胞附着后，除去培养液，将5 μM、20 μM和80 μM小肽YDW溶液（小肽YDW溶液是将小肽YDW溶于添加有10% FBS的RPMI 1640培养液后得到的）分别添加至试验孔中，每孔100 μL，每个浓度的小肽YDW溶液设置6个平行。空白组中也加入了不同浓度的小肽溶液；另设对照组，添加相同体积的RPMI1640替代小肽YDW溶液，其他同试验组。然后，将96孔板在CO₂培养箱中继续培养24h，向每个孔中添加10 μL、5 mg/mL的MTT（噻唑蓝）溶液，在CO₂培养箱中培养4 h后，除去每孔中液体，再加入50 μL的DMSO（二甲基亚砜），在37°C恒温器中震荡培养20min，使用酶标仪测量570 nm下的吸光度。根据细胞增殖活力=（OD_试验组-OD_空白组）/（OD_对照组-OD_空白组）×100%来计算细胞增殖活力。

结果（图3）显示：5 μM小肽YDW溶液对HaCaT细胞的增殖有显著性影响（p<0.05），细胞增殖活力为105.38±5.94%，且随着小肽YDW溶液浓度的增加，细胞的增殖活力逐渐增强；当小肽YDW溶液浓度为20 μM时，细胞增殖活力达109.98±5.39%；当小肽YDW溶液浓度达到80 μM时，细胞增殖活力达到112.84±4.55%。小肽YDW溶液对L929细胞也有显著的促进增殖的作用。

实施例3 小肽YDW抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW 264.7中NO的分泌

将巨噬细胞RAW 264.7细胞（湖南丰晖生物科技有限公司）采用含有10% FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养液配置成5×10⁴个细胞/mL的细胞悬浮液。在24孔板的每个试验孔中加入400 μL细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12 h使细胞贴壁，分别加入5 μM、20 μM和80 μM的小肽YDW溶液（小肽YDW溶液是将小肽YDW溶于添加有10% FBS的RPMI1640培养液后得到的），2 h后，加入LPS（脂多糖，公司Solarbio，货号L8880），培养箱中恒温放置24 h。另外设置对照孔和空白孔，对照孔和空白孔中均以添加有10% FBS的RPMI1640培养液替代小肽YDW溶液，且空白孔中不添加LPS，其他同试验孔。

然后从24孔板的每个孔（试验孔、对照孔和空白孔）中吸取上清液50 μL转移到96孔板各孔中，且96孔板中各孔的命名对应于24孔板。在96孔板的每个孔中依次加入一氧化氮检测试剂盒（碧云天生物有限公司）中的Griess Ⅰ 和Griess Ⅱ 两种溶液，混匀后。采用酶标仪检测在490 nm下的吸光度。

从图4可以看到，当小肽YDW浓度为20 μM时，与对照组相比，小肽YDW对NO（一氧化氮）的分泌具有显著性的抑制作用；当YDW为80 μM时NO的分泌具有极显著性的差异。结果表明，YDW对LPS诱导的RAW264.7分泌NO具有显著的抑制作用。

实施例4小肽YDW对LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌IL-1β，IL-6，TNF-α和IL-10的影响

将RAW 264.7细胞采用含有10% FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养液配置成5×10⁴个/mL的细胞悬浮液。在24孔板的每孔中加入400 μL细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12 h使细胞贴壁，加入5 μM、20 μM和80 μM的小肽YDW溶液（小肽YDW溶液是将小肽YDW溶于添加有10%FBS的RPMI1640培养液后得到的），2 h后，加入LPS，培养箱中恒温培养24 h。另外设置对照孔和空白孔，对照孔和空白孔中均以添加有10% FBS的RPMI1640培养液替代小肽YDW溶液，且空白孔中不添加LPS，其他同试验孔。

培养24h后，将24孔板的各孔去上清液，采用ELISA试剂盒（IL-1β ELISA检测试剂盒，IL-6 ELISA检测试剂盒，IL-10 ELISA检测试剂盒，TNF-α ELISA检测试剂盒，南京慕恩生物有限公司），检测炎症因子IL-1β，IL-6，IL-10和TNF-α含量。

结果（图5）：YDW处理的RAW 264.7 巨噬细胞在LPS诱导后，IL-1β，IL-6和TNF-α的分泌成剂量依赖性降低，而IL-10的分泌在20 μM和80 μM的小肽YDW处理后有所上升。因此，YDW对促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌具有抑制作用，对抗炎因子IL-10的分泌具有促进作用。

实施例5 小肽YDW对小鼠成纤维细胞L929和人永生化表皮细胞HaCaT迁移的影响

将L929细胞采用含有10%（体积百分浓度） FBS（胎牛血清）的RPMI 1640培养液配置成5×10⁴个/mL的细胞悬浮液。6孔板的每孔中分别加入2 mL细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12h使细胞贴壁。用10 mL灭菌枪头的尖端在每孔中划伤细胞，形成大约1 mm宽的创面，并用PBS冲洗两次，去除漂浮的细胞。形成创面后，每孔分别加入2 mL含小肽YDW的无血清RPMI1640培养液，小肽YDW浓度分别为0 μM、5 μM、 20 μM和80 μM，每个浓度设置3个平行。观察小肽YDW在培养0 h、12 h、24 h、36 h对小鼠成纤维细胞L929迁移的影响。

将人永生化表皮细胞HaCaT采用含有10%（体积百分浓度）FBS（胎牛血清）的RPMI1640培养液配置成5×10⁴个/mL的细胞悬浮液。在6孔板的每孔中加入2 mL细胞悬浮液，在CO₂培养箱中培养12 h使细胞贴壁。用10 mL灭菌枪头的尖端划伤单层创面，形成大约1 mm宽的创面，并用PBS冲洗两次，去除漂浮的细胞。形成创面后，每孔加入2 mL含小肽YDW的无血清 RPMI 1640培养液，小肽YDW浓度分别为0 μM、5 μM、 20 μM、80 μM，每个浓度设置3个平行。观察小肽YDW在培养0 h、12 h、24 h、36 h对HaCaT细胞迁移的影响。

图6显示：YDW处理增加L929成纤维细胞向创面的迁移速度。与预期一样，YDW治疗24h后创面明显较正常对照组窄，消融面积明显增大。36 h后，经YDW处理的创面区几乎完全闭合，正常对照组仍有较大间隙。图7显示：12 h时，80 μM的YDW处理后较其他组有显著性的差异。在24 h时，YDW处理组与对照组（0 μM组）具有显著性差异。36 h时，80 μM的YDW处理组迁移率相比与对照组增加了9%。

实施例6 小肽YDW促进大鼠伤口愈合

随机取6周龄雄性SD大鼠24只，各SD大鼠的体重均为200~220 g。用10%水合氯醛溶液按照1.5 mL/200 g腹腔注射麻醉各SD大鼠。在每只大鼠后背形成3个伤口，分别为对照组（即Control组）、阳性对照组（即EGF组）和小肽YDW组（即YDW组）。伤口形成方法如下：在大鼠背部用电动脱毛器脱毛，以大鼠脊椎为中轴线，以大鼠无法舔舐伤口为原则，伤口的前端不超过前肢根部，最后端的伤口不超过后肢根部，用直径为1.0 cm的圆形印章标记上下平行的3个圆形伤口，用直径为1.0 cm的圆形打孔器切除全层皮肤形成直径为1.0 cm的深达深筋膜的圆形伤口，伤口间距为1.0 cm以上。伤口干燥及回缩2小时后测量伤口面积，即为原伤口面积。

大鼠伤口自然止血，每天于固定时间用药一次，直至伤口愈合。其中Control组涂抹20 μL生理盐水，阳性对照组涂抹20 μL的阳性药EGF（表皮细胞生长因子，浓度是100 μg/mL），小肽YDW组涂抹20 μL浓度是250 μg/mL的小肽YDW溶液。

结果（图8）显示：通过肉眼观察可以发现，与对照组相比，经YDW和EGF处理后0、4、7、10天，创面闭合速度明显加快。伤后第4天，经YDW处理的动物创面面积比对照组小9%，经EGF处理的动物创面面积比对照组小23%。随后，在YDW处理组和EGF处理组中，伤口愈合速度迅速加快，第7天时，创面面积分别比对照组小15%和21%。第10天时，EGF处理组创面闭合，YDW处理组创面接近闭合，对照组创面面积是原始创面的19%。

实施例7 采用免疫荧光法检测F4/80和α-SMA

实施例6中大鼠伤口模型给药后第4天，随机取1只大鼠，处死，分别取对照组（即Control组）、阳性对照组（即EGF组）和小肽YDW组（即YDW组）伤口周围肉芽组织，浸泡于福尔马林中。取组织制成厚3 μm切片，采用免疫荧光法检测分别检测各组织中F4/80和α-SMA。试验过程中使用的一抗为抗α-SMA（购自谷歌生物，产品编号为GB13044，稀释度为1:500）和抗F4/80（谷歌生物，GB11027，稀释度为1:500）；使用的二抗为Cy3山羊抗兔（谷歌生物，GB21303，稀释浓度1:300）和Cy3山羊抗小鼠（购自谷歌生物，编号为GB21301），稀释度为1:300）。滴加DAPI（谷歌生物，G1012）进行复染细胞核，使用抗荧光淬灭封片剂（谷歌生物，G1401）封片，切片于荧光显微镜（日本尼康，Nikon DS-U3）下观察并采集图像。

结果（图9）显示：F4/80是巨噬细胞的标志物，YDW或EGF处理中F4/80的免疫荧光染色显示炎性细胞浸润明显减少。α-SMA是肌成纤维细胞的标志物，在组织形成和血管生成在创伤愈合中起着关键作用。荧光染色的α-SMA伤口区域显示，与control组相比，YDW治疗显著(p < 0.01)。

Claims

1.一种促进伤口愈合的小肽，其特征在于：其氨基酸序列SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述小肽在制备外伤皮肤受损治疗药物中的应用。

3.权利要求1所述小肽在制备美容护肤产品中的应用。

4.一种制备外伤皮肤受损治疗药物，其特征在于含有权利要求1所述促进伤口愈合的小肽。

5.一种美容护肤产品，其特征在于含有权利要求1所述促进伤口愈合的小肽。