CN110935003B

CN110935003B - 促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物

Info

Publication number: CN110935003B
Application number: CN201911393868.1A
Authority: CN
Inventors: 朱由瑾
Original assignee: Beiyi Boda Beijing Dermatology Medical Research Institute Co ltd
Current assignee: Beiyi Boda (Beijing) dermatology Medical Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110935003A

Abstract

本发明公开了一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，对皮肤修复具有非常好的效果，同时可以促进创面的表皮生长因子的分泌。其制备方法如下：将脱脂鱼下脚料与蒸馏水混合，添加3％(E/S，以底物重量计)的复合酶，混匀进行水解。还可以进一步包括黄药大头茶苷A。

Description

促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物

技术领域

本发明涉及一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，属于生物技术领域。

背景技术

肽是由一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基脱缩后通过肽键相互连接而形成，是组成蛋白质的功能与结构片段。依据氨基酸数量多少来划分：氨基酸数目在2-10范围内的称之为低聚肽或寡肽；氨基酸数目在10-50范围内的称之为多肽。多肽是介于氨基酸与蛋白质之间的高分子化合物，且具有较强的生物活性。现有技术报道了玉米蛋白酶解产物对三硝基苯磺酸致大鼠结肠炎具有良好的抗炎效果，同时还具有良好的抗氧化活性。

创伤、大面积烧伤、糖尿病或其他慢性疾病等均会造成严重的皮肤组织缺失，目前临床上常用自体、异体皮肤移植或通过组织工程人工替代物等方法进行修复，但这些方法存在供区新的创伤、供体来源有限和免疫排斥等问题。因此，皮肤损伤修复一直是亟需解决的问题。现有技术普遍认为，动物蛋白多肽活性会好于植物蛋白多肽。

天然活性肽是指来源于海洋生物、植物或动物，通过分离纯化等手段获得的肽类物质，如谷胱甘肽、扇贝肽和海兔环肽等；微生物代谢活性肽是微生物生长繁殖过程中的代谢产物，具有抗癌与抗菌作用，如放线菌素、多粘菌素、杆菌肽和博莱霉素等；人工合成活性肽是采用化学合成方法或生物工程手段生产的产品，如催产素、抑胃酶泌素、加压素、增血压素和水蛭素多肽；蛋白质转化活性肽是由禽蛋、乳制品、动物、鱼虾、贝类或海洋植物中的蛋白质水解所获得，包括乳清肽、玉米肽、酪蛋白肽、畜产肽、大豆肽、卵白肽及水产肽等。鱼蛋白多肽是以鱿鱼、金枪鱼、鳕鱼、小黄鱼等海洋生物为原料，经水解后提取的高分子活性物质，具有较高的研究与利用价值。

本发明旨在提供一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，对皮肤修复具有非常好的效果，同时可以促进创面的表皮生长因子的分泌。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，对皮肤修复具有非常好的效果，同时可以促进创面的表皮生长因子的分泌。

皮肤作为人体最大的、重要的附属器官，调节着人体的体温，维持体液平衡，同时保护机体免受各种物理、化学、生物以及外界环境的伤害。而当皮肤被破坏时，机体功能将会发生一系列变化，严重时还会危及人的生命。国内外研究发现，皮肤损伤有三个主要特点：创面难以愈合，引起反复发作的坏死性皮肤溃疡；剧烈疼痛，引起身体和情绪变化；易罹患癌症。因此，不管是急性疾病还是慢性疾病引起的皮肤损伤，都应及时处理，促进其功能修复。创伤修复是一个及其复杂的过程，受体内外很多因素的影响和制约，在创伤修复结果中，真正的创面愈合必须有新生的上皮组织覆盖，肉芽组织旺盛生长。因此，寻找促进肉芽组织生长，加速创面愈合的治疗药物尤为重要。

一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，其制备方法如下：

将脱脂低值鱼下脚料与蒸馏水混合，添加3％(E/S，以底物重量计)的复合酶，混匀进行水解。

作为优选，将20g低值鱼下脚料(脱脂)与100mL蒸馏水置于500mL具塞三角瓶中，添加3％(E/S，以底物重量计)的复合酶，混匀。

作为优选，所述复合复合酶为按照质量比，风味蛋白酶：木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶为2:1:1组成的复合蛋白酶。

所述水解工艺为：恒温振荡酶解300min，待水解完成后，升温至95℃灭酶，冷却至室温，抽滤。

所述水解工艺为：在50℃恒温振荡器中酶解300min，待水解完成后，升温至95℃，灭酶10min，冷却至室温，抽滤得到生物多肽。

黄药大头茶Gordonia chrysandra Cowan为山茶科(Theaceae)大头茶属GordoniaEllis植物，主要含有皂苷和黄酮醇苷类成分，且部分化合物具有抗肿瘤和保肝药理活性。现有技术有人从中分离得到过一种新的化合物：为3,4-二甲氧基苯酚1-O-β-D-[6-O-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基)]-吡喃葡萄糖苷，命名为黄药大头茶苷A，其结构如下所示：

本发明人发现，该黄药大头茶苷A具有促进鱼多肽的皮肤修复效果。

因此作为进一步优选，所述生物多肽组合物还进一步包含黄药大头茶苷A。

本发明的优点：

本发明的组合物能够显著促进损伤皮肤创面愈合，其作用机制可能是通过促进血管生成，抗氧化损伤，促进胶原生成，诱导干细胞形成，从而促进创面愈合，在皮肤创伤护理上具有很大的应用前景。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

实施例1

制备皮肤修复液1：

将脱脂低值小黄鱼下脚料与蒸馏水混合，添加3％(E/S，以底物重量计)的复合酶，混匀进行水解。

将20g低值鱼下脚料(脱脂)与100mL蒸馏水置于500mL具塞三角瓶中，添加3％(E/S，以底物重量计)的复合酶，混匀。

所述复合酶为按照质量比，风味蛋白酶：木瓜蛋白酶：菠萝蛋白酶为2:1:1组成的复合蛋白酶。

将所述生物多肽制备成0.8％的溶液，备用。

实施例2

制备皮肤修复液2：

制备终浓度为0.8％生物多肽，0.2％黄药大头茶苷A的溶液，备用。

实施例3测试对皮肤的修复功能

创面愈合测试：

实验动物：选择健康雌性BALB/c小鼠50只，8周龄左右，体质量35-40g，分为5组，每组10只，各组之间无统计学差异，直到实验结束没有小鼠死亡。

对照组用3组，不造模的作为空白对照组，用生理盐水作为生理盐水对照组，0.2％黄药大头茶苷A(用少量丁二醇溶解后溶于水中)的水溶液作为黄药大头茶苷A对照组。

组1：空白对照组(不造模)；

组2：生理盐水组(造模)；

组3：0.2％黄药大头茶苷A对照组(造模)；

组4：皮肤修复液1干预组(造模)；

组5：皮肤修复液2干预组(造模)。

小鼠皮肤损伤模型的制备：

用1％戊巴比妥钠按50mg/kg的剂量腹腔注射麻醉小鼠，剪短小鼠背部脊椎两侧被毛，用脱毛膏脱去背部皮肤上毛，生理盐水冲洗干净，暴露皮肤。在脊柱两侧对称位置，用特制打孔器压制成两个创面，直径1.5cm，深至皮下，形成小鼠皮肤机械性损伤模型，模型制备当天记为第0天。造模完成后，进行单笼饲养。

效果测试：全层皮肤切除当天即进行治疗，对组2-4，用无菌棉签分别蘸取生理盐水、皮肤修复液1和2，0.2％黄药大头茶苷A水溶液分两次均匀涂抹于小鼠的皮肤创面上，直至被创面全部吸收，每天早、中、晚各涂抹治疗1次，连续涂抹治疗7d。

创面愈合率测定：每隔1d用游标卡尺测量小鼠创面的大小，计算创面面积和创面的愈合率，创面的愈合率＝(治疗前创面大小-治疗后创面大小)/治疗前创面大小×100％。

计量资料的结果表示为均值±标准差,采用组间t检验。统计所用软件为SPSS17.0，P<0.05为差异有显著性意义。

结果：涂抹第7天和第14天，与生理盐水对照组相比，各治疗组创面面积均有不同程度的缩小。分别计算治疗第7天和第14天的创面愈合率，结果如表1所示：

表1不同组不同时间创面愈合率

	第7d创面愈合率(％)	第14d创面愈合率(％)
			空白对照组	N.D	N.D
生理盐水组	26.45±1.62	50.39±0.85
			黄药大头茶苷A对照组	28.71±1.34	53.63±1.36
皮肤修复液1组	35.75±0.74<sup>*</sup>	65.15±0.96<sup>*</sup>
			皮肤修复液2组	69.53±1.81<sup>*</sup>	83.14±1.43<sup>*</sup>

注：t检验,*：P<0.05(与生理盐水组比较)；N.D：not detect

可见，相对于生理盐水组，2组皮肤修复液组均具有促进创面愈合的效果，皮肤修复液2组具有显著更好的效果，但是单独使用黄药大头茶苷A并没有明显的修复效果。证明黄药大头茶苷A和多肽配合，能促进多肽的修复效果。

VEGF含量分析：

VEGF是受损血管再生的重要调节因子之一，其可以促进血管内皮细胞增殖和迁移，可以维护血管的完整性以及血管生理功能。VEGF在加速新生血管形成，修复创伤组织中重要的，也是特异性的调节因子。我们测定了血清中内VEGF的含量。

取血测试方法：分别测试治疗第7天和第14天取股动脉血约3ml,应用高速离心机3000r/min分离血清，取血保存于超低温冰箱内(-70摄氏度)备用。采用双抗体夹心ELISA法测定。用抗小鼠血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的小鼠VEGF与单抗结合,加入生物素化的抗小鼠VEGF抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,小鼠VEGF浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中小鼠VEGF浓度。

分别测试治疗第7天和第14天的VEGF(ng/L，n＝8，

)，结果如表2所示：

表2不同组不同时间血清中VEGF含量测定结果(

ng/L)

	第7d(ng/L)	第14d(ng/L)
			空白对照组	23.82±1.30	24.05±1.21
生理盐水组	37.44±1.91	46.74±0.65
			黄药大头茶苷A对照组	40.33±1.28<sup>1</sup>	52.63±1.97<sup>1</sup>
皮肤修复液1组	59.45±0.61<sup>1,2</sup>	72.65±0.76<sup>1,2</sup>
			皮肤修复液2组	90.51±1.35<sup>1，2</sup>	128.22±1.11<sup>1,2</sup>

注：t检验,1：P<0.05(与空白对照组比较)；2：P<0.05(与生理盐水组比较)

可见，与正常组比较，生理盐水组小鼠血清中VEGF含量有一定程度的增加；而与对应时间点的模型组比较，皮肤修复液组第7、14d血清中VEGF含量均显著增加(P<0.05)，但是皮肤修复液2组VEGF含量更显著增加。证明黄药大头茶苷A和多肽配合，能促进多肽的修复效果的原因之一可能是促进了VEGF的分泌。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，

若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种促进皮肤损伤修复的生物多肽组合物，其特征在于：

其包括鱼多肽和黄药大头茶苷A；

所述黄药大头茶苷A为3,4-二甲氧基苯酚1-O-β-D-[6-O-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基)]-吡喃葡萄糖苷，其结构如下所示：

所述鱼多肽的制备方法如下：

将脱脂低值鱼下脚料与蒸馏水混合，添加3％以底物重量计的复合酶，混匀进行水解；

2.权利要求1所述的生物多肽组合物，其特征在于，所述鱼多肽的制备方法如下：

将20g脱脂低值鱼下脚料与100mL蒸馏水置于500mL具塞三角瓶中，添加3％以底物重量计的复合酶，混匀进行水解。

3.权利要求2所述的生物多肽组合物，其特征在于，所述水解方法为：在50℃恒温振荡器中酶解300min，待水解完成后，升温至95℃，灭酶10min，冷却至室温，抽滤得到鱼多肽。