CN113698450A - 一种促皮肤修复多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促皮肤修复多肽及其应用，涉及生物医药技术领域，具体地，促皮肤修复多肽中疏水氨基酸的比例为16％～30％，多肽的等电点位0.55～1.00，序列长度为7～14aa，且具有修复皮肤功能，本发明通过合理设计疏水氨基酸的比例、等电点以及适宜的肽链长度，使得多肽可以在酸性和碱性溶剂中均能保持很好的稳定性，具有较强的促进皮肤修复、促进胶原蛋白表达以及抗氧化等功能，能够应用于制备具有促皮肤修复功能的化妆品和药物。

Description

一种促皮肤修复多肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种促皮肤修复多肽及其应用。
背景技术
皮肤是覆盖在人体表面最大的器官，易受多种因素的影响，如外界的物理化学因素、自身激素水平变化和机械压力等。同时，皮肤作为机体与外界的第一道天然屏障，一旦受损，机体就会立即开启生理调节进行皮肤的损伤修复。长久以来，皮肤修复一直是临床外科学中常见问题。
目前市场上的化妆品，主要有两种类型：一是以化学原料为主要成分的化妆品，二是以植物原料为主要成分的化妆品。化学类型的化妆品见效快，但含有激素、果酸、铅汞等有毒有害物质，长期使用将对人体皮肤造成较大的伤害；植物类型的化妆品比较安全、健康，但主要是从皮肤表层补水、补充维生素等营养，营养元素不能深入细胞内部，因此，起效慢，效果不明显。
同上述化妆品相比，添加动物来源生长因子的化妆品具有一定优势，包括BFGF碱性合成纤维生长因子、AFGF酸性纤维生长因子、EGF表皮细胞生长因子、KGF角质细胞生长因子以及干细胞因子等。但EGF是单向地刺激细胞增生，甚至是无序地刺激细胞增生，一味不停地刺激细胞增生可能会导致皮肤细胞出现难于预测的问题，甚至癌变。
因此，序列短小、合成简单、活性高效的促皮肤修复的超短肽越来越受到人们的关注。
《中国药用动物志》记载两栖类动物可入药用于治疗创面，如华西雨蛙具有活血止痛、活血生肌的功效，用于跌打损伤瘀血肿痛出血，外伤伤口久不愈合者；湖蛙(Ranaridibunda)皮肤分泌液粗样涂抹在经人工造创的小鼠皮肤表面，发现它对小鼠的皮肤愈合有明显的促进作用。从2014年首次发现两栖类皮肤修复肽以来(FASEB J.2014,28(9):3919-29)，目前发现的动物来源的促皮肤修复肽有：
红瘰疣螈T.verrucosus皮肤多肽tylotoin(KCVRQNNKRVCK)；云南臭蛙Odorranaandersonii皮肤多肽OA-GL12(GLLSGINAEWPC)，OA-FF10(FFTTSCRSGC),OA-1(IGRDPTWSHLAASCLKCIFDDLPKTHN)；无指盘臭蛙Odorranagrahami皮肤多肽AH90(ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG)，W49(APFRMGICTTN)；中国凹耳臭蛙Odorranatormot皮肤多肽Ot-WHP(ATAWDLGPHGIRPLRPIRIRPLCG)；腹斑倭蛙Nanoranaventripunctata皮肤多肽cathelicidin-NV(ARGKKECKDDRCRLLMKRGSFSYV)；海娃Fejervaryacancrivora皮肤多肽tigerinin-RC1(RVCSAIPLPICH)和tigerinin-RC2(RVCMAIPLPLCH)。
细胞和动物模型研究表明，AH90可以促进细胞的迁移和粘附，促进皮肤损伤动物模型皮肤愈合。通过激活NF-κB和c-Jun细胞信号通路而导致TGF-β的表达上调，进而再通过活化TGF-β的下游Smads通路而发挥一系列的细胞效应。能促进内源性促创伤愈合因子(TGF-β1)的表达而不产生促有丝分裂活性。tylotoin可直接增强角质形成细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的运动和增殖，从而加速创面的再上皮化和肉芽组织形成。也促进转化生长因子的释放β1(转化生长因子-β1)以及白细胞介素6(IL-6)表达。Ot-WHP能显著增加创面中性粒细胞的数量，并适度促进中性粒细胞的吞噬和佛波酯(PMA)诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形成。Ot-WHP能显著增加创面巨噬细胞的数量，并通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子直接诱导巨噬细胞产生趋化因子、细胞因子和生长因子-κB(核因子-κB)信号通路。总的来说，这些多肽可以促进细胞的迁移和粘附、增强角质形成细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的运动和增殖、直接诱导巨噬细胞产生调节因子，促进皮肤伤口愈合。
这些多肽都具有促皮肤修复的功能，但是它们在药品、化妆品产品应用时都有诸多缺点，例如无法应用于制备化妆品或制备化妆品时存在稳定性和分散性不足等缺陷，无法有效地发挥其促进皮肤修复的功效。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促皮肤修复多肽及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种多肽，所述多肽中疏水氨基酸的比例为16％～30％，多肽的等电点位0.55～1.00，序列长度为7～14aa，且具有修复皮肤功能。
第二方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其编码如前述实施例所述的多肽。
第三方面，本发明实施例提供了一种载体，其包括如前述实施例所述的分离的核酸。
第四方面，本发明实施例提供了一种宿主细胞，其包括如前述实施例所述的载体。
第五方面，本发明实施例提供了一种多肽的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞，或人工合成如前述实施例所述的多肽。
第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸在制备具有促进受损皮肤修复的药物或化妆品中的应用。
第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸在制备具有促进皮肤胶原蛋白增生和/或抗衰老的药物或化妆品中的应用。
第八方面，本发明实施例提供了一种化妆品，其包括：如前述实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸。
第九方面，本发明实施例提供了一种药物组合物，其包括：如前述实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过合理设计多肽中疏水氨基酸的比例、等电点以及适宜的肽链长度，使得多肽可以在酸性和碱性溶剂中均能保持很好的稳定性，具有较强的促进皮肤修复、促进胶原蛋白表达以及抗氧化等功能，能够应用于制备促皮肤修复的化妆品和药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的RW3在强酸、强碱环境中的稳定性；
图2为试验例1中RW3在动物模型中的促皮肤修复活性；
图3为试验例4中RW3治疗第3天创口皮肤巨噬细胞的募集；
图4为试验例5中促皮肤修复肽RW3可促进紫外胁迫下的胶原蛋白含量表达。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例还提供了一种多肽，所述多肽中疏水氨基酸的比例为16％～30％，多肽的等电点位0.55～1.00，序列长度为7～14aa，且具有修复皮肤功能。
经一系列创造性，本发明发现满足上述特征的多肽可以在酸性和碱性溶剂中均能保持很好的稳定性，具有较强的促进皮肤修复、促进胶原蛋白表达以及抗氧化等功能，且生产成本低。
本文中的“疏水氨基酸的比例”同“疏水比例”，是指疏水氨基酸占多肽的比例，疏水比例具体可以为16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
本文中的“等电点”是指一个分子表面不带电荷时的pH值。多肽是由氨基酸通过肽键连接而形成的化合物，其等电点与其所含的酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量比例相关。在本发明设置的等电点的范围内，多肽能够同时在酸性环境和碱性环境下保持稳定。
在一些实施例中，等电点可以为0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或1.00。
本文中的“aa”指代氨基酸。在一些实施例中，序列的长度可以为7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa或14aa。
优选地，所述筛选标准包括：疏水比例为16％～30％，等电点为0.65～0.85，序列长度为9～12aa。在优选范围内，筛选得到的多肽能更有效地发挥其促进皮肤修复的功效。
优选地，所述多肽的氨基酸序列如式1所示：
式1：X1-FRMG-X2-CTM-X3；
其中，X1选自：AM、AP、MP和P中的任意一种；
X2选自：I或M；
X3选自：-、M和N中的任意一种。需要说明的是X3为“-”表示X3的位点没有氨基酸。优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1～8中任一项所示。具体地，SEQIDNo.1为AMFRMGICTMN所示；SEQIDNo.2为AMFRMGMCTMN；SEQIDNo.3为APFRMGICTMN；SEQIDNo.4为MPFRMGICTMN；SEQIDNo.5为MPFRMGMCTMN；SEQIDNo.6为MPFRMGMCTMM；SEQIDNo.7为PFRMGMCTM；SEQIDNo.8为PFRMGMCTMN。
优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其编码如前述任意实施例所述的多肽。
本发明实施例还提供了一种载体，其包括如前述实施例所述的分离的核酸。
在一些实施例中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。
本发明实施例还提供了一种宿主细胞，其包括如前述实施例所述的载体。
宿主细胞具体可以为真核生物细胞或原核生物细胞。
本发明实施例还提供了一种多肽的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的宿主细胞，或人工合成如前述任意实施例所述的多肽。
培养宿主细胞的条件可基于常规的技术尝试获取，只要满足宿主细胞表达多肽即可，不再赘述。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸在制备具有促进受损皮肤修复的药物或化妆品中的应用。
本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸在制备具有促进皮肤胶原蛋白增生和/或抗衰老的药物或化妆品中的应用。
本发明实施例还提供了一种化妆品，其包括：如前述任意实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸。
在一些实施例中，所述化妆品还可以包括其辅助剂，如多元醇、甘油、动物油、矿物油和植物油中的至少一种；矿物油进一步优选为液体凡士林或石蜡油；植物油进一步优选为鳄梨油、豆油或澳洲坚果油；动物油进一步优选为羊毛脂。
在一些实施例中，所述辅助剂还可以包括使得化妆品成型、稳定或具有色泽、香型、防腐作用的物质，如表面活性剂、香精或香料、颜料、色素以及防腐剂。
在一些实施例中，所述化妆品还可以包括常用的其他化妆品原料，如其他蛋白、其他多肽、植物提取物、细胞因子和维生素中的至少一种。
本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括：如前述任意实施例所述的多肽或如前述实施例所述的分离的核酸。
所述药物还包括医学上可接受的载体，如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了促皮肤修复多肽RW3，为一种直链多肽，氨基酸全序列的一级结构为：Met-Pro-Phe-Arg-Met-Gly-Ile-Cys-Thr-Met-Asn(MPFRMGICTMN)。
所述促皮肤修复肽RW3的制备方法，具体步骤如下：
1、根据设计的氨基酸序列：Met-Pro-Phe-Arg-Met-Gly-Ile-Cys-Thr-Met-Asn，用固相合成法合成得到粗多肽；
2、将粗多肽通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，鉴定其纯度，直到多肽的纯度不低于95％；
HPLC纯化及鉴定方法：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm，胶粒大小5μm，孔径大小为100A)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长215nm，25℃下测定。
3、通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量为1300.6Da；
方法：将纯化后的多肽溶于去离子水中，配置成1μmol/mL的溶液，取10μL与等体积的饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％三氟醋酸的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液，离心，取上清液)混合后测定。
4、通过等电聚焦电泳测定纯化后的多肽的等电点为8.25，并采用自动氨基酸测序仪测定纯化后多肽的氨基酸序列结构，确定为Met-Pro-Phe-Arg-Met-Gly-Ile-Cys-Thr-Met-Asn。
5、所述促皮肤修复肽RW3的酸碱稳定性。
在强度较大酸碱水解情况小考察RW3的稳定性。酸降解条件：1N HCl/室温/30min；碱降解条件1N NaOH/室温/30min。在上述条件下，处理1mg/ml的RW3。用前述HPLC鉴定方法鉴定RW3在强酸、强碱溶液中的稳定性。
实验如图1，室温下，1mg/ml RW3在1M的HCl中孵育30分钟，样品稀释10倍测定色谱行为，与对照相(图1中A)比色谱行为没有改变，未出现新杂质峰(图1中B)。室温下，RW3在1M的NaOH中孵育30分钟，测定色谱行为。样品稀释10倍测定色谱行为，与对照相比色谱行为没有改变，未出现新杂质峰(图1中C)。说明设计的促皮肤修复肽RW3在强酸、强碱环境中具有很好的稳定性。
6、所述促皮肤修复肽RW3在脂性物质中的分散性。
以多肽在RW3在羊毛脂中均一性和分散性测定为例。1000g取羊毛脂、RW3多肽1000mg，室温与SHW/R型移动式高剪切乳化机中混合均匀，搅拌速度120转/min，搅拌30分钟。混匀后，分装成5ml每管。这种条件下RW3的理论含量为1mg/g。取分装20管，精密称取适量1g混合物(约相当RW3 0.1mg 10ml)量瓶中，加20％乙醇溶液，使溶解(必要时超声使溶解)并稀释至刻度，精密量取2ml用Folin酚发进行蛋白定量。实验表明20份样品中RW3的平均含量为0.95±0.08mg/g，且每分样品含量范围均在理论含量的90％以内。
说明设计的促皮肤修复肽RW3在脂性环境中具有很好的分散性。
所述促皮肤修复肽RW3可用于受损表皮的修复与再生药物的制备，以及促进皮肤胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化护肤品的开发。
实施例2-8
实施例2-8分别提供了一种多肽及其制备方法，制备方法大致实施例1相同，区别在于序列不同，实施例2-8提供的多肽的氨基酸序列具体如下：
RW0：AMFRMGICTMN(SEQIDNo.1)；
RW1：AMFRMGMCTMN(SEQIDNo.2)；
RW2：APFRMGICTMN(SEQIDNo.3)；
RW4：MPFRMGMCTMN(SEQIDNo.5)；
RW5：MPFRMGMCTMM(SEQIDNo.6)；
RW6：PFRMGMCTM(SEQIDNo.7)；
RW7：PFRMGMCTMN(SEQIDNo.8)。
对比例1-11
对比例1-11分别提供了一种促进皮肤修复多肽，序列见表1。
表1皮肤修复多肽的序列和性质
多肽 序列 疏水性比例 等电点 PH7时电荷
对比例1 OA-GL12 GLLSGINAEWP 35.71％ 4.00 -1.24
对比例2 OA-FF10 FFTTSCRSG 32.22％ 8.25 0.75
对比例3 Tylotoin KCVRQNNKRVCK 16.67％ 10.33 4.74
对比例4 OA-1 IGRDPTWSHLAASCLKCIFDDLPKTHN 33.33％ 6.9 -0.08
对比例5 AH90 ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG 41.67％ 10.26 1.84
对比例6 W49 APFRMGICTT 30.00％ 8.25 0.75
对比例7 Ot-WHP ATAWDLGPHGIRPLRPIRIRPLC 39.13％ 11.52 2.84
对比例8 cathelicidin-NV ARGKKECKDDRCRLLMKRGSFSY 17.39％ 9.89 4.74
对比例9 tigerinin-RC1 RVCSAIPLPIC 45.45％ 8.07 0.74
对比例10 tigerinin-RC2 RVCMAIPLPLC 45.45％ 8.07 0.74
对比例11 Purin-WH9 VVPTVVCPK 44.44％ 8.22 0.75
实施例1 RW3 MPFRMGICTMN 18.18％ 8.25 0.75
试验例1
促皮肤修复肽RW3对小鼠皮肤损伤模型的伤口愈合作用实验。
随机选取6-8周大(20g左右)昆明小鼠用1％戊巴比妥钠溶液腹腔注射(100μL/20g)麻醉后，用剪刀尽量剪净其背部毛发。酒精消毒后，在其背部用打孔器开两个直径8mm的创口。以PBS溶液为空白对照组；鼠源EGF(mEGF，100μg/mL)及人源EGF(hEFG，20μg/ml)为阳性对照；RW3(20μg/mL)为实验组；EGF和RW3均用PBS溶液配制。每天给药两次，每次20μL。样品加在右侧创面，左侧创面加相应的空白/阳性对照。每两天用相机拍下创面变化，直到加药创面完全脱痂愈合为止。拍照时用量尺比照创口作标尺。
如图2所示，在为期8天的创面结果观察中可以看出，促皮肤修复肽RW3浓度为20μg/ml对创伤愈合效果明显优于浓度为100μg/ml鼠源mEGF及20μg/ml人源hEGF，可见RW3具备显著提高伤口修复能力。故此促皮肤修复肽可应用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物、减少疤痕产生、加快疤痕修复领域。
试验例2
溶血性测定实验。
将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108细胞/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液分别与溶解于生理盐水的促皮肤修复肽RW3样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝(A样品-A阴性对照)/A阳性对照×100％。
表2促皮肤修复肽RW3溶血活性
Figure BDA0003171080100000111
HC10和HC50分别是引起人红细胞溶血10％和50％的多肽浓度。Hmax是最高肽浓度(320)下溶血的百分比(％)μg/mL)。
结果表明：促皮肤修复肽RW3在浓度为320μg/ml时的溶血率只有0.62％。说明RW3溶血活性极低，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在皮肤修复的化妆品添加剂领域进一步的开发应用。
试验例3
细胞毒性测定实验。
用MTT法检测该组促皮肤修复肽RW3对人皮肤成纤维细胞HFF-1毒性。
人皮肤成纤维细胞HFF-1购于昆明细胞库。先将成纤维细胞于含有15％胎牛血清以及双抗(青霉素和链霉素各100U/ml)的DMEM中培养，待细胞长满后，用0.25％的胰蛋白酶消化下来，用上述培养基洗两次，重新悬浮细胞，细胞计数后将细胞悬浮液100μl加入到96孔细胞培养板中，使每孔细胞数达到105个。加入样品，对照组加入相同体积的灭菌超纯水，置37℃，5％CO2培养箱内培养24h。培养结束后，96孔细胞培养板每孔加入20μL 5mg/ml MTT溶液(用细胞培养PBS缓冲液配制)，继续培养5h，用注射器吸出孔中液体，每孔加入100μLDMSO，用移液枪吹打几次使紫色结晶完全溶解。酶标仪检测光吸收，测定波长490nm，参考波长630nm。
表3促皮肤修复肽RW3对HFF-1细胞的毒性
RW3浓度(μg/ml) 细胞毒性％
1 0.00
50 1.25±0.21
200 2.26±0.38
结果如表3所示，表明促皮肤修复肽RW3浓度为160μg/ml时的细胞毒性只有5.14％，说明促皮肤修复肽RW3对人皮肤成纤维细胞细胞毒性非常小，对人体正常皮肤细胞不会产生伤害，因此十分利于其进一步的开发应用。
试验例4
多肽RW3对巨噬细胞的募集的影响。
巨噬细胞是创面愈合的重要细胞，其作用贯穿整个创面修复过程，它不但清除吞噬坏死组织、病原微生物和异物，而且分泌多种细胞因子趋化修复细胞、刺激细胞增殖、胶原沉积、促进血管化和肉芽新生。为了研究RW3对巨噬细胞在创口的募集的影响，于治疗后的第3天取创面组织，制备石蜡切片，切片厚3μm，用小鼠成熟巨噬细胞的特异性F4/80抗体，检测了巨噬细胞在创口募集的情况。
结果如图3所示：治疗后3天，RW3治疗组巨噬细胞的募集明显高于对照，募集的巨噬细胞数量比对照高出两倍左右，差别具有极其显著性。说明RW30可以促进巨噬细胞在创口的募集。巨噬细胞是创伤愈合中结束炎症期，启动修复期的细胞。在伤口愈合的微环境中，它分泌TGF-β、PDGF、FGF、IL-1、TNF-α等细胞因子，这些因子刺激成纤维细胞的增殖及血管的形成，促进细胞功能活化，大量合成胶原蛋白、弹性纤维和纤连蛋白，并间接的参与胶原的合成和降解过程。因此RW3促进巨噬细胞在创口募集的作用，将有利于胶原蛋白的合成与创伤的愈合。
试验例5
Western blotting电泳法检测胶原蛋白I蛋白表达实验。
人皮肤成纤维细胞(HFF-1)用含有15％胎牛血清的DMEM培养基培养至生长对数期，用0.25％胰酶消化后，以105个/ml接种于6孔板中，每孔2ml。在37℃的CO2培养箱中过夜培养使细胞贴壁，待细胞密度长至80％左右，将培养基吸去，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2-3次。加入10ug/ml样品，空白加入2％血清DMEM处理24h后采用长波紫外线UVA(320nm-400nm)紫外进行照射处理，细胞处理完毕后再换为无血清DMEM培养基继续培养24h。然后弃去细胞上层培养液，1000g离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两次。每孔细胞内加入250ulRIPA细胞裂解液，冰上裂解30min。4℃，12000g离心20min，小心吸取上清，并将上清分装至新的塑料管，吸取2ul用Bradford法测定蛋白浓度。40ug裂解产物在8％的SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，5％牛血清白蛋白封闭2h；加特异一抗，一抗(Col1、MMP-1)(1∶2000)购自Cell Signaling Technology公司，GAPDH(1∶3000)购自ComWin Biotech公司，按说明书操作，4℃孵育过夜；TBST(39g Tris，89gNaCl，0.29g KCl，0.5％Tween，定容至1000ml，用浓HCl调节PH至7.4)洗涤3次，每次5min；然后加辣根过氧化酶(HRP)标记羊抗兔抗体常温孵育1h，二抗购自Cell Signaling Technology公司，TBST洗涤3次，每次5min；暗室中加入显色液显色。
蛋白表达结果如图4所示，结果表明：在外界环境胁迫情况下(UVA＝10.8J/cm2照射)，I型胶原蛋白含量显著低于正常细胞，加药组，即10ug/ml促皮肤修复肽RW3可以提高损伤组的胶原蛋白含量至正常组。并有效抑制胶原蛋白水解酶MMP-1的蛋白表达。由此说明RW3能够有效促进胶原蛋白表达并抑制其水解，从而促进细胞的迁移，利于皮肤修复。因此，促皮肤修复肽RW3在皮肤修复及再生、刺激皮肤细胞胶原蛋白分泌，防止皮肤老化、粗糙的抗衰老等美容领域具备较好的开发前景。
试验例6
抗氧化活性测定实验
(1)DPPH自由基清除活性(DPPH radical scavenging assay)。
称取一定量的DPPH(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate，Sigma，美国)，用甲醇溶解，配成6×10-5M的溶液，现配现用。将48μl DPPH溶液和2μl样品(2mg/ml)混合(最终样品与DPPH的质量比为3∶1)，室温下避光静置30min，于517nm处测定吸光值。空白对照组以样品溶解介质代替待测样品。实验做三个平行，紫外分光光度计调零时使用甲醇。
DPPH·清除率(％)＝(AB-AA)/AB×100(AB：空白对照组吸光值；AA：样品组吸光值)。
(2)ABTS.+自由基正离子清除活性。
ABTS(3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid)(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)用PBS缓冲液(pH7.4)配成2mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70mM过硫酸钾(K2S2O8)水溶液按体积比250∶1混合，于室温避光放置15-16h。试验开始前，将ABTS.+释至734nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4μl不样品和96μl上述校正过的ABTS.+溶液混合，室温放置10min后，于734nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做3次重复。
ABTS.+清除率I(％)＝(AB-AA)/AB×100(AB：空白对照组吸光值；AA：样品组吸光值)。
3)还原力测定。
取10μl样品(2mg/ml)与50μl磷酸钠缓冲液以及50μ11％K3Fe(CN)6混合，50℃水浴20min；然后加入50μl 10％的三氯乙酸，3000rpm离心10min；取上清50μl，加入50μl去离子水和10μl 1％FeCl3。于700nm测光吸收。光吸收越强表示还原力越强。
表4促皮肤修复肽RW3体外抗氧化活性
Figure BDA0003171080100000151
促皮肤修复肽RW3体外抗氧化活性结果如表4所示。促皮肤修复肽RW3浓度为2mg/ml时，其DPPH自由基清除率可达到58.6％、ABTS·+正离子自由基清除率可以达到73.7％；具备显著的清除自由基作用，可直接防止胶原蛋白等生物大分子免受其损伤。故此促皮肤修复肽RW3可有效解除氧化应激对细胞的损伤，有助于促进皮肤修复，应用于制备治疗体表创伤、烧伤、皮肤溃疡药物、减少疤痕产生、加快疤痕修复等皮肤修复与再生美容护肤品等领域。
试验例7
依照实施例1-8制备获得多肽，并检测比较多肽的皮肤修复活性，检测结果如表5所示。
表5多肽促皮肤修复活性
Figure BDA0003171080100000161
由表5可知，相对于实施例2-8提供的多肽而言，实施例1提供的RW3的促皮肤修复活性最好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川丽妍工坊生物科技有限公司
<120> 一种促皮肤修复多肽及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ala Met Phe Arg Met Gly Ile Cys Thr Met Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ala Met Phe Arg Met Gly Met Cys Thr Met Asn
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Pro Phe Arg Met Gly Ile Cys Thr Met Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Pro Phe Arg Met Gly Ile Cys Thr Met Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Pro Phe Arg Met Gly Met Cys Thr Met Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Met Pro Phe Arg Met Gly Met Cys Thr Met Met
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Pro Phe Arg Met Gly Met Cys Thr Met
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Pro Phe Arg Met Gly Met Cys Thr Met Asn
1 5 10

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽中疏水氨基酸的比例为16％～30％，多肽的等电点位0.55～1.00，序列长度为7～14aa，且具有修复皮肤功能。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如式1所示；
式1：X1-FRMG-X2-CTM-X3；
其中，X1选自：AM、AP、MP和P中的任意一种；
X2选自：I或M；
X3选自：-、M和N中的任意一种；
优选地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1～8中任一项所示。
3.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的多肽。
4.一种载体，其特征在于，其包括如权利要求3所述的分离的核酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，其包括如权利要求4所述的载体。
6.一种多肽的制备方法，其特征在于，其包括：培养如权利要求5所述的宿主细胞，或人工合成如权利要求1或2所述的多肽。
7.如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求3所述的分离的核酸在制备具有促进受损皮肤修复的药物或化妆品中的应用。
8.如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求3所述的分离的核酸在制备具有促进皮肤胶原蛋白增生和/或抗衰老的药物或化妆品中的应用。
9.一种化妆品，其特征在于，其包括：如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求3所述的分离的核酸。
10.一种药物组合物，其特征在于，其包括：如权利要求1或2所述的多肽或如权利要求3所述的分离的核酸。
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