RU2669933C2 - Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения - Google Patents
Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2669933C2 RU2669933C2 RU2015152106A RU2015152106A RU2669933C2 RU 2669933 C2 RU2669933 C2 RU 2669933C2 RU 2015152106 A RU2015152106 A RU 2015152106A RU 2015152106 A RU2015152106 A RU 2015152106A RU 2669933 C2 RU2669933 C2 RU 2669933C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- preparation
- regeneration
- peptide
- skin
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 126
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 33
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 114
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 36
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 12
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 11
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 11
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 10
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- -1 for example Proteins 0.000 description 6
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 6
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 5
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 231100000691 up-and-down procedure Toxicity 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 101600105505 Mus musculus Vascular endothelial growth factor C (isoform 1) Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010058667 Oral toxicity Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 231100000460 acute oral toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001869 matrix assisted laser desorption--ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000418 oral toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 208000012313 wound discharge Diseases 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине, а именно к фармацевтике, и может быть использовано для создания препарата для регенерации тканей организма. Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи состоит из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ получения препарата заключается в гидролитическом расщеплении коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Полученный препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека. Использование изобретений позволяет ускорить регенерацию тканей кожи за счет более оптимального диапазона молекулярных масс фракции активных пептидов, снизить токсичность препарата. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 8 пр.
Description
Изобретение относится к области удовлетворения жизненных потребностей человека и может быть использовано в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии для регенерации тканей организма.
Известны природные пептиды и их синтетические аналоги, стимулирующие процессы регенерации тканей кожи при травматических повреждениях и дегенеративных заболеваниях.
Известны синтетические линейные и циклические пептиды - фрагменты эпидермального фактора роста человека, обладающие ранозаживляющей и противоопухолевой активностями [1]. Существенными недостатками [1] являются трудоемкость этапов химического синтеза и очистки пептидов, токсичность применяемых для синтеза реактивов и растворителей, что ограничивает область применения аналога [1].
Известны природные пептиды - факторы роста эндотелия сосудов, например, изоформа С, стимулирующая деление клеток, образование кровеносных сосудов и, как следствие, усиливающая регенерацию тканей [2]. Существенным недостатком [2] является трудоемкость процесса получения пептидов, требующего генетическую модификацию клеток-продуцентов, многоэтапное выделение и очистку целевых пептидов [2], что требует привлечения высококвалифицированных специалистов и специализированного оборудования.
Недостатки существенно ограничивают области применения [1] и [2].
Наиболее близким к заявляемому изобретению, прототипом, является препарат пептидов, получаемых в результате ферментативного расщепления коллагена и/или желатина смесью не менее двух протеолитических ферментов (эндопептидаз). Препарат по прототипу [3] состоит из разных фракций пептидов из коллагена в диапазоне молекулярных масс (далее по тексту - ММ) от 600 до 3500 дальтон (далее по тексту - Да) со средней ММ в диапазоне от 1700 до 2300 Да. Отношение значений максимальной и минимальной молекулярных масс пептидов по прототипу [3] составляет (3500:600=5,8 раза), что характеризует препарат по прототипу [3] как полифракционный. Полифракционный состав пептидов по прототипу [3], значительно различающихся по ММ и, следовательно, по структуре и регенеративной активности пептидных молекул является существенным недостатком [3]. Полифракционный состав и, следовательно, пониженная гомогенность препарата по прототипу [3] приводит к его недостаточной регенеративной активности для целевого применения. Повышению регенеративной активности способствует высокая гомогенность по молекулярной массе пептидов в препарате, используемом, например - в медицине для регенерации тканей кожи.
Существенным недостатком прототипа [3] является необходимость применения не менее двух типов эндопептидаз для получения препарата пептидов. Применение нескольких (не менее двух) типов эндопептидаз для получения препарата пептидов усложняет его реализацию в промышленном масштабе и ограничивает область применения прототипа [3].
Препарат по прототипу [3] вводят в организм человека для улучшения состояния кожных покровов перорально. Не показана полезность [3] при иных способах применения, например - при наружном. Не выявлен механизм действия и не оценена безопасность (токсичность) препарата по прототипу [3], что ограничивает его применение в качестве лекарственного средства, например - при регенерации тканей кожи. В совокупности, недостатки прототипа [3] существенно ограничивают области его применения.
Для расширенного применения пептидного препарата из коллагена в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии существенными факторами являются:
- оптимальный для проявления регенеративной активности препарата диапазон ММ пептидов и, следовательно, их (пептидов) структур;
- монофракционность (близкие значения ММ) состава препарата;
- возможность получения препарата путем упрощенного однофакторного гидролитического расщепления коллагена;
- выявленные механизм действия и безопасность (токсичность) препарата пептидов.
Целью предполагаемого изобретения является создание биоактивного пептидного препарата с отличным от прототипа и более оптимальным для ускоренной регенерации тканей кожи диапазоном молекулярных масс (ММ) пептидов из коллагена, упрощение производства и расширение области применения препарата.
Цели достигают созданием пептидного препарата из коллагена для регенерации тканей кожи, состоящего из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ получения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат получают путем гидролитического расщепления коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон. Способ применения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека.
Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируют примеры.
ПРИМЕР ПЕРВЫЙ, показывающий способ получения пептидного препарата из бычьего коллагена
Изобретение реализуют с использованием в качестве субстрата (полипептида) для гидролитического расщепления, например - бычьего денатурированного коллагена (желатина), например - производства компании Gelita (Германия). Проводят анализ молекулярных масс (структуры) желатина стандартным методом электрофореза в полиакриламидном геле [4]. По результатам анализа желатина подтверждают наличие в нем типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, соответствующей одиночным (отдельным) полипептидным цепям коллагена (Фиг. 1). На Фиг. 1 показана электрофореграмма стандартов молекулярных масс белков в диапазоне ММ от 10 до 250 килодальтон (ряд 1, Фиг. 1) и основных фракций коллагена - альфа-, бета- и гамма-фракции (ряд 2, Фиг. 1). При наличии типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, процесс получения пептидного препарата продолжают.
Бычий денатурированный коллаген растворяют при нагревании, например - при плюс 60°C, в буферном растворе, например - в фосфатно-солевом буферном растворе (далее по тексту - ФСБ) при рН в диапазоне значений рН от 6,0 до 8,0 с концентрацией (коллагена) не более 30,0% для обеспечения оптимальной вязкости раствора. Проводят гидролитическое однофакторное расщепление коллагена в приготовленном растворе одним из известных способов, например, реакцией с одной из эндопептидаз, например - с трипсином из поджелудочной железы млекопитающих в концентрации не более 3,0%. Расщепление коллагена проводят при контролируемой температуре, например - при плюс 37°C. По завершению гидролитического расщепления эндопептидазу инактивируют, например - добавлением раствора 1 М соляной кислоты. Проводят очистку продуктов гидролитического расщепления одним из известных способов (методов), например:
1) диализа, например - через полупроницаемую полимерную мембрану; или
2) гель-проникающей хроматографии, например - с использованием сорбента марки Сефадекс на хроматографе BioLogic LP (Bio-Rad Laboratories, США); или
3) микрофильтрации, например - на установке тангенциальной поточной фильтрации Cogent М1 TFF System (Merck Millipore, США).
Способы (методы) очистки продуктов гидролитического расщепления не ограничиваются вышеперечисленными.
В результате получают фракцию пептидов из коллагена с молекулярной массой преимущественно (не менее 95%) в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон (Да), изначально - в виде прозрачного водного раствора, без запаха. Полученная фракция пептидов представляет собой заявляемый пептидный препарат из коллагена (далее по тексту - препарат), где не менее 95% молекул обладают молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 Да. На Фиг. 2 показана электрофореграмма стандартов молекулярных масс белков в диапазоне ММ от 10 до 250 килодальтон (ряд 1, Фиг. 2) и заявляемого пептидного препарата (ряд 2, Фиг. 2). Пептидный препарат на электрофореграмме (ряд 2, Фиг. 2) образует единственную полосу, соответствующую отдельной фракции пептидов. На Фиг. 3 показан масс-спектр пептидного препарата, полученный методом матрично-ашвированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ-массспектрометрия) на спектрометре MALDI-TOF/TOF ultrafleXtrme (Bruker Daltonik GmbH, Германия). На Фиг. 3 по горизонтальной оси показан параметр масса/заряд (m/z) для пептидных молекул (заявляемого препарата), численно соответствующий значениям их (пептидных молекул) ММ, по вертикальной оси - интенсивность параметра m/z. Результаты (Фиг. 2 и Фиг. 3) доказывают, что полученный по заявляемому изобретению пептидный препарат состоит из одной гомогенной фракции пептидов - продуктов гидролитического расщепления коллагена - с ММ преимущественно в диапазоне от 3600 до 10000 Да. При значениях массы молекул пептидов вне пределов указанного диапазона (при ММ менее 3600 и при ММ более 10000 Да) препарат проявляет существенно меньшую активность, чем препарат с молекулами пептидов в пределах указанного диапазона масс (от 3600 до 10000 Да).
Вышеуказанные молекулярные массы пептидов в заявляемом препарате существенно отличаются от молекулярных масс пептидов по прототипу [3], следовательно - пептиды в заявляемом препарате отличаются от прототипа [3] по числу входящих в их состав аминокислот, по своей структуре и, следовательно - по химическим и биологическим свойствам.
В отличие от прототипа [3] заявляемый пептидный препарат состоит из одной гомогенной (однородной) фракции пептидов с существенно меньшим отношением значений максимальной и минимальной масс пептидов (10000:3600=2,8 раза), чем у прототипа (3500:600=5,8 раза) [3], что характеризует заявляемый препарат как монофракционный по составу пептидов.
В отличие от прототипа [3] пептидный препарат по заявляемому изобретению получают однофакторным (одностадийным) гидролитическим расщеплением коллагена, что существенно упрощает процесс производства (препарата) и реализацию заявляемого способа в промышленном масштабе.
Полученный по заявляемому способу пептидный препарат стерилизуют, например - путем фильтрации через полимерные стерилизационные фильтры с размером пор не более 400 нм. Для длительного (не менее 6 месяцев) сохранения структуры и регенеративной активности (препарата) заявляемый препарат замораживают и хранят при температуре, например - при минус 24°C. Для более длительного (не менее 24 месяцев) сохранения структуры и регенеративной активности (препарата) заявляемый препарат высушивают с использованием одного из известных способов, например - путем лиофилизации на установке Free Zone Plus (Labconco, США), и хранят при температуре, например - плюс 4…8°C. Заявляемый препарат упаковывают и хранят в стерильных емкостях. Заявляемый препарат применяют по целевому назначению. Заявляемый препарат вводят в состав лекарственных форм. Заявляемый препарат вводят в состав лечебно-косметических форм.
Заявляемый способ получения пептидного препарата из коллагена не ограничивается использованием бычьего денатурированного коллагена в качестве исходного субстрата для гидролитического расщепления. Способ реализуют с применением любых иных субстратов (полипептидов), содержащих типичные для коллагена полипептидные цепи (Фиг. 1) и их фрагменты.
В совокупности, вышеуказанные преимущества заявляемого пептидного препарата, по сравнению с прототипом [3], существенно упрощают и расширяют возможности промышленного производства заявляемого препарата, расширяют области его (заявляемого препарата) применения, например - в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии для регенерации тканей кожи.
ПРИМЕР ВТОРОЙ, показывающий способ получения пептидного препарата из свиного коллагена
Изобретение реализуют с использованием в качестве субстрата для гидролитического расщепления иного полипептида, например - свиного нативного коллагена производства компании Sigma-Aldrich (США). Подтверждают аналогичным описанному в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем наличие в свином коллагене типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции (Фиг. 1). При наличии типичных для коллагена фракций, например - альфа-фракции, процесс получения пептидного препарата продолжают.
Пептидный препарат из свиного коллагена получают аналогичным описанному в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем. Пептидный препарат из свиного коллагена характеризуют аналогичными, описанными в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ, методами электрофореза в полиакриламидном геле и МАЛДИ-масс-спектроскопии. Результаты показывают, что полученный по заявляемому способу пептидный препарат из свиного коллагена состоит из одной гомогенной фракции пептидов - продуктов гидролитического расщепления коллагена - с ММ в диапазоне от 3600 до 10000 Да.
Таким образом, получаемый описанным в ПРИМЕРЕ ПЕРВОМ путем пептидный препарат из бычьего коллагена характеризуется одинаковым диапазоном ММ с пептидным препаратом, получаемым аналогичным путем из свиного коллагена. Следовательно, препараты гомологичны по структуре, химическим и биологическим свойствам. Результаты доказывают возможность получения заявляемого пептидного препарата из нативного и денатурированного коллагенов различных видов теплокровных животных.
ПРИМЕР ТРЕТИЙ, показывающий стимулирующее действие пептидного препарата на митотическую активность фибробластов
Используют фибробласты мыши линии NIH ЗТЗ, полученные от компании АТСС (США). Фибробласты культивируют в стандартных стерильных условиях: питательная среда а-МЕМ, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 5% CO2, температура плюс 37°С [5]. Фибробласты рассеивают в 96-ти луночные планшеты в количестве 2000 клеток в каждую лунку и культивируют 24 часа. Полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат добавляют к фибробластам в лунки до конечной концентрации (препарата) не менее 0,1 нг/мл и культивируют клетки в течение 72 часов. Для оценки механизма действия заявляемого препарата в качестве препарата сравнения в лунки добавляют рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека, например - производства ООО Компании "ПанЭко" (Россия). Выбор природного фактора роста фибробластов в качестве препарата сравнения обусловлен его максимально возможным сродством с клеточными рецепторами, следовательно максимально достижимой стимуляции митотической активности фибробластов [6].
Оценивают число живых клеток в лунках - показатель пролиферативной (митотической) активности (клеток) - с помощью МТТ-теста [7] на микропланшетном анализаторе Infinite 200 PRO (Тесап, Швейцария) По величине оптического сигнала продукта восстановления реагента МТТ (Promega, США). Уровень стимуляции пролиферативной активности клеток рассчитывают в процентах от контроля (клетки, выращенные без добавления пептидного препарата или препарата сравнения).
На Фиг. 4.1 показано влияние заявляемого пептидного препарата в различных концентрациях (С) на пролиферативную активность мышиных фибробластов линии ЗТЗ по истечении 72 часов культивирования. На Фиг. 4.2 показано влияние фактора роста фибробластов на пролиферативную активность мышиных фибробластов линии ЗТЗ по истечении 72 часов культивирования. На Фиг. 4 по горизонтальной оси показан логарифм концентрации заявляемого препарата и препарата сравнения (log С), по вертикальной оси уровень стимуляции пролиферативной активности клеток в процентах (%) от контроля.
Результаты показывают, что максимальная стимуляция пролиферативной активности под действием полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемого пептидного препарата составляет 19% (Фиг. 4.2). Максимальная стимуляция пролиферативной активности препаратом сравнения (фактором роста фибробластов) составляет 21% (Фиг. 4.1). Различия в стимулирующем эффекте заявляемого пептидного препарата и препарата сравнения находятся в пределах ошибки опыта, поэтому - эффекты сопоставимы. Как видно из Фиг. 4.1 и Фиг. 4.2, заявляемый пептидный препарат и природный фактор роста фибробластов проявляют сходный дозозависимый стимулирующий эффект на пролиферативную активность фибробластов (Фиг. 4). Таким образом, заявляемый пептидный препарат приводит к максимально достижимой митотической активности фибробластов, что свидетельствует о сродстве пептидов в препарате к клеточным рецепторам природного фактора роста. Это раскрывает отсутствующий в описании прототипа [3] механизм действия заявляемого пептидного препарата, что является его (пептидного препарата) существенным преимуществом для применения в медицине и фармацевтике.
ПРИМЕР ЧЕТВЕРТЫЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на синтетическую активность фибробластов
Выявляют стимулирующее действие полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемого пептидного препарата на синтетическую активность (способность синтезировать биомолекулы) клеток, например мышиных фибробластов линии NIH ЗТЗ, полученных от компании АТСС (США). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ТРЕТЬЕМУ, но культивируют фибробласты в 24-х луночных планшетах в течение 48 часов, фиксируют клетки раствором 4% параформальдегида и окрашивают выявляющими коллаген гистохимическими красителями, например - анилиновым синим/пикриновой кислотой [8]. Для оценки механизма действия заявляемого препарата в качестве препарата сравнения в контрольные лунки добавляют рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека, например - производства ООО Компании "ПанЭко" (Россия). Проводят микроскопирование окрашенных фибробластов, например - на световом микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении 400х.
На Фиг. 5.1 показаны световые микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением заявляемого препарата, по истечении 48 часов культивирования. На Фиг. 5.2 показаны микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде с добавлением фактора роста фибробластов, по истечении 48 часов культивирования. На Фиг. 5.3 показаны микрофотографии фибробластов, выращенных в питательной среде без добавления заявляемого препарата/препарата сравнения, по истечении 48 часов культивирования (контроль).
На Фиг. 5.1 видно, что пептидный препарат повышает интенсивность гистохимического окрашивания фибробластов, что свидетельствует о сопоставимом с действием фактора роста фибробластов повышении внутриклеточного синтеза белков, например - предшественников коллагена (Фиг. 5.2). Таким образом, заявляемый пептидный препарат приводит к максимально достижимой синтетической активности фибробластов, что свидетельствует о сродстве пептидов в заявляемом препарате к клеточным рецепторам природного фактора роста. Повышение синтеза клетками белков, например - коллагена, является существенным преимуществом препаратов для регенерации соединительной ткани (дермы) кожи [9].
ПРИМЕРЫ ТРЕТИЙ и ЧЕТВЕРТЫЙ показывают, что полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат до максимально достижимого уровня повышает активность фибробластов: стимулирует их (фибробластов) пролиферативную и синтетическую активности, сопоставимые (в пределах ошибки опыта) с действием природного фактора роста фибробластов. Это свидетельствует о сродстве пептидов в составе заявляемого препарата к клеточным рецепторам фактора роста, что раскрывает, в отличие от прототипа [3], механизм действия заявляемого препарата и существенно расширяет области его (заявляемого препарата) применения.
ПРИМЕР ПЯТЫЙ, иллюстрирующий готовые формы пептидного препарата
5.1. Получают сыпучие твердые (порошковые) формы пептидного препарата по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ с разной степенью дисперсности, например - путем сублимационного, распылительного или конвективного высушивания без ограничения ими. На Фиг. 6.1 показан заявляемый пептидный препарат в форме порошка, полученный путем сублимационного высушивания. Порошковая форма заявляемого препарата по потребности содержит вспомогательные вещества, например - антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, неорганические или органические сорбенты, без ограничения ими, или их (вспомогательных веществ) композиции. Порошковую форму заявляемого препарата упаковывают, например - в пакеты-саше, без ограничения ими, и используют в качестве присыпки для регенерации раневых дефектов кожи.
5.2. Приготавливают жидкие формы заявляемого пептидного препарата растворением получаемых по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидов в водном солевом растворе в диапазоне концентраций препарата, например - от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Жидкая форма заявляемого препарата (Фиг. 6.2) по потребности содержит вспомогательные вещества, например - антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, спирт(ы), пропиленгликоль, глицерин, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сывороточный альбумин, без ограничения ими, или их (вспомогательных веществ) композиции. Для сохранения структуры и регенеративной активности пептидного препарата его жидкую форму дополнительно подвергают сублимационному высушиванию с последующим перерастворением в стерильном физиологическом растворе, например - 0,9% водном растворе хлорида натрия. Жидкую форму заявляемого препарата используют для регенерации кожи, например - в виде смачивающего раствора или виде аэрозоля (Фиг. 6.2).
5.3. Приготавливают мягкие формы, например - гели/мази для наружного применения с полученным по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидным препаратом путем смешивания препарата с образующими гель/мазь: синтетическим полимером, например - полимером акриловой/метакриловой кислоты, полиэтиленоксидом, поливиниловым спиртом, или с образующим гель природным полимером, например - полисахаридом, коллагеном, желатином, или путем смешивания препарата с липофильным компонентом, например углеводородами, липидами, силиконом, без ограничения вышеуказанными веществами. Мягкая форма заявляемого препарата (Фиг. 6.3) по потребности содержит вспомогательные вещества, например антимикробные средства, обезболивающие средства, микроэлементы, спирт(ы), увлажняющие вещества (пропиленгликоль, глицерин, полипропиленгликоль), сывороточный альбумин, ароматизаторы, красители, без ограничения ими. Мягкую форму заявляемого препарата используют, например - упакованную в тубу или шприц (Фиг. 6.3), для регенерации кожи (см. ПРИМЕРЫ ШЕСТОЙ, СЕДЬМОЙ).
Аналогичным путем приготавливают лечебно-косметические формы с полученным по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидным препаратом, например - твердые, жидкие, гелевые/мазевые формы, производные формы, например - стик, пластырь, губная помада, без ограничения ими.
ПРИМЕР ШЕСТОЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителия кожи
Используют лабораторных животных, например - 12 крыс-самцов линии Вистар массой 300±25 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ). Исследуют влияние заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителиальной ткани кожи, например на модели эксцизионной раны кожи. Проводят предоперационную наркотизацию животных изофлураном (4%, 2 мин, 1 л/мин) с помощью системы ингаляционной наркотизации (Abbott Laboratories, США). Вырезают на спине животного участок кожи диаметром (далее по тексту - 
) 12 мм. Ограничивают края раны силиконовой шиной (внутренний 0=12 мм, внешний 0=25 мм, толщина=0,5 мм) и фиксируют (шины) скобами с помощью степлера для кожи Appose™ ULC 35W (Covidien, США) для предотвращения затягивания раны за счет закрывания краев [10]. Готовят гель для наружного применения (см. ПРИМЕР ПЯТЫЙ), содержащий полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ пептидный препарат с конечной концентрацией пептидов (0,1% по массе), гелеобразователь - карбоксиметилцеллюлозу фармацевтического класса (2% по массе), антимикробный компонент (композиция пенициллина и стрептомицина). Животным опытной группы наносят на поверхность раны содержащий пептидный препарат гель объемом 200 мкл. Животным контрольной группы наносят равный объем (200 мкл) геля, содержащего карбоксиметилцеллюлозу (2% по массе) и антимикробный компонент (композиция пенициллина и стрептомицина). Проводят прижизненную перфузию (500 мл, 4% формалин в 1* ФСБ) и осуществляют забор тканевых образцов путем иссечения скальпелем участка раны в зоне травмы с захватом окружающей ткани (3 мм от края раны). Тканевые образцы фиксируют в растворе 4% формалина. Из образцов по стандартной методике [11] готовят криосрезы толщиной 7 мкм, окрашивают гематоксилин-эозином (ООО Biovitrum, РФ) и проводят гистологический анализ морфологического строения регенерировавшего эпидермиса кожи на микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).
На Фиг. 7 приведены окрашенные гематоксилин-эозином микрофотографии срезов кожи в зоне эпителизации (центр раны), демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию эпителиальной ткани кожи. На Фиг. 7 видно, что в зоне раны, обработанной содержащим заявляемый препарат гелем, по истечении 7-ми суток формируются слои эпителиальных клеток разной толщины (указаны стрелками). В аналогичных условиях в обработанной гелем без пептидного препарата (контроль) зоне раны слои эпителиальных клеток не выявляются; выявляется только раневое отделяемое. Это подтверждает стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на процесс восстановления эпителиальной ткани. Стимуляция формирования эпителия после травмы кожи является, по сравнению с прототипом [3], существенным преимуществом заявляемого препарата, так как дополнительно способствует восстановлению нижележащей соединительнотканной дермы кожи (см. ПРИМЕР СЕДЬМОЙ).
ПРИМЕР СЕДЬМОЙ, показывающий стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи
Используют лабораторных животных, например - 12 крыс-самцов линии Вистар массой 300±25 г (ООО «Питомник» Российской Академии медико-технических наук, РФ). Выполняют действия по ПРИМЕРУ ШЕСТОМУ, но исследуют регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи при действии заявляемого пептидного препарата в форме геля для наружного применения. Готовят по стандартной методике [11] криосрезы толщиной 7 мкм. Интенсивность синтетической активности фибробластов в регенерирующей дерме выявляют путем окрашивания коллагеновых волокон по Ван-Гизону [11]. Проводят гистологический анализ морфологического строения регенерировавшей дермы кожи на микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия).
На Фиг. 7 приведены микрофотографии окрашенных гематоксилин-эозином срезов кожи в центре раны, демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительной ткани (дермы) кожи. На Фиг. 7 видно, что в зоне раны, обработанной содержащим пептидный препарат гелем, по истечении 7-ми суток формируется плотная сетчатая структура, состоящая из компонентов межклеточного матрикса. В аналогичных условиях в зоне раны, обработанной гелем без пептидного препарата (контроль), формируется менее плотная структура, содержащая меньшее количество межклеточного матрикса. Это свидетельствует о более быстром, по сравнению с контролем (гель без пептидного препарата), протекании процесса восстановления соединительной ткани кожи.
На Фиг. 8 приведены микрофотографии окрашенных по методу Ван-Гизона срезов кожи в зоне раны, демонстрирующие стимулирующее действие заявляемого препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию соединительнотканных волокон (дермы) кожи. Видно, что применение геля с заявляемым пептидным препаратом, в отличие от контроля (гель без пептидного препарата), способствует более интенсивному формированию в образующейся дерме кожи коллагеновых волокон, окрашенных в красный цвет. Образование коллагеновых волокон свидетельствует о более выраженной синтетической активности фибробластов, выделяющих молекулы внеклеточного матрикса [6]. Вышеописанные результаты доказывают стимулирующее действие заявляемого пептидного препарата на процессы заживления раны и восстановления тканей кожи.
Таким образом, ПРИМЕРЫ СЕДЬМОЙ И ВОСЬМОЙ доказывают, что полученный по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ заявляемый пептидный препарат в форме геля для наружного применения стимулирует процессы регенерации эпителиальной и соединительной тканей кожи. В прототипе [3] показан оздоравливающий эффект на кожные покровы только при ограниченном, пероральном, использовании препарата [3] и не продемонстрирована его (прототипа) эффективность при наружном применении для лечения травмы кожи. Заявляемый же препарат применим при различных способах введения, например - наружном, пероральном, что является существенным преимуществом заявляемого препарата для восстановления кожи. Ускорение процессов регенерации и восстановления тканей кожи заявляемым пептидным препаратом является его существенным преимуществом перед прототипом [3], что позволяет рекомендовать заявляемый пептидный препарат к применению для регенерации и улучшения состояния тканей кожи.
ПРИМЕР ВОСЬМОЙ, показывающий отсутствие пероральной токсичности заявляемого пептидного препарата
Выявляют отсутствие острой, при однократном пероральном (внутрижелудочном) введении, токсичности заявляемого препарата на лабораторных теплокровных животных, например - здоровых половозрелых белых крысах линии Вистар: самках массой 210±20 г и самцах массой 300±25 г, полученных, например - из сертифицированного питомника лабораторных животных ООО «Питомник Российской академии медико-технических наук».
Выполняют токсикологические исследования в соответствии с российскими и европейскими правилами этичного и гуманного обращения с лабораторными животными [12, 13]. Содержат животных в соответствии с санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию лабораторных животных [14]. Кормят животных сертифицированным брикетированным кормом в соответствии с действующими нормами [14, 15]. Перед проведением исследований животных в течение 14 суток выдерживают в условиях вивария - для акклиматизации и карантина. Содержат животных в одиночных клетках при температуре +20°C и относительной влажности воздуха 60%.
Распределяют животных в опытные (5 самцов и 5 самок) и контрольные (5 самцов и 5 самок) группы. В ночь перед опытом животных оставляют без пищи в свободном доступе к воде. Принимают дозу в 2000 мг на кг массы животного в качестве максимальной для перорального введения в соответствии с ограниченным пероральным тестом для малотоксичных веществ [15, 16]. Готовят в соответствии с массой животных навески заявляемого пептидного препарата, полученного по ПРИМЕРУ ПЕРВОМУ, растворяют навеску в 2 мл стерильного физиологического раствора (0,9% водный раствор хлорида натрия); полученные растворы вводят опытным животным канюлей. Контрольным животным аналогично вводят по 2 мл стерильного физиологического раствора (0,9% водный раствор хлорида натрия). Наблюдение за животными осуществляют в течение 15 суток.
Оценивают общее состояние животных в контрольных и опытных группах, например - двигательную активность, объем потребления корма и воды, состояние слизистых оболочек, шерстного и кожного покрова. Производят взвешивание животных перед началом и после введения пептидного препарата и ежедневно в восстановительный период (в течение стандартных 14-ти суток). Масса тела животных в опытных и контрольных группах достоверно не различается; потребление воды, пищи и двигательная активность экспериментальных животных соответствует физиологической норме согласно [17].
Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии признаков острой токсичности заявляемого препарата. Летальная доза LD50 заявляемого препарата при внутрижелудочном введении превышает максимально испытанную и допустимую для однократного внутрижелудочного введения животным [16] дозу (2000 мг на один кг массы животного). Заявляемый препарат при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 2000 мг на один кг массы животного не оказывает токсического действия и по показателям общего состояния животных является безопасным для теплокровных животных и человека.
ПРИМЕР ВОСЬМОЙ свидетельствует об отсутствии острой токсичности заявляемого пептидного препарата и возможности его (препарата) перорального применения, наряду с его (препаратом) наружным применением (см. ПРИМЕРЫ ШЕСТОЙ, СЕДЬМОЙ), что в отличие от прототипа [3] существенно расширяет области его (заявляемого препарата) применения в медицине, фармацевтике, ветеринарии и косметологии.
Приведенные примеры применения предполагаемого изобретения показывают его полезность, выражающуюся в применении пептидного препарата из коллагена для регенерации тканей кожи и лечения раневых дефектов. Более высокая, по сравнению с прототипом [3], и сопоставимая с действием природного фактора(ов) роста эффективность полученного в соответствии с предполагаемым изобретением пептидного препарата для регенерации тканей кожи является одним из существенных преимуществ предполагаемого изобретения.
Заявляемое техническое решение является неочевидным, соответствует предъявляемым к изобретениям критериям новизны, так как при анализе идентифицированных источников информации не выявлены иные препараты пептидов с признаками, совпадающими с отличительными преимущественными признаками предполагаемого изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, поскольку его можно реализовать в промышленном производстве (используются продукты крупнотоннажной переработки коллагенсодержащего сырья) и в деятельности организаций здравоохранения посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.
Заявленное техническое решение поясняется следующими материалами. Комментарии к Фигурам - в тексте описания.
На Фиг. 1 показана электрофореграмма коллагена в полиакриламидном геле.
На Фиг. 2 показана электрофореграмма пептидного препарата в полиакриламидном геле.
На Фиг. 3 показан МАЛДИ-масс-спектр пептидного препарата.
На Фиг. 4 показано влияние пептидного препарата и фактора роста фибробластов на пролиферативную активность фибробластов.
На Фиг. 5 показано влияние пептидного препарата и фактора роста фибробластов на синтетическую активность фибробластов.
На Фиг. 6 приведены готовые формы пептидного препарата для наружного применения.
На Фиг. 7 и 8 приведены результаты гистологического исследования влияния пептидного препарата в форме геля для наружного применения на регенерацию тканей кожи in vivo.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. United States Patent US 5183805 A. Bioactive EGF peptides for promotion of tissue regeneration and cancer therapy [Текст] | Board Of Regents, The University Of Texas System, J.S. Lee, M. Blick. - Опубл. 02.02.1993.
2. United States Patent WO 1998033917 A1. Vascular endothelial growth factor с (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof [Текст] | K. Alitalo, V. Joukov, Ludwig Inst. Cancer Res., Univ. Helsinki Licensing. - Опубл. 06.08.1998.
3. United States Patent US 20130252899 A1 Collagen hydrolysate for use to improve the health of human skin, hair and/or nails [Текст] / S. Hausmanns, M. Giesen-Wiese, S. Oesser, Gelita AG, Eberbach (DE). - Опубл, 26.09.2013.
4. Техническое руководство Bio-Rad Laboratories, Inc. "2A guide to polyacrylamide gel electrophoresis and detection", (www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf).
5. L. Rittie, G.J. Fisher Isolation and culture of skin fibroblasts || Methods Mol. Med. 2005, Vol. 117, P. 83-98.
6. Bikfalvi, S. Klein, G. Pintucci, D.B. Rifkin. Biological roles of fibroblast growth factor-2 || Endocrine Reviews, 1997, 18(1), p. 26-45.
7. Техническое руководство Promega "CellTiter 96® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay".
8. Микроскопическая техника: Руководство | Под. ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. 544 с. (-С. 424).
9. Т. Wong; J.A. McGrath; Н. Navsaria. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration // The British Journal of Dermatology, 2007; 156(6): 1149-1155.
10. Galliano, R.D. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing / R.D. Galliano, J. Michaels, M. Dobryansky, J.P. Levine, G.C. Gurtner || Wound repair and regeneration. 2004, V. 12 (4), P. 485-492.
11. Э. Пирс Гистология. - M.: Иностранная литература, 1962, 964 с.
12. Приказ Минвуза СССР №742 от 13.11.1984. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
13. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Text with EEA relevance, http://eur-lex.europa.eu/legalcontent/EN/TXT/?uri=celex:32010L0063.
14. Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г., №708н «Об утверждении правил лабораторной практики», http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html.
15. Миронов, А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстакова, М.В. Журавлева, В.К. Лепахин, Н.В. Коробов, В.А. Меркулов, С.Н. Орехов, И.В. Сакаева, Д.Б. Утешев, А.Н. Яворский. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
16. OECD. Guidelines for the testing of chemicals. Acute Oral Toxicity - Up-and-Down-Procedure (UDP). 2008. - 27 p.
17. Трахтенберг, И.М. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте (Современные представления и методические подходы, основные параметры и константы) / И.М. Трахтенберг, Р.Е. Сова, В.О Шефтель и др. - М.: Медицина, 1978. - 176 с.
Claims (3)
1. Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, состоящий из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон.
2. Способ получения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат получают путем гидролитического расщепления коллагена с образованием фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3600 до 10000 дальтон.
3. Способ применения препарата по п. 1, заключающийся в том, что препарат применяют для регенерации тканей кожи животных и человека.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015152106A RU2669933C2 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015152106A RU2669933C2 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015152106A RU2015152106A (ru) | 2017-06-13 |
| RU2669933C2 true RU2669933C2 (ru) | 2018-10-17 |
Family
ID=59067979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015152106A RU2669933C2 (ru) | 2015-12-07 | 2015-12-07 | Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2669933C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794766C1 (ru) * | 2022-05-13 | 2023-04-24 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Композиционный биоматериал, обладающий гемостатической и регенеративной активностью (варианты) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114146219B (zh) * | 2021-12-29 | 2023-04-18 | 上海璞聚生物科技有限公司 | 一种软组织填充物及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264062B1 (en) * | 2005-06-15 | 2007-09-04 | Edgardo Ham | Remotely operable fire-fighting vehicle |
| RU2428196C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2011-09-10 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс |
| US20150111308A1 (en) * | 2004-11-23 | 2015-04-23 | The Johns Hopking University | Compositions comprising modified collagen and uses therefor |
-
2015
- 2015-12-07 RU RU2015152106A patent/RU2669933C2/ru not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150111308A1 (en) * | 2004-11-23 | 2015-04-23 | The Johns Hopking University | Compositions comprising modified collagen and uses therefor |
| US7264062B1 (en) * | 2005-06-15 | 2007-09-04 | Edgardo Ham | Remotely operable fire-fighting vehicle |
| RU2428196C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2011-09-10 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Способ получения биологически активного комплекса и биологически активный белково-полипептидный комплекс |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MATSUDA N. et al. Effects of Ingestion of Collagen Peptide on Collagen Fibrils and Glycosaminoglycans in the Dermis//Journal of Nutritional Science and Vitaminology Vol. 52 (2006), N 3, P. 211-215. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2794766C1 (ru) * | 2022-05-13 | 2023-04-24 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет" (ФГАОУ ВО КФУ) | Композиционный биоматериал, обладающий гемостатической и регенеративной активностью (варианты) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015152106A (ru) | 2017-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Burnett et al. | Hemostatic properties and the role of cell receptor recognition in human hair keratin protein hydrogels | |
| He et al. | A novel gene recombinant collagen hemostatic sponge with excellent biocompatibility and hemostatic effect | |
| Deptuła et al. | Development of a peptide derived from platelet-derived growth factor (PDGF-BB) into a potential drug candidate for the treatment of wounds | |
| JP6861298B2 (ja) | 脱毛防止又は発毛促進用注射用組成物 | |
| LoPresti et al. | Effect of source animal age upon macrophage response to extracellular matrix biomaterials | |
| RU2687151C2 (ru) | Тетрапептиды, полученные из с-х-с-хемокинов человека, подходящие для лечения различных состояний кожи | |
| US20220280680A1 (en) | Coated silk films, methods for the production thereof and uses thereof | |
| CN1997408A (zh) | 包含角蛋白的伤口护理产品 | |
| JP2022513418A (ja) | ペプチド成分の皮膚再生および治癒混合物とその使用 | |
| Poranki et al. | Assessment of deep partial thickness burn treatment with keratin biomaterial hydrogels in a swine model | |
| Loo et al. | Discovery of hyperstable noncanonical plant-derived epidermal growth factor receptor agonist and analogs | |
| CN101679495B (zh) | 用于细胞学和免疫学调节的短的生物活性肽 | |
| Zhang et al. | Kcnh2 and Kcnj8 interactively regulate skin wound healing and regeneration | |
| Ramos et al. | Wound healing modulation by a latex protein-containing polyvinyl alcohol biomembrane | |
| RU2646804C1 (ru) | Офтальмологическое средство для регенерации роговицы глаза | |
| RU2669933C2 (ru) | Пептидный препарат из коллагена для регенерации тканей кожи, способ его получения и применения | |
| Li et al. | Egg White peptide KPHAEVVLR promotes skin fibroblasts migration and mice skin wound healing by stimulating cell membrane Hsp90α secretion | |
| Sarian et al. | A review with updated perspectives on in vitro and in vivo wound healing models | |
| Woo et al. | Preparation of UV-curable gelatin derivatives for drug immobilization on polyurethane foam: development of wound dressing foam | |
| ES2383299T3 (es) | Extracto de cornamenta de ciervo | |
| CN114949174A (zh) | Cst-14在制备糖尿病皮肤溃疡、破损治疗药物中的应用 | |
| CN114716515A (zh) | 一种多肽类似物及其制备方法和应用 | |
| Hackethal et al. | Human placenta laminin-111 as a multifunctional protein for tissue engineering and regenerative medicine | |
| RU2809459C1 (ru) | Дезамидированный коллагеновый биоматрикс и способ его получения | |
| CN109091413A (zh) | 一种透皮性a型肉毒毒素、其制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA92 | Acknowledgement of application withdrawn (lack of supplementary materials submitted) |
Effective date: 20171012 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20180426 |