CN116942554A - 一种控油祛痘精华液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种控油祛痘精华液及其制备方法，该精华液的活性成分包括维A酸多肽偶联物、透明质酸抗菌肽偶联物、植物提取物。维A酸多肽偶联物能够加快上皮细胞增殖分化、抗炎和抑制皮脂腺的分泌、具有良好的皮肤渗透性，且使用后不会出现如如皮肤干燥、脱屑、瘙痒、烧灼感、炎症后色素沉着等不良反应。透明质酸钠多肽偶联物的生物相容性良好，具有良好的细菌生物膜穿透性与抗菌性能。植物提取物能够增强活性表皮层的机能，加速肌肤屏障修复，防止色素沉着。三者由内到外发挥抗炎抗菌效果，同时兼顾良好的保湿性，从而修复受损肌肤，达到保湿祛痘的效果。
Description
技术领域
本发明属于护肤品技术领域，具体涉及一种控油祛痘精华液及其制备方法。
背景技术
痘，医学名痤疮，又名粉刺，其病因与激素水平的分泌、角质代谢、皮脂腺分泌旺盛、痤疮丙酸杆菌的感染有关。临床上治疗痤疮使用的产品主要是外用维A酸类药物、过氧化苯甲酰或外用抗生素等，使用过多皮肤会出现过敏及局部红斑、脱屑、灼烧感等刺激性反应，对皮肤造成二次伤害。同时，痤疮丙酸杆菌存在耐药性并对多种抗生素交叉耐药，目前抗生素并不能完全清除痤疮丙酸杆菌。抗菌肽是由阳离子亲水性氨基酸和疏水性氨基酸组成的短肽化合物，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等具有广谱抗菌作用，是先天免疫系统的重要组成部分，主要通过与磷脂双分子层作用，物理破坏细菌的细胞膜而起到杀菌作用。这使细菌很难对其产生耐药性，令其有望成为新型抗生素。但天然抗菌肽无选择性地破坏细胞膜，导致溶血性较高，生物相容性不好，且因长度较短，结构不稳定，易被环境降解，无法直接作为抗菌剂使用。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供一种控油祛痘精华液，该精华液的活性成分包括药物多肽偶联物，多糖抗菌肽偶联物。其中药物多肽偶联物利用了维A酸酰化抗炎多肽N端，使得原来较低皮肤渗透性的多肽能够深入皮肤角质层与维A酸发挥协同消炎祛痘的作用；另外多糖抗菌肽偶联物在皮肤外表表面发挥高抗菌活性。两种活性物质协同内外对受损肌肤进行治疗。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
一种控油祛痘精华液，包括如下重量份数的组分：
维A酸多肽偶联物0.1~0.8份、透明质酸钠多肽偶联物1-5份、植物提取物0.5~5份、EDTA二钠0.05-1份、尿囊素0.1-1份、二丙二醇3-8份、羟乙基纤维素0.01-1份、对羟基苯乙酮0.1-0.5份、木糖醇基葡糖苷0.1-2份、丙二醇20-40份和甘油辛酸酯1-6份，纯净水100~300份。
所述植物提取物包括以下重量百分比的组分：辛酸/癸酸甘油三酯65-75％、向日葵籽油8-20％、红花提取物4-8％、栀子花提取物2-6％、菊花提取物2-6％、梅花提取物2-6％、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.05-0.2％。
所述维A酸多肽偶联物具有如下结构：RD-Ile-Asn-Leu-Arg-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Val-Arg-Lys-Ile-Leu-OH；该多肽为抗炎肽BMP14。
制备方法如下：
S1：树脂经活化、脱保护后，首先加入Fmoc-Leu-OH进行反应，得到Fmoc-Leu-树脂；所述树脂选自Wang树脂、Rink Amide MBHA 树脂、Rink Amide AM 树脂中的一种。脱保护剂为哌啶/DMF溶液（20/80 v/v）；
S2：按照抗炎肽BMP14氨基酸序列从第二个异亮氨酸开始到第14个异亮氨酸逐步固相偶联氨基酸，得到：Fmoc-Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；多肽缩合剂为苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和二异丙基乙胺(DIEA)。
S3：脱Fmoc保护后加入维A酸酰氯，得到：RD-Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；所述维A酸酰氯为维A酸由草酰氯反应得到；
S4:用含有三氟乙酸的切割液切割，并采用高效液相色谱纯化，得到：RD-Ile-Asn-Leu-Arg-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Val-Arg-Lys-Ile-Leu-OH。
所述透明质酸钠多肽偶联物制备方法如下：
乙烯基修饰的透明质酸与抗菌肽通过巯基-乙烯基点击反应制备得到。所述抗菌肽具体为：Arg-Cys-Ala-Ser-Ser-Cys-Gly-Ala-Lys。
有益效果：
本发明提供的精华液含有多种活性成分，包括维A酸多肽偶联物、透明质酸钠多肽偶联物、植物提取物等。维A酸多肽偶联物能够加快上皮细胞增殖分化、抗炎和抑制皮脂腺的分泌、具有良好的皮肤渗透性，且使用后不会出现如如皮肤干燥、脱屑、瘙痒、烧灼感、炎症后色素沉着等不良反应。透明质酸钠多肽偶联物的生物相容性良好，具有良好的细菌生物膜穿透性与抗菌性能。植物提取物能够增强活性表皮层的机能，加速肌肤屏障修复，防止色素沉着。三者由内到外发挥抗炎抗菌效果，同时兼顾良好的保湿性，从而修复受损肌肤，达到保湿祛痘的效果。
附图说明
图1为维A酸多肽偶联物的质谱图。
图2为维A酸多肽偶联物抗炎效果RT-PCR电泳照片结果。
图3为抗菌肽的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
制备维A酸多肽偶联物。
1、称取2g Rink Amide AM树脂（交联1m/m%二乙烯基苯，取代度为0.5mmol/g，200目），放入多肽合成管中，加入13mL DMF和2mL蓖麻油酸浸泡15min后，将多肽合成管连在真空泵上抽干溶液，得到活化的树脂；
2、向活化的树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的树脂；
3、将5mmol Fmoc-Leu-OH，6mmol HBTU，6mmol HOBT混合，加入25mL DMF完全溶解，再加入10mmol DIEA，25℃下，避光静置活化5min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入脱保护的树脂中，用N2吹动搅拌，25℃下反应3h后，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到Fmoc-Leu-树脂；脱保护剂为哌啶/DMF溶液（20/80 v/v）；
4、向Fmoc-Leu-树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的Leu-树脂；
5、将5mmol Fmoc-ILe-OH，6mmol HBTU，6mmol HOBT混合，加入25mLDMF完全溶解，再加入10mmol DIEA，25℃下，避光静置活化5min，得到活化的氨基酸溶液；将活化的氨基酸溶液加入Leu-树脂中，用N2吹动搅拌，25℃下反应3h后，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到Fmoc-ILe-Leu-树脂；
6、按照4和5的步骤依次连接Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(Boc)2-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Arg(Boc)2-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Ile-OH。
7、向Fmoc-Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu- Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂中加入10mL脱保护剂，25℃下，N2吹动搅拌反应10min，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各20mL洗涤树脂3次，每次5min，得到脱保护的Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala- Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；
8、向Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val- Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂中加入2.5mmol异维A酸酰氯、3mmol DIEA、30mL DCM，25℃下，N2吹动搅拌反应20min后，抽滤去除溶液，依次用DCM、甲醇、DMF各40mL洗涤树脂3次，每次5min，用N2吹干，得到RD-Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala- Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；
9、向RD-Ile-Asn-Leu-Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val- Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂中加入切割液，放入冰水浴中搅拌反应3h，使用砂芯漏斗过滤除去树脂，将滤液在35℃下浓缩至体积不再减少，加入35倍滤液体积的冷冻无水乙醚沉淀多肽，4℃静置40min，4000r/min离心3min，弃去上清，得到沉淀，沉淀用纯水溶解后，冷冻干燥，得到多肽产品。切割液为95wt%TFA的水溶液。
Rink Amide AM树脂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
【纯化及鉴定】：将0.1mg待测样品溶于1mL含有0.1％三氟醋酸的超纯水中，若有不溶解的杂质，用0.45μm滤膜过滤，流动相A为0.1％三氟醋酸-水，流动相B为0.1％三氟醋酸-乙腈，待基线平稳后开始上样，上样量为50μL；色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(4.6mm×300mm)，采用二元流动相梯度洗脱系统，进行梯度洗脱，即在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％-80％按线性关系增长，流速1mL/min，检测波长215nm，25℃下测定，得到纯度95％以上的产品。
用Thermo Scientific LCQ Fleet离子肼对偶联物的纯品进行质谱鉴定，分析计算质谱结果，确定目的产物所在峰。质谱条件如下：离子源：ESI；鞘气流速：20psi；辅气流速：8psi；扫气流速：5psi；喷雾电压：4.5KV；毛细管温度：275℃；毛细管电压：35V；套管透镜电压：110V。质谱图见图1，由图看出，偶联的纯品的相对分子量为1906.68。
【皮肤刺激性试验】
将异维A酸和实施例1制备的维A酸多肽偶联物作为活性物质分别制备成凝胶，组分为：活性物质0.05wt%，甘油8wt%、丙二醇26wt%、卡波姆2wt%，其余为水。
将6周龄(18～20g)的BALB/c小鼠分组，每组雌雄各半，分笼饲养。用皮肤标记笔在每只小鼠背部近头部和近尾部各标记一块1.5cm×1cm大小区域，两区域间隔约1.5cm。分别称取约0.03g凝胶涂于上述小鼠的标记区(近头部区域涂含活性物质的凝胶，近尾部区域涂空白凝胶)，每天用药1次，连续用药21天。观察小鼠皮肤变化并记录局部皮肤反应。皮肤反应评分等级：0分为局部无可见反应；0.5分为隐约可见红斑、脱屑；1分为轻度红斑、脱；2分为中度红斑、脱屑；3分为重度红斑、脱屑。平均刺激分值=所有观察动物当天的局部刺激分值之和÷观察动物数，结果列于表1。
表1：平均刺激分值
【抗炎效果】
将HaCaT角质形成细胞接种到6孔板中，培养基为10%FBS的DMEM液体培养基，然后在37℃和5% CO2中培养24h后用新鲜培养基进行更换，加入50μg/ml的痤疮丙酸杆菌、50μM的水杨酸处理细胞48h，然后分别加入2μM的维A酸多肽偶联物和异维A酸对经处理的细胞进行处理，然后在相同条件下培养24h，然后通过RT-PCR分析确认活性物质对参与炎症形成的IFN-Y、IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α基因的表达的作用，RT-PCR电泳照片结果参阅附图2。
实施例2
制备透明质酸钠多肽偶联物。
抗菌肽Arg-Cys-Ala-Ser-Ser-Cys-Gly-Ala-Lys系委托艾柏森(北京)生物科技有限公司合成，采用常规的固相合成方法。
称取20.13g透明质酸钠溶于500mL 50mmol/L的碳酸氢钠溶液中，置于0℃冰浴中，搅拌溶解后，加入9.3g EDC·HCl和11.03g NHS，搅拌至完全溶解后，加入1.42g 3-丁烯-1-胺，冰浴下搅拌反应12h，反应结束后反应液在离子水通过截留分子量为5000的透析袋透析3d，冷冻干燥后得到乙烯基改性透明质酸；称取上述乙烯基改性透明质酸重新溶于500mL二甲亚砜中，加入抗菌肽，超声分散10min后，加入DMPA，在紫外灯照射下反应15min，通过截留分子量为5000的透析袋透析3d，冷冻干燥后得到透明质酸钠多肽偶联物。抗菌肽、乙烯基改性透明质酸、DMPA的投料质量比例为4：3：1。
所述透明质酸钠的粘均分子量为105~106Da，购于镇江市东元生物科技有限公司。
抗菌肽Arg-Cys-Ala-Ser-Ser-Cys-Gly-Ala-Lys的质谱图参阅附图3。
【抑菌活性】
测试抗菌肽以及透明质酸钠多肽偶联物的MIC，评价其抑菌活性。试验菌为痤疮丙酸杆菌ATCC11827和金黄色葡萄球菌ATCC25923：购自中国典型培养物保藏中心。
对痤疮丙酸杆菌MIC的测试方法如下：将105 CFU/ mL的菌悬液接种至96孔板中，每孔加入不同浓度的抗菌肽或透明质酸钠多肽偶联物溶液和等体积的细菌悬浮液。1×PBS为阴性对照，1×PBS和细菌悬浮液混合物为阳性对照。培养6h后点板，厌氧袋密封后于37℃培养72h后计数。计数菌群数和抑菌率（=1-试验组菌落数/阳性对照菌落数），MIC定义为随抗菌剂浓度的增加，抑菌率增加至90%时所对应的最低抗菌剂浓度。
对金黄色葡萄球菌MIC的测试方法如下：将105 CFU/ mL的菌悬液接种至96孔板中，每孔加入不同浓度的抗菌肽或透明质酸钠多肽偶联物溶液和等体积的细菌悬浮液。培养12h后加入刃天青水溶液，继续培养3h。根据颜色变化直接确定其MIC，粉红色表示存在活细菌，紫色意味着没有活细菌存在。
抗菌肽以及透明质酸钠多肽偶联物对实验菌的MIC结果列于表2。
表2：MIC，单位μg/mL
【溶血实验】
将新鲜兔血离心分离得到红细胞，用Tris缓冲液洗涤红细胞至上清液澄清；用Tris缓冲液配制不同浓度的抗菌肽溶液和透明质酸钠多肽偶联物溶液；两种试样溶液与红细胞悬浮液分别在37℃下孵育1h后，分别将各样品溶液与红细胞混合；混合物经离心分离后，将上清液和Tris缓冲液移至孔板。使用酶标仪测量540 nm处吸光度。纯水作为阳性对照，Tris缓冲液作为阴性对照。计算溶血率=（试验组吸光度-阴性对照吸光度）/（阳性对照吸光度-阴性对照吸光度），结果列于表3。
表3：溶血率，单位%
配置不同组分的精华液，配方列于表4。
表4：精华液配方
植物提取物包括以下重量百分比的组分：辛酸/癸酸甘油三酯65.8％、向日葵籽油8％、红花提取物8％、栀子花提取物6％、菊花提取物6％、梅花提取物6％、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.2％。
【精华液控油效果测试】
测试各个配方面霜的控油效果，采用人体试验，受试对象为25~50岁的成年人，每个样品30人，采用皮肤油脂测试仪Sebumeter SM815进行测试，具体方法如下：
选择受试者额头，清洁后，分左右两部分标记为试验区域和空白区域；使用皮肤油脂测试仪测试同一区域3～5次，取平均值，记为起始值；在受试者实验部位涂抹样品（0.2g），受试者使用面霜1h、6h、12h后，使用皮肤油脂测试仪分别测量试验区域和空白区域3～5 次，取平均值；统计测得的数值，计算抑脂率ΔF%=（空白区域油脂含量-试验区油脂含量）/空白区域油脂含量，结果列于表5。
表5：抑制率，单位%
【精华液祛痘效果评价】
受试对象为I~III级痤疮患者，年龄25~50岁的成年人，每个试样且每个级别患者为一组，一组为20人；具体测试方法如下：受试者温水界面后，涂抹本发明精华液（每次0.2g），每天使用两次，隔12h一次，使用30天后，统计疗效。
采用Pillsburg四级改良分级法评定疗效：
Ⅰ级(轻度)，主要皮损为黑头粉刺，散发或多发。炎性丘疹散发。总病灶数10~30个；
Ⅱ级(中度)，主要皮损为粉刺，并有中等数量的丘疹和潜在性脓疱，总病灶数31~50个，局限在面部；
Ⅲ级(中度)，主要皮损为深在性炎性丘疹和脓疱，总病灶数51~100个，结节小于3个，发生于面、颈、胸背部；
Ⅳ级(重度)，主要皮损为深在性炎症性丘疹和脓疱，总病灶数大于100个，结节或囊肿大于3个，易形成瘢痕，发生在上半身。
以每个样品每级治疗前后的总病灶数来评价疗效，结果列于表6。
表6：总病灶数
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种控油祛痘精华液，其特征在于，包括如下重量份数的组分：维A酸多肽偶联物0.1~0.8份、透明质酸钠多肽偶联物1-5份、植物提取物0.5~5份、EDTA二钠0.05-1份、尿囊素0.1-1份、二丙二醇3-8份、羟乙基纤维素0.01-1份、对羟基苯乙酮0.1-0.5份、木糖醇基葡糖苷0.1-2份、丙二醇20-40份和甘油辛酸酯1-6份，纯净水100~300份；
所述维A酸多肽偶联物具有如下结构：RD-Ile-Asn-Leu-Arg-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Val-Arg-Lys-Ile-Leu-OH；
所述透明质酸钠多肽偶联物由乙烯基修饰的透明质酸与抗菌肽通过巯基-乙烯基点击反应制备得到；所述抗菌肽为：Arg-Cys-Ala-Ser-Ser-Cys-Gly-Ala-Lys；
所述植物提取物包括以下重量百分比的组分：辛酸/癸酸甘油三酯65-75％、向日葵籽油8-20％、红花提取物4-8％、栀子花提取物2-6％、菊花提取物2-6％、梅花提取物2-6％、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.05-0.2％。
2.根据权利要求1所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述维A酸多肽偶联物制备方法如下：
S1：树脂经活化、脱保护后，首先加入Fmoc-Leu-OH进行反应，得到Fmoc-Leu-树脂；
S2：按照抗炎肽BMP14氨基酸序列从第二个异亮氨酸开始到第14个异亮氨酸逐步固相偶联氨基酸，得到Fmoc-Ile-Asn-Leu- Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；
S3：脱Fmoc保护后加入维A酸酰氯，得到：RD-Ile-Asn-Leu- Arg(Boc)2-Val-Ile-Ala-Cys(Trt)-Leu-Val-Arg(Boc)2-Lys(Boc)-Ile-Leu-树脂；
S4:用含有三氟乙酸的切割液切割，并采用高效液相色谱纯化，得到：RD-Ile-Asn-Leu-Arg-Val-Ile-Ala-Cys-Leu-Val-Arg-Lys-Ile- Leu-OH。
3.根据权利要求2所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述树脂选自Wang树脂、Rink Amide MBHA 树脂、Rink Amide AM 树脂中的一种。
4.根据权利要求2所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述脱保护是指采用哌啶/DMF溶液进行脱保护，哌啶与DMF的体积比为20/80。
5.根据权利要求2所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述维A酸酰氯为异维A酸与草酰氯反应得到。
6.根据权利要求1所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述乙烯基修饰的透明质酸，具体为：透明质酸钠与3-丁烯-1-胺进行酰胺化反应制备得到。
7.根据权利要求1或6任一所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述透明质酸钠的粘均分子量为105~106Da。
8.根据权利要求1所述的一种控油祛痘精华液，其特征在于，所述植物提取物包括以下重量百分比的组分：辛酸/癸酸甘油三酯65.8％、向日葵籽油8％、红花提取物8％、栀子花提取物6％、菊花提取物6％、梅花提取物6％、季戊四醇四(双-叔丁基羟基氢化肉桂酸)酯0.2％。
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| 徐元贞等: "《中华医学百科全书 药理学》", vol. 4, 中国协和医科大学出版社, pages: 1386 * |
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