CN110183528A - 抗菌肽及其用于制药和美容的用途 - Google Patents

抗菌肽及其用于制药和美容的用途 Download PDF

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Abstract

本发明从峨眉树蛙皮肤中分离获得具有较好抑菌效果以及清除自由基功能的抗菌肽，该抗菌肽具有良好的广谱抑制细菌生长的作用，还具有较好的清除DPPH和ABTS自由基，具有随着浓度增大而效果也显著提高的优势，可用于制药和美容的用途，具有极好的市场应用前景和经济价值。

Description

抗菌肽及其用于制药和美容的用途
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体的涉及一种抗菌肽及其用于制药和美容的用途。
背景技术
抗菌肽是生物体在特定外界条件下经诱导产生的具有抑菌活性的一类小分子多肽，具有分子量小、种类多、抗菌谱广等特点。蛙类动物为两栖动物，皮肤具有裸露、湿润等特点，同时具有辅助呼吸的作用，为外界微生物生长、繁殖提供了良好的环境。为了适应生存环境，蛙类动物的表面皮肤腺体分泌一系列抗菌肽，以抵抗外界病原体对自身的侵扰。蛙类抗菌肽对原核生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、病毒等有明显的抑杀作用，甚至对真菌、癌细胞等也有抑杀作用，而对真核生物作用很小或没有明显杀伤效果。同时，蛙类抗菌肽具有抗菌广谱性，即一种抗菌肽可以对多种细菌产生抑杀作用。Csordas等人在欧洲铃蟾皮肤分泌物中发现了抗菌肽Bominin，开始了对蛙类抗菌肽的研究。此后，Morikawa等人从日本沼蛙中分离得到Brevinin-1家族抗菌肽；Isaacson等人从日本林蛙中得到Japonicin；Conlon从中国褐蛙皮肤中分离到4种Japonicin-2家族抗菌肽。蛙类抗菌肽具有较大的潜在应用价值，已经在医药、食品等方面得到重视，有望成为新一代的抗菌药、新型食品添加剂，为解决现有抗菌药物的耐药性及传统添加剂的危害性提供新途径。
蛙类动物抗菌肽为小分子多肽，分子量小，4 000Da左右，一般由10～50个氨基酸残基组成，低抗原性，水溶性好，且具有较强的碱性特征。蛙类抗菌肽分子中含有亮氨酸和异亮氨酸等疏水性氨基酸，因而具有疏水性，对抗菌肽的抗菌活性及溶血活性起到至关重要的作用；同时也含有精氨酸和赖氨酸等带正电荷的氨基酸，因而为阳离子多肽，是影响抗菌肽抗菌机制的重要因素。蛙类抗菌肽具有很好的耐热性，在温度100℃下加热15min不破坏其抗菌活性；具有很好的耐受性，在较大的离子强度和极端的pH值情况下仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点约为10。此外，一些抗菌肽还能够抵抗消化酶的水解，如胰蛋白酶、胃蛋白酶等。
蛙类抗菌肽的生物活性主要有以下几种，(1)抗菌活性：蛙类抗菌肽抗菌谱广，具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的能力。如来源于中国大蹼铃蟾的抗菌肽Maximin3，在1.5μg/mL的浓度水平时就可以完全抑制大肠杆菌、巨大芽孢杆菌以及痢疾杆菌的生长。中国滇蜀地区红褐色斑点蛙的抗菌肽amolopins对金黄色葡萄球菌和短小芽孢杆菌具有抗菌性]。从小貂蛙皮肤中分离得到的Brevinin-2-related对纺锤芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌、居泉沙雷菌、气单胞菌、食酸丛毛单胞菌、氧化微杆菌均有较好的抑杀作用，MIC为3～500μg/mL。(2)抗病毒活性：已发现的蛙类抗菌肽中部分具有抗病毒活性，特别是对有包膜结构的RNA和DNA病毒。如从中国大蹼铃蟾皮肤得到的抗菌肽Maximin3能够抑制HIV感染T细胞；从北美豹蛙皮肤中分离得到的Esculentin-2P能抑制蛙病毒活性；另外，从南美叶泡蛙皮肤得到的抗菌肽dermaseptin对疱疹病毒也有明显的抑制作用。(3)抗肿瘤活性：部分蛙类抗菌肽也具有抗肿瘤活性，并且可以选择性地作用于肿瘤细胞而对机体正常细胞无作用，即对肿瘤细胞具有靶向作用。如从欧洲林蛙皮肤分泌物中分离到的Temporin L可以直接诱导肿瘤细胞死亡；从中国大蹼铃蟾得到的的抗菌肽Maximin在微摩尔浓度就对肿瘤细胞有明显抑杀作用。(4)溶血活性：研究表明，部分蛙类抗菌肽具有对哺乳动物血细胞进行溶解的能力，如中国大蹼铃蟾的抗菌肽Maximin H和日本沼蛙的Brevinin-1均具有较高的红细胞溶解活性。其中，抗菌肽高度的疏水性、螺旋性、两亲性等结构决定了抗菌肽溶血性的强弱。(5)其他活性：蛙类抗菌肽还具有抗原虫活性、抗精子活性、胚胎毒性、促进伤口愈合、趋化与免疫激活作用，以及参与免疫调节等多方面作用。从南美叶泡蛙皮肤得到的抗菌肽dermaseptin系列对疟原虫有明显抑制作用。从中国大蹼铃蟾皮肤得到的抗菌肽Maximin1和Maximin 3对正常人精子都有显著的精子制动活性，在抗菌肽质量浓度为100μg/mL下，抗菌肽与精子保温30min后，80％的精子活性丧失。非洲爪蟾的抗菌肽Magainin-2-amide具有明显的胚胎毒性，可导致哺乳动物胚胎死亡。此外，也有关于蛙类抗菌肽可以加快伤口愈合的研究5展望蛙类抗菌肽分子量小，具有广谱的抗菌性，且对人体正常细胞、组织无毒副作用，在医药、食品方面已经受到广泛关注。一方面，由于抗生素的广泛使用，抗药菌株此消彼长，甚至出现了超级细菌，而抗菌肽不易产生耐药性，有望成为新型的抗菌药物。此外，蛙类抗菌肽具有抗精子、抗肿瘤、加速伤口愈合等作用，使蛙类抗菌肽可能成为除抗菌药以外的其他临床用药。另一方面，蛙类抗菌肽可作为安全无毒的防腐剂，用于食品的防腐与保鲜，从而取代具有毒副作用的化学防腐剂。但是由于天然资源有限、技术不够成熟，抗菌肽要想进行大规模的产业化生产，还需进一步的研究与探索。
近日吉林大学生命科学学院教授滕利荣团队将林蛙皮变废为宝，从中提取出林蛙抗菌抗病毒活性因子——林蛙抗菌肽，该物质具有广谱抗菌作用。该技术成果已成功转化，年产值突破2亿元。林蛙是一种东北特产，长期生长在山高林密的高寒山区，为了抵御寒冷潮湿环境下有害因子的侵蚀，林蛙的皮肤组织中会生成抗菌类多肽物质，即林蛙抗菌肽。林蛙抗菌肽具有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌的抑菌率达90％以上。但如何将该物质从林蛙皮上高效、快速、规模化提取出来，并保持该物质的抗菌活性是一大难题，导致过去林蛙抗菌肽项目始终无法产业化，林蛙皮资源浪费。滕利荣团队自1995年起开始研究林蛙抗菌肽，历经20余年、三代科研人员心血，在实验中摸索出提取、分离纯化和制剂的最佳生产工艺路线，成功开发了林蛙抗菌肽系列抗菌产品。滕利荣说，林蛙抗菌肽对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌、病毒等致病微生物具有极强的抑制作用，还具有耐酸碱、耐高温，不易产生耐药性，作用快速、无残留，对于人体正常细胞无毒副作用等优点。该项目的生产转化不但填补了动物多肽消毒产品市场的空白，还延长了林蛙产业链条。该项技术已获得6项国家发明专利授权，成功产业化，形成了皮肤专项抗抑菌、足部护理、生殖健康、五官抑菌护理等系列产品，年产值突破2亿元。这一成果充分的说明，蛙抗菌肽领域还有极大的发展空间。
发明内容
本发明基于现有技术的情形，开发出一种全新的蛙抗菌肽Xarwnin，其分离自峨眉树蛙皮肤，其序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明另外提供一种峨眉树蛙抗菌肽的分离方法。该方法为通过收集抗菌肽粗提液之后，通过高效液相色谱仪来分段分离相应的抗菌肽，通过活性验证之后，选择活性较好的区段进行二次分离进而获得了本发明的抗菌肽。
本发明提供的抗菌肽其氨基酸序列长度为46个氨基酸，其序列为
NPGSCVNVEEGHKYPIQYGSFAQHQIKSGATQRWVGGWCQRNSYQN，其分子量为5.2KDa，等电点为8.91，在序列的第5-39之间形成二硫键，消光系数:15340M-1cm-1。其中二硫键的形成在抗氧化功能的行使中起到重要的作用。
本发明另外提供所述的抗菌肽在抗菌实验中的应用。具体的，本发明的抗菌肽对于大肠杆菌CMCC44817、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、枯草杆菌CMCC 63501、白色念球菌ATCC 10231，绿脓假单胞菌CMCC10104都具有显著的抑制作用，说明该蛙抗菌肽具有良好的广谱抑制细菌生长的作用，适用范围更广。
另外，本发明的抗菌肽还具有较好的清除DPPH和ABTS自由基，具有随着浓度增大而效果也显著提高的优势。
此外，本发明的抗菌肽基本不发生溶血现象，具有较好的用于制备药物组合物的应用前景。
附图说明
图1是高效液相色谱仪二次纯化图
有益效果
本发明从峨眉树蛙皮肤中分离获得具有较好抑菌效果以及清除自由基功能的抗菌肽，该肽对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念球菌、绿脓假单胞菌都具有显著的抑制作用，说明该蛙抗菌肽具有良好的广谱抑制细菌生长的作用，适用范围更广。还具有较好的清除DPPH和ABTS自由基，具有随着浓度增大而效果也显著提高的优势。因此可用于制药和美容的用途，具有极好的市场应用前景和经济价值。
具体实施方式
实施例1抗菌肽的获得
1.抗菌肽粗提液的收集
将试验用峨眉树蛙活体蛙用超纯水及酒精棉清洁后，在皮肤上进行多点电刺激，电压10V，时间5min，超纯水清洗蛙的背部，收集分泌物，于4℃、12 000r/min离心15min，取上清液，低温浓缩至20mL。应用10ku超滤膜超滤后收集抗菌肽粗提液。
2.抗菌肽的纯化
将高效液相色谱仪的定量环由20μL改为100μL；缩短从检测器到废液的管路长度，使之更适于样品的收集。将抗菌肽粗提液于色谱条件下用65％乙腈和10％甲醇为流动相进行色谱分离。其中65％乙腈和10％甲醇为流动相，样品的洗脱时间缩短，可使样品获得很好的分离。
洗脱条件:等度洗脱、线性梯度洗脱均不能使样品得到有效分离。多台阶梯度洗脱使初次分离的样品获得103个洗脱峰，样品分离的流动相浓度确定为流动相A(0.10％TFA的水溶液)和流动相B(0.03％TFA的乙腈溶液)。经多次优化色谱条件，初次分离洗脱条件为在第0，5，25，80，90，91分钟的不同时间点，其流动相B的浓度依次为0、0、10％、60％、100％、100％；第二次分离洗脱条件为在第0，5，10，45，50分钟的不同时间点，其流动相B的浓度依次为0、0、10％、60％、100％。使用215nm的检测波长检测。215nm的检测波长可获得较多的色谱峰，且色谱峰吸收强度较高，便于观察和收集。
抗菌肽粗提液经过高效液相色谱仪初次分离，共获得103个色谱峰，经过抑菌试验，共有25个色谱峰具有抑菌活性，其中24号峰的抑菌效果最强。
由图1可以看出，通过对24号峰进行第二次分离纯化，共获得3个色谱峰，经抑菌活性检测，24.2号色谱峰具有最强的抑菌活性，初步筛选为本发明的抗菌肽。
3.质谱鉴定
取1μL二次纯化后的24.2号色谱峰有活性的产物，点靶，再取1μL饱和的HCCA基质覆于样品上，进行质谱鉴定，得到其氨基酸序列长度为46个氨基酸，其序列为为NPGSCVNVEEGHKYPIQYGSFAQHQIKSGATQRWVGGWCQRNSYQN，其分子量为5.2KDa，等电点为8.91，在序列的第5-39之间形成二硫键，消光系数:15340M-1cm-1。
实施例2抗菌肽的功能验证
Ⅰ、抗菌能力测定
抗菌活性检测采用杯碟法，细菌培养采用普通琼脂培养基，真菌培养采用培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测样品溶液0.lml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，24h-48h后观察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作为最小抑菌浓度。试验重复五次，取平均值，结果如表1所示，抗菌肽对于大肠杆菌CMCC44817、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、枯草杆菌CMCC 63501、白色念球菌ATCC 10231，绿脓假单胞菌CMCC10104都具有显著的抑制作用，说明该蛙抗菌肽具有良好的广谱抑制细菌生长的作用，适用范围更广。
表1.蛙抗菌肽的抗菌活性
菌株 MIC(u/ml)
大肠杆菌CMCC 44817 8.53±0.76
金黄色葡萄球菌CMCC 26003 26.51±1.77
枯草杆菌CMCC 63501 30.54±3.05
白色念球菌ATCC 10231 20.51±2.98
绿脓假单胞菌CMCC 10104 15.12±1.21
II、抗氧化能力测定
1)DPPH自由基清除能力的测定
利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率测定法研究抗氧化多肽。配制浓度为1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2ml，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517nm处测定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。
清除率(％)＝【1-(Ai-Aj)/A0】*100％
式中，A0为2ml，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2ml的样品试剂，空白对照，Ai为2ml,0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2ml的样品，Aj为2ml的无水乙醇+2ml的样品。
2)ABTS自由基清除活性的测定
以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓度为2.45nmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12～16h。将生成的ABTS自由基溶液用磷酸缓冲液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀释，使其在734nm下的吸光值为0.70。取0.1ml酶解液与2.9ml ABTS自由基液混合，摇匀30秒钟，暗处反应10分钟，然后在734nm下测定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白。
清除率(％)＝(Ai-Aj)/A0*100％
式中，A0为2.9ml ABTS试剂与0.1ml蒸馏水混合液的吸光值，Aj为2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。
如表2所示，蛙抗菌肽能显著清除DPPH和ABTS自由基，具有随着浓度增大而效果也显著提高的优势。该肽可以用于防止自由基对皮肤造成的损害，也可以制备用于保护自由基对其他器官的伤害的药物中。
表2蛙抗菌肽清除DPPH和ABTS自由基的效果图
肽样品浓度ug/mL DPPH自由基清除率(％) ABTS自由基清除率(％)
10 25.83±2.04 29.66±3.22
20 40.52±3.48 48.97±4.50
40 62.83±5.21 69.88±5.41
80 87.65±6.04 92.56±7.04
160 95.91±9.88 97.85±8.43
实施例3抗菌肽溶血活性测定
(1)从兔耳静脉取血，加生理盐水，混匀，1000rpm，离心10min，收集红细胞，用生理盐水稀释成1％红细胞悬液。
(2)取20mg抗菌肽加入20mL稀释液中混匀，药物浓度为1mg/mL，并经0.22μm滤膜过滤，做储液。
(3)用生理盐水倍比稀释成浓度为500，250，125，62.5，31，25，15.6，7.81，3.90，1.95μg/mL的稀释液。
(4)在96孔微量板中，每孔加入红细胞悬液100μL及不同浓度的抗菌肽稀释液100μL，混匀，每个浓度重复3次。另设生理盐水及1％TricineX-100为最小和最大的溶血对照。
(5)37摄氏度培养箱里放置30min，1000rpm，离心10min。
(6)取各孔上清液100μL，以酶标仪于波长405nm处测定OD值，重复3次，计算引起50％溶血的浓度(HD50)
(7)根据吸光度平均值按下试计算相对溶血率：相对溶血率＝OD实验组/OD阳性对照×100％。结果如下表3所示。
表3抗菌肽的溶血率
抗菌肽浓度ug/mL 溶血率(％)
500 2.65±0.013
250 2.40±0.020
125 2.23±0.015
62.5 2.17±0.010
31.25 2.01±0.002
15.6 1.94±0.005
7.81 1.90±0.004
3.9 1.85±0.006
1.95 1.79±0.009
生理盐水对照 1.71±0.008
阳性对照1％TricineX-100 100±0.091
经计算，抗菌肽在浓度为500μg/m L时，基本没有溶血现象，而且在此浓度时，该肽能够表现出很强的抑菌活性，这说明抗菌肽具有潜在的药用价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 苏州立豪生物科技有限公司
<120> 抗菌肽及其用于制药和美容的用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Asn Pro Gly Ser Cys Val Asn Val Glu Glu Gly His Lys Tyr Pro Ile
1 5 10 15
Gln Tyr Gly Ser Phe Ala Gln His Gln Ile Lys Ser Gly Ala Thr Gln
20 25 30
Arg Trp Val Gly Gly Trp Cys Gln Arg Asn Ser Tyr Gln Asn
35 40 45

Claims (6)

1.一种峨眉树蛙抗菌肽，所述多肽的序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸序列长度为46个氨基酸，其分子量为5.2KDa，等电点为8.91，在序列的第5-39之间形成二硫键，消光系数:15340M-1cm-1；其中二硫键的形成在抗氧化功能的行使中起到重要的作用。
2.权利要求1所述的峨眉树蛙抗菌肽在杀灭病原微生物感染疾病中的应用。
3.权利要求1所述的峨眉树蛙抗菌肽在制备抑制病原微生物的药物或试剂中的用途。
4.权利要求1所述的峨眉树蛙抗菌肽在制备清除自由基药物或美容用品中的用途。
5.权利要求1所述的虎纹蛙蛋白酶抑制肽在制备抗氧化药物或美容用品中的用途。
6.如权利要求3所述的用途，其中所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌和白色念球菌。
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