CN116970071A - 一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。该重组弹性蛋白具有比商品化弹性蛋白更明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显的抗氧化活性，可应用于生物护肤，并具有明显的抗衰抗皱功效。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
弹性蛋白（elastin）属于细胞外基质蛋白(extracellular matrix，ECM)，主要分布于血管、皮肤、韧带和肺等组织器官。弹性蛋白能够提供足够的弹性和恢复力，为组织提供拉伸和恢复其原始形状的能力。弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白（tropoelastin），原弹性蛋白经过自凝聚，交联成不可溶的渔网状结构，称为弹性蛋白。这使得从动物组织中提取弹性蛋白非常困难，这需要分解弹性蛋白分子进行释放，每个原弹性蛋白分子具有36个随机排列的结构域，具有交替的疏水性和亲水性结构域，且异源提取的天然弹性蛋白对人体有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。而重组弹性蛋白是原弹性蛋白的疏水结构域衍生来的循环重复氨基酸序列，是一种经过人工改造的、具有弹性且随温度变化会发生相变的基因工程多肽，在结构上主要由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly五肽段单元串连重复组成，Xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。现有的研究已发现此多肽序列像原弹性蛋白一样具有生物学活性。且不经过任何修饰的类人弹性蛋白可以作为细胞培养表面的修饰物以促进细胞粘附特性和增殖能力，有希望成为新型的生物医学材料。因此，本申请通过获取一种新型重组弹性蛋白，促进其促细胞增殖和促细胞粘附活性，使其能够用于抗衰除皱。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有的重组弹性蛋白促细胞增殖和促细胞粘附活性不足的技术问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如Seq IDNO.6所示。
可选地，所述重组弹性蛋白是经毕赤酵母表达的人弹性蛋白与人胶原蛋白的融合蛋白。
可选地，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段所得。
可选地， 所述连接肽片段为弹性蛋白亲水区结构域片段。
可选地，所述人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段、如Seq ID NO.2所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如SeqID NO.3所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
可选地，所述类弹性蛋白六肽重复片段为类弹性蛋白六肽氨基酸序列串联重复5次所得。
本发明还提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-Col-ELPs重组质粒；
制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白。
可选地，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-Col-ELPs重组质粒的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPIC9K质粒上的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间，获得pPIC9K-Col-ELPs重组质粒。
可选地，将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30℃静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再选取所述YPD平板的单菌落转移至YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。
可选地，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：
选取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10 min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30℃、220 rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。
可选地，将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白。
本发明还提出了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗衰活性的重组弹性蛋白作为护肤品中的抗衰活性成分。
本发明通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的重组人源弹性蛋白，不仅解决了天然蛋白分子量过大，难以从动物组织中提取，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该重组弹性蛋白的核苷酸序列进行优化设计，在C端添加终止子，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。经过体外细胞验证和人体功效验证，该重组弹性蛋白具有比商品化弹性蛋白更明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显的抗氧化活性，可应用于生物护肤，并具有明显的抗衰抗皱功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例所述的阳性转化子鉴定的电泳结果示意图；
图2为本发明实施例所述的诱导上清的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图3为本发明实施例所述的重组弹性蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果示意图；
图4为本发明实验例所述的重组弹性蛋白的促细胞增殖活性示意图；
图5为本发明实验例所述的重组弹性蛋白的促细胞粘附活性示意图；
图6为本发明实验例所述的使用重组弹性蛋白精华液后不同时间点皮肤弹性R2值的示意图；
图7为本发明实验例所述的使用重组弹性蛋白精华液后不同时间点皮肤紧致参数F4值的示意图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表说明（序列表内容单独提供）：
Seq ID NO.1所示为本发明实施例中人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.2所示为本发明实施例中人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.3所示为本发明实施例中人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.4所示为本发明实施例中胶原蛋白融合肽的氨基酸序列；
Seq ID NO.5所示为本发明实施例中重组弹性蛋白的氨基酸序列；
Seq ID NO.6所示为本发明实施例中重组弹性蛋白的核苷酸序列；
Seq ID NO.7所示为本发明实施例中连接肽片段的氨基酸序列；
Seq ID NO.8所示为本发明实施例中类弹性蛋白六肽重复片段的氨基酸序列。
针对现有的弹性蛋白所存在的技术问题，本发明的实施例提供了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
本发明通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构稳定、具有生物学功能的重组人源弹性蛋白，不仅解决了天然蛋白分子量过大，难以从动物组织中提取，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了天然蛋白的优良生物学性能。其中，氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码该重组弹性蛋白的核苷酸序列进行优化设计，在C端添加终止子，核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。经过体外细胞验证和人体功效验证，该重组弹性蛋白具有比商品化弹性蛋白更明显的促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显的抗氧化活性，可应用于生物护肤，并具有明显的抗衰抗皱功效。
作为本发明的一种可实施方式，所述重组弹性蛋白是经毕赤酵母表达的人弹性蛋白与人胶原蛋白的融合蛋白。
本发明利用毕赤酵母异源表达蛋白，稳定且可分泌至胞外易于纯化，同时具有将异源蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能。胶原蛋白与弹性蛋白同属于细胞外基质蛋白，也是与美容护肤、组织再生关系最为紧密的成分。同时，弹性蛋白本身具有良好的细胞相容性、并能够在体内自然降解成对生物体无毒的、内源性的氨基酸等，且弹性蛋白具有促进成纤维细胞和角质细胞增殖、诱导血管再生等生物学性能，也可间接影响胶原蛋白对细胞的作用。因此，本发明利用基因工程技术表达重组人类弹性蛋白和胶原蛋白的融合蛋白，以拓宽类弹性蛋白的应用范围，使该胶原蛋白与弹性蛋白的融合蛋白可同时具有胶原蛋白和弹性蛋白的功效，具有明显促细胞增殖和促细胞粘附活性。
作为本发明的一种可实施方式，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段所得。
本发明通过毕赤酵母表达类人弹性蛋白与类人胶原蛋白的融合蛋白序列，通过对胶原蛋白成熟肽功能结构域序列进行筛选分析，比对选择胶原蛋白三螺旋重复序列片段，并以连接肽片段连接人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段，使其整合成弹性-胶原融合蛋白，即得到具有抗衰活性的重组弹性蛋白。
作为本发明的一种可实施方式，所述连接肽片段为弹性蛋白亲水区结构域片段。
在具体应用中，弹性蛋白亲水区结构域片段源于人源弹性蛋白氨基酸序列，人源弹性蛋白氨基酸序列参考：UniProt P02751序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02751），每个弹性蛋白分子具有36个随机排列的结构域，具有交替的疏水性和亲水性结构域，其中包括富含非极性氨基酸特别是甘氨酸（G），缬氨酸（V），脯氨酸（P）和丙氨酸（A）的疏水区结构域，常以三到六肽的重复序列存在；以及富含与交联有关的赖氨酸（K）和丙氨酸（A）的亲水区结构域，这些区域通常被两到三个Ala分隔开的分散的Lys所组成，本发明的连接肽片段选择弹性蛋白亲水区结构域片段AAAKAAKAA，如Seq ID NO.7所示。
作为本发明的一种可实施方式，所述人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段、如Seq ID NO.2所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.3所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
在具体应用中，人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅰ型胶原蛋白序列，人源Ⅰ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02452序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02452），人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅱ型胶原蛋白序列，人源Ⅱ型胶原蛋白序列参考：UniProtP02458序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02458），人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段源于人源Ⅲ型胶原蛋白序列，人源Ⅲ型胶原蛋白序列参考：UniProt P02461序列（https://www.uniprot.org/uniprot/P02461）。对胶原蛋白成熟肽功能结构域序列进行筛选分析，比对选择胶原三螺旋重复序列片段，分别为如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段、如Seq ID NO.2所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.3所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段，将三个胶原蛋白肽片段依次首尾相连构成新的胶原蛋白融合肽，如Seq ID NO.4所示。
作为本发明的一种可实施方式，所述类弹性蛋白六肽重复片段为类弹性蛋白六肽氨基酸序列串联重复5次所得。
目前，针对人的六肽串联重复序列的研究较少，但现有的研究已发现六肽串联重复序列像原弹性蛋白一样具有生物学活性。本发明参照前期研究成果（专利号：202010611388），选择类人弹性蛋白六肽氨基酸序列，并串联重复5次，即为（VAPGVG）5，如Seq ID NO.8所示，其串联重复次数较少，但具有较高的使用周期和超氧自由基清除活性，进而可以提高本发明经过融合后的重组弹性蛋白的抗氧化活性。
本发明的实施例还提供了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S10、依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-Col-ELPs重组质粒。
在具体应用中，委托通用生物（安徽）股份有限公司依据如Seq ID NO.6所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPIC9K质粒上的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间，获得pPIC9K-Col-ELPs重组质粒。
具体的，在这一步中，使用QuickCut Sac Ⅰ对pPIC9K-Col-ELPs重组质粒进行酶切线性化，酶切体系（50μL）包括pPIC9K-Col-ELPs重组质粒（10μg-15μg），Quick Cut Sac I（10μL），10×Quick Cut buffer（5μL），在37℃下酶切5h，使pPIC9K-Col-ELPs重组质粒线性化；
酶切结束后，需通过乙醇回收酶切pPIC9K-Col-ELPs重组质粒，具体方式为：加入0.1倍体积3 M NaAc（pH 5.2）和2.5倍体积无水乙醇，在-20℃下放置过夜；再在4℃，13000rpm的条件下离心20 min，弃上清；加入700μL的75%乙醇进行漂洗，再在4℃，13000 rpm的条件下离心20 min，弃上清；倒置于超净台吸水纸上约10 min，尽量去除水分和残留乙醇，再用20μL双蒸水重新溶解pPIC9K-Col-ELPs重组质粒，并取1μL稀释10倍后，用one-drop检测核酸浓度。
S20、制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌。
在具体实施过程中，GS115感受态细胞为毕赤酵母感受态细胞，制备时，将GS115菌株平板划线后选取单菌落接种于20 mL YPD固体培养基，在30 ℃、225 rpm的条件下培养24h；再以1：1000的接种比例转接于50 mL YPD液体培养基，并在30℃、225 rpm的条件下培养至OD600nm吸光值为1.3-1.5；再将菌液转入无菌50 mL离心管中，在4℃、1500 rpm的条件下离心5 min，弃上清后收集菌体；再用50 mL预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀，并在4℃、1500rpm的条件下离心5 min，弃上清后，再用50 mL预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀；在4℃、1500 rpm的条件下离心5 min，弃上清后，再用40 mL预冷的无菌1 M山梨醇重悬细胞沉淀；再在4℃、1500 rpm的条件下离心5 min，弃上清后，用100μL-150 μL预冷的无菌1 M山梨醇重新悬浮细胞沉淀，温和旋转混匀，置于冰上，待用，得到GS115感受态细胞；
取100μL的GS115感受态细胞与10μL的pPIC9K-Col-ELPs重组质粒混合，移入预冷的电转化杯中，立即冰浴5 min，上电转仪，选择电转仪的酵母模式，进行电击，然后立即向电转杯中加入1 mL预冷的1 M山梨醇溶液，混匀后，混合均匀后将混合物转移到无菌EP管中，在30℃培养箱静置孵育1h-2h后，取孵育的100μL- 200μL的菌液涂布于MD固体平板，室温静置10min，再经30℃培养箱倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
向MD固体平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中，以无菌水稀释成105cells/ml浓度的细胞悬液（用分光光度计计数，1 OD600≈5×107cells/ml），并涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，经30℃倒置培养3d-4d后至单菌落出现；再选取所述YPD平板的单菌落转移至含200μL YPD培养基的第一块96孔培养板中，于30℃继续培养；48h后，吹匀菌液，每孔吸取10μL菌液转移至第二块96孔培养板（含190μL YPD）；继续培养24h后，吹匀菌液，每孔吸取10μL菌液转移至第三块96孔培养板；24h后，吹匀第三块96孔培养板中菌液，并吸取1μL分别点在含有1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上继续培养；阳性转化子若能在含4mg/mL高浓度G418的平板上生长，则说明该阳性转化子含有多拷贝的目的基因，经过这一步筛选可得到可高效表达的重组酵母工程菌。
具体的，在这一步中，所用的培养基的配方如下：
YPD固体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，并含有2％琼脂；
YPD液体培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
MD固体培养基：YNB无氨基酸氮源13.4g/L；生物素0.4mg/L；葡萄糖20g/L，并含有2％琼脂。
在具体应用中，筛选阳性转化子后，对阳性转化子进行鉴定，取上述第一块96孔培养板剩余菌液50μL，沸水浴中煮沸10 min，再在液氮中冻存30 min后，再在沸水浴中煮沸10min，经过反复冻融后，以12000 rpm的转速离心5 min，取上清作为PCR模板，通过PCR扩增鉴定目的基因是否整合到酵母染色体上；
其中，检测引物为：
上游引物：5’AOX1(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)
下游引物：3’AOX1(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)
PCR条件为：98℃预变性5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min；
对扩增的产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果在1500bp附近有明显条带（实际约1417bp），如图1所示，表明目的基因成功整合到酵母染色体上，为阳性菌落。其中，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-10：单菌落PCR产物。
S30、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清。
在具体实施过程中，选取所述重组酵母工程菌单菌落接种于BMGY诱导培养基中，在30℃、220 rpm的条件下培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10 min后，收集菌体，重新接种于等体积的BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30℃、220 rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集诱导上清，经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，如图2所示，其中，泳道M：蛋白Marker。可观察到30kDa左右有明显的特异性条带出现。说明本发明制备的含重组弹性蛋白的真核表达载体pPIC9K-Col-ELPs的重组酵母工程菌经诱导能产生30kDa左右的重组弹性蛋白。
具体的，在这一步中，BMGY诱导培养基的配置包括：毕赤酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L K2HPO4，加水至895mL，121℃灭菌20min，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB 100mL（13.4 g/L），500×生物素1mL（4×10-4g/L），甲醇5mL。
S40、将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白。
在具体实施过程中，将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白。
具体的，在这一步中，使用阳离子交换介质（层析填料为千纯产SP Purose 6 HighPerformance，装载于GE Akta层析系统），以NaH2PO4缓冲液（25Mm，pH 4.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速为5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；待上样结束后，再以NaH2PO4缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外A280吸光值和导电电导率值降至最低且不再变化，停止接样；再以含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后，即得到重组弹性蛋白。
通过SDS-PAGE检测，含NaCl（1M）的NaH2PO4缓冲液可明显洗脱目的蛋白，检测结果如图3所示，其中，泳道M：蛋白Marker。
本发明的实施例还提供了一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白在护肤品中的应用，采用上述具有抗衰活性的重组弹性蛋白作为护肤品中的抗衰活性成分。该重组弹性蛋白在任意护肤品中添加，可促细胞增殖和促细胞粘附活性，并具有明显抗氧化活性。
下面结合具体实施例对本发明上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的优化后的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPIC9K质粒上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPIC9K-Col-ELPs重组质粒；
将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30℃静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再选取所述YPD平板的单菌落转移至YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌；
选取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10 min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30℃、220 rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清；
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白。
实验例1
对本发明的重组弹性蛋白进行促细胞增殖试验。参考《中国药典》2020版（三部）附录“3528”。本法系依据重组弹性蛋白对小鼠胚胎成纤维细胞（BALB/c 3T3 细胞）的生长具有刺激作用，BALB/c 3T3细胞的生长状况因不同的重组弹性蛋白生物学活性的差异，以此检测体外促细胞增殖的生物学活性。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的1640培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
噻唑蓝（MTT）溶液：称取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml使溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存；
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
样本：实施例1的重组弹性蛋白、商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）。
1.2具体实施方法：
将BALB/c 3T3细胞株用完全细胞培养液于37℃、5%二氧化碳的条件下培养，控制细胞浓度为1.0×105cells/ml-5.0×105cells/ml，传代后24h-36h用于生物学活性测定；弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全细胞培养液配成5.0×105cells/ml- 8.0×105cells/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳的条件下培养；24h后换成PBS缓冲液，于37C、5%二氧化碳条件下培养24h；制备的细胞培养板弃去PBS缓冲液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养64h-72h；每孔加入MTT溶液20μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养5h。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μL，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
1.3数据处理：
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。测定结果如下表1和图4所示。
表1
由表1和图4可以看出，本发明实施例所制备的重组弹性蛋白促BALB/c 3T3细胞增殖效果显著高于商品化弹性蛋白产品，说明本发明的重组弹性蛋白具有较好的促细胞增殖活性。
实验例2
对本发明的重组弹性蛋白进行促细胞粘附试验。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的1640培养液（含双抗），4℃保存；
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15min高压灭菌；
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
BSA（购自Sigma）；
样本：实施例1的重组弹性蛋白、商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）。
1.2具体实施方法：
将重组弹性蛋白用PBS缓冲液预稀释至0.5μg/mL，预稀释完成后在96孔细胞培养板中进行2倍梯度稀释，共做8个稀释度，每孔50μL不同稀释度的重组弹性蛋白样本，并设立阴性对照（不加重组弹性蛋白），加入50μL的PBS缓冲液作为对照，4℃过夜孵育；孵育完成后，弃去细胞培养板中液体，每孔加入100μL的PBS缓冲液洗涤，共洗涤3次；洗涤结束后，每孔加入100μL的 30μg/μL BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；孵育完成后，弃去细胞培养板中液体，每孔加入100μL的PBS缓冲液洗涤3次，再加入纤维细胞悬液，细胞接种密度为1.0×105cells/ml，每孔接种100uL，温箱孵育5h；将孵育完成的细胞培养板用PBS缓冲液洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况。
1.3数据处理：
选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出结论。测定结果如图5所示。
由图5可见，本发明的重组弹性蛋白和商品化弹性蛋白均具有促BALB/c 3T3细胞粘附活性，本发明的重组弹性蛋白促细胞粘附活性略好于商品化弹性蛋白。
实验例3
评价本发明实施例制备的重组弹性蛋白的体外抗衰功效。
羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种生物大分子，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的一种活性氧自由基，与机体的衰老、肿瘤发生发展、辐射损伤和细胞吞噬有关。羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一，在抗氧化类保健品和药品研究中得到广泛应用。
1.1试验材料：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水；
羟自由基清除能力检测试剂盒，购自索莱宝生物公司，货号：BC1320；
供试品：实施例1的重组弹性蛋白、商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）。
1.2试验原理：
H2O2/Fe2+通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe2+水溶液中Fe2+氧化为Fe3 +，导致536nm的吸光度下降，样本536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样本清除羟自由基的能力。
H2O2+ [Fe (phen)3]2+(536nm) → OH-+ [Fe (phen)3]3+
1.3具体实施方法：
按照羟自由基清除能力检测试剂盒说明书操作。操作记录表如下表2所示。
表2
其中，羟自由基清除率D（%）＝（A测-A对）÷（A空-A对）×100%
1.4结果：
将样品原液稀释至1mg/mL，再进行2倍梯度稀释，共稀释5个梯度，然后测试不同浓度稀释液的羟自由基清除率。羟自由基清除率试验结果如下表3所示。
表3
添加量减少，羟自由基的清除率逐渐降低，呈线性相关；同时相较于商品化弹性蛋白，重组弹性-胶原融合蛋白羟自由基清除效果更明显。
实验例4
对本发明的重组弹性蛋白进行体外促成纤维细胞胶原生成试验。胶原蛋白是真皮细胞外基质的主要成分之一，由成纤维细胞合成，分泌至胞外，在末端前胶原肽酶的作用下，聚合形成胶原纤维。
1.1试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的1640培养液（含双抗），4℃保存；
维持培养液：含0.4%胎牛血清的1640培养液（含双抗），4℃保存；
消化液：0.25%胰蛋白酶；
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000ml，经121℃、15分钟高压灭菌；
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）；
BSA（购自Sigma）；
样本：实施例1的重组弹性蛋白、商品化弹性蛋白（购自索莱宝，P06063）。
1.2具体实施方法：
将培养24h的BALB/c 3T3细胞用完全细胞培养液重悬细胞配成5.0×104cells/mL-8.0×104cells/mL的悬液，并接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%二氧化碳条件下培养；培养24h后，弃去上清液，换成PBS缓冲液，置于37℃、5%二氧化碳条件下继续培养；培养第24h后，用PBS缓冲液对重组弹性蛋白样品进行稀释，稀释成浓度分别为10μg/mL、1μg/mL和0.1μg/mL，将稀释后的样品加入至上述96孔细胞培养板中，每孔0.2mL，每个浓度设3个复孔；此外，同样的方法稀释商品化弹性蛋白，其稀释浓度为10μg/mL加入至96孔细胞培养板中，每孔0.2mL，每个浓度设3个复孔。同时设立细胞对照组和维生素C阳性对照。继续在7℃、5%二氧化碳条件下继续培养72h；然后，弃去培养上清液，用20mM PBS缓冲液洗涤细胞3次后，向每孔中添加100μL的4%多聚甲醛，室温固定20min，弃去固定液，每孔加入20mMPBS缓冲液再洗涤细胞3次；向每孔中加入0.15mL 0.1%的天狼猩红苦味酸染液，室温染色1h，吸出染液，每孔加入0.2mL 0.1%冰醋酸，洗3遍，每遍5min；最后向每孔加入100μL0.1mol/L氢氧化钠室温充分振荡1h，放入酶标仪中检测540nm波长处吸光度A值，检测胶原蛋白变化情况。
1.3结果：
540nm波长处吸光度A值检测结果如下表4所示。
表4
由表4可见，本发明的重组弹性蛋白与商品化弹性蛋白均能够促进胶原蛋白分泌，但本发明的重组弹性蛋白相较于商品化弹性蛋白，其促胶原蛋白分泌效果明显更好，具有较好的促成纤维细胞合成效果。
实验例5
对本发明的重组弹性蛋白进行人体皮肤功效评价。
将本发明实施例1制备的重组弹性蛋白制备成重组弹性蛋白精华液，通过30名亚洲成年女性受试者在正常情况下连续使用该重组弹性蛋白精华液样品28天，通过测量皮肤弹性R2值、皮肤紧致参数F4值，以及皮肤科医生对受试者进行功效性临床评估和安全性临床评估，评估该测试样品在紧致和抗皱的功效及安全性。
1.1具体实施方法：
使用样品前：测试开始前两天，受试者停用化妆品或外用药品，测试前一天晚上，受试者洗脸后脸上不再涂抹任何护肤品；测试当天早上，清水洗脸后脸上不涂抹任何护肤品；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；皮肤科医生进行临床评估；技术员使用皮肤快速光学成像系统PRIMOS对受试者进行图像采集；技术员使用皮肤弹性测试仪Cutometer检测皮肤紧致参数F4值和皮肤弹性R2值；受试者在技术员指导下使用测试样品；发放测试样品和使用说明。
分别使用样品14天和28天后：受试者在实验室用洁面产品清洁面部；受试者在温度21±1℃，相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟；皮肤科医生进行临床评估；技术员使用皮肤快速光学成像系统PRIMOS对受试者进行图像采集；技术员使用皮肤弹性测试仪Cutometer检测皮肤紧致参数F4值和皮肤弹性R2值。
1.2评判依据：
皮肤弹性：Courage+ Khazaka皮肤弹性测试仪，检测皮肤弹性R2值，测量值升高，说明皮肤弹性提升。
皮肤紧致度：Courage+Khazaka皮肤弹性测试仪，检测皮肤紧致参数F4值（单位：无量纲），测量值越小，说明皮肤紧致度越好。
1.3数据处理
经过统计学软件分析，比较在使用重组弹性蛋白精华液第14d和28d与使用前的差异性。结果如图6和图7所示。“*”表示皮肤弹性R2值与使用前比较差异性显著，P<0.05。
由图6可见，受试女性在使用重组弹性蛋白精华液后，使用14d时皮肤弹性R2值与使用前比较差异不显著，而使用第28d时皮肤弹性R2值显著提高，差异显著。由图7可见，使用第14d和28d时，皮肤紧致参数F4值有一定程度的降低。可见本发明所制备的重组弹性蛋白具有较好的除皱和紧致的功效。
以上所述仅为本发明的可选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (12)
1.一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列如Seq ID NO.5所示，编码所述重组弹性蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白是经毕赤酵母表达的人弹性蛋白与人胶原蛋白的融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述重组弹性蛋白的氨基酸序列是由连接肽片段串联表达人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段和类弹性蛋白六肽重复片段所得。
4.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述连接肽片段为弹性蛋白亲水区结构域片段。
5.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述人源化Ⅰ×Ⅱ×Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区重复片段为将如Seq ID NO.1所示的人源Ⅰ型胶原蛋白肽片段、如Seq ID NO.2所示的人源Ⅱ型胶原蛋白肽片段和如Seq ID NO.3所示的人源Ⅲ型胶原蛋白肽片段依次首尾相连所构成的胶原蛋白融合肽，所述胶原蛋白融合肽的氨基酸序列如Seq ID NO.4所示。
6.根据权利要求3所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白，其特征在于，所述类弹性蛋白六肽重复片段为类弹性蛋白六肽氨基酸序列串联重复5次所得。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-Col-ELPs重组质粒；
制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清；
将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白。
8.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，所述依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-Col-ELPs重组质粒的步骤，包括：
依据如Seq ID NO.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPIC9K质粒上的酶切位点EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之间，获得pPIC9K-Col-ELPs重组质粒。
9.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
将所述pPIC9K-Col-ELPs重组质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混匀后，转移至无菌EP管中，经30℃静置孵育1h-2h后，涂布于MD固体平板，再经30℃倒置培养2d-5d，直至长出单菌落；
刮下所述MD固体平板上的His+转化子并进行稀释后，涂布于含有G418的YPD平板上，经30℃倒置培养至单菌落出现，再选取所述YPD平板的单菌落转移至YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养，以筛选重组酵母工程菌。
10.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清的步骤，包括：
选取所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；
以3000rpm的转速离心10 min后，收集菌体，重新接种于BMGY诱导培养基中，使OD600nm吸光值达到2.0，并在30℃、220 rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，诱导后，离心收集诱导上清。
11.根据权利要求7所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于，将所述诱导上清纯化后，获得重组弹性蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清经过阳离子交换层析柱纯化，洗脱并收集洗脱峰所对应的蛋白，即获得重组弹性蛋白。
12.一种具有抗衰活性的重组弹性蛋白在护肤品中的应用，其特征在于，采用如权利要求1-6任一项所述的具有抗衰活性的重组弹性蛋白作为护肤品中的抗衰活性成分。
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