CN117447611B - 一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域，旨在解决现有方法对贻贝黏蛋白的制备效率及产量均较低的技术问题。所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，将如SEQ ID No.3氨基酸序列所示重组贻贝黏蛋白的工程菌株作为新宿主细胞，采用酪氨酸羟化酶进行羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白；所述酪氨酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。本申请所述目标重组贻贝黏蛋白具有高DOPA含量和天然贻贝黏附蛋白活性，即具有良好的抑炎效果和促黏附效果，可应用于生物护肤应用；且本申请所述生产工艺简单，生产成本更低。

Description

一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，特别涉及一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
贻贝是双壳类软体动物，俗称海虹和青口，可在水环境中牢固地黏附于各种不同材料表面，其足丝中起黏附作用的物质已被证明是各种贻贝足黏蛋白。贻贝足黏蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)是由贻贝类腹足附近的足腺合成并泌到足丝的一类特殊的黏性蛋白质，是足丝的主要成分，又称多酚蛋白质或贻贝黏附蛋白质。Mefp 黏合强度高，能在水下迅速凝固成有黏附能力的附着基，呈生物惰性并具有生物降解的特性，生物相容性好，对人体无毒、无害、无免疫原性，具有合成胶水所不具有的特殊优势，可作为生物黏合剂广泛用于软组织黏接、人造骨骼断骨接合、口腔修复以及眼科手术等，有可能成为今后医用黏合剂研究的主流。
现有贻贝黏蛋白产品主要是从贻贝足丝腺体中提取获得的天然黏附蛋白，但由于贻贝黏附蛋白的分泌量很低，提取1g黏附蛋白大约需要30000只贻贝；或采用基因工程法制备重组贻贝黏蛋白，但该方法存在产率较低、纯化量低且纯化工艺复杂等缺陷，进而造成制备贻贝黏蛋白纯品的效率及产量均较低，极大的限制了贻贝黏蛋白的应用。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白及其制备方法与应用，旨在解决现有方法对贻贝黏蛋白的制备效率及产量均较低的技术问题。
为实现上述目的，本申请第一种实施例提出了：一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，将如SEQ ID No.3氨基酸序列所示重组贻贝黏蛋白的工程菌株作为新宿主细胞，采用酪氨酸羟化酶进行羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白；
所述酪氨酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
作为本申请一些可选实施方式，编码所述酪氨酸羟化酶的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
作为本申请一些可选实施方式，所述重组贻贝黏蛋白是贻贝黏蛋白Mefp-3A和纤连蛋白主要结构域FN10序列串联获得的。
作为本申请一些可选实施方式，所述贻贝黏蛋白Mefp-3A的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述纤连蛋白主要结构域FN10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为本申请一些可选实施方式，编码所述重组贻贝黏蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。
为实现上述目的，本申请第二种实施例还提出了：一种如上所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，包括以下步骤：
获取目标核苷酸序列，构建质粒；
制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
作为本申请一些可选实施方式，所述获取目标核苷酸序列，构建质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒；
基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒。
作为本申请一些可选实施方式，所述基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPIC9K-FN10-Mfp3质粒。
作为本申请一些可选实施方式，所述基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPICZ A质粒上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPICZ A-rhTH1质粒。
作为本申请一些可选实施方式，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌。
作为本申请一些可选实施方式，所述制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：
制备GS115感受态细胞；
将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落；
向所述MD固体平板加入无菌水后，获取含有其表面His+转化子的细胞悬液；将所述细胞悬液涂布于含有G418的YPD平板上，倒置培养至单菌落出现；将所述单菌落转移至含YPD培养基的培养板中进行培养和筛选，获得第一重组酵母工程菌。
作为本申请一些可选实施方式，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，还包括：
基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌。
作为本申请一些可选实施方式，所述基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌的步骤，包括：
基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；
将所述pPICZ A-rhTH1质粒和所述重组菌株感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落，获得第二重组酵母工程菌。
作为本申请一些可选实施方式，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；
所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白。
作为本申请一些可选实施方式，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
将所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中进行培养，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；所述培养条件为30℃和220rpm；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，采用与BMGY诱导培养基等体积的BMMY培养基重悬所述菌体，使OD600nm值吸光值达到2.0；并在30℃、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，在诱导24h、48h、72h和96h时分别取菌液样品，将所述菌液样品进行离心处理收集，获得诱导上清液。
作为本申请一些可选实施方式，所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清液纯化后，获得重组贻贝黏蛋白；
将1mg/mL所述重组贻贝黏蛋白与100U/mL酪氨酸酶、20mM硼酸钠、20mM抗坏血酸混合于0.1M PBS体系中，并将所述PBS体系在常温下进行搅拌以发生鼓泡反应，直至将所述重组贻贝黏蛋白中的酪氨酸残基羟基化为DOPA；
将鼓泡反应结束后的溶液进行透析处理和超滤处理，获得重组贻贝黏蛋白。
作为本申请一些可选实施方式，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；
将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
作为本申请一些可选实施方式，将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
将所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中进行培养，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；所述培养条件为30℃和220rpm；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，采用与BMGY诱导培养基等体积的BMMY培养基重悬所述菌体，使OD600nm值吸光值达到2.0；并在30℃、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%甲醇、1%PTM1微量元素和终浓度为10mM的抗坏血酸；在诱导24h、48h、72h和96h时分别取菌液样品，将所述菌液样品进行离心处理收集，获得诱导上清液。
作为本申请一些可选实施方式，将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：
将所述诱导上清液纯化后，使用阳离子交换介质，以20mM NaH2PO4、pH 5.0的磷酸盐缓冲液进行平衡层析柱处理，至所述诱导上清液的电导率值及A280吸光值不变，获得第一诱导上清液；
设置样品上样流速5 mL/min，检测所述第一诱导上清液的紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；待上样结束后，再以磷酸盐缓冲液进行平衡阳离子层析介质处理，直至所述第一诱导上清液的紫外A280吸光值和电导率值降至最低且不再变化，停止接样，获得第二诱导上清液；
采用含1M NaCl的20mM NaH2PO4的磷酸盐缓冲液对所述第二诱导上清液进行洗脱处理和透析处理，获得目标重组贻贝黏蛋白；其中，所述NaH2PO4的pH为5.0。
为实现上述目的，本申请第三种实施例还提出了：一种如上所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的应用，采用所述重组贻贝黏蛋白制备生物黏合剂。
市场上的贻贝黏蛋白主要来源于天然提取，通常需要约10000只贻贝才能获取1mg的蛋白，其过程的低效性和高成本在很大程度上限制了其应用。重组贻贝黏蛋白分子量较小不易生产，又多为体外添加酪氨酸酶修饰，其生产成本大大增加。相较于现有技术，本申请利用毕赤酵母表达系统，通过重组表达人源纤连蛋白和三型贻贝黏融合蛋白获得一种重组贻贝黏蛋白；并以该重组贻贝黏蛋白工程菌株作为新宿主细胞，共表达酪氨酸羟化酶基因对重组贻贝黏蛋白进行羟化修饰，以获得目标重组贻贝黏蛋白。相较于传统体外修饰方法，本申请大大减少了生产工艺和成本，可以一步发酵获得具有天然活性的目标重组贻贝黏蛋白。并且通过体外细胞试验发现，本申请所述目标重组贻贝黏蛋白具有高DOPA含量和天然贻贝黏附蛋白活性，即具有良好的抑炎效果和促黏附效果，可应用于生物护肤应用；且本申请所述生产工艺简单，生产成本更低。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒图谱；
图2为本申请实施例所述 pPICZ A-rhTH1质粒图谱；
图3为本申请实施例所述一次电转化后阳性菌落PCR电泳图谱；
图4为本申请实施例所述酵母工程菌共表达体内修饰蛋白的SDS-PAGE结果图；
图5为本申请实施例所述二次电转化后阳性菌落PCR电泳图；
图6为本申请实施例所述酵母工程菌共表达体内修饰蛋白的SDS-PAGE图；
图7为本申请实施例所述纯化上清蛋白SDS-PAGE结果示意图；
图8为本申请实施例所述重组贻贝黏蛋白鉴别试验结果示意图；
图9为本申请实施例所述重组贻贝黏蛋白的多巴含量示意图；
图10为本申请实施例所述TNFα含量和IL-6含量抑制率示意图；
图11为本申请实施例所述重组贻贝黏蛋白促细胞黏附活性示意图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
现有贻贝黏蛋白产品主要是从贻贝足丝腺体中提取天然黏附蛋白，由于贻贝黏附蛋白的分泌量很低，提取1 g黏附蛋白大约需要30000只贻贝，获取贻贝黏蛋白纯品的效率及产量较低，极大的限制了贻贝黏蛋白的应用。为了大量获取贻贝黏蛋白，开始采用基因工程法制备重组贻贝黏蛋白。Hwang等将Mefp-5和Mefp-3A在大肠杆菌中表达并纯化，虽然具有与Cell TakTM（从紫贻贝Mytilus edulis中提取的足蛋白混合物）类似的黏附特性，但该方法具有产率低、纯化量低和纯化后不溶性等缺陷。对此，他们构建出一种新型融合蛋白Mefp-151，其具体序列为Mefp-5氨基酸序列N端和C端分别添加6个Mefp-1十肽序列（即AKPSYPPTYK）。在人工合成重组贻贝黏蛋白时，为了得到高黏度的贻贝黏蛋白，需要将重组蛋白中的酪氨酸残基转化为多巴。需体外添加CuSO4及酪氨酸酶进行酶促反应，将酪氨酸残基修饰成DOPA分子。这不仅仅增加了生产工艺步骤和成本，而且获取的重组贻贝黏蛋白中L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)含量很低。同时，原核表达(大肠杆菌表达系统)的贻贝黏蛋白无法对蛋白质进行翻译后修饰，导致多为胞内表达，需要进行菌体的裂解，会有大量杂质蛋白与目的蛋白混合，对纯化工艺都有极高的要求，且原核表达体系天然带有(细菌细胞壁成分)内毒素、肽聚糖，需要复杂的纯化工艺方能去除。
为解决上述问题以及获得应用更广的贻贝黏蛋白，本申请实施例所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，是通过将如SEQ ID No.3氨基酸序列所示重组贻贝黏蛋白的工程菌株作为新宿主细胞，采用酪氨酸羟化酶（UniProt：P07101-3）进行羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白；所述酪氨酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
其中，所述重组贻贝黏蛋白是贻贝黏蛋白Mefp-3A（UniProt：Q9GUX8）和纤连蛋白主要结构域FN10序列（UniProt：P02751）串联获得的；所述重组贻贝黏蛋白的预测分子量约为18kDa。其中，所述贻贝黏蛋白Mefp-3A的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述纤连蛋白主要结构域FN10的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
可以看出，相较于现有技术，本申请利用毕赤酵母表达系统，通过重组表达人源纤连蛋白和三型贻贝黏融合蛋白获得一种重组贻贝黏蛋白；并以该重组贻贝黏蛋白工程菌株作为新宿主细胞，共表达酪氨酸羟化酶基因对重组贻贝黏蛋白进行羟化修饰，以获得目标重组贻贝黏蛋白。相较于传统体外修饰方法，本申请大大减少了生产工艺和成本，可以一步发酵获得具有天然活性的目标重组贻贝黏蛋白。并且通过体外细胞试验发现，本申请所述目标重组贻贝黏蛋白具有高DOPA含量和天然贻贝黏附蛋白活性，即具有良好的抑炎效果和促黏附效果，可应用于生物护肤应用；且本申请所述生产工艺简单，生产成本更低。
在获得上述重组贻贝黏蛋白后，在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码重组贻贝黏蛋白的DNA序列进行优化设计（SEQ ID No.4），使重组贻贝黏蛋白肽更适应在毕赤酵母中表达。
将重组贻贝黏蛋白肽优化后的碱基序列（SEQ ID No.4），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成，将合成的基因片段通过EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得如图1所示的重组新型贻贝黏蛋白质粒。
在一些实施例中，所述酪氨酸羟化酶氨基酸序列为人源基因TH-1（UniProt：P07101-3），其具体序列为SEQ ID No.5，预测分子量约为55.8kDa。在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码酪氨酸羟化酶的DNA序列进行优化设计（SEQ ID No.6），使酪氨酸羟化酶肽更适应在毕赤酵母中表达。
进一步地，将酪氨酸羟化酶肽优化后的碱基序列（SEQ ID No.6），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点插入pPICZ A质粒，获得如图2所示的重组酪蛋白羟化酶质粒。
需要说明的是，Mefp-3的分子量为5-7KD，无重复单元，在Mefp中含量最少，但DOPA的含量高达28%，主要分布在基底面和外界接触的界面处，含有Arg。Arg被修饰成4-羟基-L精氨酸(R)后能以π-π键、库伦相互作用。H-键在金属表面形成有机金属络合物而黏到物体表面。有研究将Mefp-3基因转入到大肠杆菌，Mefp-3蛋白主要以包涵体的形式得到了表达。
多巴（DOPA）在贻贝黏蛋白中起到主要的黏附作用，它的含量与黏附性成正比。当贻贝黏附蛋白黏附到基体上时，DOPA与基体发生某些特定反应，形成络合物。DOPA是一种侧基为儿茶酚(邻苯二酚)官能团的氨基酸，其中的苯酚基团具有很强的金属螯合能力，能在材料表面形成不可逆的有机金属络合物，还能与蛋白质等极性聚合物形成很强的氢键，多巴对贻贝黏蛋白的防水性黏合及内聚力起关键作用。
纤连蛋白（Fibronectin，FN）是一种广泛存在于人体各种组织中的糖蛋白，是细胞外基质（ECM）的重要组成部分。它在细胞黏附、迁移、增殖、分化等过程中起着关键作用。它由三个结构域组成：一个中央的纤维连接区域（FC），两个侧翼的重复结构域（RD）。FC区域富含酸性氨基酸，具有良好的离子交换能力，可以与钙离子和其他二价阳离子结合，形成稳定的结构。FN通过其FC区域与细胞表面的整合素受体结合，促进细胞与ECM的黏附和迁移。
上述内容中所涉及的序列信息如下所示：
SEQ ID No.1:
MNNISVAVLVALVLIGSFAVQSDAADYYGPKYGPPRRYGGGNYNRYGRRYGGYKGWNNGWKRGRWGRKYY
SEQ ID No.2:
SDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDS
SEQ ID No.3:
SDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDS GGGGSGGGGSGGGGS MNNISVAVLVALVLIGSFAVQSDAADYYGPKYGPPRRYGGGNYNRYGRRYGGYKGWNNGWKRGRWGRKYY
SEQ ID No.4:
AGTGACGTGCCAAGAGACTTAGAAGTAGTTGCCGCAACACCAACCTCTTTGTTGATATCTTGGGATGCTCCCGCTGTGACTGTGAGATATTACAGAATCACTTACGGAGAAACCGGTGGTAACAGTCCTGTTCAGGAGTTTACAGTACCAGGTTCAAAGAGTACCGCTACCATTAGTGGTTTAAAGCCTGGTGTTGATTACACTATCACCGTTTATGCTGTCACGGGTAGAGGAGATAGTGGAGGCGGTGGAAGTGGAGGTGGAGGTTCTGGAGGAGGAGGCTCTATGAACAACATTTCTGTGGCTGTCCTTGTAGCCCTAGTGTTGATAGGATCTTTCGCCGTACAATCTGACGCTGCCGATTATTACGGACCTAAATACGGTCCTCCTCGTAGGTACGGTGGAGGAAATTACAATAGGTACGGAAGACGTTATGGAGGTTATAAGGGTTGGAATAATGGCTGGAAAAGGGGAAGATGGGGTAGAAAGTACTAT
SEQ ID No.5:
MPTPDATTPQAKGFRRAVSELDAKQAEAIMSPRFIGRRQSLIEDARKEREAAVAAAAAAVPSEPGDPLEAVAFEEKEGKAVLNLLFSPRATKPSALSRAVKVFETFEAKIHHLETRPAQRPRAGGPHLEYFVRLEVRRGDLAALLSGVRQVSEDVRSPAGPKVPWFPRKVSELDKCHHLVTKFDPDLDLDHPGFSDQVYRQRRKLIAEIAFQYRHGDPIPRVEYTAEEIATWKEVYTTLKGLYATHACGEHLEAFALLERFSGYREDNIPQLEDVSRFLKERTGFQLRPVAGLLSARDFLASLAFRVFQCTQYIRHASSPMHSPEPDCCHELLGHVPMLADRTFAQFSQDIGLASLGASDEEIEKLSTLYWFTVEFGLCKQNGEVKAYGAGLLSSYGELLHCLSEEPEIRAFDPEAAAVQPYQDQTYQSVYFVSESFSDAKDKLRSYASRIQRPFSVKFDPYTLAIDVLDSPQAVRRSLEGVQDELDTLAHALSAIG
SEQ ID No.6:
ATGCCAACTCCCGACGCAACTACCCCCCAAGCTAAAGGATTCCGAAGAGCCGTCTCCGAATTGGATGCCAAACAGGCCGAGGCCATTATGTCTCCACGTTTTATAGGAAGACGTCAATCTCTGATTGAGGATGCTAGAAAAGAGAGAGAAGCAGCCGTTGCTGCAGCTGCAGCTGCAGTTCCATCTGAGCCTGGTGATCCCTTGGAAGCCGTTGCTTTTGAAGAGAAAGAAGGAAAGGCTGTATTGAACCTTTTATTTTCACCTAGAGCCACCAAGCCATCTGCTTTATCTCGTGCTGTAAAGGTCTTCGAAACATTCGAGGCTAAGATCCATCACTTGGAGACGAGACCAGCACAAAGGCCAAGAGCAGGTGGTCCTCATTTGGAGTACTTTGTAAGATTAGAAGTTCGTAGGGGTGATCTGGCCGCACTTCTTTCTGGTGTCAGGCAGGTTTCAGAAGACGTTAGGTCCCCTGCTGGACCAAAGGTCCCTTGGTTTCCACGTAAAGTTTCCGAACTTGACAAGTGCCACCATCTTGTCACCAAATTTGATCCCGACCTAGATTTGGATCATCCTGGATTTTCTGATCAGGTCTACAGACAGCGAAGAAAGTTGATCGCCGAGATTGCATTTCAGTACAGACATGGAGACCCTATTCCAAGGGTTGAATATACCGCTGAGGAGATTGCCACTTGGAAGGAAGTATACACCACACTAAAAGGCCTTTATGCTACTCACGCCTGTGGAGAGCATCTTGAGGCTTTCGCATTGCTTGAAAGATTTTCTGGCTACAGAGAGGACAACATTCCTCAACTGGAGGATGTTAGTAGATTTTTAAAGGAAAGAACCGGATTTCAACTGAGGCCTGTTGCTGGTCTGTTGTCAGCTAGAGATTTCTTAGCTTCTTTGGCTTTTCGTGTCTTTCAGTGTACTCAGTACATCAGGCATGCTTCATCTCCTATGCATTCTCCTGAGCCTGATTGCTGCCATGAGCTATTGGGTCACGTGCCAATGCTAGCTGATAGAACATTTGCTCAGTTTTCACAGGATATAGGTCTGGCTTCTCTAGGAGCATCCGACGAGGAAATAGAAAAGTTGAGTACCCTTTACTGGTTCACCGTAGAGTTCGGCTTGTGCAAGCAGAATGGTGAAGTAAAAGCTTACGGTGCAGGACTTCTGTCCTCTTACGGAGAATTATTGCACTGTTTGAGTGAAGAACCTGAAATCAGAGCTTTTGACCCTGAGGCTGCTGCCGTACAACCATACCAAGATCAAACCTACCAATCTGTCTATTTCGTTAGTGAGAGTTTCTCAGATGCCAAAGACAAACTTCGTTCTTACGCTTCCCGTATTCAACGTCCATTTAGTGTGAAATTCGATCCCTATACTCTAGCTATTGATGTTTTAGACTCTCCACAGGCAGTTCGTAGGAGTTTAGAAGGAGTCCAGGATGAACTTGATACTTTAGCACACGCCTTGTCAGCAATAGGATAA
为了便于本领域技术人员理解，下面，本申请针对上述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法进行相应公开，即包括以下步骤：
步骤S10、获取目标核苷酸序列，构建质粒；
步骤S20、制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌；
步骤S30、将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
上述步骤S10中所述的质粒包括pPIC9K-FN10-Mfp3质粒和pPICZ A-rhTH1质粒，即所述步骤S10包括：基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒；基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒。
具体地，所述基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒的步骤，包括：基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPIC9K-FN10-Mfp3质粒。所述基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒的步骤，包括：基于如SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPICZ A质粒上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPICZ A-rhTH1质粒。
具体地，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌。
在本申请所述技术方案中，所述重组贻贝黏蛋白的修饰可以是在体外完成的，也可以是胞内完成的。如：
在第一种实施方案中，当在体外完成修饰时，所述制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，包括：制备GS115感受态细胞；将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落；向所述MD固体平板加入无菌水后，获取含有其表面His+转化子的细胞悬液；将所述细胞悬液涂布于含有G418的YPD平板上，倒置培养至单菌落出现；将所述单菌落转移至含YPD培养基的培养板中进行培养和筛选，获得第一重组酵母工程菌。
在该实施方案中，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白。
具体地，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：将所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中进行培养，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；所述培养条件为30℃和220rpm；以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，采用与BMGY诱导培养基等体积的BMMY培养基重悬所述菌体，使OD600nm值吸光值达到2.0；并在30℃、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，在诱导24h、48h、72h和96h时分别取菌液样品，将所述菌液样品进行离心处理收集，获得诱导上清液。
具体地，所述诱导上清液纯化后，进行体外修饰，获得修饰后的重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：将所述诱导上清液纯化后，获得重组贻贝黏蛋白；将1mg/mL所述重组贻贝黏蛋白与100U/mL酪氨酸酶、20mM硼酸钠、20mM抗坏血酸混合于0.1M PBS体系中，并将所述PBS体系在常温下进行搅拌以发生鼓泡反应，直至将所述重组贻贝黏蛋白中的酪氨酸残基羟基化为DOPA；将鼓泡反应结束后的溶液进行透析处理和超滤处理，获得重组贻贝黏蛋白。
在第二种实施方案中，当在胞内完成修饰时，所述制备感受态细胞，并将所述质粒电转化至所述感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得重组酵母工程菌的步骤，还包括：基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌。
其中，所述基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌的步骤，包括：基于第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒和所述重组菌株感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落，获得第二重组酵母工程菌。
在该实施方案中，将所述重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
具体地，将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：将所述重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中进行培养，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；所述培养条件为30℃和220rpm；以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，采用与BMGY诱导培养基等体积的BMMY培养基重悬所述菌体，使OD600nm值吸光值达到2.0；并在30℃、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%甲醇、1%PTM1微量元素和终浓度为10mM的抗坏血酸；在诱导24h、48h、72h和96h时分别取菌液样品，将所述菌液样品进行离心处理收集，获得诱导上清液。
具体地，将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白的步骤，包括：将所述诱导上清液纯化后，使用阳离子交换介质，以20mM NaH2PO4、pH 5.0的磷酸盐缓冲液进行平衡层析柱处理，至所述诱导上清液的电导率值及A280吸光值不变，获得第一诱导上清液；设置样品上样流速5 mL/min，检测所述第一诱导上清液的紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样；待上样结束后，再以磷酸盐缓冲液进行平衡阳离子层析介质处理，直至所述第一诱导上清液的紫外A280吸光值和电导率值降至最低且不再变化，停止接样，获得第二诱导上清液；采用含1M NaCl的20mM NaH2PO4的磷酸盐缓冲液对所述第二诱导上清液进行洗脱处理和透析处理，获得目标重组贻贝黏蛋白；其中，所述NaH2PO4的pH为5.0。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，包括以下步骤：
工程菌的构建、鉴定及制备
本实施例所用培养基配方如下：
1）YPD完全培养基：
酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基含2％琼脂)；
2）MD固体培养基：
YNB无氨基酸氮源13.4g/L；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖，(固体培养基含2％琼脂)；
3）BMGY酵母生长培养基：
酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L K2HPO4，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入10×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甘油10mL。
4）BMMY酵母诱导培养基：
酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L K2HPO4，加水至895mL，121℃灭菌20分钟，然后待温度降至60℃以后在超净台上加入100×YNB 100mL(13.4 g/L)，500×生物素1mL(4×10-4g/L)，甲醇5mL。
1、蛋白序列选择及重组质粒的获取
本申请所述贻贝黏蛋白序列为新型融合蛋白FN10-Mfp3，其具体序列为贻贝黏蛋白Mefp-3A（UniProt：Q9GUX8）氨基酸序列（SEQ ID No.1）和纤连蛋白主要结构域FN10（UniProt：P02751）序列（SEQ ID No.2），串联获得新型贻贝黏蛋白多肽序列（SEQ IDNo.3）；预测分子量约为18kDa。在C端添加终止子，针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码融合蛋白的DNA序列进行优化设计（SEQ ID No.4），使融合蛋白肽更适应在毕赤酵母中表达。将重组新型蛋白肽优化后的碱基序列（SEQ ID No.4），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点插入pPIC9K质粒，获得如图1所示重组新型贻贝黏蛋白质粒。
本申请所述酪氨酸羟化酶氨基酸序列为人源基因TH-1（UniProt：P07101-3），其具体序列为SEQ ID No.5，预测分子量约为55.8kDa。在C端添加终止子。针对不同宿主中基因的转录、翻译过程存在差异，对编码融合蛋白的DNA序列进行优化设计（SEQ ID No.6），使酪氨酸羟化酶肽更适应在毕赤酵母中表达。将酪氨酸羟化酶肽优化后的碱基序列（SEQ IDNo.6），委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成。将合成的基因片段通过EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位点插入pPICZ A质粒，获得如图2所示重组酪蛋白羟化酶质粒。
2、重组工程菌的构建及筛选
将上述优化后的碱基序列（SEQ ID No.4、SEQ ID No.6）委托金斯瑞生物科技股份有限公司进行基因片段合成，经测序验证后提供相应质粒和穿刺菌，扩大培养后提取高浓度质粒备用。
2.1 pPIC9K-FN10-Mfp3质粒的线性化
使用QuickCut Sac Ⅰ对上述提取的10 μg质粒pPIC9K-FN10-Mfp3进行线性化酶切，酶切条件为37 ℃，5 h，酶切体系如表1所示：
电泳验证后，加入0.1倍体积 3 M NaAc (pH 5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20 ℃放置过夜。4 ℃，13000 rpm离心20 min，弃上清；加入700 μL 75%乙醇漂洗，13000 rpm离心20 min，弃上清，重复一遍；EP管倒置于超净台吸水纸上约10 min，尽量去除水分和残留乙醇，20 μL ddH2O重新溶解质粒，取1μL稀释10倍，并用one-drop检测核酸浓度。
2.2 GS115感受态细胞的制备
GS115菌株平板划线后挑取单菌落接种于20 mL YPD，30 ℃、225 rpm培养24 h；以1：1000接种比例转接于50 mL YPD液体培养基，30 ℃、225 rpm培养至OD600nm吸光值为1.3-1.5；将菌液转入无菌50 mL离心管，4 ℃，1500 rpm，离心5 min，弃上清后收集菌体；用50mL预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀，4 ℃，1500 rpm，离心5 min；弃上清后，用50 mL 预冷的无菌超纯水重悬菌体沉淀；4 ℃，1500 rpm 离心5min，弃上清后，40 mL预冷的无菌1 M山梨醇重悬细胞沉淀；4 ℃，1500 rpm 离心5 min，弃上清后，用100-150μL预冷的无菌1 M山梨醇重新悬浮细胞沉淀，温和旋转混匀，置于冰上，待用。
2.3 电转化至GS115感受态细胞
取100μLGS115感受态细胞与10μL线性化的pPIC9K-FN10-Mfp3质粒混合，移入预冷的电转化杯中，立即冰浴5 min。选择电转仪的酵母模式，进行电击。然后立即向电转杯中加入1 mL预冷的1 M的山梨醇，混合均匀后将混合物转移到无菌EP管中，30 ℃培养箱静置孵育1-2 h。取100μL~ 200μL菌液涂布于MD固体平板，室温静置10min，30℃培养箱倒置培养约2~5 d，直至出现单菌落。
2.4 阳性转化子的筛选
向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中。用分光光度计计数，OD600≈ 5 × 107cells/mL。以无菌水稀释成105cells/mL浓度的细胞悬液，涂布于含有0.5mg/mL G418的YPD平板上，倒置，30℃培养3～4d后至单菌落出现。挑取YPD平板单菌落，转移至含200μL YPD培养基的96孔培养板中，于30℃继续培养。48h后，吹匀菌液，每孔吸取10μL转移至新的96孔培养板（含190μLYPD），继续培养24h后重复一次上述步骤。24h后，吹匀第三块96孔板中菌液，并吸取1μL分别点在含有1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL G418的YPD平板上继续培养。转化子若能在含4mg/mL高浓度G418的平板上生长，说明该转化子含有多拷贝的目的基因。
经过这一步筛选可得到可高效表达的重组酵母工程菌种。
2.5 阳性转化子的鉴定
取上述2.4步骤中第一块96孔板剩余菌液50μL，沸水浴中煮沸10 min，液氮中冻存30 min，沸水浴中煮沸10 min，反复冻融后，12000 rpm离心5 min，取上清作为PCR模板，通过PCR扩增鉴定目的基因是否整合到酵母染色体上。
上游引物：5’AOX1(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)
下游引物：3'AOX1(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’)
PCR条件：98℃预变性，5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃复性10min。
对扩增的产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定是否扩增出预期大小的基因片段（约1000bp，图3）。
2.6 重组贻贝黏蛋白的表达和体外修饰
2.6.1 重组贻贝黏蛋白的表达及纯化
具体操作为：挑取单菌落接种于BMGY培养基，30℃，220rpm培养24 h至OD600nm吸光值为2.0-6.0。根据实测OD600nm吸光值调整BMGY培养菌液体积，3000rpm，10min收集菌体，用与BMGY等体积的BMMY培养基重悬菌体，使起始OD600nm吸光值为2.0。30℃，220 rpm继续培养，每24h向培养基添加0.5%甲醇，诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集表达上清。经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白分子量（约20kDa）和表达量（图4）。
2.6.2 重组贻贝黏蛋白的体外修饰
体外DOPA修饰需要在酸性环境下添加一定浓度的酪氨酸酶（Cu2+）、抗坏血酸、硼酸钠等。具体操作为：将含有1mg/mL重组贻贝黏蛋白、100U/mL酪氨酸酶、20mM硼酸钠、20mM抗坏血酸的0.1M PBS体系在25℃搅拌并鼓泡反应（通气）5h将蛋白中酪氨酸残基羟基化为DOPA。反应过程中实时控制反应温度和鼓泡速度。反应结束后溶液透析、超滤得到修饰后重组贻贝黏蛋白A。
2.7 重组贻贝黏蛋白工程菌株的二次电转化
使用PmeⅠ对pPICZA-rhTH1质粒进行线性化酶切（参照步骤2.1）。取上述步骤2.5中筛选的高拷贝菌株制备重组菌株感受态细胞（参照步骤2.2）。
取100μL酵母感受态细胞与10μL线性化质粒混合，移入预冷的电转化杯中，立即冰浴5 min。选择电转仪的酵母模式，进行电击。然后立即向电转杯中加入1 mL预冷的1 M的山梨醇，混合均匀后将混合物转移到无菌EP管中，30 ℃培养箱静置孵育1-2h。取100μL ~ 200μL菌液涂布于YPD固体平板（含0.25mg/mL Zeocin），室温静置10min，30℃培养箱倒置培养约2~5 d，直至出现单菌落。
2.8 阳性菌株的鉴定
挑取少量上述2.6步骤中的单菌落溶于10-20μL无菌水，沸水浴中煮沸10 min，液氮中冻存30 min，沸水浴中煮沸10 min，反复冻融后，12000 rpm离心5 min，取上清作为PCR模板，通过PCR扩增鉴定目的基因是否整合到酵母染色体上。
上游引物：5’- TCATGCCAACTCCCGACGCAACTA-3’
下游引物：5’- TTATCCTATTGCTGACAAGGCGTGTG-3’
PCR条件：98℃预变性，5min，98℃热变性50s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃复性10min。
对扩增的产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，鉴定是否扩增出预期大小的基因片段（约1500bp，图5）。
3、重组酵母菌的诱导表达
挑取单菌落接种于BMGY培养基，30 ℃，220 rpm培养24 h至OD600nm吸光值为2.0-6.0。根据实测OD600nm吸光值调整BMGY培养菌液体积，3000 rpm，10 min收集菌体，用与BMGY等体积的BMMY培养基重悬菌体，使起始OD600nm吸光值为2.0。在30 ℃，220 rpm继续培养，每24 h向培养基添加0.5%甲醇、1%微量元素（PTM1）和抗坏血酸（终浓度10mM），诱导后24h、48h、72h、96h分别取菌液样品，离心收集表达上清。经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白分子量（约23kDa）和表达量（图6）。
体操作为：取上清液40μL，加入10μL5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH6.8)，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μL加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色40min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
6、纯化
离心收集培养液上清。使用阳离子交换介质（层析填料为千纯产SP Purose 6High Performance，装载于GE Akta层析系统），以磷酸盐缓冲液（20mM NaH2PO4，pH 5.0）平衡层析柱至电导率值及A280吸光值不变，设置样品上样流速5 mL/min，检测紫外A280吸光值，当其上升时，开始接样。待上样结束后，再以磷酸盐缓冲液平衡阳离子层析介质，直至紫外和电导降至最低且不再变化，停止接样。再以含NaH2PO4-NaCl（1M）缓冲液洗脱并收集对应的蛋白，透析后得到重组贻贝黏蛋白B原液。
利用SDS-PAGE检测分子量和纯度（图7），与体外修饰蛋白（A）和天然提取贻贝黏蛋白比较测量蛋白活性。
实验例1
贻贝黏蛋白的鉴别
参考行业标准（YY/T 1293.6-2020）“接触性创面敷料第6部分：贻贝黏蛋白敷料”附录A试验方法。在碱性和过量甘氨酸作为还原剂的条件下，多巴蛋白分子内的多巴(DOPA)残基的12-苯二酚可氧化转化为醒类化合物，加入氯化硝基四氧唑蓝(NBT)后，生成不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)。
试验材料：
甘氨酸-钾缓冲液(pH10.0)：称取75g甘氨酸溶解于400mL水中，用固体KOH调节pH到10，加水定容至500mL，配好后2℃~8℃保存。
硼酸钠溶液：称取25g十水合硼酸钠溶于40mL水，40℃超声加热溶解。
NBT染色液：称取9mg NBT 加15 mL甘氨酸-钾缓冲液溶解，混匀，临用现配。
样本：重组贻贝黏蛋白A（体外修饰）、重组贻贝黏蛋白B（共表达修饰）、天然提取贻贝黏蛋白（购自江阴贝瑞森）。
具体实施方法：取2μL样品点在5cm×5cm的0.2μm的硝酸纤维素膜(NC膜)上，标记样品位置。待样品被NC膜吸收后，将载有样品的NC膜放置于500mL烧杯中，加纯水300mL后超声10 min。取出NC膜放入培养皿，加入NBT染色液避光染色45min。取出NC膜用硼酸钠溶液冲洗两次后，保存于硼酸钠溶液中过夜，再用纯水冲洗3次，观察样品标记处有蓝紫色斑点生成，及时拍照保存结果，见图8。经多巴修饰的样品（重组贻贝黏蛋白A、B）和天然贻贝黏蛋白点样处显明显的紫红色，未修饰样品无紫红色斑点（可见无色印记）。
实验例2
多巴含量试验
参考行业标准（YY/T 1293.6-2020）“接触性创面敷料第6部分：贻贝黏蛋白敷料”附录B试验方法。含有3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)结构的物质在酸性条件下呈黄色，当过量碱加入时会变为深橘红色。
试验材料：
盐酸溶液(0.012 mol/L)：取0.2 mL盐酸用纯水稀释定容至200 mL。
DOPA标准溶液(200μg/mL)：称取DOPA标准品20 mg用盐酸溶液定容至100 mL，临用现配。
酸性试剂(0.516 mol/L)：取4.3 mL盐酸，用纯水稀释定容至100 mL。
碱性试剂(1 mol/L)：称取4.0 g氢氧化钠（NaOH），用纯水稀释定容至100 mL。
亚硝酸试剂：称取二水合钼酸钠10 g和亚硝酸钠10 g，用纯水溶解并定容至100mL。
具体实施方法：DOPA 标准液系列制备：分别取DOPA标准溶液0 mL、0.1 mL、0.5mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5mL、3 mL用盐酸溶液稀释定容至10mL，摇匀，备用。分别取上述系列标准液1 mL，向每支试管中加入0.5mL 酸性试剂，然后向每支试管依次加入1.5 mL亚硝酸试剂和2mL碱性试剂(碱性试剂要在亚硝酸试剂加入后的5 min内加入)，摇匀。取待测样品1mL于10 mL 试管中按照上述方法进行操作，以0号管为空白，用1cm比色皿在波长为500 nm下测定配制好的标准溶液和样品溶液吸光度。若待测溶液吸光度超过标准曲线最高值，需对样品进行稀释。（注：样品如有干扰比色现象，用3000 r/min 转速离心10 min，取上清液进行比色）。
以DOPA 浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标做标准曲线，如表2所示；再根据测得的样品溶液的吸光度计算出样品的 DOPA含量如图9所示：
可以看出，将蛋白浓度统一稀释至1mg/mL测定多巴含量，结果显示：经多巴修饰的样品（重组贻贝黏蛋白A、B）和天然贻贝黏蛋白有明显吸光值，未修饰样品无明显吸光值。重组贻贝黏蛋白A、B对应的DOPA浓度分别为2.1μg/mL和6.058μg/mL；天然贻贝黏蛋白DOPA浓度为1.4μg/mL。由此可知，重组贻贝黏蛋白经共表达酪氨酸羟化酶修饰后具有更高的多巴含量。
实验例3
体外抑炎功效评价
研究表明，脂多糖（LPS）能够引发RAW264.7巨噬细胞较强烈的炎症反应，表现为炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA水平的表达上调及细胞因子分泌水平的升高。通过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞促炎分化模型的建立，研究IL-37和TSG-6在体外抑制炎症的作用效果。
试验材料：
细胞：小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中国医学科学院细胞培养中心。
试剂：脂多糖（Sigma）、DMEM培养基（高糖型）、0.25%胰酶、FBS、双抗、PBS、MTT、DMSO、地塞米松（国药）、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒（购自R＆D）。
具体实施方法：将处于对数生长期的RAW264.7细胞重悬后稀释至1×105/mL，向96孔板内每孔加入100μL细胞悬液，四周每孔加入200μLPBS作为保湿孔，放置于37℃ 5%CO2培养箱培养24h。观察RAW264.7细胞的形态、密度以及分布是否均匀，以确定是否满足后续试验的需求。然后，吸弃全部培养液，后续使用的培养液均为不含FBS的DMEM基础培养基。针对不同组别加入含不同成分的DMEM培养液0.9mL，具体分组见表3，每组3个复孔，37℃ 5%CO2培养箱培养6h。
预处理后空白对照组加入0.1mL DMEM培养液，LPS模型组及各用药组加入0.1mL含10μg/mL LPS的DMEM培养液，37℃ 5%CO2培养箱培养24h。分别于刺激后24h收集细胞培养上清液。通过ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α和IL-6的水平；操作步骤参照试剂盒公司提供的产品说明书进行。
数据处理和分析：所有实验结果均重复3次，且表示为平均值±标准差，采用SPSS22.0对抗炎活性数据进行单因素方差分析（S-N-K检测）和多重比较。TNF-α和IL-6抑制率的计算公式：抑制率（%）=（1-T/C）×100%，其中，T：受试物TNF-α和IL-6含量平均值；C：阴性对照TNF-α和IL-6含量平均值。结果如表3和图10所示：
实验例4
体外促细胞黏附试验
试验材料：
完全细胞培养液：加入10%胎牛血清的DMEM培养液（含双抗），4℃保存。
无血清培养基：1640培养液（含双抗），4℃保存。
消化液：0.25%胰蛋白酶。
PBS缓冲液：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并定容至1000mL，经121℃、15分钟高压灭菌。
BALB/c 3T3细胞（购自武汉普诺赛）。
BSA（购自Sigma）。
具体实施方法：将纤连蛋白用PBS预稀释至0.5μg/mL，预稀释完成后在96孔板中进行2倍梯度稀释，共做8个稀释度，每孔50μL不同稀释度的纤连蛋白样本，并设立阴性对照（不加纤连蛋白），加入50μL PBS作为对照，4℃过夜孵育。孵育完成后，弃去板中液体，每孔加入100μL PBS洗涤，共洗涤3次；洗涤结束后，每孔加入100μL 30μg/μL BSA封闭，置于37℃温箱孵育1h；孵育完成后，弃去板中液体，每孔加入100μL PBS洗涤3次，再加入纤维细胞悬液，细胞接种密度为5.0×105cells/mL，每孔接种100μL，温箱孵育5h。将孵育完成的细胞板PBS洗涤3次，镜下观察细胞贴壁情况，选取200倍镜下除边缘处五个点计贴壁细胞数，根据计数结果拟合曲线得出效价。
结果表明，重组贻贝黏蛋白A、B和天然贻贝均有促细胞黏附活性，见图11。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种具有天然活性的重组贻贝黏蛋白，其特征在于，将表达如SEQ ID No.3所示的重组贻贝黏蛋白 FN10-Mfp3的工程菌株作为新宿主细胞，采用氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的酪氨酸羟化酶进行共表达的体内羟化修饰后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
2.一种如权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒；基于如SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒；
制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，进行培养和阳性转化子筛选，获得高效表达新型融合蛋白 FN10-Mfp3 的第一重组酵母工程菌种；基于所述第一重组酵母工程菌制备重组菌株感受态细胞；将所述pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌；
将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液；将所述诱导上清液纯化后，获得目标重组贻贝黏蛋白。
3.根据权利要求2所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，构建pPIC9K-FN10-Mfp3质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入质粒pPIC9K上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPIC9K-FN10-Mfp3质粒。
4.根据权利要求2所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，构建pPICZ A-rhTH1质粒的步骤，包括：
基于如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列进行基因片段合成，并将合成的基因片段插入pPICZ A质粒上的酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ之间，获得pPICZ A-rhTH1质粒。
5.根据权利要求2所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备GS115感受态细胞，并将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒电转化至所述GS115感受态细胞，进行经过培养和阳性转化子筛选，获得高效表达新型融合蛋白 FN10-Mfp3 的第一重组酵母工程菌种的步骤，包括：
制备GS115感受态细胞；
将所述pPIC9K-FN10-Mfp3质粒与所述GS115感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落；
向所述MD固体平板加入无菌水后，获取含有其表面His+转化子的细胞悬液；将所述细胞悬液涂布于含有G418的YPD平板上，倒置培养至单菌落出现；将所述单菌落转移至含YPD培养基的培养板中进行培养和筛选，获得高效表达新型融合蛋白 FN10-Mfp3 的第一重组酵母工程菌种。
6.根据权利要求2所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，所述将pPICZ A-rhTH1质粒电转化至所述重组菌株感受态细胞，获得第二重组酵母工程菌的步骤，包括：
将所述pPICZ A-rhTH1质粒和所述重组菌株感受态细胞混合，冰浴后，进行电击，再加入山梨醇溶液，混合均匀后，转移至无菌EP管中进行静置孵育；孵育完成后，涂布于MD固体平板进行倒置培养，直至长出单菌落，获得第二重组酵母工程菌。
7.根据权利要求2所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的制备方法，其特征在于，将所述第二重组酵母工程菌进行放大培养，并经诱导表达后，收集诱导上清液的步骤，包括：
将所述第二重组酵母工程菌接种于BMGY诱导培养基中进行培养，培养至OD600nm吸光值达到2.0-6.0；所述培养的条件为30℃和220rpm；
以3000rpm的转速离心10min后，收集菌体，采用与BMGY诱导培养基等体积的BMMY培养基重悬所述菌体，使OD600nm值吸光值达到2.0；并在30℃、220rpm的条件下继续培养，并每24h添加0.5%的甲醇，在诱导24h、48h、72h和96h时分别取菌液样品，将所述菌液样品进行离心处理收集，获得诱导上清液。
8.一种如权利要求1所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白的应用，其特征在于，采用所述具有天然活性的重组贻贝黏蛋白制备生物黏合剂。
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