KR20120114072A

KR20120114072A - 티로시나아제 동시발현에 의해 제조된 홍합 접착 단백질

Info

Publication number: KR20120114072A
Application number: KR1020110031824A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 최유성
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-06
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2012-10-16
Also published as: KR101412773B1

Abstract

본 발명은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조방법, 상기 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하긴 위한 형질전환체, 및 상기 재조합 홍합 접착 단백질의 접착제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

티로시나아제 동시발현에 의해 제조된 홍합 접착 단백질 {Mussel adhesive proteins obtained from tyrosinase co-expression}

본 발명은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조방법, 상기 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하기 위한 형질전환체, 및 상기 재조합 홍합 접착 단백질의 접착제로서의 용도에 관한 것이다.

해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착 단백질(adhesive proteins)을 생산 및 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다. 그리고, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 아직까지 화학접착제 개발에서 미완의 과제로 남아 있는 젖은 표면에서의 접착도 몇 분 안에 가능하다. 더욱이, 홍합 접착 단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등 의료분야에 응용 가능성이 크다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 세포의 표면 접착에도 이용될 수 있는데, 세포의 표면 접착 기술은 세포 배양 및 조직 공학 분야에 필요한 매우 중요한 기술 중의 하나로, 세포의 증식 및 분화를 촉진시키는 데 매우 중요하다.

그러나 홍합으로부터 자연 추출한 접착물질 1 그램을 얻기 위해서는 약 일만 마리의 홍합을 필요로 하기 때문에, 홍합 접착 단백질의 물성이 매우 뛰어남에도 불구하고, 자연 추출한 홍합 접착 단백질을 산업적으로 이용하기에 많은 제약이 따르고 있다. 하나의 대안으로 유전자 재조합 기술을 이용한 홍합 접착 단백질 대량생산 연구가 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 등에서 수행되었으나, 여전히 산업적으로 유의미한 생산량을 얻기에 부족하였다.

본 발명자들은 이전의 연구에서, Mefp-1에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(decapeptide)를 6번 반복하여 Mgfp-5의 양쪽 말단에 융합한 새로운 형태의 홍합 접착 단백질인 fp-151을 개발하였으며, 상기 재조합 홍합 접착 단백질이 대장균에서 대량생산이 가능하고, 정제과정 또한 매우 단순하여 산업적 이용 가능성이 매우 높음을 확인한 바 있다 (국제공개번호 제WO2006/1071831A1호 또는 제WO2005/092920호). 그러나, 대장균에서 대량 생산한 홍합 접착 단백질은 별도의 전사 후 수정(post-translational modification) 메커니즘이 존재하지 않아, 자연 추출한 홍합 접착 단백질과 달리 아미노산 잔기들이 수정되어 있지 않다는 문제가 있다.

홍합 접착 단백질이 기질의 표면에 접착하는 기작은 단백질 자체의 3차원 구조적인 특성과, 단백질을 구성하는 티로신 잔기의 효소 및 화학적 수정에 의한 것으로 보고되고 있다. 대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 20-30 %이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 도파(Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine)로 변화되어 있고, 이 도파가 표면에의 접착에 가장 주된 역할을 수행하는 것으로 추정되고 있다. 또한 도파는 산화과정을 거쳐 최종적으로 도파 퀴논(Dopa o-quinone)으로 변화되는데 이 도파 퀴논은 접착단백질들 사이의 가교화(cross-linking)을 일으키게 함으로써 접착을 견고하게 하는 역할을 수행한다. 따라서, 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기의 변형은 홍합 접착 단백질의 기능을 효율적으로 발휘하는 데 매우 중요하다.

대장균에서 생산된 홍합 접착 단백질은 티로신 잔기들이 변형되어 있지 않아, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 수정 반응이 수행되고 있다. 예를 들면, 지금까지 홍합에서 티로신 잔기를 변형시키는 효소는 명확히 밝혀지지 않았지만, 대표적 산화효소인 티로시나아제는 인 비트로(In-vitro) 상에서 티로신을 도파나 도파퀴논으로 변형시키는 대표적인 효소로 알려져 있어, 대장균으로부터 생산된 홍합 접착 단백질은 정제 후에 별도로 인 비트로 상에서 티로시나아제를 이용하여 티로신 잔기를 변형하고 있다. 하지만 인 비트로 상에서 상기의 수정반응을 수행할 경우, 별도의 반응을 추가로 수행해야 하고, 사용하는 효소의 비용이 매우 높은 점 등, 산업적으로 활용하기에 효율성과 경제성 측면에서 한계로 작용하고 있다.

이에, 본 발명자들은 티로신 잔기가 수정된 홍합 접착 단백질을 대량 생산하는 기술을 개발하고자 노력한 결과, 하나의 숙주세포에서 홍합 접착 단백질과 티로시나아제를 동시에 발현시킴으로써 인 비트로 상에서 별도의 수정 반응을 수행하지 않고 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기들을 대장균 세포 내에서 수정하는 방법을 개발하였으며, 이렇게 생산된 홍합 접착 단백질이 티로신 잔기가 수정된 상태로 정제 가능하며 기존의 인 비트로 상에서 수정한 홍합 접착 단백질에 비해 우수한 접착능을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산이 포함된 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산이 포함된 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 방법으로 제조된, 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 홍합 접착 단백질을 포함하는 접착제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은

(1) 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 각각 제조하는 단계;

(2) 상기에서 제조한 두 벡터를 하나의 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환체를 배양하여 티로시나아제 및 홍합 접착 단백질을 동시 발현시키는 단계를 포함하는, 티로신 잔기가 도파 (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine) 또는 도파 퀴논(Dopa o-quinone)으로 변형된 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 상세히 설명한다.

단계 (1)은 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 각각 제조하는 단계이다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 fp(foot protein)-1 내지 fp-6 단백질 또는 이의 변이체를 포함하며, 바람직하게는 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-3 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-5 단백질 또는 이들의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 단백질이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 연속 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 융합된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 융합 폴리펩타이드의 예시로 서열번호 1의 fp-151 단백질 또는 서열번호 3의 fp-131 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체는, 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다

상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명에서 티로시나아제는 상기 티로신의 잔기를 도파 또는 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소라면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 대장균에서 홍합 접착 단백질과 동시 발현하여 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기를 도파 또는 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

대장균에서 홍합 접착 단백질과 동시 발현이 되지 않을 경우, 세포 내에서 효율적으로 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기를 수정할 수 없기 때문이다.

본 발명에서의 상기 홍합 접착 단백질 및 티로시나아제 단백질은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다.

본 발명에서 벡터란, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 벡터 pET22b(+) 또는 pET23b(+)에 삽입한 발현 벡터를 제조하였으며, 또한 상기 티로시나아제를 코딩하는 핵산 및 티로시나아제가 활성을 나타내도록 하기 위한 활성 부위(active site)에 구리를 도입하는데 관여하는 유전자 orf438을 벡터 pACYC-Duet 에 삽입한 발현 벡터를 제조하였다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 홍합 접착 단백질과 티로시나아제를 코딩하는 핵산 서열은 숙주세포에서 주로 사용하는 코돈으로 변형 및 최적화되거나, 코돈 서열의 중복 또는 반복을 피하기 위한 다른 코돈 서열로 변형하여 사용할 수 있다.

단계 (2)는 상기에서 제조한 두 벡터를 하나의 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계이다.

상기 단계 (1)에서 제조한 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주세포의 예이다. 바람직하게는 대장균이 사용될 수 있다.

벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 제작된 두 가지 벡터, 즉 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 동시에 대장균 BL21 (DE3) 균주에 42 ℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법에 의해 도입하여, 상기 수정된 홍합 접착 단백질을 생산하는 형질전환체를 제조하였다.

단계 (3)은 상기 형질전환체를 배양하여 티로시나아제 및 홍합 접착 단백질을 동시 발현시키는 단계이다.

상기 수정된 홍합 접착 단백질의 발현은, 제작된 외부 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터와 숙주세포에 따라 통상의 방법으로 실시할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 구체적인 일 양태로, 상기 형질전환체는 통상의 LB 배지에서 배양할 수 있으며, 상기 수정된 홍합 접착 단백질의 생산을 위하여 발현 유도 물질인 IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside)를 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 일 구현예로서, 엠피실린과 클로로엠피니콜이 첨가된 LB 배지에 상기 형질전환체를 접종하여 진탕배양하고, 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 600nm에서 0.4 내지 1이 되었을 때 단백질의 발현 유도물질인 IPTG를 0.1 내지 10 mM 첨가한 후, 추가로 16 ℃ 내지 37 ℃에서 3시간 내지 24시간 동안 진탕 배양하여 발현할 수 있다.

상기의 방법으로 동시 발현시킨 수정된 홍합 접착 단백질의 발현 여부의 확인은, 예컨대 회수된 전세포를 버퍼 수용액에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기 또는 고압분 질기를 이용하여 파쇄하고, 파쇄된 세포의 일부를 수용성 분액 및 불용성 분액으로 나누어 통상의 SDS-PAGE 상에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법은 (4) 형질전환체 내에서 동시발현에 의하여 생산된 홍합 접착 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 분리 방법에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC) 등이 이용될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

구체적인 일 양태로, 형질전환체에서 생산된 수정된 홍합 접착 단백질은, 회수된 전세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 파쇄된 세포의 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼을 이용한 변형된 친화도 크로마토그래피를 실시하여 분리 및 정제할 수 있다. 정제된 단백질은 물을 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아있는 물과 단백질 성분 이외의 성분을 제거하고 최종적으로 동결건조를 통해 파우더 형태로 정제된 단백질을 생산할 수 있다. 한편, 불용성 분액에 존재하는 수정된 홍합 접착 단백질은 이전의 상기 홍합 접착 단백질 정제 방법을 이용하여 정제를 수행할 수 있다. 최종적으로 수정된 홍합 접착 단백질의 정제여부는 통상의 SDS-PAGE와 MALDI-MS분석을 통하여, 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기의 수정여부는 LC-MS/MS를 통하여 확인하였다(도 3 내지 도 7).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 제조된 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서의 수정된 홍합 접착 단백질은 접착제로서 상기의 기존 홍합 접착 단백질이 사용될 수 있는 용도에 동일하게 적용될 수 있어 미세접착 시스템 뿐만 아니라, 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 수정된 홍합 접착 단백질을 이용하였을 때, 기존의 인 비트로 상에서 수정시킨 홍합 접착 단백질보다 약 3배 가량 큰 접착력을 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8).

본 발명의 접착제는, 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 적용하기 위해 사용될 수 있으며, 즉 상기 기질을 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 제조방법은 상기의 기존 홍합 접착 단백질의 접착제 제조방법에 준하고, 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다.

특히 본 발명의 접착제는 생체 물질에 적용될 수 있는데, 상기 생체 물질은 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 의미하며, 일예로는, 세포, 조직, 기관, RNA, DNA, 단백질, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 호르몬, 지질 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 물질에 사용되는 경우 본 발명의 접착제는 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 Cell-Tak 제품(BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, 미국)에 준하여 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명의 접착제는 용제형, 수용성, 무용제형일 수 있으며, 기질에 대하여 0.01 내지 100 ug/cm²로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 접착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수 (물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자, 의약물, 생리적 또는 대사적 관찰 장치, 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).

또한 본 발명은 접착제에 계면활성제, 산화제, 가교제, 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 수정된 홍합 접착 단백질의 농도를 조절함으로써 상기 접착제의 접착력을 조절할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).

본 발명은 인 비트로 상에서 별도의 티로신 수정 반응을 수행하지 않고도 형질전환대장균으로부터 티로신 잔기가 수정된 홍합 접착 단백질을 직접 생산할 수 있으므로, 활성형의 홍합 접착 단백질을 대량으로 용이하게 확보할 수 있다.

도 1은 티로시나아제 발현 벡터 pACYC-Tyr-438 의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 티로시나아제와 홍합 접착 단백질의 동시발현을 위한 형질전환체를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 형질전환체에서 fp-151 만 발현시킨 경우와(Fp-151 expression) fp-151 및 티로시나아제를 동시 발현시킨 경우(Fp-151 co-expression), 각각 수용성 분액(S) 과 불용성 분액(IS)을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 동시발현에 의해 생산된 수정된 홍합 접착 단백질 fp-151의 정제 결과를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 정제된 단백질의 분자량을 MALDI-MS로 분석한 결과이다.
도 6은 정제된 단백질을 트립신 처리하여 펩티드 단편으로 나누고 LC-MS/MS 분석을 수행하여 티로신 잔기의 수정 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 NBT (nitroblue tetrazolium chloride) 시약을 이용하여 상기 정제된 단백질 내의 티로신 잔기의 수정 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 BSA(bovine serum albumin), 라이소자임, 기존의 인 비트로 상에서 수정한 홍합 접착 단백질 fp-151 (Sole Fp-151) 및 동시발현에 의해 얻어진 수정된 홍합 접착 단백질 fp-151(Co-Fp-151)의 접착력을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍합 접착 단백질 발현 벡터의 제조

1-1. 홍합 접착 단백질 fp -151 발현 벡터의 제조

홍합 접착 단백질 fp-151은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 fp-1 을 이루는 아미노산 중에서 80번 정도 반복되는 10개의 아미노산으로 구성된 데카펩타이드(decapeptide)가 대장균에서 발현될 수 있도록 6번 반복된 아미노산으로 이루어진 fp-1 변이체를 합성하고, 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 삽입한 후, 대장균에서 생산한 것이다. 구체적으로, fp-151는 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7의 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-5의 N-말단 및 C-말단에 각각 6xAKPSYPPTYK을 연결한 것으로, 서열번호 1로 나타낼 수 있다. 국제공개번호 제WO2005/092920호에 명시되어 있는 fp-151 유전자를 포함하는 pMDG151 벡터로부터, 두 개의 프라이머, 즉 정방향 프라이머: 5'-gag gta tat att aat gta tcg-3' (서열번호 19) 및 역방향 프라이머: 5'-gat tta atc tgt atc agg-3' (서열번호 20)을 이용하여 fp-151 유전자를 증폭하였고, 이를 NdeI과 HindIII 제한효소를 이용하여 pET-22 벡터에 도입하였다 (D.S. Hwang et. al., Biomaterials 28, 3560-3568, 2007).

1-2. 홍합 접착 단백질 fp -131 발현 벡터의 제조

홍합 접착 단백질 fp-131은, 상기의 fp-151과 마찬가지 방식으로, 2개의 fp-1 변이체 사이에 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-3A의 유전자(Genbank No. BAB16314 또는 AB049579)를 삽입한 후, 대장균에서 생산한 것이다. 구체적으로, fp-131은 fp-1 (Genbank No. Q27409 또는 S23760)의 아미노산 서열에서, 서열번호 6으로 기재되는 AKPSYPPTYK로 이루어진 펩타이드가 6회 반복 연결된 서열번호 7로 표시되는 fp-1 변이체(이하, 6xAKPSYPPTYK라 함)를 제조하고 Mgfp-3 의 N-말단 및 C-말단에 각각 6xAKPSYPPTYK을 연결한 것으로, 서열번호 3으로 나타낼 수 있다. 상기 서열번호 3의 fp-131의 유전자를 국제공개특허 제2005/092920호에 명시되어 있는 fp-151 유전자 제조 방식과 마찬가지 방식으로 제조하였고, fp-131 유전자도 마찬가지로 제한효소 NdeI과 HindIII를 이용하여 pET-22 벡터에 도입하였다.

1-3. 홍합 접착 단백질 fp -5 발현 벡터의 제조

홍합 접착 단백질 fp-5은 자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463 또는 AY521220)를 대장균에서 생산한 것으로, 서열번호 5로 나타낼 수 있다 (D. S. Hwang et al., Applied and environmental microbiology, 70, 3352-3359, 2004). 그리고, 상기 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 발현양을 증대시키기 위하여 상기 유전자를 대장균에서 빈번하게 사용되는 유전자 코돈으로 변형하여 화학합성하고, 이를 두 개의 프라이머, fp-5-HT-forward: 5'-GCC CAT ATG AAA CAC CAT CAC CAT CAC CAT CTG GTG CCG CGC GGC AGC AGC TCT GAA G-3' (서열번호 21) 및 fp-5-HT-reverse: 5'-TTC GGA TCC TCA GCT GCT GCC GCC-3' (서열번호 22) 을 이용하여 PCR로 증폭하여, 제한효소 NdeI과 BamHI 자리를 이용하여 pET-23 벡터에 도입하였다.

실시예 2. 티로시나아제 발현 벡터의 제조

활성형 티로시나아제의 발현을 위하여 방선균 (Streptomyces antibioticus) 유래의 티로시나아제 유전자를 방선균 게놈으로부터 두 개의 DNA 프라이머 pSA-mel-5p: 5'-cac caG GAT CCg acc gtc cgc aag aac-3' (서열번호 23) 및 pSA-mel-3p: 5'-cac AAG CTT tca gac gtc gaa ggt-3' (서열번호 24) 을 이용하여 PCR로 증폭하고, 이를 발현벡터인 pACYC-Duet 벡터의 BamHI과 HindIII의 제한효소 자리에 도입하였다. 또한, 티로시나아제로 구리를 도입하는데 필요한 orf438 유전자를 방선균 게놈으로부터 두 개의 DNA 프라이머 pSA-438-5p: 5'-cac CAT ATG ccg gaa ctc acc cgt-3' (서열번호 25) 및 pSA-438-3p: 5'-cac CTC GAG tca gtt gga ggg gaa-3' (서열번호 26) 를 이용하여 PCR로 증폭하고, 이를 상기 티로시나아제 유전자가 도입된 벡터의 NdeI과 XhoI 제한 효소 자리에 도입하여 최종적으로 티로시나아제 발현 벡터인 pACYC-Tyr-438을 제조하였다. 상기 제조된 티로시나아제 발현 벡터 pACYC-Tyr-438의 모식도는 도 1에 나타내었다.

실시예 3. 홍합 접착 단백질 발현 벡터 및 티로시나아제 발현 벡터를 포함하는 형질전환체의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 발현 벡터 pET22-fp151 및 상기 실시예 2에서 제조한 티로시나아제 발현 벡터 pACYC-Tyr-438를 포함하는, 티로신 잔기가 수정된 홍합 접착 단백질을 발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여, 도 2에 나타난 모식도와 같이 수행하였다. pACYC-Tyr-438은 클로로앰피니콜 항생제에서 저항 내성을 지니는 벡터이고 pET22-fp151은 앰피실린 항생제에 저항 내성을 지니는 벡터이므로, 두 개의 벡터를 동시에 42 ℃에서 2분간 열충격을 가하여 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 두 벡터가 모두 도입된 형질전환체는 앰피실린과 클로로앰피니콜이 모두 첨가되어 있는 LB-한천 배지에서 선별하였다.

실시예 4. 티로시나아제와 홍합 접착 단백질 fp -151의 동시 발현

상기 실시예 3에서 제조한 형질전환체를 50 μg/mL 앰피실린 및 10 μg/mL 클로로앰피니콜이 첨가된 통상의 37 ℃, LB 배지에서 진탕 배양하여 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.8~0.9 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside, 1mM)을 첨가하여 상기 단백질들의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 5시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 배양된 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 세포 파쇄를 위한 용액 (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7, 8M urea, 10 mM imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 수용성 분액과 불용성 분액으로 나누어 각각을 통상의 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 대조군으로 티로시나아제 발현 벡터 pACYC-Tyr-438을 포함하지 않고 홍합 접착 단백질 fp-151 만을 발현하는 형질전환체를 제조하여 상기와 같은 조건에서 단백질을 발현하였고, 회수 파쇄하여 수용성 분액과 불용성 분액으로 나누어 동시에 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

도 3은 대조군 대장균에서 발현된 홍합 접착 단백질 fp-151의 수용성 분액과 불용성 분액, 그리고 티로시나아제 동시발현을 통해 얻어진 수정된 홍합 접착 단백질 fp-151의 수용성 분액과 불용성 분액을 SDS-PAGE로 분석한 사진이다. 도 3에 의하면, fp-151 발현 벡터만 포함하고 있는 형질전환체에서는 fp-151 단백질이 응집체(Inclusion body)로 발현되어 불용성 분액에서 검출되는 반면, fp-151 발현 벡터와 티로시나아제 발현 벡터가 모두 포함하고 있는 형질전환체에서는 fp-151 단백질이 수용성 분액과 불용성 분액 모두에서 검출됨을 알 수 있다. 이는 형질전환체 내에서 fp-151 과 티로시나아제가 동시 발현하여 티로신 잔기가 수정된 fp-151 단백질이 수용성 분액과 불용성 분액 모두에서 검출된 것으로 해석할 수 있다. 또한 동시발현에 의해 얻어진 세포 파쇄액에서 발현된 티로시나아제와 ORF438의 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

실시예 5. 동시발현에 의해 생산된 홍합 접착 단백질의 정제

동시발현에 의해 생산된 티로신 잔기가 수정된 홍합 접착 단백질 fp-151을 수용성 분액으로부터 니켈 컬럼 크로마토그래피에 의하여 분리 정제하였다. 구체적으로, 상기 단백질 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼에 적용하여 단백질과 컬럼이 결합하도록 하고, 세척 버퍼(50 mM sodium phosphate buffer, 8M urea, 30 mM imidazole, pH 7.0)로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 씻어 냈다. 컬럼으로부터 단백질의 용출은 0.5 M HCl을 이용하여 진행하였고, 상기 정제된 용액은 물을 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아 있는 물과 단백질 성분 이외의 성분을 제거하고 최종적으로 동결건조를 통해 파우더 형태로 정제된 단백질을 생산하였다.

도 4는 이와 같이 정제된 단백질을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 사진이고, 도 5는 정제된 단백질을 MALDI-MS 분석을 통해 얻어진 단백질의 분자량을 확인한 그림이다. 도 4 및 도 5를 통하여, 동시발현에 의해 수정된 홍합 접착 단백질이 효율적으로 정제됨을 알 수 있었다.

실시예 6. 동시발현에 의해 생산된 홍합 접착 단백질 내 티로신 잔기의 수정 확인

정제된 홍합 접착 단백질을 트립신으로 처리하여 펩티드 단편으로 나눈 뒤, C-18 컬럼을 통하여 염을 제거하고 모든 단편을 얻었다. 상기 펩티드 단편들은 LC-MS/MS 분석을 수행하여 상기 얻어진 동시발현에 의해 얻어진 홍합 접착 단백질에의 티로신 잔기가 도파 또는 도파퀴논으로 수정되어 있는지를 조사하였다.

그 결과 상기 얻어진 단백질에서 도파퀴논 피크를 확인하였으며, 도 6은 MS/MS 분석에 의해 확인된 도파퀴논의 피크를 나타낸 도이다.

한편, 티로신 잔기가 도파 또는 도파퀴논을 포함하는 산화된 형태로 변화되었을 때 NBT (nitroblue tetrazolium chloride) 용액에 의하여 청남색으로 색깔 변화가 발생하는 것으로 알려져 있다. 청남색의 색깔 변화는 도파에 대하여 가장 강하게 나타나고, 도파퀴논 및 그 외 산화된 형태의 티로신에 대하여는 상대적으로 도파보다 강도가 약하게 나타난다.

상기에서 동시발현에 의해 생산된 홍합 접착 단백질 fp-151을 NBT 시약에 적용한 결과, 청남색의 색깔변화를 확인할 수 있었고, 대조군인 티로신 잔기가 수정되어 있지 않은 fp-151에 대하여는 청남색의 색깔변화가 나타나지 않아, 본 발명에서 얻어진 수정된 fp-151의 티로신 잔기가 수정되었음을 다시 한 번 확인할 수 있었다 (도 7).

실시예 7. 동시발현에 의하여 수정된 홍합 접착 단백질의 접착력 측정

동시발현에 의해 수정된 홍합 접착 단백질의 접착력을 측정하기 위하여 동결건조 상태의 5 mg 상기 수정된 홍합 접착 단백질을 10 μL 5% 아세트산 용액에 녹여 이를 알루미늄 시편에 12 mm × 10 mm 넓이로 도말하여 접착시켰다. 비교실험을 위하여 BSA(bovine serum albumin), 라이소자임, 그리고 기존의 수정되지 않은 홍합 접착 단백질을 인 비트로 상에서 티로시나아제로 수정하고 회수하여 동결건조한 파우더 5 mg을 이용하여 동일한 접착실험을 수행하였다. 접착된 알루미늄 시편들은 37 ℃에서 3시간 동안 말리고, 접착제의 인장강도를 측정하기 위하여 알루미늄 시편의 양쪽에 힘을 가해 탈착시에 가해지는 힘을 인장강도 측정기(Instron)로 정량하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 동시발현에 의해 얻어진 수정된 홍합 접착 단백질 fp-151의 접착력은 기존의 인 비트로 상에서 수정한 홍합 접착 단백질에 비해 약 3배 가량 더욱 우수한 접착력을 지님을 알 수 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Mussel adhesive proteins obtained from tyrosinase co-expression <130> DPP20111186KR <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-131 <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from FP-1 <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-1 <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 8 Arg Gly Asp 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 3 <400> 10 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 4 <400> 11 Arg Gly Asp Val 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 5 <400> 12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 6 <400> 13 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 7 <400> 14 Gly Arg Gly Asp Thr Pro 1 5 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 8 <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 9 <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 10 <400> 17 Tyr Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 18 <211> 273 <212> PRT <213> Streptomyces antibioticus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(273) <223> Tyrosinase <400> 18 Met Thr Val Arg Lys Asn Gln Ala Ser Leu Thr Ala Glu Glu Lys Arg 1 5 10 15 Arg Phe Val Ala Ala Leu Leu Glu Leu Lys Arg Thr Gly Arg Tyr Asp 20 25 30 Ala Phe Val Thr Thr His Asn Ala Phe Ile Leu Gly Asp Thr Asp Asn 35 40 45 Gly Glu Arg Thr Gly His Arg Ser Pro Ser Phe Leu Pro Trp His Arg 50 55 60 Arg Phe Leu Leu Glu Phe Glu Arg Ala Leu Gln Ser Val Asp Ala Ser 65 70 75 80 Val Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Ser Ala Asp Arg Ser Thr Arg Ser 85 90 95 Ser Leu Trp Ala Pro Asp Phe Leu Gly Gly Thr Gly Arg Ser Arg Asp 100 105 110 Gly Gln Val Met Asp Gly Pro Phe Ala Ala Ser Ala Gly Asn Trp Pro 115 120 125 Ile Asn Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Phe Leu Arg Arg Ala Leu Gly 130 135 140 Ala Gly Val Ser Glu Leu Pro Thr Arg Ala Glu Val Asp Ser Val Leu 145 150 155 160 Ala Met Ala Thr Tyr Asp Met Ala Pro Trp Asn Ser Gly Ser Asp Gly 165 170 175 Phe Arg Asn His Leu Glu Gly Trp Arg Gly Val Asn Leu His Asn Arg 180 185 190 Val His Val Trp Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Gly Val Ser Pro Asn 195 200 205 Asp Pro Val Phe Trp Leu His His Ala Tyr Ile Asp Lys Leu Trp Ala 210 215 220 Glu Trp Gln Arg Arg His Pro Ser Ser Pro Tyr Leu Pro Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Pro Asn Val Val Asp Leu Asn Glu Thr Met Lys Pro Trp Asn Asp 245 250 255 Thr Thr Pro Ala Ala Leu Leu Asp His Thr Arg His Tyr Thr Phe Asp 260 265 270 Val <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for the amplification of fp-151 <400> 19 gaggtatata ttaatgtatc g 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for the amplification of fp-151 <400> 20 gatttaatct gtatcagg 18 <210> 21 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5-HT-forward primer <400> 21 gcccatatga aacaccatca ccatcaccat ctggtgccgc gcggcagcag ctctgaag 58 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-5-HT-reverse primer <400> 22 ttcggatcct cagctgctgc cgcc 24 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-mel-5p primer <400> 23 caccaggatc cgaccgtccg caagaac 27 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-mel-3p primer <400> 24 cacaagcttt cagacgtcga aggt 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-438-5p primer <400> 25 caccatatgc cggaactcac ccgt 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-438-3p primer <400> 26 cacctcgagt cagttggagg ggaa 24

Claims

(1) 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 각각 제조하는 단계;
(2) 상기에서 제조한 두 벡터를 하나의 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환체를 배양하여 티로시나아제 및 홍합 접착 단백질을 동시 발현시키는 단계를 포함하는, 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine) 또는 도파 퀴논(Dopa o-quinone)으로 변형된 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, (4) 형질전환체 내에서 동시발현에 의하여 생산된 홍합 접착 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열이 1회 내지 10회 연속하여 연결된 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 8 내지 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 티로시나아제는 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 방법.
홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 티로시나아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 형질전환체.
제1항의 방법으로 제조된 티로신 잔기가 도파 또는 도파 퀴논으로 변형된 홍합 접착 단백질.
제11항의 홍합 접착 단백질을 포함하는 접착제 조성물.