WO2015016400A1 - 방선균 유래 티로시나아제를 이용하여 제조된 가교 결합 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용 - Google Patents

방선균 유래 티로시나아제를 이용하여 제조된 가교 결합 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용 Download PDF

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tyrosinase
derived
crosslinking
actinomycetes
gelatin
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김병기
이나훔
이상혁
송창현
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서울대학교산학협력단
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    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
    • C12Y114/18001—Tyrosinase (1.14.18.1)

Definitions

  • the present invention aims to induce a crosslinking reaction of proteins using high efficiency tyrosinase, and to provide protein immobilization and polypeptide molding. Accordingly, the present invention can be applied to mass production of medical substances and medical products using enzymatic reactions.
  • Proteins such as transglutaminase, laccase, saltase, lysyl oxidase and peroxidase undergo crosslinking between one or two amino acid residues, while tyrosine residues activated by tyrosinase, ie Dopa and dopaquinone form crosslinking reactions with other phenolic moieties or residues with amino or thiol groups.
  • crosslink proteins and polypeptides There are many ways to crosslink proteins and polypeptides. Chemical methods may induce crosslinking by treating glutaaldehyde, and biological methods may be crosslinking using transglutaminase or laccase. However, it is not widely used due to toxicity of monomer chemicals, denaturation of immobilized objects, and limited accessibility of enzymes.
  • tyrosinase catalyzes the hydroxylation and oxidation reactions of monophenolic structures, producing catechol and quinone structures, and finally polymerizing to produce melanin.
  • tyrosinase functionalizes or polymerizes a monophenolic structural material
  • experiments have been reported to react tyrosine residues introduced into proteins.
  • tyrosine residues on bulky protein surfaces do not readily access tyrosinase.
  • phenolic monomers have been introduced into polypeptide amino residues to facilitate access to tyrosinase (Fairhead and Thony-Meyer, Cross-linking and immobilisation of different proteins with Verrucomic robium spinosum tyrosinase, Jounal of Biotechnology, 2010, 150 (4), 546-551; and Suzana Jus et al., Enzymatic cross-linking of gelatine with laccase and tyrosinase, Biocatalysis and Biotransformation, 2012, Vol. 30, No. 1, 86-95. ).
  • the polymeric materials produced through the introduction of new monomers are not biocompatible when the monomers cannot be completely removed and are not used in medical molding materials.
  • Non-Patent Document 1 Applied Microbiology and Biotechnology 2013, Vol. 97: 461-475.
  • Non-Patent Document 2 Fairhead and Thony-Meyer, Cross-linking and immobilisation of different proteins with Verrucomic robium spinosum tyrosinase, Jounal of Biotechnology, 2010, 150 (4), 546-551.
  • Non-Patent Document 3 Suzana Jus et al., Enzymatic cross-linking of gelatine with laccase and tyrosinase, Biocatalysis and Biotransformation, 2012, Vol. 30, No. 1, 86-95.
  • a tyrosinase derived from a mushroom is mainly used to introduce a dopa moiety, and a crosslinking reaction between the moieties is performed, but the efficiency is very low and it is difficult to achieve effectiveness. The biggest reason is that the efficiency of formulating reaction is very low.
  • tyrosinase which has been reported previously, is difficult to access tyrosine in the polymer due to steric hindrance of the substrate inlet, while actinomycetes-derived tyrosinase is advantageous for tyrosine and oxidative reactions of polymers.
  • the present invention is intended to be applied to all reactions that want to introduce a waveguide residue in a protein using a tyrosinase derived from actinomycetes with less steric constraints on substrate accessibility.
  • Tyrosinase derived from actinomycetes is structurally different from other tyrosinase.
  • actinomycetes-derived tyrosinase has an open structure around the catalysis reaction, so that the steric hindrance factor is very small, and the catalytic efficiency of tyrosine residues in gelatin is about 20 times higher than that of mushroom-derived tyrosinase (about 94.8: 5.3).
  • gelatin derived from pigs contains 0.7% of tyrosine residues, and the reaction is catalyzed by tyrosinase reaction with efficiency similar to that of tyrosine as a substrate (about 100: 94.8).
  • tyrosinase derived from actinomycetes when used, tyrosine residues in the protein can be catalyzed with high efficiency, and thus, conversion efficiency to dopa or quinone residues is high.
  • the converted moieties are crosslinked by covalent or coordinative bonds, and have a high thermal stability and mechanical stability due to the dense crosslinking reaction. Since only crosslinking proteins and tyrosine crosslinking are used, the existing technical limitations on the toxicity of monomeric chemicals and the limited accessibility of enzymes can be overcome.
  • the present invention provides the following.
  • a construct for three-dimensional organ culture comprising a crosslinking material according to any one of (1) to (3).
  • a biocompatible adhesive comprising the crosslinking material according to any one of (1) to (3).
  • a molded prosthesis comprising the crosslinking material according to any one of (1) to (3).
  • a method of culturing artificial skin or artificial organs comprising: collecting a crosslinking material to create a construct for three-dimensional organ culture.
  • the crosslinking material of the present invention has a protein immobilization effect. Immobilization of proteins using tyrosine residues of proteins allows for the immobilization of proteins by treatment with actinomycetes-derived tyrosinase enzymes without additional genetic manipulation and chemical treatment and introduction of polyphenolic monomers.
  • the crosslinking material of the present invention is capable of encapsulating a protein and a support.
  • the protein can be immobilized by stirring the tyrosine residue of the protein (eg, an enzyme) and the gelatin protein, so that proteins such as enzymes are strongly immobilized without toxic chemical treatment, and the protein entrapment Along with the effect, strong covalent bonds can be maintained.
  • crosslinking materials of the present invention exhibit increased thermal stability.
  • the range of application is very limited due to the re-melting property at high temperature, but by applying tyrosinase derived from actinomycetes to increase thermal stability, it can be applied to applications such as biocompatible patches.
  • crosslinking materials of the present invention exhibit increased mechanical stability.
  • the application range is very limited, but by treating the gelatin with tyrosinase derived from actinomycetes, the elastic force may be increased, and mechanical stability may be obtained.
  • FIG. 1 is a structural comparison diagram of tyrosinase derived from mushrooms and tyrosinase derived from actinomycetes most commonly used ( S. avermitilis: from actinomycetes, A. bisporus: from mushrooms).
  • Figure 1a is actinomycetes-derived tyrosinase, with less steric hindrance around the inlet where the tyrosinase accepts the substrate.
  • FIG. 1B is a mushroom-derived tyrosinase, and the unwanted peptide around the inlet reduces access to tyrosine in bulky proteins such as gelatin.
  • Figure 2 is a table showing the relative reactivity of the tyrosine monomer and tyrosine on the polymeric material of actinomycetes-derived tyrosinase and mushroom-derived tyrosinase.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a 2D structure by introducing tyrosine oligomer (YYY), which is a gelatin 2D film formed in a buffer.
  • YYY tyrosine oligomer
  • FIG. 4 is an adhesion test of gelatin treated with tyrosinase on a glass surface.
  • gelatin was treated with tyrosinase
  • gelatin was treated with tyrosinase and ELP
  • gelatin was treated with tyrosinase, ELP, and FeCl 3 .
  • S. avermitilis tyrosinase is a tyrosinase derived from actinomycetes and
  • A. bisporus tyrosinase is a tyrosinase derived from mushrooms.
  • FIG. 5 is a view showing whether or not breakage of the gelatin molding after mechanical stress (Stress) measurement.
  • Stress mechanical stress
  • FIG. 6 is a graph showing numerical data of the experiment shown in FIG. 5. Using a rheometer (rheometer) to give a weight of 200g to the circular sample of FIG. 5,
  • C is free of tyrosinase
  • M is free from tyrosinase derived from mushrooms
  • S is free from tyrosinase derived from actinomycetes.
  • FIG. 8 shows the results of immobilization of Green Fluorescence Protein (GFP) with tyrosine residues at its ends to chitosan beads, one tube treated with beads and tyrosinase, and two tubes treated with beads and GFP.
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • Figure 9 shows gelatin beads using actinomycetes-derived tyrosinase, which shows the case where ELP is not added and when it is added.
  • Figure 10 shows the capture of stem cells (hMSC) in 10% gelatin gel treated with tyrosinase.
  • the present invention is a cross-linked material of a catechol-type or quinone-type structural material produced by the oxidation reaction of a monophenolic structural material, wherein the oxidation reaction is a reaction catalyzed by actinomycetes-derived tyrosinase. It provides a method for producing the same and a molded article applied thereto.
  • the present invention can be applied to all reactions that want to introduce dopa (DOPA) residues in proteins, wherein tyrosine residues activated by actinomycetes-derived tyrosinase, ie dopa and dopaquinone, have other phenolic residues or amino or thiol groups. Crosslinking reaction with the residues.
  • DOPA dopa
  • Actinomycetes according to the present invention is Streptomyces avermitilis, and actinomycetes-derived tyrosinase, as shown in Figure 1, because the steric hindrance around the active site inlet compared to other derived tyrosinase is smaller, It is easy to activate tyrosine residues in bulky polypeptides. Tyrosine residues are easily exposed in the case of unstructured and unstructured tertiary structures, but the effect of steric hindrance around the tyrosinase active site is not significant. The steric structure of the aze also masks the activity. By using tyrosinase derived from actinomycetes having few steric hindrances, crosslinking of monophenolic structures in polymers with amines, thiols or other aromatic structures can be carried out efficiently.
  • FIG. 2 the relative reactivity of the actinomycetes-derived tyrosinase and mushroom-derived tyrosinase to tyrosine and tyrosine on the polymer material is shown in FIG. 2.
  • the reactivity of FIG. 2 was measured based on the rate of melanin formation, and the reactivity of actinomycetes-derived tyrosinase and mushroom-derived tyrosinase with respect to gelatin was 94.8 and 5.3, respectively. The difference is about 20 times.
  • the crosslinking material according to the present invention comprises the steps of catalyzing the oxidation reaction of the monophenolic structure using tyrosinase derived from actinomycetes; And the step of crosslinking the catechol-type or quinone-type structural material produced by the oxidation reaction.
  • the monophenolic structure according to the present invention is a tyrosine residue in a protein (polypeptide), and since the tyrosine residue is hydrophobic, the monophenolic side chain is mainly buried inside the surrounding polypeptide structure.
  • the catechol-like structure according to the present invention is L-dopa in which the tyrosine residue is ortho-specific hydroxide.
  • Dopa is more hydrophilic than tyrosine residues and can be oxidized to dopaquinone in alkaline aqueous solutions.
  • waveguides are known to have strong adhesion to metals and organics (Haeshin Lee et al., Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science, 2007, 318, 426-430).
  • the quinone type structural material according to the present invention is dopaquinone, in which the waveguide is oxidized, and is a radical having high reactivity.
  • the waveguide quinones thus formed are not only crosslinked between quinones but also crosslinked with amino and thiol groups.
  • a crosslinking material can be obtained by treating a gelatin containing a monophenolic structural material with tyrosinase derived from actinomycetes. More preferably, the crosslinking material of the present invention is a gelatin hydrogel with crosslinking formed.
  • the gelatin is a biocompatible material as collagen hydrolyzed by acid or heat treatment. Appropriate amounts of powder and liquid forms of medicine are stored and sold in gelatin capsules. At high temperatures, the triple helix structure is released and then the low temperature structure is rearranged to form a hydrogel containing high amounts of water.
  • Tyrosine residues in the gelatin are oxidized by dissolving 3-10 w% gelatin at a temperature of 35 ° C. or higher in a buffer solution or distilled water and then using purified actinomycetes-derived tyrosinase.
  • Oxidized tyrosine is a doped or quinone type material that will crosslink with other aromatic moieties, or thiols, amino moieties.
  • the gelatin hydrogel, which has undergone the crosslinking reaction, has high thermal and mechanical properties.
  • the gelatin hydrogel which has a sufficient crosslinking reaction by actinomycetes-derived tyrosinase, contains 90% or more of moisture, which can be used as a molded prosthesis, and as a moisture membrane that prevents the organs exposed to the air during open surgery from drying out. It is possible.
  • crosslinking material of the present invention will have a high elasticity and high mechanical properties, as shown in Figures 5, 6 and 7.
  • the range of application is very limited, but gelatin hydrogel treated with actinomycetes-derived tyrosinase may increase elasticity and have mechanical stability.
  • crosslinking materials of the present invention exhibit increased thermal stability.
  • the range of application is very limited due to the re-melting property at high temperature, but by applying tyrosinase derived from actinomycetes to increase thermal stability, it can be applied to applications such as biocompatible patches.
  • actinomycetes-derived tyrosinase stabilizes the molding such as gelatin at physiological temperature, and makes it suitable for human use.
  • the crosslinking material of the present invention has a protein immobilization effect. Immobilization of proteins using tyrosine residues of proteins allows for immobilization only by actinomycetes-derived tyrosinase treatment without additional genetic manipulation and chemical treatment and introduction of polyphenolic monomers.
  • the crosslinking material of the present invention is capable of encapsulating a protein support and an enzyme.
  • the enzyme can be immobilized by stirring the tyrosine residue of the enzyme and the support protein (eg, gelatin), so that the enzyme is immobilized strongly without the toxic chemical treatment, and the effect of protein entrapment is strong. Covalent bonds can be maintained.
  • the enzyme when forming gelatin beads, by mixing the crosslinking material of the present invention and other enzymes capable of crosslinking together, the enzyme can be immobilized in the gelatin beads.
  • Actinomycetes-derived tyrosinase can be used to induce covalent bonds of gelatin beads and other enzymes capable of crosslinking to produce enzyme immobilized membranes.
  • enzymes capable of crosslinking include lysine decarboxylase (4.8% tyrosine), wherein 34 of the 711 sequences are tyrosine residues derived from E. coli K12. decarboxylase) or proteins whose histidine, cysteine, tyrosine residues are co-expressed at the ends, for example pet28a.
  • lysine decarboxylase (4.8% tyrosine)
  • proteins whose histidine, cysteine, tyrosine residues are co-expressed at the ends, for example pet28a.
  • These enzymes are designed for plasmids, which are commonly used for genetic engineering, so that six histidines at the end can be easily expressed at the end of the protein as a tag (6his-tag). All the proteins in which 6his-tag is introduced at the terminal by genetic recombination can be crosslinked.
  • FIG. 8 three tyrosines were expressed together at the end of the GFP, and it was confirmed that the t
  • the cross-linking material subjected to the oxidation reaction by actinomycetes-derived tyrosinase increases the tensile force of the material itself, and serves as a support that can support the waveguide material that does not participate in crosslinking when attached to another object.
  • the tyrosinase treated material can be used as a biocompatible adhesive.
  • the biocompatible adhesive can be used in the manufacture of artificial bones. In order for the bone to heal naturally, signals from regeneration-related cells and substances must be well communicated between the two fractures. When the biocompatible adhesive formed as described above is applied and attached between two cross sections, it maintains a certain distance to facilitate the transfer of regeneration-related cells and substances.
  • the present invention can be used as a tool capable of capturing functional cells such as stem cells, thereby preparing a construct for three-dimensional organ culture by capturing a crosslinking material according to the present invention. can do.
  • functional cells such as stem cells
  • a crosslinking material such as polyethylene glycol
  • the present invention can be used as a tool capable of capturing functional cells such as stem cells, thereby preparing a construct for three-dimensional organ culture by capturing a crosslinking material according to the present invention. can do.
  • functional cells such as stem cells
  • a crosslinking material according to the present invention. can do.
  • artificial skin or artificial organs can be cultured.
  • Adult stem cells are collected by various biodegradable substances, and culture methods such as artificial joints are widely known (Mark F. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 1999, vol. 284. 143- 147).
  • the present invention can improve the strength and stability by adding various additives to the tyrosinase reaction.
  • various additives including tyrosine residues or amine residues can be added to control the efficiency and stability of crosslinking.
  • Elastin-Like Polypeptide, ELP, (VPGVGVPGYG) 10 (VPGVG) 20 Elastin-Like Polypeptide, ELP, (VPGVGVPGYG) 10 (VPGVG) 20 , 5% tyrosine residues, total 200, containing 5% tyrosine residues expressed in E. coli by genetic engineering.
  • Strength and stability can be improved when adding 0.1 w%-10 w%. Improved strength and stability is that the tyrosine residues introduced into elastin are converted to dopa / dopaquinone by tyrosinase and then cross-linked with amino groups, tyrosine, and cysteine residues in gelatin, resulting in intrinsic hydrophobic binding. (Kimberly Trabbic-Carlson et al., Swelling and Mechanical Behaviors of Chemically Cross-Linked Hydrogels of Elastin-like Polypeptides, Biomacromolecules, 2003, 4 (3), 572-580).
  • dopa which is an intermediate product, forms coordination bonds and can improve adhesion by a mechanism such as mussel protein (Proc Natl Acad Sci US A. 2011, 15, 108 (7), 2651). -2655).
  • the amount required for the reaction is preferably 1 to 10 times the substrate.
  • gelatin 10 w% gelatin was cross-linked with actinomycetes-derived tyrosinase and mushroom-derived tyrosinase, and then adhered to the glass surface to compare adhesion.
  • the adhesiveness when 1 mM iron ion and 0.1 w% of elastin-derived biopolymer (ELP) were added was also compared. This is shown in FIG. 4.
  • gelatin is treated with tyrosinase 1
  • gelatin is treated with tyrosinase and ELP
  • gelatin is treated with tyrosinase, ELP, and FeCl 3 .
  • S.avermitilis tyrosinase is a tyrosinase derived from actinomycetes and A.bisporus tyrosinase is a tyrosinase derived from mushrooms.
  • FIG. 5 is a view showing whether the gelatin molded product after the measurement of the mechanical stress (Stress), it can be seen that the mechanical strength is improved in the case of the actinomycetes-derived tyrosinase.
  • Stress mechanical stress
  • the stress-bearing efficiency for pressure and rotation is so large that it is hard to compare.
  • the molded product coagulated by gelatin-treated tyrosinase derived from actinomycetes showed an improved mechanical strength, and showed a strong ability to stand at 200 g weight strength.
  • the non-treatment of tyrosinase and the treatment of tyrosinase derived from mushrooms which corresponded to the comparative experiments, it had a low strength of less than 5%. Due to the limitations of mechanical measurements it was difficult to measure the ability to withstand higher stresses, and it can be assured that the present invention has a higher strength than the comparative group.
  • FIG. 6 is a graph showing the numerical data of the experiment shown in FIG. 5, in which a circular sample of FIG. 5 is weighed by 200 g using a rheometer and twisted at a constant speed to measure stress applied to a specimen.
  • a stress As shown in FIG. 6, it was shown to withstand a stress of approximately 42000 dyn / cm 2 . Despite this, it was observed that the slide on the test plate during rotation, which is considered to be due to the elasticity by crosslinking. As a result, experiments with higher stress could not be conducted.
  • actinomycetes-derived tyrosinase When treated with actinomycetes-derived tyrosinase was able to maintain a stable binding state without changing the structure. Thus, even when the industrial reaction proceeds at a high temperature it can be usefully used without denaturing the gelatin molding. That is, considering that heat resistance is required for application to the human body, actinomycetes-derived tyrosinase stabilizes the gelatinous molding at physiological temperature and is suitable for human use.
  • the chitosan was dissolved in 0.5% of 1.5% acetic acid and then dropped in 50% ethanol and 10% sodium hydroxide solution to form beads.
  • the impurities were then washed with distilled water and pH 8, 50 mM, tris-HCl buffer. 0.5 mL, pH 8, 50 mM tris for the addition of tyrosine residues at the ends of the Green Fluorescence Protein (GFP) (GFP YYY) and the immobilization of GFP to the beads using actinomycetes-derived tyrosinase Beads were placed in -HCl buffer and crosslinked with 5 ⁇ g / mL of purified tyrosinase. The crosslinking reaction was carried out in an incubator at 200 rpm, 37 °C.
  • hMSC human mesenchimal cells
  • the present invention can be applied to mass production of medical substances and the production of medical products using enzyme reactions.
  • the crosslinking material of the present invention can be applied to the production of beads that can be used for a long time while maintaining the stability of the enzyme.
  • the crosslinking material of the present invention is suitable for living organisms, and applications such as medical molding materials, structures for 3D organ culture, biocompatible adhesives, or molded implants are expected.

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Abstract

본 발명은 방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여, 단백질 티로신 잔기의 수산화 및 산화 반응을 높은 효율로 촉매화하고, 이로 인해 생성된 카테콜형, 퀴논형 구조물질의 가교로 인해 우수한 접착성, 높은 열적 안정성 및 기계적 안정성을 제공하는 단백질에 관한 발명이다. 또한, 상기 단백질을 응용하여, 효소를 고정화 할 수 있고, 생체 적합성 물질의 제작이 가능하다.

Description

방선균 유래 티로시나아제를 이용하여 제조된 가교 결합 물질, 그의 제조 방법 및 그의 응용
본 발명은 고효율의 티로시나아제를 이용하여 단백질의 가교 반응을 유도하고, 이를 통한 단백질 고정화 및 폴리펩타이드 성형물 제조를 목적으로 한다. 이에 따라, 본 발명은 효소 반응을 이용한 화학물질의 대량 생산 및 의료용 제품 생산에 적용할 수 있다.
효소를 이용한 단백질 간 결합에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다 (Applied Microbiology and Biotechnology 2013, Vol. 97: 461-475). 트랜스글루타미나아제, 락카아제, 솔테이즈, 라이실 옥시다제 및 퍼옥시다제 등의 단백질은 한 가지 또는 두 가지의 아미노산 잔기 간의 가교를 진행하는 반면, 티로시나아제에 의해 활성화된 티로신 잔기, 즉 도파 (DOPA) 와 도파퀴논은 다른 페놀형 잔기 또는, 아미노기나 티올기를 가진 잔기들과 가교 반응을 이룬다.
단백질 및 폴리펩타이드의 가교를 할 수 있는 방법은 매우 다양하다. 화학적인 방법으로는 글루타알데히드를 처리하여 가교를 유도하기도 하며 생물학적인 방법으로는 트랜스글루타미나아제 혹은 락카아제를 이용하여 가교를 하기도 한다. 다만, 단위체 화학물질의 독성 및 고정 대상물의 변성, 효소의 한계적 접근성 등의 이유로 폭넓게 활용되지 못하고 있는 실정이다.
일반적으로, 티로시나아제는 모노페놀형 구조물질의 수산화 반응 및 산화 반응을 촉매화하여, 카테콜형과 퀴논형 구조물질을 생산하고, 최종적으로 고분자화하여 멜라닌을 생성한다. 티로시나아제가 모노페놀형 구조물질을 수식화 (functionalization) 하거나 고분자화 (polymerization) 하는 점에 착안하여 단백질내 도입되어 있는 티로신 (tyrosine) 잔기를 반응하는 실험이 보고되어 있다. 하지만, 부피가 큰 단백질 표면의 티로신 잔기가 티로시나아제에 쉽게 접근하지 못한다는 것이 한계점으로 알려져 있다.
그러하기에, 종래에는 페놀형 단위체를 폴리펩타이드 아미노 잔기에 도입한 뒤, 티로시나아제와의 접근성을 용이하게 하였다(Fairhead and Thony-Meyer, Cross-linking and immobilisation of different proteins with Verrucomicrobium spinosum tyrosinase, Jounal of Biotechnology, 2010, 150(4), 546-551; 및 Suzana Jus et al., Enzymatic cross-linking of gelatine with laccase and tyrosinase , Biocatalysis and Biotransformation, 2012, Vol.30, No.1, 86-95.). 하지만, 새로운 단위체의 도입을 통해 생성된 고분자 물질은 단위체를 완전하게 제거하지 못할 경우에 생체 적합하지 않아 의료용 성형 물질에는 사용되지 않는다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Applied Microbiology and Biotechnology 2013, Vol. 97: 461-475.
(비특허문헌 2) Fairhead and Thony-Meyer, Cross-linking and immobilisation of different proteins with Verrucomicrobium spinosum tyrosinase, Jounal of Biotechnology, 2010, 150(4), 546-551.
(비특허문헌 3) Suzana Jus et al., Enzymatic cross-linking of gelatine with laccase and tyrosinase , Biocatalysis and Biotransformation, 2012, Vol.30, No.1, 86-95.
기존에는, 주로 버섯 유래의 티로시나아제를 이용하여 도파 잔기를 도입하고, 잔기간의 가교 반응을 진행하려 하나, 효율이 매우 낮고 실효를 거두기 어렵다. 가장 큰 원인으로는 수식화 반응 효율이 매우 낮기 때문이다.
이처럼, 기존에 보고되고 있는 티로시나아제는 기질 주입구의 입체 장애적인 요인으로 인해 고분자 안의 티로신에 접근하기가 어려운 반면에, 방선균 유래의 티로시나아제는 고분자 물질의 티로신 수산화 반응 및 산화 반응에 유리한 장점을 가지고 있다.
이에, 본 발명은 기질 접근성에 대한 입체적 제약이 적은 방선균 유래의 티로시나아제를 사용하여, 단백질 내 도파 잔기를 도입하기 원하는 모든 반응에 적용하고자 한다.
방선균 유래의 티로시나아제의 경우 구조적으로 타종의 티로시나아제와 차이가 나타난다. 즉, 방선균 유래의 티로시나아제는 촉매화 반응 주변이 개방된 구조로서 입체 장애적인 요인이 매우 작아, 젤라틴 내의 티로신 잔기에 대한 촉매화 효율이 버섯 유래의 티로시나아제보다 약 20 배 가량 높다 (약 94.8 : 5.3). 참고로 돼지 유래의 젤라틴의 경우 0.7 % 의 티로신 잔기를 포함하고 있으며, 티로시나아제 반응에 의해 티로신을 기질로 할 때와 유사한 효율로 반응이 촉매화된다 (약 100 : 94.8).
이처럼, 방선균 유래의 티로시나아제를 이용하는 경우에는 높은 효율로 단백질 내의 티로신 잔기를 촉매화할 수 있으므로, 도파 혹은 퀴논 잔기로의 변환 효율이 높다. 변환된 잔기는 공유 결합 혹은 배위 결합에 의해 가교가 이루어지며, 조밀한 가교 반응으로 인해, 높은 열적 안정성 및 기계적 안정성을 가지게 된다. 가교를 이루는 단백질과 가교를 진행하는 티로신 만이 사용되기에, 단위체 화학 물질의 독성 및 효소의 한계적 접근성에 대한 기존의 기술 한계를 극복할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 하기를 제공한다.
(1) 모노페놀형 구조물질의 산화반응으로 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교 결합된 물질로서, 상기 산화반응이 방선균 유래 티로시나아제에 의해 촉매되는 반응인 것을 특징으로 하는 가교 결합 물질.
(2) (1) 에 있어서, 상기 모노페놀형 구조물질이 폴리펩타이드의 티로신 잔기이고, 상기 카테콜형 구조물질이 티로신 잔기가 수산화된 도파(L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 인 가교 결합 물질.
(3) (1) 에 있어서, 상기 산화반응에 엘라스틴 유래 생체고분자(Elastin-Like Polypeptide, ELP)가 추가로 첨가되는 가교 결합 물질.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 젤라틴 비드.
(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 가교 결합 물질과 효소가 공유 결합된 효소 고정화막.
(6) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 3 차원 장기 배양을 위한 구조체.
(7) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 생체 적합형 접착제.
(8) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 인공뼈 제작시 사용되는 생체 적합형 접착제.
(9) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 성형 보형물.
(10) 하기의 단계를 포함하는 가교 결합 물질의 제조방법:
방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여 모노페놀형 구조물질의 산화반응을 촉매하는 단계; 및
산화 반응으로 인해 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교되는 단계.
(11) (10) 에 따라 제조된 가교 결합 물질과 효소의 공유결합을 유도하여 효소를 고정하는 방법.
(12) (10) 에 따라 가교 결합 물질을 제조하는 단계; 및
가교 결합 물질을 포집하여 3 차원 장기 배양을 위한 구조체를 만드는 단계를 포함하는, 인공 피부 또는 인공 장기의 배양 방법.
본 발명의 가교 결합 물질은 단백질의 고정화 효과를 가진다. 단백질의 티로신 잔기를 이용한 단백질의 고정화를 통하여 별도의 유전자 조작 및 화학적 처리, 폴리페놀형 단위체의 도입없이 방선균 유래 티로시나아제 효소 처리만으로도 단백질의 고정화가 가능하다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 단백질과 지지체의 캡슐화가 가능하다. 구체적으로, 단백질(예를 들어, 효소)의 티로신 잔기와 젤라틴 단백질의 교반으로 단백질의 고정화가 가능하여, 독성이 있는 화학 처리를 하지 않고도 효소 등의 단백질이 강하게 고정화되며, 단백질 포획(entrapment) 의 효과와 더불어 강한 공유 결합을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 증가된 열적 안정성을 나타낸다. 젤라틴의 경우 높은 온도에서 다시 녹는 성질로 인해 활용 범위가 매우 국한적이나, 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하여 열적 안정성을 증대시킴으로써, 생체 적합 패치 등의 응용 분야에 적용이 가능하다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 증가된 기계적 안정성을 나타낸다. 젤라틴의 경우 쉽게 부서지는 성질이 있어서 활용 범위가 매우 국한적이나, 젤라틴에 방선균 유래의 티로시나아제를 처리함으로써 탄성력이 증가하고, 기계적 안정성을 가질 수 있다.
도 1 은 기존에 가장 많이 활용되고 있는 버섯 유래의 티로시나아제와 방선균 유래의 티로시나아제의 구조적인 비교도이다 (S. avermitilis: 방선균 유래, A. bisporus: 버섯 유래). 도 1a 는 방선균 유래 티로시나아제로서, 티로시나아제가 기질을 받아들이는 입구 주변의 입체적 장애가 적다. 이에 반해, 도 1b 는 버섯유래의 티로시나아제로서, 입구 주변의 불필요한 펩타이드로 인해, 젤라틴과 같이 부피가 큰 단백질에 있는 티로신과의 접근성이 저하된다.
도 2 는 방선균 유래 티로시나아제와 버섯 유래 티로시나아제의 단위체 티로신과 고분자 물질 위의 티로신에 대한 상대적 반응성을 나타낸 표이다.
도 3 은 티로신 올리고머(YYY)를 도입하여 2D 구조체를 형성한 도면으로서, 완충액 속에서 형성된 젤라틴 2D 필름이다.
도 4 는 유리 표면 위에서 티로시나아제를 처리한 젤라틴의 접착성 테스트를 한 도면이다. 1 번은 젤라틴에 티로시나아제를 처리한 것이고, 2 번은 젤라틴에 티로시나아제와 ELP 를 처리한 것이며, 3 번은 젤라틴에 티로시나아제, ELP 및 FeCl3 를 처리한 것이다. S. avermitilis tyrosinase 는 방선균 유래의 티로시나아제이고, A. bisporus tyrosinase 는 버섯 유래의 티로시나아제이다.
도 5 는 기계적 강도 (Stress) 측정 후의 젤라틴 성형물의 파손 여부를 보여주는 도면이다. w/o treatment 는 티로시나아제를 무처리한 것, M_TYR 는 버섯 유래 티로시나아제을 처리한 것, S_TYR 는 방선균 유래 티로시나아제를 처리한 것이다.
도 6 은 도 5 에 보여진 실험의 수치적 데이터를 보여주는 그래프이다. 리오미터(rheometer)를 이용하여 도 5 의 원형표본에 200g 의 무게를 가한 뒤 일정 속도로 비틀며, 표본에 가해지는 스트레스를 측정한 결과이다.
도 7 은 젤라틴을 각각 다른 유래 티로시나아제로 가교 반응을 진행한 후 열적 안정성을 비교한 결과이다. C 는 티로시나아제를 무처리한 것, M 은 버섯 유래의 티로시나아제를 처리한 것, S 는 방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 것이다.
도 8 은 말단에 티로신 잔기를 가진 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence Protein, GFP) 을 키토산 비드에 고정화 한 뒤의 결과로서, 1 튜브는 비드와 티로시나아제를 처리하였고, 2 튜브는 비드와 GFP 를 처리하였으며, 3 튜브는 티로신 잔기(YYY)를 도입한 GFP와 함께, 비드 및 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하였고, 4 튜브는 티로신 잔기(YYY)를 도입하지 않은 GFP 와 함께, 비드 및 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하였고, 5 튜브는 티로신 잔기(YYY)를 도입한 GFP 와 함께, 비드 및 버섯 유래의 티로시나아제를 처리하였고, 6 튜브는 티로신 잔기(YYY)를 도입하지 않은 GFP 와 함께, 비드 및 버섯 유래의 티로시나아제를 처리하였다.
도 9 는 방선균 유래 티로시나아제를 이용한 젤라틴 비드를 나타낸 것으로서, ELP 를 첨가하지 않은 경우와 첨가한 경우를 나타내었다.
도 10 은, 티로시나아제를 처리한 10% 젤라틴 젤 안에 줄기세포 (hMSC) 을 포획한 것이다.
이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 모노페놀형 구조물질의 산화반응으로 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교 결합된 물질로서, 상기 산화반응이 방선균 유래 티로시나아제에 의해 촉매되는 반응인 것을 특징으로 하는 가교 결합 물질, 이의 제조방법 및 이를 응용한 성형물을 제공한다.
본 발명은 단백질 내 도파 (DOPA) 잔기를 도입하길 원하는 모든 반응에 적용될 수 있고, 방선균 유래 티로시나아제에 의해 활성화된 티로신 잔기, 즉 도파와 도파퀴논은 다른 페놀형 잔기 또는, 아미노기나 티올기를 가진 잔기들과 가교 반응을 이룬다.
본 발명에 따른 방선균은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 (Streptomyces avermitilis) 이며, 방선균 유래 티로시나아제는, 도 1 에서 보이는 것과 같이, 다른 유래 티로시나아제에 비해 활성 부위 입구 주변의 입체적 장애가 작기 때문에, 부피가 큰 폴리펩타이드 안의 티로신 잔기를 활성화시키기에 용이하다. 3 차 구조를 이루지 않고 구조가 풀어져 있는 단백질인 경우 티로신 잔기는 쉽게 노출 되어 티로시나아제 활성 부위 주변의 입체적 장애에 대한 영향이 크지 않지만, 수용액 상에서 3 차 구조를 이루고 있는 단백질 상의 티로신 잔기는 티로시나아제의 입체적 구조에 의해 활성 반응 여부가 가려진다. 입체적 장애가 적은 방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여, 고분자 속 모노페놀형 구조와 아민, 티올, 또는 다른 방향족 구조체와의 가교를 효율적으로 진행할 수 있다.
이와 관련하여, 방선균 유래 티로시나아제와 버섯 유래 티로시나아제의 단위체 티로신과 고분자 물질 위의 티로신에 대한 상대적 반응성을 도 2 에 나타내었다. 상기 도 2 의 반응성은 멜라닌 형성 속도를 바탕으로 측정되었으며, 티로신 단위체에 대한 반응성을 기준으로 볼 때, 젤라틴에 대한 방선균 유래 티로시나아제와 버섯 유래 티로시나아제 각각의 반응성은, 94.8 과 5.3 으로 약 20 배 가량 크게 차이가 난다. 젤라틴과 같은 고분자 물질 위의 티로신 잔기를 활성화시키는 것에 방선균 유래 티로시나아제가 유리함을 보여주는 결과이다.
본 발명에 따른 가교 결합 물질은 방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여 모노페놀형 구조물질의 산화반응을 촉매하는 단계; 및 산화 반응으로 인해 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교되는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.
본 발명에 따른 모노페놀형 구조물질은 단백질(폴리펩타이드)안의 티로신 잔기이며, 티로신 잔기는 소수성이므로, 모노페놀형 곁가지는 주로 주변 폴리펩타이드 구조 안쪽에 묻혀 있다.
본 발명에 따른 카테콜형 구조물질은 상기 티로신 잔기가 오르토 특이적 수산화된 도파(L-dopa)이다. 도파는 티로신 잔기보다 친수성이며, 알카리 수용액 상에서 도파퀴논으로 산화될 수 있다. 또한, 도파는 금속과 유기물에 강한 접착성을 갖는 것으로 알려져있다(Haeshin Lee et al., Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science, 2007, 318, 426-430).
본 발명에 따른 퀴논형 구조물질은 상기 도파가 산화된 도파퀴논(Dopaquinone)이며, 높은 반응성을 가지고 있는 라디칼이다. 이렇게 형성된 도파 퀴논은 퀴논간의 가교 뿐만 아니라, 아미노기, 티올기와 가교를 이루게 된다.
본 발명의 예시로서, 모노페놀형 구조물질을 포함하는 젤라틴에 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하여 가교 결합 물질을 얻을 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 가교 결합 물질은 가교 결합이 형성된 젤라틴 하이드로겔이다.
상기 젤라틴은 산이나 열처리로 인해 가수 분해된 콜라젠으로서 생체 적합한 물질이다. 적절량의 파우더 및 액체 형태의 약을 젤라틴 캡슐에 보관, 판매되고 있다. 높은 온도에서 3 중 헬릭스 (helix) 구조가 풀어진 뒤 낮은 온도 구조가 재배열되면 높은 양의 물을 포함하는 하이드로겔 형태로 변하게 된다.
35℃ 이상의 온도에서 3~10 w% 젤라틴을 완충 용액 또는 증류수에 녹인 후 정제된 방선균 유래 티로시나아제를 이용하여, 젤라틴 안의 티로신 잔기를 산화시킨다. 산화된 티로신은 도파형 또는 퀴논형 물질로서 다른 방향성 잔기, 또는 티올, 아미노 잔기와 가교 반응을 이루게 된다. 이렇게 가교 반응이 진행된 젤라틴 하이드로겔은 높은 열적, 기계적 성질을 갖게 된다.
방선균 유래 티로시나아제에 의해 가교 반응이 충분히 이루어진 젤라틴 하이드로겔은 90% 이상의 수분을 포함하고 있어, 성형 보형물로서의 사용이 가능하며, 개복 수술 시 공기 중에 노출되는 장기들이 마르지 않게 하는 수분 막으로서의 활용이 가능하다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 도 5, 도 6 및 도 7 에서 보이는 것과 같이, 높은 탄성과 높은 기계적 성질을 가지게 된다. 젤라틴의 경우 쉽게 부서지는 성질이 있어서 활용 범위가 매우 국한적이나, 방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 젤라틴 하이드로겔은 탄성력이 증가하고, 기계적 안정성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 증가된 열적 안정성을 나타낸다. 젤라틴의 경우 높은 온도에서 다시 녹는 성질로 인해 활용 범위가 매우 국한적이나, 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하여 열적 안정성을 증대시킴으로써, 생체 적합 패치 등의 응용 분야에 적용이 가능하다.
이에, 산업적으로 높은 온도에서 효소반응을 진행하는 경우에도 젤라틴 성형물의 변성없이 유용하게 사용이 가능하다. 즉, 인체에 적용하기 위해서는 성형물의 내열성이 요구되는 점을 고려할 때, 방선균 유래의 티로시나아제는 생리학적 온도에서 젤라틴 등의 성형물을 안정하게 하며, 인체 사용에 적합하게 한다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 단백질의 고정화 효과를 가진다. 단백질의 티로신 잔기를 이용한 단백질의 고정화를 통하여 별도의 유전자 조작 및 화학적 처리, 폴리페놀형 단위체의 도입없이 방선균 유래 티로시나아제 처리만으로도 고정화가 가능하다.
또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 단백질 지지체와 효소의 캡슐화가 가능하다. 구체적으로, 효소의 티로신 잔기와 지지체 단백질(예를 들어, 젤라틴)의 교반으로 효소 고정화가 가능하여, 독성이 있는 화학 처리를 하지 않고도 효소가 강하게 고정화되며, 단백질 포획(entrapment) 의 효과와 더불어 강한 공유 결합을 유지할 수 있다.
또한, 젤라틴 비드를 성형할 때, 본 발명의 가교 결합 물질과 가교 결합이 가능한 기타 효소를 함께 섞음으로써, 젤라틴 비드 내에 효소가 고정화되는 효과를 거둘 수 있다. 방선균 유래 티로시나아제를 이용하여, 젤라틴 비드 및 가교 결합이 가능한 기타 효소의 공유 결합을 유도하여 효소 고정화막을 제조할 수 있다.
상기 가교 결합이 가능한 기타 효소로는, 티로신 잔기가 표면 주변에 많은 효소, 예를 들어, E. coli K12 유래로 711 서열 중 34 개가 티로신 잔기인(4.8% 티로신) 리신 탈카르복실화효소(lysine decarboxylase), 또는 히스티딘, 시스테인, 티로신 잔기가 말단에 같이 발현된 단백질, 예를 들어 pet28a 등이 있다. 이와 같은 효소는 유전자 조작에 흔히 사용되는 플라즈미드는 말단에 여섯 개의 히스티딘이 tag (6his-tag) 으로 쉽게 단백질 말단에 같이 발현될 수 있게 디자인이 되어 있다. 유전자 재조합 기술로 6his-tag이 말단에 도입된 단백질은 모두 가교 가능하다. 도 8 에서 보여지는 것과 같이 GFP 말단에 세 개의 티로신이 같이 발현되었고, 티로시나아제에 의해 산화반응 진행 후 아미노기를 가진 비드에 잘 결합되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 방선균 유래 티로시나아제에 의해 산화 반응이 진행된 가교 결합 물질은 물질 자체의 인장력을 증가시키고, 가교에 참여하지 않은 도파형 물질이 다른 물체에 부착될 시 지탱할 수 있는 지지체의 역할을 한다. 이러하기에 티로시나아제 처리가 된 물질은 생체 적합형 접착제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 생체 적합형 접착제는 인공뼈 제작 시에 사용될 수 있다. 뼈가 자연적으로 치유되기 위해서는 골절이 일어난 두 단면간에, 재생 관련 세포와 물질들의 신호가 잘 전달되어야 한다. 위와 같이 형성된 생체 적합형 접착제는 두 단면간에 도포되어 부착되면, 일정 거리를 유지시켜 재생관련 세포 및 물질의 전달을 수월하게 한다.
또한, 도 10 에서 보이는 것과 같이, 본 발명은 줄기 세포 등의 기능성 세포를 포집할 수 있는 도구로서 사용이 가능하기에, 본 발명에 따른 가교 결합 물질을 포집하여 3 차원 장기 배양을 위한 구조체를 제조할 수 있다. 이와 같은 방법으로, 인공 피부 또는 인공 장기를 배양할 수 있다. 성체 줄기세포를 다양한 생분해 물질에 의해 포집하여, 인공 관절 등으로의 배양법은 널리 알려져 있다 (Mark F. Pittenger et al., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 1999, vol. 284. 143-147).
한편, 본 발명은 티로시나아제 반응에 다양한 첨가물을 첨가함으로써 강도 및 안정성을 향상시킬 수 있다. 티로시나아제의 반응에 다양한 첨가물로서 티로신 잔기를 포함하거나 아민 잔기를 포함하고 있는 것을 첨가하여 가교의 효율 및 안정성의 조절이 가능하다.
상기 첨가물의 바람직한 예시로서, 유전자 조작으로 대장균에서 발현한 티로신 잔기를 5% 포함하고 있는 엘라스틴 유래 생체고분자 (Elastin-Like Polypeptide, ELP, (VPGVGVPGYG)10(VPGVG)20, 5%티로신 잔기, 총 200 아미노산 서열) 0.1 w% - 10 w%을 첨가하는 경우에 강도 및 안정성이 향상될 수 있다. 향상된 강도와 안정성은 엘라스틴 내 도입된 티로신 잔기가 티로시나아제에 의해 도파/도파퀴논으로 변환된 후 젤라틴 안의 아미노기나 티로신, 시스테인 잔기를 가진 아미노산과 가교 반응을 이루고, 엘라스틴 고유의 소수성에 의한 결합으로 인한 것이다(Kimberly Trabbic-Carlson et al., Swelling and Mechanical Behaviors of Chemically Cross-Linked Hydrogels of Elastin-like Polypeptides, Biomacromolecules, 2003, 4 (3), 572-580).
또한, 상기 첨가물로서, 철이온 도입시 중간 생성물인 도파는 이와 배위 결합을 이루며 홍합단백질과 같은 기작으로 접착력을 향상 시킬 수 있다 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 15, 108(7), 2651-2655). 반응 시 필요한 양은 기질 대비 1 내지 10 배가 바람직하다.
본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
티로시나아제를 처리한 젤라틴의 접착성 테스트
10 w% 의 젤라틴을 방선균 유래 티로시나아제와 버섯 유래의 티로시나아제로 가교 반응을 진행시킨 뒤, 유리 표면에 부착시켜 접착성을 비교하였다. 가교에 영향을 주는 1mM 의 철이온과 0.1 w % 의 엘라스틴 유래 생체고분자 (ELP) 를 첨가하는 경우의 접착성도 비교하였다. 이는 도 4 에 나타내었다. 도 4 에서, 1 번은 젤라틴에 티로시나아제를 처리한 것이고, 2 번은 젤라틴에 티로시나아제와 ELP 를 처리한 것이며, 3 번은 젤라틴에 티로시나아제, ELP 및 FeCl3 를 처리한 것이다. S.avermitilis tyrosinase 는 방선균 유래의 티로시나아제이고, A.bisporus tyrosinase 는 버섯 유래의 티로시나아제이다.
도 4 에서 확인할 수 있듯이, 첨가제의 여부와는 상관없이 방선균 유래 티로시나아제로 가교 반응이 형성된 경우에 젤라틴 하이드로겔이 유리 표면에 부착되어 강한 교반 후에도 떨어지지 않고 붙어 있으며, ELP 또는 FeCl3 를 처리함으로써 접착성을 더욱 향상시킬 수 있다. 또한, 방선균 유래 티로시나아제로 가교 반응이 형성된 경우에는 37℃의 온도 조건에서도 강하게 결합하여 부착되어 있으며, 중성의 완충액에서 해리되지 않음을 관찰하였다. 이에 반해, 버섯 유래 티로시나아제로 가교 반응 진행 시에는, 형성된 젤라틴 젤은 완충액 속 유리판에서 쉽게 떨어지거나 해리되는 것을 관찰하였다.
[실시예 2]
YYCYY 펩타이드의 2D 구조체 생성
방선균 유래 티로시나아제에 의해 1mg/mL 의 YYCYY 펩타이드와 3-5 w% 젤라틴이 가교 결합을 이룰 경우에 YYY 펩타이드와 다르게 그래핀 (graphene) 과 같은 이차원적 구조를 가짐을 확인하였다. 이는 도 3 에 나타내었다. YYY 펩타이드와 결합 시에는 덩어리 형태의 3 차원적 구조가 형성되었다. 원하는 형태에 따른 젤 성형이 가능함을 보여 주는 실험이다.
[실시예 3]
기계적인 안정성의 증대
10 w% 젤라틴을 50mM, pH 8, tris-HCl 완충액에 녹이고, 1 시간 동안 티로시나아제와 가교 반응을 진행하였다. 형성된 젤라틴 젤의 두께를 2.5 mm로 조절하였고, 지름 23mm 원형 틀에 의해 잘려져 기계적 물성 테스트를 위한 샘플로 준비되었다. 준비된 샘플은 200g으로 이가 있는 거친 표면에 의해 눌려졌으며, 0°/s - 360°/s 로 비틀어졌다. 그 결과, 보통의 젤라틴 젤이나 다른 유래 티로시나아제를 처리한 젤라틴 젤과 다르게 방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 젤라틴 젤은 360°/s 속도의 뒤틀림에서도 원 상태의 모형을 유지하는 것을 관찰하였다.
도 5 는 기계적 강도 (Stress) 측정 후의 젤라틴 성형물의 파손 여부를 보여주는 도면으로서, 방선균 유래의 티로시나아제의 경우 기계적인 강도가 향상되는 것을 확인할 수 있다. 압력 및 회전에 대한 스트레스를 버티는 효율이 비교하기 힘들 정도로 차이가 크다. 젤라틴에 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하여 응고한 성형물의 경우 기계적인 강도가 향상되어 200 g 무게 강도에서도 강하게 버티는 능력이 나타났다. 비교 실험에 해당하는 티로시나아제의 무처리, 버섯 유래의 티로시나아제의 처리의 경우는 5 % 미만의 낮은 강도를 가지고 있었다. 기계적인 측정의 한계로 인해 더 강한 스트레스에서의 견디는 능력을 측정하기 어려웠으며, 본 발명이 비교군에 비해 더 높은 강도를 갖는 것으로 확신할 수 있다.
도 6 은, 도 5 에 보여진 실험의 수치적 데이터를 보여주는 그래프로서, 리오미터 (rheometer) 를 이용하여 도 5 의 원형표본에 200g 의 무게를 가한 뒤 일정 속도로 비틀며, 표본에 가해지는 스트레스를 측정한 결과이다. 도 6 에서 보이는 것과 같이, 대략 42000dyn/cm2 의 스트레스를 견디는 것으로 보여졌다. 이가 있음에도 불구하고, 회전 시 실험판 위에서 미끄러져 나오는 것을 관찰했으며, 이는 가교에 의한 탄성에 의한 성질이라 판단된다. 그러하기에 더 높은 스트레스에 대한 실험을 진행할 수 없었다.
[실시예 4]
열적 안정성의 증대
방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 젤라틴 성형물의 열적 안정성을 비교하기 위해, 지름 23 mm, 높이 2.5 mm 의 원기둥을 제작하고, 이를 해당 온도에서 비교하였다. 비교군으로는 티로시나아제의 무처리, 버섯 유래의 티로시나아제의 처리가 된 성형물을 각각 비교하였다. 실험 결과 18℃ 의 온도 조건에서는 모든 젤라틴 성형물이 온전하게 보존되었으나, 37℃ 및 65℃ 조건에서는 오직 방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 경우에만 성형물이 온전하게 보존되었다. 이를 도 7 에 나타내었다.
방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 경우에는 구조의 변화없이 안정적인 결합상태를 유지할 수 있었다. 이에, 산업적으로 높은 온도에서 효소반응을 진행하는 경우에도 젤라틴 성형물의 변성없이 유용하게 사용이 가능하다. 즉, 인체에 적용하기 위해서는 내열성이 요구되는 점을 고려할 때, 방선균 유래의 티로시나아제는 생리학적 온도에서 젤라틴 성형물을 안정하게 하며, 인체 사용에 적합하다.
[실시예 5]
단백질 고정
범용적으로 사용되는 키토산 비드 제작법에 따라, 1.5% 아세트 산에 키토산이 0.5% 되도록 녹인 후 50% 에탄올, 10% 수산화 나트륨 용액에 떨어뜨려 비드를 형성했다. 그 후 증류수와 pH 8, 50mM, tris-HCl 완충액으로 불순물을 씻어 냈다. 녹색 형광 단백질 (Green Fluorescence Protein, GFP) 말단에 티로신 잔기가 추가적으로 도입된 것(GFP YYY)과 그렇지 않은 GFP 를 방선균 유래 티로시나아제를 사용하여 비드에 고정화 하기 위해, 0.5 mL, pH 8, 50mM tris-HCl 완충액 속에 비드를 넣고, 5 ㎍/mL 의 정제된 티로시나아제로 가교 반응을 진행하였다. 가교 반응은 200rpm, 37℃ 인큐베이터에서 진행되었다.
형광 이미지를 통해 확인한 결과를 도 8 에 나타내었다. 도 8 에서는 3 및 4 튜브에서만이 형광이 나타났다. 즉, GFP 단백질을 모델로 하여 키토산 비드에 고정화하는 실험을 수행한 결과 방선균 유래의 티로시나아제를 처리한 것만이 고정화가 되었다.
이에 따라, 방선균 유래의 티로시나아제를 사용하는 경우에는 티로신 잔기의 추가적인 도입 (YYY) 없이도 고정화가 가능함을 확인할 수 있었다. 반면, 기존에 활용이 많이 되는 버섯 유래의 티로시나아제의 경우에는 단백질과의 반응 효율이 낮기 때문에 고정화가 거의 이루어지지 않았다.
[실시예 6]
젤라틴으로 비드 제작시 완충액 속에서 해리되는 것을 관찰하였다. 이를 극복하기 위하여, 10 w% 의 젤라틴을 pH 8, 50mM Tris-HCl 완충 용액에 녹인 후, 방선균 유래의 티로시나아제를 처리하고, 10 분간 가교 반응을 진행한 후에 4℃ 의 완충용액에 한 방울씩 떨어뜨릴 경우에 비드 제작이 가능하다. 이를 도 9 에 나타내었다. 도 9 에서 보이듯이, 비드의 안정성을 증대하기 위해, 티로신 잔기를 5% 포함하고 있는 엘라스틴 유래 생체고분자 (ELP) 를 첨가하는 경우에 강도 및 안정성이 향상될 수 있다. 티로시나아제의 반응에 다양한 첨가물로서 티로신 잔기를 포함하거나 아민 잔기를 포함하고 있는 것을 첨가하여 가교의 효율 및 안정성의 조절이 가능하다.
[실시예 7]
10 w% 젤라틴을 pH 8, 50mM tris-HCl 완충액에 녹인 뒤, 중배엽 성체 세포 (Human mesenchimal cell, hMSC) 를 1x107 cells/mL 로 넣어 준 뒤, 티로시나아제로 30 분간 가교 반응을 진행하였다. 이를 도 10 에 나타내었다. hMSC 들이 젤라틴 젤안에 잘 포획되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 세포 포집 일주일 뒤에 실시된 MTT assay (세포독성 실험) 결과, 세포에 아무런 독성이 없음을 확인하였다.
본 발명은 효소 반응을 이용한 화학물질의 대량 생산 및 의료용 제품 생산에 적용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 가교 결합 물질은 효소의 안정성을 유지하면서도 장기간 사용이 가능한 비드의 제작에 응용할 수 있다. 또한, 본 발명의 가교 결합 물질은 생체에 적합하여 의료용 성형물질, 3D 장기 배양을 위한 구조체, 생체 적합형 접착제 또는 성형 보형물 등의 응용이 기대된다.

Claims (12)

  1. 모노페놀형 구조물질의 산화반응으로 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교 결합된 물질로서, 상기 산화반응이 방선균 유래 티로시나아제에 의해 촉매되는 반응인 것을 특징으로 하는 가교 결합 물질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 모노페놀형 구조물질이 폴리펩타이드의 티로신 잔기이고, 상기 카테콜형 구조물질이 티로신 잔기가 수산화된 도파(L-3,4-dihydroxyphenylalanine) 인 가교 결합 물질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 산화반응에 엘라스틴 유래 생체고분자(Elastin-Like Polypeptide, ELP)가 추가로 첨가되는 가교 결합 물질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 젤라틴 비드.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 가교 결합 물질과 효소가 공유 결합된 효소 고정화막.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 3 차원 장기 배양을 위한 구조체.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 생체 적합형 접착제.
  8. 제 7 항에 있어서, 인공뼈 제작시 사용되는 생체 적합형 접착제.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 가교 결합 물질을 포함하는 성형 보형물.
  10. 하기의 단계를 포함하는 가교 결합 물질의 제조방법:
    방선균 유래의 티로시나아제를 이용하여 모노페놀형 구조물질의 산화반응을 촉매하는 단계; 및
    산화 반응으로 인해 생성된 카테콜형 또는 퀴논형 구조물질이 가교되는 단계.
  11. 제 10 항에 따라 제조된 가교 결합 물질과 효소의 공유결합을 유도하여 효소를 고정하는 방법.
  12. 제 10 항에 따라 가교 결합 물질을 제조하는 단계; 및
    가교 결합 물질을 포집하여 3 차원 장기 배양을 위한 구조체를 만드는 단계를 포함하는, 인공 피부 또는 인공 장기의 배양 방법.
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