KR101435606B1

KR101435606B1 - 홍합 접착 단백질에의 생체 내 잔기-특이적 ｄｏｐａ 도입 방법

Info

Publication number: KR101435606B1
Application number: KR1020120070246A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 양병선; 최유성; 윤형돈
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2012-06-28
Filing date: 2012-06-28
Publication date: 2014-08-29
Also published as: US8765682B2; US20140005356A1; KR20140002244A

Abstract

본 발명은 타이로신 잔기 대신 DOPA 잔기가 생체 내에서 직접 도입된 형태의 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 타이로신 잔기를 대신하여 DOPA 잔기가 도입된 재조합 홍합 접착 단백질 및 이의 제조방법, 상기 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하기 위한 형질전환체에 관한 것이다.

Description

홍합 접착 단백질에의 생체 내 잔기-특이적 ＤＯＰＡ 도입 방법{Method for in vivo residue-specific DOPA incorporation into mussel adhesive proteins}

본 발명은 홍합 접착 단백질에 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌 (3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine; DOPA)를 도입하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 타이로신 영양요구변이주를 홍합접착백질을 발현하도록 형질전환시키고, 이 형질전환체를 DOPA가 첨가된 배지에서 배양하여 홍합 접착 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, DOPA가 도입된 홍합 접착 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

해양 생명체인 홍합(mussel)은 특별한 내수성 접착단백질(adhesive protein)을 생산 및 분비함으로써 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착하고 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않으므로, 효과적인 내수성 바이오-접착제(bio-adhesive)에 대한 잠재적 원료로써 연구되어 오고 있다. 홍합은 발에서 뻗어 나오는 족사를 통해 수중 표면에 단단히 부착하며, 각 족사의 끝부분에는 내수성 접착제를 포함하고 있어 접착 플라크(plaque)는 젖은 고체 표면에 고정할 수 있다. 홍합 접착 단백질은 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 화학 합성 접착제와 비교하였을 때 대부분 에폭시 수지보다 약 두배 정도 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 지니고 있다. 또한, 홍합 접착 단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있으며, 인체에 무해하고 면역반응을 일으키지 않기 때문에 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등 의료분야에 응용 가능성이 크다. 또한 생분해가 가능하므로 환경친화적인 장점도 지니고 있다.

홍합 접착 단백질은 6종의 단백질, 즉 fp(foot protein)-1로부터 fp-6까지로 이루어져 있다. 이들 대부분은 타이로신(tyrosine) 잔기의 수산화(hydroxylation) 과정에서 유래된 DOPA(3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine)를 높은 비율로 포함하고 있으며 부착 면에 인접한 접착 단백질 fp-3, fp-5에서 DOPA 잔기의 함유율이 가장 높게 확인된다. 이와 대조적으로 DOPA 잔기가 결핍된 홍합 접착 단백질 유사체들은 접착성이 현저히 감소되는 것으로 알려져 있어, DOPA가 표면에의 접착에 가장 주된 역할을 수행하는 것으로 추정되고 있다. 또한 DOPA 잔기는 산화 과정을 거쳐 최종적으로 DOPA 퀴논(DOPA o-quinone)으로 변화되는데, 이 DOPA 퀴논은 접착 단백질들 간 가교화(cross-linking)가 일어나게 함으로써 접착을 견고하게 하고 수중에서도 접착 단백질들이 용해되어 나오지 않도록 하는 역할을 수행한다. 따라서 홍합 접착 단백질의 DOPA 잔기 함유율은 접착 특성과 밀접한 관련성이 있다.

현재 홍합으로부터 자연 추출한 접착물질 1 그램을 얻기 위해서는 약 일만 마리의 홍합을 필요로 하기 때문에, 홍합 접착 단백질의 물성이 매우 뛰어남에도 불구하고, 자연 추출한 홍합 접착 단백질을 산업적으로 이용하기에 많은 제약이 따르고 있다. 특히 fp-5의 경우 DOPA 함유율이 25 mol%로, 가장 높은 DOPA 함유율을 보이고 있어, 강력한 표면 접착제로써의 응용이 기대되지만, 추출을 통해 상용화 할 만큼의 양을 얻는 것은 거의 불가능하다. 대안으로서, 유전자 재조합 기술을 이용한 홍합 접착 단백질 대량 생산 연구가 수행되었으며, 6개의 히스티딘(6X-Histidine)이 포함된 홍합 접착 단백질 fp-5가 대장균에서 대량생산이 가능하고, 니켈-엔티에이(Ni-NTA)를 통해 분리 정제가 가능함을 확인한 바 있다(Biofouling Vol. 27, No. 7, August 2011, 729-737 "Recombinant mussel adhesive protein fp-5 (MAP fp-5) as a bulk bioadhesive and surface coating material")

하지만, 대장균은 별도의 전사 후 수정(post-translational modification) 매커니즘이 존재하지 않기 때문에, 대장균에서 대량 생산한 재조합 홍합 접착 단백질은 자연 추출한 홍합 접착 단백질과 달리 아미노산 잔기들이 수정되어 있지 않다는 문제가 있다. 따라서 대장균에서 생산된 홍합 접착 단백질은 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 타이로신을 DOPA로 수정하는 추가적 반응이 수행되고 있다. 예를 들면, 대표적 산화 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)는 인 비트로(in vitro) 상에서 타이로신을 DOPA나 DOPA 퀴논으로 변형시키는 대표적인 효소로 알려져 있어, 대장균으로부터 생산된 홍합 접착 단백질은 정제 후 별도로 in vitro 상에서 타이로시나아제를 이용하여 타이로신 잔기를 DOPA로 변형하고 있다. 하지만 이 방법은 별도의 반응을 추가로 수행해야 하고, 사용하는 효소의 비용이 높으며, DOPA 잔기로 수정되는 정도가 낮아, 산업적으로 활용하기에는 효율성과 경제성 측면에서 한계로 작용하고 있다.

따라서, 보다 효율적으로 홍합 접착 단백질 내에 DOPA를 도입하는 기술의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 대장균에서 생산하는 재조합 홍합 접착 단백질에 DOPA 잔기를 대량으로 도입하기 위하여 잔기-특이적 비천연 아미노산 도입 방법을 이용함으로써, 인 비트로 상에서 별도의 수정 반응을 수행하지 않고 대장균 세포 내에서(in vivo) 생산되는 홍합 접착 단백질에 높은 함유율(mol%)로 DOPA 잔기를 도입시킬 수 있는 방법을 개발하였으며, 이렇게 생산된 홍합 접착 단백질은 DOPA 잔기가 도입된 상태로 정제 가능하며, 기존의 in vitro 상에서 수정한 홍합 접착 단백질에 비해 매우 높은 DOPA 함유율을 보임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 일례는 타이로신 잔기가 DOPA로 치환된 재조합 홍합 접착 단백질의 제조 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, 상기 제조 방법에 의하여 제조된 타이로신 잔기가 DOPA로 치환된 재조합 홍합 접착 단백질이 제공된다.

또 다른 측면에서, 타이로신 영양요구변이주(tyrosine auxotroph)에 홍합 접착 단백질 발현 벡터를 도입한 형질전환체가 제공된다.

본 발명자들은 홍합 접착 단백질의 타이로신 잔기 대신에 비천연 아미노산인 DOPA를 도입하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 타이로신 영양요구변이주를 이용하여 DOPA의 존재 하에서 재조합 홍합 접착 단백질을 발현시키는 경우 DOPA가 홍합 접착 단백질 내에 높은 함유율로 도입됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

비천연 아미노산을 단백질 내에 도입하는 방법은 최근 생물공학분야에서 발전해나가는 분야로, 단백질에 새로운 기능기를 도입함으로써 새로운 성질을 지닌 생체분자를 생산하고, 단백질의 구조와 기능, 단백질 간의 상호작용을 연구하는데 유용하게 이용되고 있다. 비천연 아미노산을 단백질 내에 도입하는 데에는 크게 두 가지 방법이 있는데, 유전 암호 확장(expanding the genetic code)이라 불리는 위치-특이적(site-specific) 비천연 아미노산 도입 방법과, 유전 암호 공학(engineering the genetic code)라 불리는 잔기-특이적(residue-specific) 비천연 아미노산 도입 방법이 있다.

위치-특이적(site-specific) 도입 방법은 비천연 아미노산을 위한 특별한 tRNA와 코돈(codon) 짝을 새로이 만들어 주는 방법이다. 비천연 아미노산을 위한 새로운 코돈으로는 종결 코돈(stop codon) 중에서도 그 사용률이 낮은 앰버코돈(amber)을 많이 이용하며, 4개의 염기(base)로 이루어진 쿼드러블릿 코돈(quadruplet codon)을 이용하기도 한다. 새로운 코돈을 이용하므로 비천연 아미노산을 도입하고자 하는 곳에 새로운 코돈을 넣어주는 유전 조작을 필요로 한다. 새로운 코돈에 상응하는 새로운 tRNA 또한 필요하며 새로운 tRNA에 비천연 아미노산을 연결시켜줄 아미노아실- tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase) 또한 필요하다. 새로운 tRNA와 아미노아실-tRNA 합성효소는 결과적으로 내생 tRNA와 아미노아실-tRNA 합성효소(endogenous tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase)와 교차반응이 일어나지 않고 직교하는 쌍(orthogonal tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pair)이어야 한다. 이를 위해 아미노아실-tRNA 합성효소는 주로 다른 생명체에서 가져오며, 생산하고자 하는 단백질, 새로운 tRNA와 함께 발현시켜주어야 한다. 이와 같은 위치-특이적(site-specific) 도입 방법은 다른 천연 아미노산이 단백질 합성에 이용되는 데에는 방해를 주지 않는 이점이 있는 반면, 추가적인 유전 조작이 필요하고 방법이 복잡하며 한 단백질 내에 두 개 이상의 비천연 아미노산 도입이 힘들다는 단점이 있다.

한편, 잔기-특이적(residue-specific) 도입 방법은 위치-특이적 도입 방법과는 달리 추가적인 유전 조작을 필요로 하지 않는다. 아미노산 영양요구변이주(amino acid auxotroph)를 발현 균주(expression host)로 이용하며, 이 영양요구변이주가 필요로 하는 천연 아미노산 대신 비천연 아미노산을 넣어주어, 비천연 아미노산이 발현하고자 하는 단백질 내에 도입되도록 한다. 아미노아실-tRNA 합성효소가 비천연 아미노산을 인식해야 하기 때문에 도입하고자 하는 비천연 아미노산은 해당 천연 아미노산과 매우 비슷한 구조를 지녀야 하며, 해당 천연 아미노산이 단백질 합성에 사용되지 못한다는 단점이 있지만, 하나의 천연 아미노산을 대신하여 비천연 아미노산이 도입되므로 양적인 비천연 아미노산 도입을 가능케 한다는 장점을 지니고 있다.

본 발명은 타이로신 영양요구변이주를 이용하여 타이로신 잔기가 대신에 DOPA 또는 DOPA 퀴논이 높은 비율로 도입된 홍합접착 단백질을 제조하는 기술을 제공하는 것을 특징으로 한다.

우선, 본 발명의 일예는 티로신 잔기가 DOPA 또는 DOPA 퀴논으로 변형된 재조합 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은

(1) 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 타이로신 영양요구 변이주에 도입하여 형질전환체를 준비하는 단계;

(2) 상기 준비된 형질전환체를 타이로신을 포함하지 않는 배지에서 정지상(statary phase)까지 배양하는 단계; 및

(3) 세포가 정지상이 되면 배지에 DOPA (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine) 및/또는 DOPA 퀴논(Dopa o-quinone)을 첨가하고 추가로 배양하는 단계

를 포함하는, 타이로신 잔기가 DOPA 및/또는 DOPA 퀴논(Dopa o-quinone)로 치환된 재조합 홍합 접착 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 타이로신 영양요구변이주(tyrosine auxotroph)를 상기 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시킨 형질전환체에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 fp(foot protein)-1 (서열번호 7), fp-2 (서열번호 27), fp-3 (서열번호 4), fp-4 (서열번호 28), fp-5 (서열번호 5), 및 fp-6 (서열번호 29)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하며, 바람직하게는 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 바람직하게는 국제공개번호 제WO2006/107183A1호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-3 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 Mgfp-5 단백질 또는 이들의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 단백질 단편, 또는 상기 fp-1 단백질 단편이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-1 (서열번호 7), fp-2 (서열번호 27), fp-3 (서열번호 4), fp-4 (서열번호 28), fp-5 (서열번호 5), fp-6 (서열번호 29), 및 fp-1 단백질 단편(서열번호 6)으로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이, 예컨대 1 내지 10회 연속하여 연결된, 융합된 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 바람직하게 상기 융합 폴리펩타이드의 예시로 서열번호 1의 fp-151 단백질 또는 서열번호 3의 fp-131 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 홍합 접착 단백질의 변이체는, 바람직하게는 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합 접착 단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체는, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 단계 (1)에서 사용된 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산은, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있도록 설계한다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다.

본 발명에서 벡터란, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 pQE-80L 벡터에 삽입한 발현 벡터를 제조하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 사용되는 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 숙주세포에서 주로 사용하는 코돈으로 변형 및 최적화되거나, 코돈 서열의 중복 또는 반복을 피하기 위한 다른 코돈 서열로 변형하여 사용할 수 있다.

이와 같이 준비된 홍합 접착 단백질 코딩 핵산 서열 함유 벡터를 타이로신 영양요구변이주에 형질전환하여 형질전환체를 제조한다.

상기 타이로신 영양요구변이주는 세포내에서 타이로신 합성 능력이 없어서 외부에서 타이로신이 공급되어야 하는 균주를 의미하는 것으로, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 세포를 타이로신 영양요구성으로 변이시킨 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 타이로신 영양요구변이주는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 세포, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등을 타이로신 영양요구성으로 변이시킨 세포일 수 있다. 구체적으로 대장균 타이로신 영양요구변이주(E. coli JW2581 tyrosine auxotroph; yale genetic stock center; http://cgsc.biology.yale.edu/Strain.php?ID=108330)일 수 있다.

상기 타이로신 영양요구변이주를 홍합 접착 단백질 코딩 핵산 서열 함유 벡터로 형질전환하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본원발명에 포함된다.

벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 홍합 접착 단백질 코딩 핵산 서열 함유 벡터를 대장균 영양요구성 변이주에 40 내지 45 ℃, 예컨대 약 42℃에서 60 내지 120초, 예컨대 약 90초 정도 방치하는 열충격 방법에 의해 도입하여, 상기 수정된 홍합 접착 단백질을 생산하는 형질전환체를 준비할 수 있다.

단계 (2)은 상기 준비된 형질전환체를 타이로신을 포함하지 않는 배지에서 정지상까지 배양하는 단계이다. 상기 타이로신을 포함하지 않는 배지는 통상의 배지에서 타이로신만 제거한 것일 수 있으며, 바람직하게는 최소배지, 예컨대, 염화칼슘, 황산마그네슘, 포도당, 및 티아민이 포함된 M9 최소배지(M9 minimal medium)에 타이로신을 제외한 19종의 천연 아미노산(알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 및 라이신)이 첨가된 배지일 수 있다.

상기 형질전환체 배양 시의 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 형질전환된 대장균 타이로신 영양요구변이주를 타이로신을 제외한 19종 아미노산이 첨가된 M9 최소배지에서 35 내지 40℃, 예컨대 약 36 내지 38℃에서 정지상이 될 때까지 예컨대 약 5 내지 7시간 동안 배양할 수 있다.

세포가 정지상이 되면, 배지에 DOPA (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine)을 첨가하고 배양한다 (단계 3). 타이로신 영양요구변이주는 체내에서 타이로신을 합성할 수 없으므로 배지에 공급된 타이로신을 재료로 하여 단백질을 합성하는데, 타이로신과 유사한 구조의 DOPA (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine)이 첨가되면 단백질 합성시 타이로신 대신 DOPA (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine)를 사용하여 타이로신 잔기가 DOPA로 치환된 홍합 접착 단백질이 얻어지게 된다. 상기 첨가되는 DOPA의 첨가량은 배지내 농도가 0.1 내지 2 mM, 구체적으로 0.5 내지 1 mM이 되도록 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. DOPA의 첨가량이 상기 범위보다 적으면 DOPA의 도입률이 낮아지고, 상기 범위보다 많으면 독성이 증가하여 단백질 발현에 불리한 영향을 미치기 때문이다. 이 때, 홍합 접착 단백질의 생산을 위하여 발현 유도 물질인 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단계 (3)의 배양은 36 내지 38℃, 예컨대 약 37℃에서 정지상이 될 때까지 예컨대 약 3시간 30분 내지 5시간 30분 동안 배양할 수 있다.

상기의 방법으로 발현시킨 타이로신 잔기가 DOPA로 수정된 홍합 접착 단백질의 발현 여부의 확인은, 예컨대 회수된 전세포를 버퍼 수용액에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기 또는 고압분 질기를 이용하여 파쇄하고, 파쇄된 세포의 일부를 수용성 분액 및 불용성 분액으로 나누어 통상의 SDS-PAGE 상에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법은 상기 단계 (3) 이후에, (4) 형질전환체 내에서 생산된 타이로신 잔기가 DOPA로 치환된 재조합 홍합 접착 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이러한 분리 방법에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC) 등이 이용될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

상기 형질전환체에서 생산된 수정된 홍합 접착 단백질은, 회수된 전세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 파쇄된 세포의 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼을 이용한 변형된 친화도 크로마토그래피를 실시하여 분리 및 정제할 수 있다. 정제된 단백질은 물을 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아있는 물과 단백질 성분 이외의 성분을 제거하고 최종적으로 동결건조를 통해 파우더 형태로 정제된 단백질을 생산할 수 있다. 한편, 불용성 분액에 존재하는 수정된 홍합 접착 단백질은 이전의 상기 홍합 접착 단백질 정제 방법을 이용하여 정제를 수행할 수 있다. 최종적으로 수정된 홍합 접착 단백질의 정제여부는 통상의 SDS-PAGE와 MALDI-MS분석을 통하여, 홍합 접착 단백질의 티로신 잔기의 수정여부는 LC-MS/MS를 통하여 확인하였다(도 2 내지 도 5).

또한 다른 예는, 타이로신 영양요구변이주(tyrosine auxotroph)를 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시킨 형질전환체가 제공된다. 상기 타이로신 영양요구변이주, 홍합 접착 단백질, 및 형질 전환 방법은 앞서 설명한 바와 같다.

또 다른 측면에서, 상기 제조 방법에 의하여 제조된 타이로신 잔기가 DOPA로 치환된 재조합 홍합 접착 단백질 및 상기 재조합 홍합 접착 단백질을 포함하는 접착제 조성물이 제공된다.

상기 재조합 홍합 접착 단백질은 전체 타이로신 중 이를 대체하여 DOPA가 도입된 비율이, 30% 이상, 또는 50% 이상, 구체적으로 70% 이상, 보다 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 85% 이상, 예컨대 90% 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서의 수정된 홍합 접착 단백질은 접착제로서 상기의 기존 홍합 접착 단백질이 사용될 수 있는 용도에 동일하게 적용될 수 있어 미세접착 시스템뿐만 아니라, 대용량 접착시스템, 예를 들면 알루미늄 등의 금속 물질의 접착에도 효과적인 접착력을 유지한다.

본 발명의 접착제 조성물은, 플라스틱, 유리, 금속, 및 고분자 합성수지로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 적용하기 위해 사용될 수 있으며, 즉 상기 기질을 접착시키거나 고정하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 제조방법은 상기의 기존 홍합 접착 단백질의 접착제 제조방법에 준하고, 사용방법은 통상의 접착제 사용방법에 준하며, 대표적인 방법은 도포법이다.

특히 본 발명의 접착제 조성물은 생체 물질에 적용될 수 있는데, 상기 생체 물질은 생물로 분류되는 모든 동, 식물 및 상기 동, 식물로부터 유래된 일부를 의미하며, 일예로는, 세포, 조직, 기관, RNA, DNA, 단백질, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 호르몬, 지질 및 화합물이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 생체 물질에 사용되는 경우 본 발명의 접착제는 구체적인 사용법, 사용량 및 제형 등은, 현재 시판되는 Cell-Tak 제품(BD Biosciences, Two oak Park, Bedford, MA, 미국)에 준하여 사용될 수 있다. 일예로, 본 발명의 접착제는 용제형, 수용성, 무용제형일 수 있으며, 기질에 대하여 0.01 내지 100 ug/cm²로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 접착제의 적용예는 이에 한정되지 않으나, (1) 수 (물 또는 염분이 있는 물)중에 있는 기질간의 접착; (2) 뼈, 인대, 힘줄, 반월(meniscus) 및 근육 치료 및 인공재료 이식과 같은 정형외과적 치료; (3) 천공, 열창, 절개 등의 치료, 각막 이식, 인공 각막 삽입와 같은 안과적 접합; (4) 보정장치, 가공의치, 치관 장착, 흔들리는 치아 고정, 부러진 치아 치료 및 충진제 고정과 같은 치과적 접합; (5) 혈관 접합, 세포조직 접합, 인공재료 이식, 상처 봉합과 같은 외과적 치료; (6) 식물의 이식편 접합, 상처 치유와 같은 식물에서의 접합; 및 (7) 약물, 호르몬, 생물학적 인자, 의약물, 생리적 또는 대사적 관찰 장치, 항생제 및 세포의 이식과 같은 용도가 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).

또한 본 발명은 접착제에 계면활성제, 산화제, 가교제, 및 충진제(filler)로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 처리하거나, 또는 상기 접착제의 유효성분인 수정된 홍합 접착 단백질의 농도를 조절함으로써 상기 접착제의 접착력을 조절할 수 있다(참조: 미국 특허 제 5,015,677호).

본 발명은 인 비트로 상에서 별도의 타이로신 수정 반응을 수행할 필요 없이 형질전환 대장균으로부터 DOPA 잔기가 도입된 홍합 접착 단백질을 직접 생산할 수 있으므로, 활성 형의 홍합 접착 단백질을 용이하게 확보할 수 있다.

도 1은 홍합 접착 단백질 발현 벡터 pQE-80L-fp5h의 개열지도이다.
도 2는 형질전환체에서 M9 최소 배지에 DOPA를 첨가하여 발현시킨 DOPA가 도입된 fp5h와, 타이로신을 첨가하여 발현시킨 양성 대조군, 아무것도 첨가하지 않은 음성 대조군의 전세포를 tricine SDS-PAGE와 쿠마씨 염색으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 상기 DOPA가 도입된 fp5h, 양성 대조군, 음성 대조군의 전세포를 tricine SDS-PAGE와 NBT 염색으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 분리정제된 홍합 접착 단백질의 분자량을 MALDI-TOF MS로 분석한 결과이다.
도 5는 분리정제된 홍합 접착 단백질을 아미노산 조성 분석기를 이용하여 아미노산 조성을 분석함으로써 DOPA 잔기의 도입 여부를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍합 접착 단백질 fp -5 발현 벡터의 제조

자연에 존재하는 홍합 접착 단백질 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AY521220; AAS00463 (홍합 접착 단백질 Mgfp-5; 서열번호 5)의 코딩 폴리뉴클레오타이드)를 대장균에서 발현시켜 재조합 홍합 접착 단백질 fp-5(서열번호 5: Biofouling Vol. 27, No. 7, August 2011, 729-737 "Recombinant mussel adhesive protein fp-5 (MAP fp-5) as a bulk bioadhesive and surface coating material" 참조)를 얻었다. 구체적인 방법은 'D. S. Hwang et al., Applied and environmental microbiology, 70, 3352-3359, 2004'를 참조하였다.

그리고, 상기 얻어진 홍합 접착 단백질 fp-5의 발현양을 증대시키기 위하여 상기 유전자(서열번호 2(AY521220)를 대장균에서 빈번하게 사용되는 유전자 코돈으로 변형하여 화학합성하고(Biofouling Vol. 27, No. 7, August 2011, 729-737 "Recombinant mussel adhesive protein fp-5 (MAP fp-5) as a bulk bioadhesive and surface coating material"), 이를 두 개의 프라이머, fp-5h-forward: 5'-GAA TTC ATT AAA GAG GAG AAA TTA ACT ATG AAA CAC CAT CAC CAT CAC CAT CTG GTG CCG CGC GGC AGC-3' (서열번호 30), fp-5h-reverse: 5'-AAG CTT TTA TTA GCT GCT GCC GCC ATA ATA TTT TTT ATA-3' (서열번호 31)을 이용하여 PCR로 증폭하였다. 얻어진 증폭산물을 제한효소 EcoR Ⅰ과 Hind Ⅲ 자리를 이용하여 pQE-80L 벡터(QIAGEN)에 도입하여 Mgfp-5가 도입된 재조합 벡터를 제조하였다 (도 1). 이렇게 만들어진 재조합 벡터를 pQE-80L-fp5h이라고 명명하였다.

실시예 2. 홍합 접착 단백질 발현 벡터를 포함하는 형질전환체의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질 발현 벡터 pQE-80L-fp5h를 포함하는 홍합 접착 단백질을 발현하는 형질전환체를 제조하기 위하여, 상기 벡터 제조된 pQE-80L-fp5h를 42℃에서 90초간 열충격을 가하여 대장균 타이로신 영양요구변이주(tyrosine auxotroph; E. coli JW2581 tyrosine auxotroph; yale genetic stock center; http://cgsc.biology.yale.edu/Strain.php?ID=108330)에 도입하였고, 앰피실린이 첨가되어 있는 LB-한천 배지에서 선별하였다.

실시예 3. DOPA 잔기가 도입된 홍합 접착 단백질의 발현

M9 염(인산수소이나트륨 67.8 g, 인산이수소칼륨 30.0g, 염화나트륨 5.0 g, 염화암모늄 10.0 g의 혼합물을 1 L의 증류수에 녹인 용액)과 염화칼슘, 황산마그네슘, 포도당, 및 티아민이 포함된 M9 최소배지(M9 minimal medium; 증류수 650 ml, M9 염 100 ml, 20% 포도당 20 ml, 1M 황산마그네슘 200 ul, 1M 염화칼슘 100 ul, 티아민-염산 1 mg)에 타이로신을 제외한 19개의 천연 아미노산을 40 mg/L의 농도로 녹여서 타이로신이 포함되지 않은 M9 최소배지를 제조하였다.

상기 실시예 2에서 제조한 형질전환체(Single Colony)를 50 μg/mL 앰피실린이 첨가된 통상의 LB 배지(USB Corporation) 100 mL에서 37℃ 조건에서 진탕 배양하여 약 12시간 배양하였다. DOPA 잔기가 도입된 홍합 접착 단백질 fp-5를 발현시키기 위하여, 위에서 제조된 타이로신이 포함되지 않은 M9 최소배지 1 L를 준비한 후, 배양액의 시작 흡광도(starting OD₆₀₀)가 약 0.15가 되도록 타이로신 40 mg/L이 추가로 포함된 M9 최소배지에서 약 10-12시간 동안 배양한 세포를 상기 준비된 타이로신이 포함되지 않은 M9 최소배지 1 L에 옮겼다. 이와 같이 대장균 형질전환체 세포를 옮긴 M9 최소배지 1 L에, 흡광도가 일정 수준(0.7-0.8정도)에서 정지상(stationary phase)에 도달하도록 타이로신을 소량 (약 0.02-0.025mM)만 넣어준 후 37℃에서 진탕 배양하였다. 약 6시간 배양 후에 정지상을 보임을 확인하였다.

정지상임을 확인 후, 배지 내의 DOPA(DOPA; 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine) 농도가 1 mM이 되도록 DOPA를 넣어주었다. DOPA를 넣어준 후, 유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 1mM)를 첨가하여 상기 단백질들의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 양성 대조군(positive control)의 경우 DOPA 대신 타이로신을 농도 1 mM이 되도록 넣고 IPTG로 상기 단백질들의 발현을 유도하였으며, 음성 대조군(negative control)의 경우에는 아무것도 넣어주지 않았다. 배양한 후 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다.

DOPA를 넣어준 후 발현시킨 홍합 접착 단백질 fp5h와 양성 대조군, 음성 대조군의 회수된 세포 각각을 tricine SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

도 2는 타이로신 영양요구변이주 대장균에서 발현된 홍합 접착 단백질 fp5h와 양성 대조군(PC), 음성 대조군(NC)의 전세포(whole cell)를 tricine SDS-PAGE와 쿠마씨 염색(coomassie staining)으로 분석한 사진이다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, DOPA를 넣어주었을 때 홍합 접착 단백질 fp5h가 발현이 되었음을 확인할 수 있었다. 타이로신을 넣어준 양성 대조군과 비교해보았을 때, DOPA를 넣어준 경우에는 발현양이 적어지고 단백질 밴드가 약간 위쪽 방향으로 이동하였음을 알 수 있는데, 타이로신 대신 비천연 아미노산인 DOPA가 들어감으로 인해 단백질 생합성 과정이 어려워져서 발현양은 적어지고, 단백질 내에 타이로신 대신 DOPA가 도입되었기 때문에 분자량, 등전점(isoelectric point)과 같은 단백질의 특성이 변했기 때문에 단백질 밴드의 위치가 달라졌다고 해석할 수 있다.

도 3은 상기 tricine SDS-PAGE와 NBT(nitroblue tetrazolium chloride) 염색으로 분석한 사진이다. 단백질에 DOPA가 존재할 경우 NBT 용액에 의하여 청남색으로 색 변화가 발생하는 것으로 알려져 있다. DOPA를 넣고 발현한 fp5h에서만 단백질 밴드가 염색된 것으로 보아, 단백질 내에 DOPA 잔기가 성공적으로 도입되었음을 확인할 수 있다.

실시예 4. DOPA 잔기가 도입된 홍합 접착 단백질 fp -5의 정제

DOPA를 넣어 발현된 DOPA 잔기가 도입된 홍합 접착 단백질 fp5h를 니켈 컬럼 크로마토그래피(Ni column chromatography)에 의하여 분리 정제하였다. 구체적으로, 발현 후 회수된 세포를 세포 파쇄를 위한 용액 (100 mM sodium phosphate, 10 mM tris, 100 mM boric acid, 10 mM ascorbic acid, 8 M urea, pH ~7)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 파쇄된 세포를 9000rpm 15min으로 원심분리하여 수용성 분액은(상청액)과 불용성 분액(펠렛)으로 분리시켰다. 이와 같이 분리된 수용성 분액과 불용성 분액 중에서 수용성 분액을 니켈 아가로즈 레진(Ni-nitrilotriacetic acid (NTA) agarose resin; quiagen)이 충진된 컬럼에 적용하여 단백질과 컬럼이 결합하도록 하였다. 세척 용액(100 mM sodium phosphate, 10 mM tris, 100 mM boric acid, 10 mM ascorbic acid, 8 M urea, pH 6.0)으로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 씻어내고 0.5 M HCl을 이용하여 컬럼으로부터 단백질을 용출하였다. 상기 정제된 용액은 5%(v/v) 아세트산 용액과 물을 이용한 투석을 통해, 단백질 수용액에 남아있는 물과 단백질 성분 이외의 성분을 제거하고 최종적으로 동결건조를 통해 파우더 형태로 정제된 단백질을 생산하였다.

도 4는 분리 정제된 단백질을 MALDI-TOF MS 분석(4700 Proteomics Analyzer, Maldi TOF-TOF, Applied Biosystems)을 통해 얻어진 단백질의 분자량을 확인한 그래프이다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, DOPA가 도입된 홍합 접착 단백질이 효율적으로 정제됨을 알 수 있다.

실시예 5. 생산된 홍합 접착 단백질 내 DOPA 잔기의 도입 확인

분리정제된 홍합 접착 단백질을 아미노산 조성 분석기를 이용하여 단백질에 DOPA 잔기가 도입되었는지를 확인하였다. 상기 실시예 4에서 정제된 홍합 접착 단백질 약 0.5mg을 6 M HCl 500uL 로 가수분해 하여 아미노산 단위체들로 만들어준 후, 크로마토그래피를 이용하여 아미노산 단위체들의 정성, 정량 분석을 통하여 단백질을 구성하고 있는 아미노산 단위체들을 분석하였다. 약 0.5mg의 단백질과 6M HCl용액 500uL, phenol 25uL를 유리 바이알에 넣고 argon gas로 charging하여 산소를 제거한 후, 유리 바이알을 불에 달구어 sealing하였다. 그 후 156℃에서 1시간동안 가수분해한 후 아미노산 분석을 수행하였다. 증류수와 메탄올로 세척하고, evaporation한 후 단백질 시료를 sample buffer에 녹인 후 아미노산 조성 분석기(Amino Acid Analyzer S4300, SYKAM Company)에 넣어 분석하였다.

표 1과 도 5는 각각 상기 아미노산 조성 분석기를 이용하여 정제된 홍합 접착 단백질을 구성하는 아미노산 단위체들을 분석한 표와 그래프를 나타낸다. 도 5에서 U PAD2-1는 440 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과로 프롤린 검출을 위한 것이며, U PAD2-2는 570 nm 파장에서의 흡광도 내며, 프롤린 이외의 다른 아미노산 검출을 위한 것이다. 표 1 및 도 5에 나타난 결과를 보면 DOPA는 약 17.8개로 전체 타이로신이 들어가야 할 자리 20개 중에서 DOPA가 17~18개 정도로 도입되었음을 확인할 수 있었다. 그러므로 약 85~90%정도의 타이로신이 DOPA로 된 재조합 홍합 접착 단백질을 얻을 수 있었다.

실시예 6. DOPA 잔기의 도입 비율 비교

본 발명에 따른 타이로신 영양요구변이주를 사용한 DOPA 잔기 도입과 기존의 타이로시나아제 동시 발현에 의한 DOPA 잔기 도입시의 DOPA 도입 정도를 비교하였다.

6.1. 타이로시나아제 동시 발현에 의한 DOPA 잔기 도입

활성형 티로시나아제의 발현을 위하여 방선균 (Streptomyces antibioticus) 유래의 티로시나아제 유전자를 방선균 게놈으로부터 두 개의 DNA 프라이머 pSA-mel-5p: 5'-cac caG GAT CCg acc gtc cgc aag aac-3' (서열번호 23) 및 pSA-mel-3p: 5'-cac AAG CTT tca gac gtc gaa ggt-3' (서열번호 24) 을 이용하여 PCR로 증폭하고, 이를 발현벡터인 pACYC-Duet 벡터의 BamHI과 HindIII의 제한효소 자리에 도입하였다. 또한, 티로시나아제로 구리를 도입하는데 필요한 orf438 유전자를 방선균 게놈으로부터 두 개의 DNA 프라이머 pSA-438-5p: 5'-cac CAT ATG ccg gaa ctc acc cgt-3' (서열번호 25) 및 pSA-438-3p: 5'-cac CTC GAG tca gtt gga ggg gaa-3' (서열번호 26) 를 이용하여 PCR로 증폭하고, 이를 상기 티로시나아제 유전자가 도입된 벡터의 NdeI과 XhoI 제한 효소 자리에 도입하여 최종적으로 티로시나아제 발현 벡터인 pACYC-Tyr-438을 제조하였다.

상기 실시예 1에서 제작된 홍합 접착 단백질 fp5h 발현 벡터와 상기 pACYC-Tyr-438를 동시에 42 ?에서 2분간 열충격을 가하여 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 두 벡터가 모두 도입된 형질전환체는 앰피실린과 클로로앰피니콜이 모두 첨가되어 있는 LB-한천 배지에서 선별하였다.

상기 제조한 형질전환체를 50 μg/mL 앰피실린 및 10 μg/mL 클로로앰피니콜이 첨가된 통상의 37 ℃, LB 배지에서 진탕 배양하여 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.8~0.9 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 1mM)을 첨가하여 상기 단백질들의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 5시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 배양된 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 세포 파쇄를 위한 용액 (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7, 8M urea, 10 mM imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하였다.

위와 같이 동시발현에 의해 생산된 티로신 잔기가 수정된 홍합 접착 단백질 fp5h를 수용성 분액으로부터 니켈 컬럼 크로마토그래피에 의하여 분리 정제하였다. 구체적으로, 상기 단백질 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼에 적용하여 단백질과 컬럼이 결합하도록 하고, 세척 버퍼(50 mM sodium phosphate buffer, 8M urea, 30 mM imidazole, pH 7.0)로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 씻어 냈다. 컬럼으로부터 단백질의 용출은 0.5 M HCl을 이용하여 진행하였고, 상기 정제된 용액은 물을 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아 있는 물과 단백질 성분 이외의 성분을 제거하고 최종적으로 동결건조를 통해 파우더 형태로 정제된 단백질을 생산하였다.

6.2. DOPA 잔기 함유 비율 확인

DOPA 잔기만 특이적으로 감지할 수 있는 IRPH assay을 수행하였다. 농도를 알고 있는 DOPA 용액을 이용하여 IRPH reagent를 섞은 후, 510nm에서 흡광도를 측정하여 standard curve를 그린 후, 시험 시료에 IRPH reagent(0.10 g의 o-phenanthroline monohydrate, 0.08 g의 ammonium ferric sulfate dodecahydrate, 2 ml의 1M 염산, 총 100 ml이 되도록 증류수 첨가)를 섞어 510nm에서 흡광도를 측정하여 그 흡광도를 standard curve와 비교함으로써 단백질 내 DOPA 함량을 확인하여 아래의 표 2에 나타내었다. DOPA 잔기가 수정되지 않은 fp5h와 본 실시예에서 비교를 위하여 제작된 타이로시나아제로 DOPA 잔기를 수정한 fp5h, 및 본 발명에 따라서 도파가 도입된 후 분리정제된 홍합 접착 단백질 fp5h의 도파 잔기 함유 정도를 비교한 결과를 나타낸다.

앞선 실시예 5의 아미노산 조성 분석기를 이용한 시험은 강한 산 조건에서 가수분해하기 때문에 도입된 DOPA 중에서 DOPA 퀴논으로 변형되거나 가교 반응이 일어난 DOPA가 다시 가수분해되어 DOPA로 되어, 도입된 DOPA의 양을 모두 분석할 수 있는 반면, 본 시험은 DOPA 퀴논으로 변형되거나 가교 반응이 일어난 DOPA는 검출하지 못하기 때문에, 단백질 내 존재하는 DOPA 함량을 측정한 것이다. 표 1의 결과에서와 같이, 본 발명의 방법에 따라서 DOPA를 도입시키는 경우, 타이로시네이즈 동시 발현 경우와 비교하여 현저한 DOPA 함유율을 보이는 것을 알 수 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for in vivo residue-specific DOPA incorporation into mussel adhesive proteins <130> DPP20121720KR <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys 195 <210> 2 <211> 202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151-RGD <400> 2 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 130 135 140 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 165 170 175 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Thr Tyr Lys Gly Arg Gly Asp Ser Pro 195 200 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-131 <400> 3 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Trp Ala 50 55 60 Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp Asn 85 90 95 Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr Gly Ser Ala 100 105 110 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 115 120 125 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from FP-1 <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 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Pro Ile Tyr Lys Ser Lys Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Pro Lys Ile Thr Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys 245 250 255 Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 260 265 270 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 275 280 285 Pro Thr Tyr Ile Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 290 295 300 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 305 310 315 320 Tyr Lys Ala Lys Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr 325 330 335 Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 340 345 350 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr 355 360 365 Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys 370 375 380 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Ile Ser Tyr Pro 385 390 395 400 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys Ala Lys 405 410 415 Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 420 425 430 Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Thr 435 440 445 Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Thr Tyr Pro Pro Thr 450 455 460 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Pro Ser 465 470 475 480 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Lys Ser Ser Tyr Pro Ser Ser Tyr Lys 485 490 495 Pro Lys Lys Thr Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Leu Thr Tyr Pro 500 505 510 Pro Thr Tyr Lys Pro Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Lys 515 520 525 Ile Thr Tyr Pro Ser Thr Tyr Lys Leu Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 530 535 540 Tyr Lys Ser Lys Thr Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Asn Lys Lys Ile Ser 545 550 555 560 Tyr Pro Ser Gln Tyr 565 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 8 Arg Gly Asp 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> 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Met Thr Val Arg Lys Asn Gln Ala Ser Leu Thr Ala Glu Glu Lys Arg 1 5 10 15 Arg Phe Val Ala Ala Leu Leu Glu Leu Lys Arg Thr Gly Arg Tyr Asp 20 25 30 Ala Phe Val Thr Thr His Asn Ala Phe Ile Leu Gly Asp Thr Asp Asn 35 40 45 Gly Glu Arg Thr Gly His Arg Ser Pro Ser Phe Leu Pro Trp His Arg 50 55 60 Arg Phe Leu Leu Glu Phe Glu Arg Ala Leu Gln Ser Val Asp Ala Ser 65 70 75 80 Val Ala Leu Pro Tyr Trp Asp Trp Ser Ala Asp Arg Ser Thr Arg Ser 85 90 95 Ser Leu Trp Ala Pro Asp Phe Leu Gly Gly Thr Gly Arg Ser Arg Asp 100 105 110 Gly Gln Val Met Asp Gly Pro Phe Ala Ala Ser Ala Gly Asn Trp Pro 115 120 125 Ile Asn Val Arg Val Asp Gly Arg Thr Phe Leu Arg Arg Ala Leu Gly 130 135 140 Ala Gly Val Ser Glu Leu Pro Thr Arg Ala Glu Val Asp Ser Val Leu 145 150 155 160 Ala Met Ala Thr Tyr Asp Met Ala Pro Trp Asn Ser Gly Ser Asp Gly 165 170 175 Phe Arg Asn His Leu Glu Gly Trp Arg Gly Val Asn Leu His Asn Arg 180 185 190 Val His Val Trp Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Gly Val Ser Pro Asn 195 200 205 Asp Pro Val Phe Trp 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caagaac 27 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-mel-3p primer <400> 24 cacaagcttt cagacgtcga aggt 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-438-5p primer <400> 25 caccatatgc cggaactcac ccgt 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSA-438-3p primer <400> 26 cacctcgagt cagttggagg ggaa 24 <210> 27 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-2 <400> 27 Thr Asn Arg Pro Asp Tyr Asn Asp Asp Glu Glu Asp Asp Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Pro Val Tyr Lys Pro Ser Pro Ser Lys Tyr Arg Pro Val Asn Pro Cys 20 25 30 Leu Lys Lys Pro Cys Lys Tyr Asn Gly Val Cys Lys Pro Arg Gly Gly 35 40 45 Ser Tyr Lys Cys Phe Cys Lys Gly Gly Tyr Tyr Gly Tyr Asn Cys Asn 50 55 60 Leu Lys Asn Ala Cys Lys Pro Asn Gln Cys Lys Asn Lys Ser Arg Cys 65 70 75 80 Val Pro Val Gly Lys Thr Phe Lys Cys Val Cys Arg Asn Gly Asn Phe 85 90 95 Gly Arg Leu Cys Glu Lys Asn Val Cys Ser Pro Asn Pro Cys Lys Asn 100 105 110 Asn Gly Lys Cys Ser Pro Leu Gly Lys Thr Gly Tyr Lys Cys Thr Cys 115 120 125 Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Val His Ala Cys Lys Pro 130 135 140 Asn Pro Cys Lys Asn Lys Gly Arg Cys Phe Pro Asp Gly Lys Thr Gly 145 150 155 160 Tyr Lys Cys Arg Cys Val Asp Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gln Glu 165 170 175 Asn Ala Cys Lys Pro Asn Pro Cys Ser Asn Gly Gly Thr Cys Ser Ala 180 185 190 Asp Lys Phe Gly Asp Tyr Ser Cys Glu Cys Arg Pro Gly Tyr Phe Gly 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Arg Tyr Val Cys Ala Pro Asn Pro Cys Lys Asn Gly 210 215 220 Gly Ile Cys Ser Ser Asp Gly Ser Gly Gly Tyr Arg Cys Arg Cys Lys 225 230 235 240 Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Lys Val Asn Val Cys Lys Pro Thr 245 250 255 Pro Cys Lys Asn Ser Gly Arg Cys Val Asn Lys Gly Ser Ser Tyr Asn 260 265 270 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Cys Gly Glu Asn Val 275 280 285 Cys Lys Pro Asn Pro Cys Gln Asn Arg Gly Arg Cys Tyr Pro Asp Asn 290 295 300 Ser Asp Asp Gly Phe Lys Cys Arg Cys Val Gly Gly Tyr Lys Gly Pro 305 310 315 320 Thr Cys Glu Asp Lys Pro Asn Pro Cys Asn Thr Lys Pro Cys Lys Asn 325 330 335 Gly Gly Lys Cys Asn Tyr Asn Gly Lys Ile Tyr Thr Cys Lys Cys Ala 340 345 350 Tyr Gly Trp Arg Gly Arg His Cys Thr Asp Lys Ala Tyr Lys Pro Asn 355 360 365 Pro Cys Val Val Ser Lys Pro Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Ile Trp 370 375 380 Asn Gly Lys Ala Tyr Arg Cys Lys Cys Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Arg 385 390 395 400 His Cys Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Lys Asn Pro Cys Ala Ser Arg Pro 405 410 415 Cys Lys Asn Arg Gly Lys Cys Thr Asp Lys Gly Asn Gly Tyr Val Cys 420 425 430 Lys Cys Ala Arg Gly Tyr Ser Gly Arg Tyr Cys Ser Leu Lys Ser Pro 435 440 445 Pro Ser Tyr Asp Asp Asp Glu Tyr 450 455 <210> 28 <211> 787 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-4 <400> 28 Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Glu Pro Ser Gly Tyr Ala Asn Ile Gly His 1 5 10 15 Arg Arg Tyr Tyr Glu Arg Ala Ile Ser Phe His Arg His Ser His Val 20 25 30 His Gly His His Leu Leu His Arg His Val His Arg His Ser Val Leu 35 40 45 His Gly His Val His Met His Arg Val Ser His Arg Ile Met His Arg 50 55 60 His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Arg 65 70 75 80 His Val His Arg His Arg Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg 85 90 95 Val Leu His Arg His Leu His Arg His Arg Val Leu His Gly His Val 100 105 110 His Arg His Arg Val Leu His Asn His Val His Arg His Ser Val Leu 115 120 125 His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Arg His Val His Arg 130 135 140 His Asn Val Leu His Gly His Val His Arg His Arg Val Leu His Lys 145 150 155 160 His Val His Asp His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln 165 170 175 Val Leu His Gly His Val His Arg His Gln Val Leu His Lys His Val 180 185 190 His Asn His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu 195 200 205 His Gly His Val His Thr His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys 210 215 220 His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu His Gly 225 230 235 240 His Ile His Thr His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln 245 250 255 Val Leu His Gly His Val His Thr His Arg Val Leu His Lys His Val 260 265 270 His Lys His Arg Val Leu His Lys His Leu His Lys His Gln Val Leu 275 280 285 His Gly His Val His Met His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys 290 295 300 His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His His Val Val His Lys 305 310 315 320 His Val His Ser His Arg Val Leu His Lys His Val His Lys His Arg 325 330 335 Val Glu His Gln His Val His Lys His His Val Leu His Arg His Val 340 345 350 His Ser His His Val Val His Ser His Val His Lys His Arg Val Val 355 360 365 His Ser His Val His Lys His Asn Val Val His Ser His Val His Arg 370 375 380 His Gln Ile Leu His Arg His Val His Arg His Gln Val Val His Arg 385 390 395 400 His Val His Arg His Leu Ile Ala His Arg His Ile His Ser His Gln 405 410 415 Ala Ala Val His Arg His Val His Thr His Val Phe Glu Gly Asn Phe 420 425 430 Asn Asp Asp Gly Thr Asp Val Asn Leu Arg Ile Arg His Gly Ile Ile 435 440 445 Tyr Gly Gly Asn Thr Tyr Arg Leu Ser Gly Gly Arg Arg Arg Phe Met 450 455 460 Thr Leu Trp Gln Glu Cys Leu Glu Ser Tyr Gly Asp Ser Asp Glu Cys 465 470 475 480 Phe Val Gln Leu Gly Asn Gln His Leu Phe Thr Val Val Gln Gly His 485 490 495 His Ser Thr Ser Phe Arg Ser Asp Leu Ser Asn Asp Leu His Pro Asp 500 505 510 Asn Asn Ile Glu Gln Ile Ala Asn Asp His Val Asn Asp Ile Ala Gln 515 520 525 Ser Thr Asp Gly Asp Ile Asn Asp Phe Ala Asp Thr His Tyr Asn Asp 530 535 540 Val Ala Pro Ile Ala Asp Val His Val Asp Asn Ile Ala Gln Thr Ala 545 550 555 560 Asp Asn His Val Lys Asn Ile Ala Gln Thr Ala His His His Val Asn 565 570 575 Asp Val Ala Gln Ile Ala Asp Asp His Val Asn Asp Ile Gly Gln Thr 580 585 590 Ala Tyr Asp His Val Asn Asn Ile Gly Gln Thr Ala Asp Asp His Val 595 600 605 Asn Asp Ile Ala Gln Thr Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln 610 615 620 Thr Ala Asp Asp His Val Asn Ala Ile Ala Gln Thr Ala Asp His Val 625 630 635 640 Asn Asp Ile Gly Asp Thr Ala Asn Ser His Ile Val Arg Val Gln Gly 645 650 655 Val Ala Lys Asn His Leu Tyr Gly Ile Asn Lys Ala Ile Gly Lys His 660 665 670 Ile Gln His Leu Lys Asp Val Ser Asn Arg His Ile Glu Lys Leu Asn 675 680 685 Asn 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Claims

(1) 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 타이로신 영양요구 변이주에 도입하여 형질전환체를 준비하는 단계;
(2) 상기 준비된 형질전환체를 타이로신을 포함하지 않는 배지에서 정지상(statary phase)까지 배양하는 단계; 및
(3) 세포가 정지상이 되면 배지에 DOPA (Dopa, 3,4-dihydroxyphenylalanine) 또는 DOPA 퀴논(Dopa o-quinone)을 첨가하고 추가로 배양하는 단계
를 포함하는, 티로신 잔기가 DOPA 또는 DOPA 퀴논으로 치환된 홍합 접착 단백질을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3) 이후에,
(4) 제조된 홍합 접착 단백질을 분리 및 정제하는 단계
를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 타이로신 영양요구변이주는 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모, 스포도프테라 프루기페르다(SF9), CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, 및 BMT 10으로 이루어진 군에서 선택된 세포의 타이로신 영양요구변이주인, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 및 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종의 단백질,
서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 단편이 1 내지 10회 연속하여 연결된 단백질, 또는
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 1회 내지 10회 연속하여 연결된 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 RGD를 포함하는 폴리펩타이드는 서열번호 8 내지 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되고, 전체 타이로신 중 DOPA 도입률이 50% 이상인 것을 특징으로 하는,
홍합 접착 단백질.
제9항의 홍합 접착 단백질을 유효성분으로 포함하는 접착제 조성물.
타이로신 영양요구변이주(tyrosine auxotroph)를 홍합 접착 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환시킨 형질전환체.